The work was funded by the Leukemia and Lymphoma Society of the USA (6105-08), a Cancer Council NSW grant (13-02), an NHMRC Senior Research Fellowship (LJB) (1042305) and project grant (1041614).

Burada açıklanan protokol, akut lenfoblastik lösemi hücre çizgisi NALM6 kullanır, ancak diğer hücre tiplerine uygulanabilir. 1. Çözümler ve Reaktifler <ol><li> Tam RPMI <ol><li> 56 ml cenin buzağı serumu (FCS) ve RPMI-1640 ortam içinde 500 ml&#39;lik bir şişeye 5.5 mi, 200 mM L-glutamin ekleyin. </li></ol></li><li> BrdU Stok Çözümü <ol><li> Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) içinde 32.5 mM BrdU (10 mg / ml) hazırlayın. </li></ol></li><li> BrdU tam RPMI <ol><li> Tam RPMI 10 ml BrdU stok çözeltisi 6.2 ul ekleyin. </li></ol></li><li> DNaz Çözümü <ol><li> 1 mg Dnaz / DPBS ml hazırlayın. </li></ol></li><li> Lekeleme tampon maddesi <ol><li> DPBS içinde% 3 ısı ile inaktive edilmiş FCS ve% 0.09 sodyum azit hazırlayın. </li></ol></li><li> Sabitleme Buffer, Permeabilization Tampon ve Yıkama Tamponu tanımları için malzemeler Listesine bakınız. </li></ol> 2. Hücreler Hayırte: Hücreler 6 aydan fazla süre ile kültüre değildi. Bu yöntem, hücre yoğunluğu ve kültür ortamına ayarlamaları ile herhangi bir bitişik olmayan hücre hattına doğrudan uyarlanabilir. Deneyin başlangıcında katlanarak büyüyen hücreler kullanın. <ol><li> Tam RPMI içinde, T-75 kültür şişelerinde NALM6 hücreleri korumak. Bir Sınıf II Biyogüvenlik Kabini kullanarak steril şartlar altında tüm adımları uygulayın. <ol><li> Haftada üç kez kültürü bölerek ml başına 6 10 x 1-2 arasındaki hücreleri NALM6 hücreleri korumak. </li><li> Havadaki CO2,% 5 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li></ol></li></ol> BrdU Hücre 3. Darbe Etiketleme DİKKAT: potansiyel bir mutajen ve teratojen olduğu gibi özenle BrdU kullanın. <ol><li> 5 dakika boyunca 150 x g&#39;de santrifüje hücreleri. Not: Taze ortama aktarılması hücrelerin sonuçların tekrarlanabilirliği geliştirir. </li><li> 2 x 10 6 c Komple RPMI bir hücre sayımı ve tekrar süspansiyon hücreleri gerçekleştirinarşın / ml olmuştur. </li><li> BrdU tam RPMI 1 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir nihai hücre konsantrasyonu üreten 2 hücreleri: 1 seyreltin. </li><li> Daha sonra tam RPMI ile 10 hücreleri: 1 seyreltin, 45 dakika boyunca% 5 CO2 37 ° C&#39;de inkübe edilir. Dikkatle 150 5 dakika boyunca xg ve Santrifüj hücreleri süpernatant tüm atın. </li><li> Tam RPMI küçük bir hacme (~ 100 ul) içinde süspanse edin hücreleri, bir hücre sayımı yapar ve 1 x 10 6 hücre / ml olacak şekilde ayarlanır. </li><li> Pipet 48 çukurlu bir levhanın çukurlarına içine hücre 1 mi. Herhangi bir işgal edilmemiş kuyulara DPBS pipetle 1 ml daha yeniden üretilebilir sonuçlar elde edilmiştir. </li><li> 17 Burada arzu edilen zaman noktalarında, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 için hava içinde% 5 37 ° C&#39;de CO2 inkübe , 18, 19, 20, 21, 22, 23 ve 24 saat. Not: süre deneysel tasarım ölçmeyi amaçlamaktadır ne bağlıdır. </li><li> Bir pipet kullanarak FACS tüpler içine tüm hücreleri aktarın. 1 mi VOLU iyi bir sekans durulayın5 ml&#39;lik bir nihai toplam hacim PBS mes. </li><li> 5 dakika boyunca 150 xg&#39;de Santrifüj ve dikkatli bir şekilde tüm süpernatant kaldırmak. Hücreler, boyama için hazır hemen bu (bölüm 4) gerçekleştirin. </li></ol> 4. Hücre Boyama Not: hücre yüzeyi boyaması gerekli ise hücreler boyunca 4 ° C&#39;de tutulmasını sağlamak, tespit öncesinde bunu gerçekleştirmek. <ol><li> Lekeleme tampon maddesi içinde 100 ul içinde süspanse hücreleri (isteğe bağlı yüzeyi boyama, antijenleri yüzey ve 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca inkübasyona antikorun önerilen hacim kazandırmak). </li><li> 150 x g&#39;de 5 dakika boyunca boyama tamponu 1 ml santrifüj ekleyin ve süpernatant atılır. Not: vs. özel antikor, konsantrasyon, kuluçkalama süresi spesifik deneysel hedeflerine bağlı olarak değişecektir. </li><li> Tespit ve Permeabilization <ol><li> Sabitleme tampon 100 ul hücre yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. </li><li> 1 ml o eklemef yıkama tamponu, 150 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj ve süpernatant atın. </li><li> Permeabilizasyon tampon maddesi içinde 100 ul hücrelerin tekrar ve buz üzerinde 10 dakika boyunca hücreler inkübe edin. </li><li> 150 x g&#39;de 5 dakika boyunca yıkama tamponu 1 ml santrifüj ekleyin ve süpernatant atılır. </li><li> Tüp başına sabitleme tampon 100 ul hücre yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. </li><li> 150 x g&#39;de 5 dakika boyunca yıkama tamponu 1 ml santrifüj ekleyin ve süpernatant atılır. Not: Gerekirse protokol burada durdurulmuş olabilir. lekeleme tampon maddesi içinde yeniden süspansiyona alınmış, eğer sabit hücreler 4 ° C &#39;de pek çok gün boyunca stabildir. Devam etmeden önce santrifüj aşağıdaki boyama tamponu çıkarın. </li></ol></li><li> DNaz Tedavi <ol><li> DNaz çözeltisi 100 ul (30 DNase / 10 6 hücre ug) ve 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca hücrelerin inkübe yeniden süspanse hücreleri. </li><li> 5 dakika boyunca 150 xg&#39;de yıkama tamponu, santrifüj 1 ml ekleyin ve süpernatant atın. </li&gt; </ol></li><li> Antikor Boyama Not: BrdU dışındaki hücre içi belirteçler için boyama BrdU boyama ile eş zamanlı olarak yapılabilir. <ol><li> ÖNEMLİ: Her bir florokrom etiketli lekesiz hücreleri ve hücrelerin oluşturduğu tazminat kontrolleri hazırlayın. İdeal olarak, deney tüpleri kullanılanlar gibi dengeleme kontrol için aynı antikorları kullanır. Bu mümkün değilse Ancak, son derece ifade antijenlere karşı antikorlar yerine aynı florokromu konjuge. </li><li> Yıkama tamponu, 50 ul hücrelerin yeniden süspanse edin ve 1 ul / BrdU antikoru 10 6 hücre ekleyin. Not: diğer spesifik hücre içi antijenlere karşı doğrudan konjüge edilmiş antikorlar da ilave edilebilir. NOT:. Cdc2 için Ser10 üzerinde fosforile histon H3 antikorlar G2 ve M hücreleri arasında ayrım yapmak için kullanılabilir, histon H3 mitoz sırasında Ser10 üzerinde fosforlaştırılır 10 antikorlar, hav hücreleri tespit etmek için kullanılabilir Tyr15 ilgili fosforileE mitoz kararlıdır. 11 </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe hücreleri. </li><li> 5 dakika boyunca 150 x g&#39;de 1 yıkama tampon maddesinin ml&#39;si santrifüj hücreleri ekleyin ve süpernatant atılır. </li></ol></li></ol><ol start="6"><li> Hücre Döngüsü Analizi için Leke DNA <ol><li> Pelet gevşetin ve 7-AAD çözeltisi (0.25 mcg) 20 ul ekleyin. Not: 7-AAD / hücre sabit bir miktarda kullanımı için çok önemlidir. </li><li> Lekeleme tampon maddesi içinde 1 ml içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li></ol></li></ol> Sitometrisi Verilerin 5. Koleksiyonu Not: Kullanılan fluorochromes sayısı ve niteliğine bağlı olacaktır gerekli makine. <ol><li> Aşağıdaki parametreler toplamak: FSC A, SSC-A, FSC lH doğrusal bir ölçek üzerinde ve 7-AAD floresan (FSC W yerine FSC H kullanılabilir). Bir günlük ölçeğinde APC kanalı toplayın. Bir günlük ölçeği kullanılarak yüzey veya iç etiket değerlendirilmesi için gerekli herhangi bir ek kanallar toplayın. </li><li> Com gerçekleştirinörnekleri analiz etmeden önce farklı fluorochromes arasında gözlenen emisyon spektrumları sinyalleri örtüşen Telafisi. Not: Çoğu akış sitometrelerinde otomatik olarak gerçekleştirecektir. </li><li> Her bir numune için en azından 10,000 olayları toplayın. </li></ol> Sitometrisi Verilerin 6. Analizi Not: Veri analizi, ancak diğer yazılım paketleri de kullanılabilir sitometri FlowJo akışı için bu çalışmada kullanılmıştır. Ayırıcı stratejisi, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. <ol><li> FSC-A ve SSC-A parametreleri kullanılarak canlı hücre popülasyonu tanımlayın. </li><li> Bu nüfus içinde çiftleri ve (burada da kullanılabilir FSC-W) FSC-A ve FSC-H kullanılarak agrega dahil değildir. </li><li> Bu nüfusun içinde y ekseni üzerinde x-ekseni ve BrdU-APC 7-AAD kullanarak nokta arsa ayarlayın. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52840/52840fig1highres.jpg" width="700" /> Şekil 1: Yolluk Strateji Sol pa.nel: ungated hücreler SSC-A nokta arsa vs FCS-A gösterilir. canlı hücre popülasyonu gösterilen kapısı ile tanımlanır. Merkez paneli: sol panelden Geçitli hücreler FSC-H nokta arsa (yerine yüksekliği kullanılabilir FSC-W) vs FSC-A gösterilir. Ikilileri ve agrega tespit ve gösterilen kapısı ile dışlanır. Sağ paneli: orta panelinde ikili dışlama tarihinden itibaren Geçitli hücreler APC-bir nokta arsa vs 7-AAD gösterilir. BrdU antikoru APC darbe etiketleme sırasında BrdU dahil hücrelerin tanımlanmasına imkân ile etiketlenir. 7-AAD DNA içeriği hakkında bilgi verir. Üst geçit BrdU darbe, sol alt kapısı, hücrelerde G 0/1 ve G olanlar sağ alt geçidin zamanında S fazında nedenle BrdU pozitif ve hücreleri tanımlar / M 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52840/52840fig1highres.jpg" target="_blank">Bir görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın büyük bir sürümü.</a> <ol start="4"><li> Hücre Döngüsü A<html> nalysis <ol><li> Ikili dışlama kapısı hücreler üzerinde ilk veri dosyası ve kapıyı açın. </li><li> (Flojo yazılımında platformlarda altında bulunur) hücre döngüsü dağıtımı için bu nüfusu analiz ve Dean-Jett-Fox modeli kullanın. </li><li> G 0/1 ve G kapıları oluşturmak kullanarak 2 / M zirveleri konumlarını edinin. </li><li> BrdU pozitif hücrelerin ve konuyla ilgili Kapısı aynı hücre döngüsü analizi bu nüfus. </li><li> Oluşturmak kapıları aynı kapıları uygulanması ve G 0/1 ve G 2 / M zirveleri pozisyonları için (yaratılmış kapıları kullanarak) kısıtlamaları ayarlayarak G 0/1 ve G 2 / M zirveleri için pozisyonları sağlayın. Bu durum, Şekil 2&#39;nin birinci 2 panel gösterilmiştir. Not: Diğer yazılım aynı zamanda verileri analiz etmek için kullanılabilir ve talimatlar buna göre değişecektir. </li></ol></li></ol>840 / 52840fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 700 &quot;/&gt; Şekil 2:. Hücre Döngüsü İlerleme ilk panel (Tüm Hücreler) ikili dışlama kapısı tarafından tanımlanan hücre popülasyonu üzerinde işlenir. Bu popülasyon, X ekseni üzerindeki 7-AAD içeren bir histogramda gösterilen edildi. G 0/1 pikin tepe ekseninin altında bir okla gösterilir. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi daha sonra paneller BrdU pozitif hücreler kapılanmış edilmiştir. Çiftler dışlama kapısının yolluk elde edilen G 0/1 pozisyonda değeri FlowJo hücre döngüsü yazılım içinde BrdU pozitif kapılanmış hücrelerin uygulanır. Şekil 1, ilk iki panel de gösterildiği gibi, tüm nüfus analizinde elde edilen değere göre G 0/1 tepe pozisyonda gösterildiği gibi, her bir takip eden paneli BrdU pozitif popülasyonu üzerinde geçirilen edildi. Aynı samp BrdU pozitif hücrelerin G 0/1 nüfus yerini belirlemek için BrdU negatif kısmını kullanmale örnekler arasındaki DNA leke yoğunluğunda herhangi küçük farklılıklar için kontrol eder. Her panelde gösterilen numara BrdU darbe sona ermesinden bu yana zamanı temsil eder. Hesaplanan hücre döngüsü fazları gölgeli yeşil gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52840/52840fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<ol>
	<li>Banfalvi, G., Banfalvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods Mol Biol. 761, 1-23 (2011).</li><li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression.">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132, 487-498 (2008).</li><li>Harper, J. W., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+damage+response:+ten+years+after.">The DNA damage response: ten years after.</a> Molecular Cell. 28, 739-745 (2007).</li><li>Latt, S. A., George, Y. S., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+bromodeoxyuridine-substituted+cells+stained+with+33258+Hoechst.">Flow cytometric analysis of bromodeoxyuridine-substituted cells stained with 33258 Hoechst.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 25, 927-934 (1977).</li><li>Gratzner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+to+5-bromo-+and+5-iododeoxyuridine:+A+new+reagent+for+detection+of+DNA+replication.">Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication.</a> Science. 218, 474-475 (1982).</li><li>Carayon, P., Bord, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+DNA-replicating+lymphocyte+subsets+using+a+new+method+to+label+the+bromo-deoxyuridine+incorporated+into+the+DNA.">Identification of DNA-replicating lymphocyte subsets using a new method to label the bromo-deoxyuridine incorporated into the DNA.</a> Journal of Immunological Methods. 147, 225-230 (1992).</li><li>Gonchoroff, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-phase+detection+with+an+antibody+to+bromodeoxyuridine.+Role+of+DNase+pretreatment.">S-phase detection with an antibody to bromodeoxyuridine. Role of DNase pretreatment.</a> Journal of Immunological Methods. 93, 97-101 (1986).</li><li>Rabinovitch, P. S., Torres, R. M., Engel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+cell+cycle+analysis+and+two-color+surface+immunofluorescence+using+7-amino-actinomycin+D+and+single+laser+excitation:+applications+to+study+of+cell+activation+and+the+cell+cycle+of+murine+Ly-1+B+cells.">Simultaneous cell cycle analysis and two-color surface immunofluorescence using 7-amino-actinomycin D and single laser excitation: applications to study of cell activation and the cell cycle of murine Ly-1 B cells.</a> Journal of Immunology. 136, 2769-2775 (1986).</li><li>Saunders, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAD001+(everolimus)+induces+dose-dependent+changes+to+cell+cycle+regulation+and+modifies+the+cell+cycle+response+to+vincristine.">RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine.</a> Oncogene. 32, 4789-4797 (2013).</li><li>Hendzel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis-specific+phosphorylation+of+histone+H3+initiates+primarily+within+pericentromeric+heterochromatin+during+G2+and+spreads+in+an+ordered+fashion+coincident+with+mitotic+chromosome+condensation.">Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation.</a> Chromosoma. 106, 348-360 (1997).</li><li>Draetta, G., Beach, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+cdc2+protein+kinase+during+mitosis+in+human+cells:+cell+cycle-dependent+phosphorylation+and+subunit+rearrangement.">Activation of cdc2 protein kinase during mitosis in human cells: cell cycle-dependent phosphorylation and subunit rearrangement.</a> Cell. 54, 17-26 (1988).</li><li>Saunders, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAD001+(everolimus)+induces+dose-dependent+changes+to+cell+cycle+regulation+and+modifies+the+cell+cycle+response+to+vincristine.">RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine.</a> Oncogene. , (2012).</li><li>Knudsen, R. C., Ahmed, A. A., Sell, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+microassay+for+lymphotoxin+using+microculture+plates+and+the+multiple+automated+sample+harvester.">An in vitro microassay for lymphotoxin using microculture plates and the multiple automated sample harvester.</a> Journal of Immunological Methods. 5, 55-63 (1974).</li><li>Beck, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+kinetics+of+perturbed+cell+populations+determined+by+the+bromodeoxyuridine-33258+technique:+radiotoxic+effects+of+incorporated+[3H]thymidine.">Proliferation kinetics of perturbed cell populations determined by the bromodeoxyuridine-33258 technique: radiotoxic effects of incorporated [3H]thymidine.</a> Cytometry. 2, 170-174 (1981).</li><li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node.">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li><li>Collins, J. M., Berry, D. E., Bagwell, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+rates+of+DNA+synthesis+during+the+S+phase+of+log+phase+HeLa+S3,+WI-38,+and+2RA+cells.">Different rates of DNA synthesis during the S phase of log phase HeLa S3, WI-38, and 2RA cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 255, 3585-3590 (1980).</li><li>Schwarting, R., Gerdes, J., Niehus, J., Jaeschke, L., Stein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+growth+fraction+in+cell+suspensions+by+flow+cytometry+using+the+monoclonal+antibody+Ki-67.">Determination of the growth fraction in cell suspensions by flow cytometry using the monoclonal antibody Ki-67.</a> Journal of Immunological Methods. 90, 65-70 (1986).</li><li>Danova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle-related+proteins:+a+flow+cytofluorometric+study+in+human+tumors.">Cell cycle-related proteins: a flow cytofluorometric study in human tumors.</a> Biology of the Cell. 64, 23-28 (1988).</li><li>Juan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3+phosphorylation+and+expression+of+cyclins+A+and+B1+measured+in+individual+cells+during+their+progression+through+G2+and+mitosis.">Histone H3 phosphorylation and expression of cyclins A and B1 measured in individual cells during their progression through G2 and mitosis.</a> Cytometry. 32, 71-77 (1998).</li><li>Langan, T. J., Chou, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+mammalian+cell+cultures+by+serum+deprivation.">Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation.</a> Methods in Molecular Biology. 761, 75-83 (2011).</li><li>Kues, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+synchronization+of+porcine+fetal+fibroblasts:+effects+of+serum+deprivation+and+reversible+cell+cycle+inhibitors.">Cell cycle synchronization of porcine fetal fibroblasts: effects of serum deprivation and reversible cell cycle inhibitors.</a> Biology of Reproduction. 62, 412-419 (2000).</li><li>Urbani, L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+nuclear+and+cytoplasmic+cell+cycle+progression+by+drugs+employed+in+cell+synchronization.">Dissociation of nuclear and cytoplasmic cell cycle progression by drugs employed in cell synchronization.</a> Experimental Cell Research. 219, 159-168 (1995).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hücre döngüsü analiz yeteneği kanseri biyoloji anlaşılması ve hücre çoğalmasını ve büyümesini etkileyen iki ilaç ve gen hareket mekanizması için çok önemlidir. Bildirildi hücre çoğalmasını ölçmek deneylerinde bir sayıda olsa da, çoğunluğu sadece Halen mevcut hücreleri gösteren bir ölçü sağlar. Bu doğrudan görselleştirme ve sayma, metabolik aktivite veya ATP konsantrasyonu ile hücre sayısını ölçmek deneyleri içermektedir. Bu yöntemlerin çoğu temel avantajı, koşullar ya ...

hücre döngüsü ilerlemesi sırasında hücre döngüsü özellikleri ve hücrelerde meydana gelen değişikliklerin değerlendirilmesi biyolojisi, özellikle kanser biyolojisi birçok yönünü anlamak için esastır. Malignitelerin tedavisi için geliştirilmesinde bir çok madde, hücre döngüsü ilerlemesi üzerinde derin etkilere sahip ya da hücre devre bağımlı-mekanizmalar yoluyla hücre ölümüne neden olmaktadır. Hücre döngüsünün belirli fazında hücre döngüsü dinamikleri veya hücreleri incelemek için, bu hücrelerin senkronize olağandır. Ancak senkronizasyon yöntemleri potansiyel sonuçlar elde karıştırıcı, çalışılan hücreleri üzerinde zararlı etkileri olabilir. 1 zamanla tek hücrelerde hücre döngüsü ilerlemesinin son hücrelerin döngüsünün belirli aşamalarında sadece mevcut floresan isim levhası proteinlerin kullanılmasına izin var analizi 2, bununla birlikte, bu hücreler, genetik olarak okunabilir sistemlere kullanımlarını sınırlayan, bu etiketlenmiş proteinlerin sentezlenmesi için manipüle edilmesi ihtiyacı incelenecekily elde etti. (S) faz DNA çoğaltılır ve mitoz (M) burada hücre bölünmesi gerçekleşir: hücre döngüsü, iki aktif aşamadan oluşmaktadır. Bu fazlar, üç boşluk fazlar, G 0, G1 ve G2 ile ayrılır. Hücreler boyutu önceden hücre büyümesi DNA replikasyonu tamamlanması arasındaki fakat hücre bölünmesi öncesinde devam DNA replikasyonu ve G 2 artırmak nerede G 0 ya da sessizlik, hücre döngüsünü terk etti bir dinlenme aşamasıdır, G 1&#39;dir. hücre döngüsü yoluyla ilerleme kontrol noktaları bir dizi tarafından kontrol edilir. Çevre koşulları, DNA sentezinin destekleyici değildir ve S fazına girişi önler G 1 kapısı aktive edilir. içi S fazı kapısı veya gecikme durdu çoğaltma çatal yol açabilir DNA hasarı ile tetiklenebilir. Hasar G 2 sonra tespit edilirse G 2 Sırasında çoğaltılan DNA sadakat onaylanır ve </sub&gt; Denetim noktası bölümü hücre DNA tamir önce izin aktive edilir. Mitoz sırasında son bir kontrol noktası o hücre bölünmesi başarıyla tamamlandı böylece kromatidler doğru mitotik plakada hizalanmış olduğunu garanti eder. Bu kontrol noktalarında 3 aktivasyonu yaygın hücre popülasyonlarının eşitlemek için kullanılır. Hücre döngüsü kontrol noktası, bir dizi faktöre göre ancak en yaygın DNA hasarının tespiti, Kanser biyolojisinde etkinleştirilebilir. DNA hasar cevabı (ATR) ile ilgili PI3-kinaz benzeri kinazlar ataksi telenjiektazi ve RAD3 tarafından başlatılan ve ataksi telenjiektazi (ATM) sırasıyla aşağı efektör kinazları CHK1 ve Chk2 aktive olduğu mutasyona uğramış. 3 olaylar bir dizi durdu dahil CHK1 aktive çoğaltma çatal, DNA çapraz bağlarının ve ultraviyole radyasyon hasarı Chk2 öncelikle çift iplikli kırılmalara tarafından aktive ediliyor. hücre döngüsü i uzunluğuna değiştirilmiş koşullarının etkisini incelemek için her zamanki yöntemis hücre döngüsü belirli bir aşamasında hücreleri senkronize etmek. 1. Bu çeşitli yöntemler ile elde edilebilir. Hücreler fiziksel boyutu, yoğunluk, yan dağılım (parçalı) ve hücre yüzey ifadesi belirteçleri dayalı ayrıştırılır edilebilir. Daha pratik hücreleri kimyasal yollarla senkronize edilebilir. Örneğin timidin, hidroksiüre ve sitosin arabinosid gibi çeşitli ajanlar ajanlar çıkarıldıktan sonra bisiklet devam S fazında hücrelerin birikimiyle sonuçlanır hücre döngüsünün S fazında DNA sentezini inhibe etmek için de kullanılabilir. Veya M-fazı DNA içeriğinin - Hücreler G 2 mitotik iğ oluşumunu tutuklama önler nokodazolun ile işlemden geçirildi. G 0 aşamasında hücrelerin birikimi kültür ortamı sonuçlarından serum ortadan kaldırılması. kültür, serum içindeki besinlerin yeniden eklenmesi hücrelerinin normal bisiklet yeniden başlatır. Ancak, bu senkronizasyon yöntemlerinin tüm hücrelerin normal bisiklet ve büyüme ile müdahale ve resul edebilirsinizönemli bir hücre ölümü t. Akut lenfoblastik lösemi hücrelerinin Senkronizasyon özellikle zor olduğu ve bu hücreler genetik manipülasyon için uygun değildir. Burada tarif edilen yöntem, hücre döngüsü dinamiklerinin değerlendirme ve geleneksel senkronizasyon veya genetik değişiklik yapılmadan hücre döngüsünün belirli aşamalarında hücreleri çalışmasına izin verir. Bu yöntem, aynı zamanda genetik modifikasyon ve geleneksel senkronizasyon işlemleri kolayca elde olmayan diğer hücre türleri için yararlı olabilir. yöntem hücrelerin kısa vadeli büyüme ve çoğalması üzerinde çok az etkiye sahiptir bromodeoksiüridin (BrdU) Kuruluş, uzun kurulan kullanımına dayanmaktadır. 4 Kuruldu BrdU protokolleri S fazında yeni sentezlenmiş DNA içine BrdU dahil yararlanmak . Bu kalıcı BrdU maruziyeti sırasında S fazında yapılmış olan olarak hücreleri işaretler. Bu popülasyon BrdU incorpor için boyama daha sonra zaman noktalarında tespit edilebilirtirme ve böylece takip ve hücre döngüsü transit uyuşturucu etkileri çalışma izin zamanla değerlendirilebilir senkronize nüfus olarak hareket ederler. BrdU genellikle DNase veya asit tedaviden sonra elde önce antikor boyama maruz kalması gerekir. 6,7 dahil BrdU ek markörler dahil sağlayan tespit etmek için akış sitometrisi kullanılarak. En önemli çalışma başlangıcında S fazında olan hücrelerin, hücre döngüsü faz dağılımının değerlendirilmesini sağlayan DNA içeriğini ölçmek için boyalar kullanılmasıdır. 8 Ayrıca ek yüzey ya da hücre içi antijenler de incelenebilir. 9 Bu Böyle Ki67 gibi hücre döngüsü olaylarla ilgili ya da bölünmüş kaspaz-3 gibi apoptoz belirteçlerinin olarak görünüşte ilgisiz hücre özellikleri olabilir. potansiyel uygulamalar araştırmacı hayal gücü ile sınırlıdır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC BrdU Flow Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552598</td>
			<td>Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm 
			Buffer (referred to as Fixation Buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561651</td>
			<td>Referred to as Permeabilization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Perm/Wash Buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554723</td>
			<td>Referred to as Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-4513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 12 x 75-mm FACS tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen Stain Buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR FORTESSA flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FORTESSA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>P2, P20, P100, P1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 w/o L-Gln 500 ml</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-167F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>FisherBiotec</td>
			<td>FBS-7100113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromo-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5002-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon TC 150cm2 vented Flasks</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>355001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes 25mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>760180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aersol Pipettes 200&#181;L</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>24700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aersol Pipettes 1mL</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>24800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Spintron</td>
			<td>GT-175R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>C 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>9708S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>2197S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td><a name="RANGE!C23">2348S</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NALM6&#160;</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC-128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

temporal tracking of cell cycle progression using flow cytometry without the need for synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

Bu yöntem, bir dizi bilgi elde etmek için kullanılabilir. Birkaç uygulamalar burada özetlenmiştir. Hücre döngüsü süresinin değerlendirilmesi Hücre döngüsü yoluyla transit hücreleri için gerekli süreyi belirlemek için, hücreler BrdU darbe sonra çeşitli zaman noktalarında toplanır. değerlendirmeler arasındaki aralıklar analiz edilmekte olan özel hücrelere uyarlanabilir. Hematopoietik hücre hatları, standart kültür koşulları altı...

Watch this Scientific Journal Video about Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization at JoVE.com

Senkronizasyona Gerek Olmadan Akış Sitometrisi Kullanılarak Hücre Döngüsü İlerlemesinin Geçici Takibi | Biyoloji | Video

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Bu protokol, zaman içinde belirli bir noktada S fazında olan hücrelerin zamansal izleme izin vermek için bromodeoksiüridin (BrdU) alımından kullanımını tarif eder. DNA boyalar ve antikor etiketleme eklenmesi daha sonraki zamanlarda S fazı hücrelerinin kaderi detaylı analizini kolaylaştırır.

Senkronizasyon Need for olmadan Akım Sitometri Kullanımı Hücre Döngüsü ilerleme zamansal İzleme

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

temporal-tracking-cell-cycle-progression-using-flow-cytometry-without

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Cellular Processes

Cell Cycle and Division

SCIENTISTS IN ACTION

19.1K Görüntüleme.  Westmead Millennium Institute for Medical Research and University of Sydney.  Bu protokol, zaman içinde belirli bir noktada S fazında olan hücrelerin zamansal izleme izin vermek için bromodeoksiüridin (BrdU) alımından kullanımını tarif eder. DNA boyalar ve antikor etiketleme eklenmesi daha sonraki zamanlarda S fazı hücrelerinin kaderi detaylı analizini kolaylaştırır. 

Video: Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Fare Mayotik Hücreler Sitometrisi Arıtma

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Biyoloji

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

Metabolik Etiketleme ve Flow Sitometri ile Hücre Döngüsü İlerleme Kinetik Ölçüm

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Cep Takip Boyalar kullanarak Hücre Bölünmesi İzleme için optimize Boyama ve Çoğalma Modelleme Yöntemleri

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

Akım Sitometri Kullanımı Ekstrasellüler Veziküller Analizi Teknikleri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

Senkronizasyon<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Bakteriyel Hücre Döngüsü Soruşturma

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

Akım Sitometri Kullanımı rekombinant İyon Kanallarının göreli Hücre Yüzey ve toplam İfade tayini

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Spektral Sitometrisi ile Katı Dokular İzole Hücre Cezalar Analizi

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The synchronization of cell populations at specific stages of the cell cycle has been found to be very useful in such experimental endeavors. Synchronization of cells by treatment with chemicals that are relatively less toxic can be advantageous over the use of pharmacological inhibitory drugs for the study of consequent cell cycle events and to obtain specific enrichment of selected mitotic stages. Here, we describe the protocol for synchronizing human cells at different stages of the cell cycle, including both in S phase and M phase with a double thymidine block and release procedure for studying the functionality of mitotic proteins in chromosome alignment and segregation. This protocol has been extremely useful for studying the mitotic roles of multifunctional proteins which possess established interphase functions. In our case, the mitotic role of Cdt1, a protein critical for replication origin licensing in G1 phase, can be studied effectively only when G2/M-specific Cdt1 can be depleted. We describe the detailed protocol for depletion of G2/M-specific Cdt1 using double thymidine synchronization. We also explain the protocol of cell fixation, and live cell imaging using high resolution confocal microscopy after thymidine release. The method is also useful for analyzing the function of mitotic proteins under both physiological and perturbed conditions such as for Hec1, a component of the Ndc80 complex, as it enables one to obtain large sample sizes of mitotic cells for fixed and live cell analysis as we show here.&#160;&#160;

We present a protocol for double thymidine synchronization of HeLa cells followed by analysis using high resolution confocal microscopy. This method is key to obtaining large number of cells that proceed synchronously from S phase to mitosis, enabling studies on mitotic roles of multifunctional proteins which also possess interphase functions.

Mitotik hücre eşitleme ve yüksek çözünürlüklü Confocal mikroskobu mitoz sırasında çok fonksiyonlu hücre döngüsü proteinlerin rolü çalışmaya birleştirme

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells

In vivo cell cycle progression analysis is routinely performed in studies on genes regulating mitosis and DNA replication. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) has been utilized to investigate replicative/S-phase progression, whereas antibodies against phospho-histone H3 have been utilized to mark mitotic nuclei and cells. A combination of both labels would enable the classification of G0/G1 (Gap phase), S (replicative), and M (mitotic) phases and serve as an important tool to evaluate the effects of mitotic gene knockdowns or null mutants on cell cycle progression. However, the reagents used to mark EdU-labelled cells are incompatible with several secondary antibody-fluorescent tags. This complicates immunostaining, where primary and tagged secondary antibodies are used to mark pH3-positive mitotic cells. This paper describes a step-by-step protocol for the dual-labeling of EdU and pH3 in Drosophila larval neural stem cells, a system utilized extensively to study mitotic factors. Additionally, a protocol is provided for image analysis and quantification to allocate labeled cells in 3 distinct categories, G0/G1, S, S&gt;G2/M (progression from S to G2/M), and M phases.

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells

Cell cycle analysis with 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) and phospho-histone H3 (pH3) labeling is a multi-step procedure that may require extensive optimization. Here, we present a detailed protocol that describes all steps for this procedure including image analysis and quantification to distinguish cells in different cell cycle phases.

5-Etil-2'-Deoksiroridin/Fosfo-Histon H3 Drosophila Nöral Kök Hücrelerde Hücre Döngüsü İlerleme Analizi için Çift Etiketleme Protokolü

In vivo cell cycle progression analysis is routinely performed in studies on genes regulating mitosis and DNA replication. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ...

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes are critical for the investigations of spindle assembly and chromosome segregation in male meiotic division. The mouse spermatocyte is an ideal model for mechanistic studies of meiosis, however, the effective methods for the analyses of spermatocytes are lacking. In this article, a practical and efficient method for the in vivo inhibition of kinesin-7 CENP-E in mouse spermatocytes is reported. A detailed procedure for testicular injection of a specific inhibitor GSK923295 through abdominal surgery in 3-week-old mice is presented. Furthermore, described here is a series of protocols for tissue collection and fixation, hematoxylin-eosin staining, immunofluorescence, flow cytometry and transmission electron microscopy. Here we present an in vivo inhibition model via abdominal surgery and testicular injection, that could be a powerful technique to study male meiosis. We also demonstrate that CENP-E inhibition results in chromosome misalignment and metaphase arrest in primary spermatocytes during meiosis I. Our in vivo inhibition method will facilitate mechanistic studies of meiosis, serve as a useful method for genetic modifications of male germ lines, and shed a light on future clinical applications.

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

This article reports an in vivo inhibition of CENP-E through abdominal surgery and testicular injection of GSK923295, a valuable model for male meiotic division. Using the immunofluorescence, flow cytometry and transmission electron microscopy assays, we show that CENP-E inhibition results in chromosome misalignment and genome instability in mouse spermatocytes.

Kinesin-7 CENP-E'nin In Vivo İnhibisyon, İmmünofloresan ve Akım Sitometrisi Kullanılarak Spermatositlerde Fonksiyonel Değerlendirilmesi

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...

Methods Article

Senkronizasyon Need for olmadan Akım Sitometri Kullanımı Hücre Döngüsü ilerleme zamansal İzleme