Name: temporal tracking of cell cycle progression using flow cytometry without the need for synchronization
Uploaded: 2015-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization at JoVE.com

The work was funded by the Leukemia and Lymphoma Society of the USA (6105-08), a Cancer Council NSW grant (13-02), an NHMRC Senior Research Fellowship (LJB) (1042305) and project grant (1041614).

Burada açıklanan protokol, akut lenfoblastik lösemi hücre çizgisi NALM6 kullanır, ancak diğer hücre tiplerine uygulanabilir. 1. Çözümler ve Reaktifler <ol><li> Tam RPMI <ol><li> 56 ml cenin buzağı serumu (FCS) ve RPMI-1640 ortam içinde 500 ml&#39;lik bir şişeye 5.5 mi, 200 mM L-glutamin ekleyin. </li></ol></li><li> BrdU Stok Çözümü <ol><li> Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) içinde 32.5 mM BrdU (10 mg / ml) hazırlayın. </li></ol></li><li> BrdU tam RPMI <ol><li> Tam RPMI 10 ml BrdU stok çözeltisi 6.2 ul ekleyin. </li></ol></li><li> DNaz Çözümü <ol><li> 1 mg Dnaz / DPBS ml hazırlayın. </li></ol></li><li> Lekeleme tampon maddesi <ol><li> DPBS içinde% 3 ısı ile inaktive edilmiş FCS ve% 0.09 sodyum azit hazırlayın. </li></ol></li><li> Sabitleme Buffer, Permeabilization Tampon ve Yıkama Tamponu tanımları için malzemeler Listesine bakınız. </li></ol> 2. Hücreler Hayırte: Hücreler 6 aydan fazla süre ile kültüre değildi. Bu yöntem, hücre yoğunluğu ve kültür ortamına ayarlamaları ile herhangi bir bitişik olmayan hücre hattına doğrudan uyarlanabilir. Deneyin başlangıcında katlanarak büyüyen hücreler kullanın. <ol><li> Tam RPMI içinde, T-75 kültür şişelerinde NALM6 hücreleri korumak. Bir Sınıf II Biyogüvenlik Kabini kullanarak steril şartlar altında tüm adımları uygulayın. <ol><li> Haftada üç kez kültürü bölerek ml başına 6 10 x 1-2 arasındaki hücreleri NALM6 hücreleri korumak. </li><li> Havadaki CO2,% 5 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li></ol></li></ol> BrdU Hücre 3. Darbe Etiketleme DİKKAT: potansiyel bir mutajen ve teratojen olduğu gibi özenle BrdU kullanın. <ol><li> 5 dakika boyunca 150 x g&#39;de santrifüje hücreleri. Not: Taze ortama aktarılması hücrelerin sonuçların tekrarlanabilirliği geliştirir. </li><li> 2 x 10 6 c Komple RPMI bir hücre sayımı ve tekrar süspansiyon hücreleri gerçekleştirinarşın / ml olmuştur. </li><li> BrdU tam RPMI 1 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir nihai hücre konsantrasyonu üreten 2 hücreleri: 1 seyreltin. </li><li> Daha sonra tam RPMI ile 10 hücreleri: 1 seyreltin, 45 dakika boyunca% 5 CO2 37 ° C&#39;de inkübe edilir. Dikkatle 150 5 dakika boyunca xg ve Santrifüj hücreleri süpernatant tüm atın. </li><li> Tam RPMI küçük bir hacme (~ 100 ul) içinde süspanse edin hücreleri, bir hücre sayımı yapar ve 1 x 10 6 hücre / ml olacak şekilde ayarlanır. </li><li> Pipet 48 çukurlu bir levhanın çukurlarına içine hücre 1 mi. Herhangi bir işgal edilmemiş kuyulara DPBS pipetle 1 ml daha yeniden üretilebilir sonuçlar elde edilmiştir. </li><li> 17 Burada arzu edilen zaman noktalarında, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 için hava içinde% 5 37 ° C&#39;de CO2 inkübe , 18, 19, 20, 21, 22, 23 ve 24 saat. Not: süre deneysel tasarım ölçmeyi amaçlamaktadır ne bağlıdır. </li><li> Bir pipet kullanarak FACS tüpler içine tüm hücreleri aktarın. 1 mi VOLU iyi bir sekans durulayın5 ml&#39;lik bir nihai toplam hacim PBS mes. </li><li> 5 dakika boyunca 150 xg&#39;de Santrifüj ve dikkatli bir şekilde tüm süpernatant kaldırmak. Hücreler, boyama için hazır hemen bu (bölüm 4) gerçekleştirin. </li></ol> 4. Hücre Boyama Not: hücre yüzeyi boyaması gerekli ise hücreler boyunca 4 ° C&#39;de tutulmasını sağlamak, tespit öncesinde bunu gerçekleştirmek. <ol><li> Lekeleme tampon maddesi içinde 100 ul içinde süspanse hücreleri (isteğe bağlı yüzeyi boyama, antijenleri yüzey ve 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca inkübasyona antikorun önerilen hacim kazandırmak). </li><li> 150 x g&#39;de 5 dakika boyunca boyama tamponu 1 ml santrifüj ekleyin ve süpernatant atılır. Not: vs. özel antikor, konsantrasyon, kuluçkalama süresi spesifik deneysel hedeflerine bağlı olarak değişecektir. </li><li> Tespit ve Permeabilization <ol><li> Sabitleme tampon 100 ul hücre yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. </li><li> 1 ml o eklemef yıkama tamponu, 150 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj ve süpernatant atın. </li><li> Permeabilizasyon tampon maddesi içinde 100 ul hücrelerin tekrar ve buz üzerinde 10 dakika boyunca hücreler inkübe edin. </li><li> 150 x g&#39;de 5 dakika boyunca yıkama tamponu 1 ml santrifüj ekleyin ve süpernatant atılır. </li><li> Tüp başına sabitleme tampon 100 ul hücre yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. </li><li> 150 x g&#39;de 5 dakika boyunca yıkama tamponu 1 ml santrifüj ekleyin ve süpernatant atılır. Not: Gerekirse protokol burada durdurulmuş olabilir. lekeleme tampon maddesi içinde yeniden süspansiyona alınmış, eğer sabit hücreler 4 ° C &#39;de pek çok gün boyunca stabildir. Devam etmeden önce santrifüj aşağıdaki boyama tamponu çıkarın. </li></ol></li><li> DNaz Tedavi <ol><li> DNaz çözeltisi 100 ul (30 DNase / 10 6 hücre ug) ve 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca hücrelerin inkübe yeniden süspanse hücreleri. </li><li> 5 dakika boyunca 150 xg&#39;de yıkama tamponu, santrifüj 1 ml ekleyin ve süpernatant atın. </li&gt; </ol></li><li> Antikor Boyama Not: BrdU dışındaki hücre içi belirteçler için boyama BrdU boyama ile eş zamanlı olarak yapılabilir. <ol><li> ÖNEMLİ: Her bir florokrom etiketli lekesiz hücreleri ve hücrelerin oluşturduğu tazminat kontrolleri hazırlayın. İdeal olarak, deney tüpleri kullanılanlar gibi dengeleme kontrol için aynı antikorları kullanır. Bu mümkün değilse Ancak, son derece ifade antijenlere karşı antikorlar yerine aynı florokromu konjuge. </li><li> Yıkama tamponu, 50 ul hücrelerin yeniden süspanse edin ve 1 ul / BrdU antikoru 10 6 hücre ekleyin. Not: diğer spesifik hücre içi antijenlere karşı doğrudan konjüge edilmiş antikorlar da ilave edilebilir. NOT:. Cdc2 için Ser10 üzerinde fosforile histon H3 antikorlar G2 ve M hücreleri arasında ayrım yapmak için kullanılabilir, histon H3 mitoz sırasında Ser10 üzerinde fosforlaştırılır 10 antikorlar, hav hücreleri tespit etmek için kullanılabilir Tyr15 ilgili fosforileE mitoz kararlıdır. 11 </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe hücreleri. </li><li> 5 dakika boyunca 150 x g&#39;de 1 yıkama tampon maddesinin ml&#39;si santrifüj hücreleri ekleyin ve süpernatant atılır. </li></ol></li></ol><ol start="6"><li> Hücre Döngüsü Analizi için Leke DNA <ol><li> Pelet gevşetin ve 7-AAD çözeltisi (0.25 mcg) 20 ul ekleyin. Not: 7-AAD / hücre sabit bir miktarda kullanımı için çok önemlidir. </li><li> Lekeleme tampon maddesi içinde 1 ml içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li></ol></li></ol> Sitometrisi Verilerin 5. Koleksiyonu Not: Kullanılan fluorochromes sayısı ve niteliğine bağlı olacaktır gerekli makine. <ol><li> Aşağıdaki parametreler toplamak: FSC A, SSC-A, FSC lH doğrusal bir ölçek üzerinde ve 7-AAD floresan (FSC W yerine FSC H kullanılabilir). Bir günlük ölçeğinde APC kanalı toplayın. Bir günlük ölçeği kullanılarak yüzey veya iç etiket değerlendirilmesi için gerekli herhangi bir ek kanallar toplayın. </li><li> Com gerçekleştirinörnekleri analiz etmeden önce farklı fluorochromes arasında gözlenen emisyon spektrumları sinyalleri örtüşen Telafisi. Not: Çoğu akış sitometrelerinde otomatik olarak gerçekleştirecektir. </li><li> Her bir numune için en azından 10,000 olayları toplayın. </li></ol> Sitometrisi Verilerin 6. Analizi Not: Veri analizi, ancak diğer yazılım paketleri de kullanılabilir sitometri FlowJo akışı için bu çalışmada kullanılmıştır. Ayırıcı stratejisi, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. <ol><li> FSC-A ve SSC-A parametreleri kullanılarak canlı hücre popülasyonu tanımlayın. </li><li> Bu nüfus içinde çiftleri ve (burada da kullanılabilir FSC-W) FSC-A ve FSC-H kullanılarak agrega dahil değildir. </li><li> Bu nüfusun içinde y ekseni üzerinde x-ekseni ve BrdU-APC 7-AAD kullanarak nokta arsa ayarlayın. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52840/52840fig1highres.jpg" width="700" /> Şekil 1: Yolluk Strateji Sol pa.nel: ungated hücreler SSC-A nokta arsa vs FCS-A gösterilir. canlı hücre popülasyonu gösterilen kapısı ile tanımlanır. Merkez paneli: sol panelden Geçitli hücreler FSC-H nokta arsa (yerine yüksekliği kullanılabilir FSC-W) vs FSC-A gösterilir. Ikilileri ve agrega tespit ve gösterilen kapısı ile dışlanır. Sağ paneli: orta panelinde ikili dışlama tarihinden itibaren Geçitli hücreler APC-bir nokta arsa vs 7-AAD gösterilir. BrdU antikoru APC darbe etiketleme sırasında BrdU dahil hücrelerin tanımlanmasına imkân ile etiketlenir. 7-AAD DNA içeriği hakkında bilgi verir. Üst geçit BrdU darbe, sol alt kapısı, hücrelerde G 0/1 ve G olanlar sağ alt geçidin zamanında S fazında nedenle BrdU pozitif ve hücreleri tanımlar / M 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52840/52840fig1highres.jpg" target="_blank">Bir görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın büyük bir sürümü.</a> <ol start="4"><li> Hücre Döngüsü A<html> nalysis <ol><li> Ikili dışlama kapısı hücreler üzerinde ilk veri dosyası ve kapıyı açın. </li><li> (Flojo yazılımında platformlarda altında bulunur) hücre döngüsü dağıtımı için bu nüfusu analiz ve Dean-Jett-Fox modeli kullanın. </li><li> G 0/1 ve G kapıları oluşturmak kullanarak 2 / M zirveleri konumlarını edinin. </li><li> BrdU pozitif hücrelerin ve konuyla ilgili Kapısı aynı hücre döngüsü analizi bu nüfus. </li><li> Oluşturmak kapıları aynı kapıları uygulanması ve G 0/1 ve G 2 / M zirveleri pozisyonları için (yaratılmış kapıları kullanarak) kısıtlamaları ayarlayarak G 0/1 ve G 2 / M zirveleri için pozisyonları sağlayın. Bu durum, Şekil 2&#39;nin birinci 2 panel gösterilmiştir. Not: Diğer yazılım aynı zamanda verileri analiz etmek için kullanılabilir ve talimatlar buna göre değişecektir. </li></ol></li></ol>840 / 52840fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 700 &quot;/&gt; Şekil 2:. Hücre Döngüsü İlerleme ilk panel (Tüm Hücreler) ikili dışlama kapısı tarafından tanımlanan hücre popülasyonu üzerinde işlenir. Bu popülasyon, X ekseni üzerindeki 7-AAD içeren bir histogramda gösterilen edildi. G 0/1 pikin tepe ekseninin altında bir okla gösterilir. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi daha sonra paneller BrdU pozitif hücreler kapılanmış edilmiştir. Çiftler dışlama kapısının yolluk elde edilen G 0/1 pozisyonda değeri FlowJo hücre döngüsü yazılım içinde BrdU pozitif kapılanmış hücrelerin uygulanır. Şekil 1, ilk iki panel de gösterildiği gibi, tüm nüfus analizinde elde edilen değere göre G 0/1 tepe pozisyonda gösterildiği gibi, her bir takip eden paneli BrdU pozitif popülasyonu üzerinde geçirilen edildi. Aynı samp BrdU pozitif hücrelerin G 0/1 nüfus yerini belirlemek için BrdU negatif kısmını kullanmale örnekler arasındaki DNA leke yoğunluğunda herhangi küçük farklılıklar için kontrol eder. Her panelde gösterilen numara BrdU darbe sona ermesinden bu yana zamanı temsil eder. Hesaplanan hücre döngüsü fazları gölgeli yeşil gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52840/52840fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<ol>
	<li>Banfalvi, G., Banfalvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods Mol Biol. 761, 1-23 (2011).</li><li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression.">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132, 487-498 (2008).</li><li>Harper, J. W., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+damage+response:+ten+years+after.">The DNA damage response: ten years after.</a> Molecular Cell. 28, 739-745 (2007).</li><li>Latt, S. A., George, Y. S., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+bromodeoxyuridine-substituted+cells+stained+with+33258+Hoechst.">Flow cytometric analysis of bromodeoxyuridine-substituted cells stained with 33258 Hoechst.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 25, 927-934 (1977).</li><li>Gratzner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+to+5-bromo-+and+5-iododeoxyuridine:+A+new+reagent+for+detection+of+DNA+replication.">Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication.</a> Science. 218, 474-475 (1982).</li><li>Carayon, P., Bord, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+DNA-replicating+lymphocyte+subsets+using+a+new+method+to+label+the+bromo-deoxyuridine+incorporated+into+the+DNA.">Identification of DNA-replicating lymphocyte subsets using a new method to label the bromo-deoxyuridine incorporated into the DNA.</a> Journal of Immunological Methods. 147, 225-230 (1992).</li><li>Gonchoroff, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-phase+detection+with+an+antibody+to+bromodeoxyuridine.+Role+of+DNase+pretreatment.">S-phase detection with an antibody to bromodeoxyuridine. Role of DNase pretreatment.</a> Journal of Immunological Methods. 93, 97-101 (1986).</li><li>Rabinovitch, P. S., Torres, R. M., Engel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+cell+cycle+analysis+and+two-color+surface+immunofluorescence+using+7-amino-actinomycin+D+and+single+laser+excitation:+applications+to+study+of+cell+activation+and+the+cell+cycle+of+murine+Ly-1+B+cells.">Simultaneous cell cycle analysis and two-color surface immunofluorescence using 7-amino-actinomycin D and single laser excitation: applications to study of cell activation and the cell cycle of murine Ly-1 B cells.</a> Journal of Immunology. 136, 2769-2775 (1986).</li><li>Saunders, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAD001+(everolimus)+induces+dose-dependent+changes+to+cell+cycle+regulation+and+modifies+the+cell+cycle+response+to+vincristine.">RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine.</a> Oncogene. 32, 4789-4797 (2013).</li><li>Hendzel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis-specific+phosphorylation+of+histone+H3+initiates+primarily+within+pericentromeric+heterochromatin+during+G2+and+spreads+in+an+ordered+fashion+coincident+with+mitotic+chromosome+condensation.">Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation.</a> Chromosoma. 106, 348-360 (1997).</li><li>Draetta, G., Beach, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+cdc2+protein+kinase+during+mitosis+in+human+cells:+cell+cycle-dependent+phosphorylation+and+subunit+rearrangement.">Activation of cdc2 protein kinase during mitosis in human cells: cell cycle-dependent phosphorylation and subunit rearrangement.</a> Cell. 54, 17-26 (1988).</li><li>Saunders, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAD001+(everolimus)+induces+dose-dependent+changes+to+cell+cycle+regulation+and+modifies+the+cell+cycle+response+to+vincristine.">RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine.</a> Oncogene. , (2012).</li><li>Knudsen, R. C., Ahmed, A. A., Sell, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+microassay+for+lymphotoxin+using+microculture+plates+and+the+multiple+automated+sample+harvester.">An in vitro microassay for lymphotoxin using microculture plates and the multiple automated sample harvester.</a> Journal of Immunological Methods. 5, 55-63 (1974).</li><li>Beck, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+kinetics+of+perturbed+cell+populations+determined+by+the+bromodeoxyuridine-33258+technique:+radiotoxic+effects+of+incorporated+[3H]thymidine.">Proliferation kinetics of perturbed cell populations determined by the bromodeoxyuridine-33258 technique: radiotoxic effects of incorporated [3H]thymidine.</a> Cytometry. 2, 170-174 (1981).</li><li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node.">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li><li>Collins, J. M., Berry, D. E., Bagwell, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+rates+of+DNA+synthesis+during+the+S+phase+of+log+phase+HeLa+S3,+WI-38,+and+2RA+cells.">Different rates of DNA synthesis during the S phase of log phase HeLa S3, WI-38, and 2RA cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 255, 3585-3590 (1980).</li><li>Schwarting, R., Gerdes, J., Niehus, J., Jaeschke, L., Stein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+growth+fraction+in+cell+suspensions+by+flow+cytometry+using+the+monoclonal+antibody+Ki-67.">Determination of the growth fraction in cell suspensions by flow cytometry using the monoclonal antibody Ki-67.</a> Journal of Immunological Methods. 90, 65-70 (1986).</li><li>Danova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle-related+proteins:+a+flow+cytofluorometric+study+in+human+tumors.">Cell cycle-related proteins: a flow cytofluorometric study in human tumors.</a> Biology of the Cell. 64, 23-28 (1988).</li><li>Juan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3+phosphorylation+and+expression+of+cyclins+A+and+B1+measured+in+individual+cells+during+their+progression+through+G2+and+mitosis.">Histone H3 phosphorylation and expression of cyclins A and B1 measured in individual cells during their progression through G2 and mitosis.</a> Cytometry. 32, 71-77 (1998).</li><li>Langan, T. J., Chou, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+mammalian+cell+cultures+by+serum+deprivation.">Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation.</a> Methods in Molecular Biology. 761, 75-83 (2011).</li><li>Kues, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+synchronization+of+porcine+fetal+fibroblasts:+effects+of+serum+deprivation+and+reversible+cell+cycle+inhibitors.">Cell cycle synchronization of porcine fetal fibroblasts: effects of serum deprivation and reversible cell cycle inhibitors.</a> Biology of Reproduction. 62, 412-419 (2000).</li><li>Urbani, L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+nuclear+and+cytoplasmic+cell+cycle+progression+by+drugs+employed+in+cell+synchronization.">Dissociation of nuclear and cytoplasmic cell cycle progression by drugs employed in cell synchronization.</a> Experimental Cell Research. 219, 159-168 (1995).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hücre döngüsü analiz yeteneği kanseri biyoloji anlaşılması ve hücre çoğalmasını ve büyümesini etkileyen iki ilaç ve gen hareket mekanizması için çok önemlidir. Bildirildi hücre çoğalmasını ölçmek deneylerinde bir sayıda olsa da, çoğunluğu sadece Halen mevcut hücreleri gösteren bir ölçü sağlar. Bu doğrudan görselleştirme ve sayma, metabolik aktivite veya ATP konsantrasyonu ile hücre sayısını ölçmek deneyleri içermektedir. Bu yöntemlerin çoğu temel avantajı, koşullar ya ...

hücre döngüsü ilerlemesi sırasında hücre döngüsü özellikleri ve hücrelerde meydana gelen değişikliklerin değerlendirilmesi biyolojisi, özellikle kanser biyolojisi birçok yönünü anlamak için esastır. Malignitelerin tedavisi için geliştirilmesinde bir çok madde, hücre döngüsü ilerlemesi üzerinde derin etkilere sahip ya da hücre devre bağımlı-mekanizmalar yoluyla hücre ölümüne neden olmaktadır. Hücre döngüsünün belirli fazında hücre döngüsü dinamikleri veya hücreleri incelemek için, bu hücrelerin senkronize olağandır. Ancak senkronizasyon yöntemleri potansiyel sonuçlar elde karıştırıcı, çalışılan hücreleri üzerinde zararlı etkileri olabilir. 1 zamanla tek hücrelerde hücre döngüsü ilerlemesinin son hücrelerin döngüsünün belirli aşamalarında sadece mevcut floresan isim levhası proteinlerin kullanılmasına izin var analizi 2, bununla birlikte, bu hücreler, genetik olarak okunabilir sistemlere kullanımlarını sınırlayan, bu etiketlenmiş proteinlerin sentezlenmesi için manipüle edilmesi ihtiyacı incelenecekily elde etti. (S) faz DNA çoğaltılır ve mitoz (M) burada hücre bölünmesi gerçekleşir: hücre döngüsü, iki aktif aşamadan oluşmaktadır. Bu fazlar, üç boşluk fazlar, G 0, G1 ve G2 ile ayrılır. Hücreler boyutu önceden hücre büyümesi DNA replikasyonu tamamlanması arasındaki fakat hücre bölünmesi öncesinde devam DNA replikasyonu ve G 2 artırmak nerede G 0 ya da sessizlik, hücre döngüsünü terk etti bir dinlenme aşamasıdır, G 1&#39;dir. hücre döngüsü yoluyla ilerleme kontrol noktaları bir dizi tarafından kontrol edilir. Çevre koşulları, DNA sentezinin destekleyici değildir ve S fazına girişi önler G 1 kapısı aktive edilir. içi S fazı kapısı veya gecikme durdu çoğaltma çatal yol açabilir DNA hasarı ile tetiklenebilir. Hasar G 2 sonra tespit edilirse G 2 Sırasında çoğaltılan DNA sadakat onaylanır ve </sub&gt; Denetim noktası bölümü hücre DNA tamir önce izin aktive edilir. Mitoz sırasında son bir kontrol noktası o hücre bölünmesi başarıyla tamamlandı böylece kromatidler doğru mitotik plakada hizalanmış olduğunu garanti eder. Bu kontrol noktalarında 3 aktivasyonu yaygın hücre popülasyonlarının eşitlemek için kullanılır. Hücre döngüsü kontrol noktası, bir dizi faktöre göre ancak en yaygın DNA hasarının tespiti, Kanser biyolojisinde etkinleştirilebilir. DNA hasar cevabı (ATR) ile ilgili PI3-kinaz benzeri kinazlar ataksi telenjiektazi ve RAD3 tarafından başlatılan ve ataksi telenjiektazi (ATM) sırasıyla aşağı efektör kinazları CHK1 ve Chk2 aktive olduğu mutasyona uğramış. 3 olaylar bir dizi durdu dahil CHK1 aktive çoğaltma çatal, DNA çapraz bağlarının ve ultraviyole radyasyon hasarı Chk2 öncelikle çift iplikli kırılmalara tarafından aktive ediliyor. hücre döngüsü i uzunluğuna değiştirilmiş koşullarının etkisini incelemek için her zamanki yöntemis hücre döngüsü belirli bir aşamasında hücreleri senkronize etmek. 1. Bu çeşitli yöntemler ile elde edilebilir. Hücreler fiziksel boyutu, yoğunluk, yan dağılım (parçalı) ve hücre yüzey ifadesi belirteçleri dayalı ayrıştırılır edilebilir. Daha pratik hücreleri kimyasal yollarla senkronize edilebilir. Örneğin timidin, hidroksiüre ve sitosin arabinosid gibi çeşitli ajanlar ajanlar çıkarıldıktan sonra bisiklet devam S fazında hücrelerin birikimiyle sonuçlanır hücre döngüsünün S fazında DNA sentezini inhibe etmek için de kullanılabilir. Veya M-fazı DNA içeriğinin - Hücreler G 2 mitotik iğ oluşumunu tutuklama önler nokodazolun ile işlemden geçirildi. G 0 aşamasında hücrelerin birikimi kültür ortamı sonuçlarından serum ortadan kaldırılması. kültür, serum içindeki besinlerin yeniden eklenmesi hücrelerinin normal bisiklet yeniden başlatır. Ancak, bu senkronizasyon yöntemlerinin tüm hücrelerin normal bisiklet ve büyüme ile müdahale ve resul edebilirsinizönemli bir hücre ölümü t. Akut lenfoblastik lösemi hücrelerinin Senkronizasyon özellikle zor olduğu ve bu hücreler genetik manipülasyon için uygun değildir. Burada tarif edilen yöntem, hücre döngüsü dinamiklerinin değerlendirme ve geleneksel senkronizasyon veya genetik değişiklik yapılmadan hücre döngüsünün belirli aşamalarında hücreleri çalışmasına izin verir. Bu yöntem, aynı zamanda genetik modifikasyon ve geleneksel senkronizasyon işlemleri kolayca elde olmayan diğer hücre türleri için yararlı olabilir. yöntem hücrelerin kısa vadeli büyüme ve çoğalması üzerinde çok az etkiye sahiptir bromodeoksiüridin (BrdU) Kuruluş, uzun kurulan kullanımına dayanmaktadır. 4 Kuruldu BrdU protokolleri S fazında yeni sentezlenmiş DNA içine BrdU dahil yararlanmak . Bu kalıcı BrdU maruziyeti sırasında S fazında yapılmış olan olarak hücreleri işaretler. Bu popülasyon BrdU incorpor için boyama daha sonra zaman noktalarında tespit edilebilirtirme ve böylece takip ve hücre döngüsü transit uyuşturucu etkileri çalışma izin zamanla değerlendirilebilir senkronize nüfus olarak hareket ederler. BrdU genellikle DNase veya asit tedaviden sonra elde önce antikor boyama maruz kalması gerekir. 6,7 dahil BrdU ek markörler dahil sağlayan tespit etmek için akış sitometrisi kullanılarak. En önemli çalışma başlangıcında S fazında olan hücrelerin, hücre döngüsü faz dağılımının değerlendirilmesini sağlayan DNA içeriğini ölçmek için boyalar kullanılmasıdır. 8 Ayrıca ek yüzey ya da hücre içi antijenler de incelenebilir. 9 Bu Böyle Ki67 gibi hücre döngüsü olaylarla ilgili ya da bölünmüş kaspaz-3 gibi apoptoz belirteçlerinin olarak görünüşte ilgisiz hücre özellikleri olabilir. potansiyel uygulamalar araştırmacı hayal gücü ile sınırlıdır.

<table><tbody><tr><td>APC BrdU Flow Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>552598</td><td>Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm&lt;br/&gt; Buffer (referred to as Fixation Buffer)</td></tr><tr><td>BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus</td><td>BD Biosciences</td><td>561651</td><td>Referred to as Permeabilization buffer</td></tr><tr><td>BD Perm/Wash Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>554723</td><td>Referred to as Wash buffer</td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>D-4513</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 12 x 75&amp;nbsp;mm FACS tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen Stain Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>554656</td><td></td></tr><tr><td>BD LSR FORTESSA flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>FORTESSA</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman</td><td>Gilson</td><td>P2, P20, P100, P1000</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1,640 w/o L-Gln 500 ml</td><td>Lonza</td><td>12-167F</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>FisherBiotec</td><td>FBS-7100113</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G7513-100ML</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-2&amp;prime;-deoxyuridine</td><td>Sigma</td><td>B5002-1G</td><td></td></tr><tr><td>Falcon TC 150&amp;nbsp;cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; vented Flasks</td><td>BD Biosciences</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes 25&amp;nbsp;ml</td><td>Greiner</td><td>760180</td><td></td></tr><tr><td>Aersol Pipettes 200&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Interpath</td><td>24700</td><td></td></tr><tr><td>Aersol Pipettes 1&amp;nbsp;ml</td><td>Interpath</td><td>24800</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Spintron</td><td>GT-175R</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Binder</td><td>C 150</td><td></td></tr><tr><td>AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody</td><td>Cell Signalling</td><td>9708S</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb</td><td>Cell Signalling</td><td>2197S</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb</td><td>Cell Signalling</td><td>2348S</td><td></td></tr><tr><td>NALM6&amp;nbsp;</td><td>DSMZ</td><td>ACC-128</td><td></td></tr></tbody></table>

temporal tracking of cell cycle progression using flow cytometry without the need for synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

Bu yöntem, bir dizi bilgi elde etmek için kullanılabilir. Birkaç uygulamalar burada özetlenmiştir. Hücre döngüsü süresinin değerlendirilmesi Hücre döngüsü yoluyla transit hücreleri için gerekli süreyi belirlemek için, hücreler BrdU darbe sonra çeşitli zaman noktalarında toplanır. değerlendirmeler arasındaki aralıklar analiz edilmekte olan özel hücrelere uyarlanabilir. Hematopoietik hücre hatları, standart kültür koşulları altı...

Watch this Scientific Journal Video about Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization at JoVE.com

Senkronizasyona Gerek Olmadan Akış Sitometrisi Kullanılarak Hücre Döngüsü İlerlemesinin Geçici Takibi | Biyoloji | Video

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Bu protokol, zaman içinde belirli bir noktada S fazında olan hücrelerin zamansal izleme izin vermek için bromodeoksiüridin (BrdU) alımından kullanımını tarif eder. DNA boyalar ve antikor etiketleme eklenmesi daha sonraki zamanlarda S fazı hücrelerinin kaderi detaylı analizini kolaylaştırır.

Senkronizasyon Need for olmadan Akım Sitometri Kullanımı Hücre Döngüsü ilerleme zamansal İzleme

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

temporal-tracking-cell-cycle-progression-using-flow-cytometry-without

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Cellular Processes

Cell Cycle and Division

SCIENTISTS IN ACTION

19.1K Görüntüleme.  Westmead Millennium Institute for Medical Research and University of Sydney.  Bu protokol, zaman içinde belirli bir noktada S fazında olan hücrelerin zamansal izleme izin vermek için bromodeoksiüridin (BrdU) alımından kullanımını tarif eder. DNA boyalar ve antikor etiketleme eklenmesi daha sonraki zamanlarda S fazı hücrelerinin kaderi detaylı analizini kolaylaştırır. 

Video: Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such as cancer. Cell cycle-regulated gene expression analysis depends on cell synchronization into specific phases. Here we describe a method utilizing two complementary synchronization protocols that is commonly used for studying periodic variation of gene expression during the cell cycle. Both procedures are based on transiently blocking the cell cycle in one defined point. The synchronization protocol by hydroxyurea (HU) treatment leads to cellular arrest in late G1/early S phase, and release from HU-mediated arrest provides a cellular population uniformly progressing through S and G2/M. The synchronization protocol by thymidine and nocodazole (Thy-Noc) treatment blocks cells in early mitosis, and release from Thy-Noc mediated arrest provides a synchronized cellular population suitable for G1 phase and S phase-entry studies. Application of both procedures requires monitoring of the cell cycle distribution profiles, which is typically performed after propidium iodide (PI) staining of the cells and flow cytometry-mediated analysis of DNA content. We show that the combined use of two synchronization protocols is a robust approach to clearly determine the transcriptional profiles of genes that are differentially regulated in the cell cycle (i.e. E2F1 and E2F7), and consequently to have a better understanding of their role in cell cycle processes. Furthermore, we show that this approach is useful for the study of mechanisms underlying drug-based therapies (i.e. mitomycin C, an anticancer agent), because it allows to discriminate genes that are responsive to the genotoxic agent from those solely affected by cell cycle perturbations imposed by the agent.

We report two cell synchronization protocols that provide a context for studying events related to specific phases of the cell cycle. We show that this approach is useful for analyzing the regulation of specific genes in an unperturbed cell cycle or upon exposure to agents affecting the cell cycle.

Hücre Çevrimiyle Düzenlenen Gen İfadesini İki Tamamlayıcı Hücre Senkronizasyon Protokolü İle Çalışmak

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Genetik

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer treatments as used in clinical oncology. It enables a quantitative and longitudinal analysis of the DNA damage response after genotoxic stress, as induced by radiotherapy and a multitude of anti-cancer drugs. The method covers all stages of the DNA damage response, providing endpoints for induction and repair of DNA double-strand breaks (DSBs), cell cycle arrest and cell death by apoptosis in case of repair failure. Combining these measurements provides information about cell cycle-dependent treatment effects and thus allows an in-depth study of the interplay between cellular proliferation and coping mechanisms against DNA damage. As the effect of many cancer therapeutics including chemotherapeutic agents and ionizing radiation is limited to or strongly varies according to specific cell cycle phases, correlative analyses rely on a robust and feasible method to assess the treatment effects on the DNA in a cell cycle-specific manner. This is not possible with single-endpoint assays and an important advantage of the presented method. The method is not restricted to any particular cell line and has been thoroughly tested in a multitude of tumor and normal tissue cell lines. It can be widely applied as a comprehensive genotoxicity assay in many fields of oncology besides radio-oncology, including environmental risk factor assessment, drug screening and evaluation of genetic instability in tumor cells.

The presented method combines the quantitative analysis of DNA double-strand breaks (DSBs), cell cycle distribution and apoptosis to enable cell cycle-specific evaluation of DSB induction and repair as well as the consequences of repair failure.

ΓH2AX ve Apoptosis'in Genotoksik Stres sonrası Akış Sitometrisi ile Hücre Döngüsüne Özgü Ölçümü

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Kanser Araştırmaları

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, senescence is a fundamentally different machinery restraining&#160;propagation of cancer cells. Decades of scientific studies have revealed the complex pathological effects of senescent cancer cells in tumors and microenvironments that modulate cancer cells and stromal cells. New evidence suggests that senescence is a potent prognostic factor during cancer treatment, and therefore rapid and accurate detection of senescent cells in cancer samples is essential. This paper presents a method to visualize and detect therapy-induced senescence (TIS) in cancer cells. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) cell lines were treated with mafosfamide (MAF) or daunorubicin (DN) and examined for the senescence marker, senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the DNA synthesis marker 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU), and the DNA damage marker gamma-H2AX (&#947;H2AX). Flow cytometer imaging can help generate high-resolution single-cell images in a short period of time to simultaneously visualize and quantify the three markers in cancer cells.

Here we present a flow cytometry-based method for visualization and quantification of multiple senescence-associated markers in single cells.

Tedaviye Bağlı Yaşlanan Kanser Hücrelerinde Çoklu Floresan Yaşlanma Belirteçlerinin Eşzamanlı Görüntüleme ve Akış Sitometrisine Dayalı Tespiti

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

Hücre Döngüsü FRET oranlı metrik sayesinde Kinaz ve Fosfataz Aktiviteleri İzleme

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Biyoloji

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

Metabolik Etiketleme ve Flow Sitometri ile Hücre Döngüsü İlerleme Kinetik Ölçüm

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Cep Takip Boyalar kullanarak Hücre Bölünmesi İzleme için optimize Boyama ve Çoğalma Modelleme Yöntemleri

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Few techniques can assess phenotype and fate for the same cell simultaneously. Most of the current protocols used to characterize phenotype, although able to generate large datasets, necessitate the destruction of the cell of interest, making it impossible to assess its functional fate. Heterogeneous biological differentiating systems like hematopoiesis are therefore difficult to describe. Building on cell division tracking dyes, we further developed a protocol to simultaneously determine kinship, division number, and differentiation status for many single hematopoietic progenitors. This protocol allows the assessment of the ex vivo differentiation potential of murine and human hematopoietic progenitors, isolated from various biological sources. Moreover, as it is based on flow cytometry and a limited number of reagents, it can quickly generate a large amount of data, at the single-cell level, in a relatively inexpensive manner. We also provide the analytical pipeline for single-cell analysis, combined with a robust statistical framework. As this protocol allows the linking of cell division and differentiation at the single-cell level, it can be used to quantitatively assess symmetric and asymmetric fate commitment, the balance between self-renewal and differentiation, and the number of divisions for a given commitment fate. Altogether, this protocol can be used in experimental designs aiming to unravel the biological differences between hematopoietic progenitors, from a single-cell perspective.

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Presented here is a flow cytometry-based technique that allows for simultaneously measuring the number of cell divisions, surface cell phenotype, and cellular kinship. Those properties can be tested statistically using a permutation-based framework.

Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücreler için Akış Sitometrisi ile Akrabalık, Bölünme Sayısı ve Fenotipin Eşzamanlı Değerlendirilmesi

Few techniques can assess phenotype and fate for the same cell simultaneously. Most of the current protocols used to characterize phenotype, although able ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Cell Cycle Analysis: Assessing CD4 and CD8 T Cell Proliferation After Stimulation Using CFSE Staining and Flow Cytometry

Source: Perchet Thibaut1,2,3, Meunier Sylvain1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,3 
1 Unit for Lymphpoiesis, Department of Immunology, Pasteur Institute, Paris, France 
2 INSERM U1223, Paris, France 
3 Universit&#233; Paris Diderot, Sorbonne Paris Cit&#233;, Cellule Pasteur, Paris, France 
4 Flow Cytometry Platfrom, Cytometry and Biomarkers UtechS, Center for Translational Science, Pasteur Institute, Paris, France
The cell cycle is a universal process of life. During the cell cycle, a cell undergoes several modifications to divide into two daughter cells. This mechanism occurs throughout an organism&#39;s life in response to its needs. Cell divisions and embryonic development produce a full organism from a single-celled zygote. During adulthood, the cell cycle is central to many critical biological processes, such as tissue repairs.
Mechanisms of cell division are tightly controlled events where the cell undergoes stepwise modifications before final division. Cells that are not yet in the cycle are described as being in the Gap 0 (G0) phase. During this stage the cell is considered quiescent. When the cell starts to cycle, four distinct phases are recognized: Gap 1 (G1), Synthesis (S), Gap 2 (G2) and Mitosis (M). G1 phase is a checkpoint for resources needed by the cell for DNA synthesis. Then, S phase occurs, and DNA replication starts, followed by the G2 interphase, another checkpoint that controls all elements necessary to for the cell to divide. Finally, the cell enters mitosis and divides into two daughter cells.
Cell division is a highly informative parameter in many different biological systems. In the field of immunology, analysis of leukocyte proliferation can indicate the mechanism of the immune response. Other domains of investigation also rely on cell cycle analysis. For instance, analysis of the cell cycle during tumor development has improved our understanding of cancer.
Many fluorescent dyes are now available for tracking cell proliferation. These dyes differ in their chemical and spectral properties. Two different classes of dyes exist: protein dyes permanently combine with protein by forming a covalent bond, and membrane dyes stably intercalate within cell membranes via strong hydrophobic associations. In vitro and in vivo studies of immune cell proliferation by flow cytometry are among the most common applications of both classes of cell tracking dyes (1, 2).
CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester) is a fluorescent dye that marks dividing cells. Initially, all the cells receive the same amount of dye; dividing cells evenly split the dye they received between their two daughter cells. Consequently, the cell cycle can be followed by the progressive decrease of dye intensity in the cells. CFSE staining is followed by conventional multi-parametric flow cytometry, a high-throughput, fluorescence-based technology that allows phenotypic and functional characterization of cells based on their degree of CFSE staining (3).
In the following experiment, we assess the proliferation of CD4+ and CD8+ T cells in-vitro, following CD3 stimulation, using CFSE staining and flow cytometry.

Cell Cycle Analysis: Assessing CD4 and CD8 T Cell Proliferation

Source: Perchet Thibaut1,2,3, Meunier Sylvain1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,3
1 Unit for Lymphpoiesis, Department of Immunology, Pasteur ...

JoVE Science Education

İleri Biyoloji

İmmünoloji

Bromodeoxyuridine Pulse Labelling Assay: A Technique to Measure Cell Proliferation

Source: Welschinger R. et al. <a href="https://www.jove.com/t/52840">Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization.</a> J. Vis. Exp. (2015)
The video describes the stepwise pulse labeling assay of mammalian cells with bromodeoxyuridine (BrdU) for measuring cell proliferation. The BrdU uptake permits the temporal tracking of cells that were in the synthesis phase at a specific point in time, without requiring the cells to be synchronized.

Bromodeoksiüridin Nabız Etiketleme Testi: Hücre Proliferasyonunu Ölçmek İçin Bir Teknik

Source: Welschinger R. et al. Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization. J. Vis. Exp. (2015)
...