Biz çizimler ile yardım için erken giriş ve Ilya Aylyarov için flow sitometri, Dr Purnima Jaiswal ve Dr Di Wu ile yardım Dr R. Michael Sramkoski ederim. NIH hibe R01GM089872 ve Sitometri &amp; Vaka Kapsamlı Kanser Merkezi (P30 CA43703) görüntülenmesi Mikroskopi Çekirdek Tesisi tarafından desteklenir.

1. Haploid Hücre Büyümesi <ol><li> S. büyütün standart koşullar altında 10 S288C plan (BY4741) den cerevisiae hücreleri. </li><li> İki göze floresan işaretleri 10 ya ifade etmek haploidlerin Transform. Seçim marker mCherry (A. Johnston pAJ1661, URA3/CEN,) ile kaynaşmış sitoplazma içerisinde ifade edilen çözünür GFP (BgII 11 ile doğrusallaştırılmış pEG220, URA3/YIp,) ve tek bir ribozomal protein, RPL25 vardır. Biz eşdeğer iki renkli arıtma protokolü haploit ebeveyn hücreler tarafından sentezlenir diğer parlak floresan proteinleri yararlanabilece bekliyoruz. Alternatif olarak, hücre duvarı floresan ile etiketlenmiş lektinler olabilir. </li><li> Günden önceki zigot arınma, her hücre tipi, 5 ml kültür aşılamak ve ° C 1.0 geçmeyen A600 ulaşmak için 23 gecede sallayarak onları büyümek. % 2 glukoz (CSM-glikoz) bir de dahil olmak üzere tam sentetik ortamda GFP transformantlar (ATY4442) büyümekurasil 10 eksik sentetik seçici ortamda nd RPL25-mCherry transformantlar (ATY4552). Oda sıcaklığında çalkalanarak her bir hücre tipinde paralel kültürleri koruyun. </li></ol> 2. Bir Çapraz İletken <ol><li> Taze ortamda 1,0 her numunenin optik yoğunluk (A600) ayarlayın. [1 Optik Yoğunluk Birim ~ 3 x 10 7 hücre / ml] </li><li> 10 sn için bir uzun vorteks sonra kısaca iki kültür, vorteks 3 kez, eşit hacimleri karıştırın. </li><li> CSM-glukoz tabak hazırlayın. Plakalar rutin büyüme için kullanılan ile aynıdır ve 45 dakika sonra dökme ve agar 10 katılaşma kurutuldu edilmiştir. </li><li> CSM-glikoz levhaların yüzeyine kenarından karışım 1 cm kadar yirmi 40 ml damlacıkları dağıtın. Damlacıkları birinci yüzeye tatbik edildiğinde süresi geçtikten ölçmek için zamanlayıcı başlar. Sıvı (yaklaşık 30 dakika) absorbe edildikten sonra, plakaları kaplamak ve roo az rahatsız bırakınm sıcaklığı. </li></ol> 3. Hasat Hazırlıklar <ol><li> Hasat örnekleri 23 1,75-2,5 saat sonra ° C art arda buz üzerinde plaka tutarak, 150 ml soğuk CSM-glikoz kullanılarak plaka bireysel kurutulmuş damlacıkları yıkama. Defalarca kurtarma maksimize etmek için aynı orta damlacık alanı 10-20 kez yıkayın. Buz üzerinde 15 ml Falcon tüpleri içinde toplayın. </li><li> Buz üzerinde bir Fisher FB120 sonikatör (120Volt 120Watt, Frekans 20KHz) ile% 60 genlikte örnekleri 10x sonikasyon kontrol edin. </li><li> Az veya hiç agrega kalması bir faz mikroskop doğrulayın. Hücrelerin% 15-50 oranında bu noktada zigot oluşmuş bekleniyor. </li><li> Diğer bir önlem (agrega yerleşmeye izin vermek için) ve 10 dakika süreyle buz üzerinde rahat bir dikey pozisyon içinde hücrelerin tüp bırakın. </li><li> Hacim üstteki% 90 kurtarın ve bir naylon örgü (BD Falcon Polipropilen boru süzgeç başlığı (Ref 352235) ile) aracılığıyla filtre. Tipik bir deneme, 10 7 hücreleribir levha geri kazanılır CSM-glikoz 4 mL seyreltik bu noktada edildi. </li></ol> 4. Akış Sitometri <ol><li> 100 mikron ucu ile Sony iCyt Yansıma Modeli Akış Sitometresi, (Highly Otomatik Paralel Sıralama) HAPS1 göre sırala hücreleri. GFP uyarım için, mavi argon-iyon, 488 nm&#39;de 250 milimetrelik lazer kullanmak. MCherry uyarma için, 561 nm&#39;de 100 milimetrelik lazer kullanır. Biz diğer makineleri ile deneyimi yok, ancak biz doğru lazerler ile donatılmış olduğunda Becton Dickinson FACSAria, Becton Dickson akını ya Beckman Coulter MoFlo XDP iyi olacağını bekliyoruz. </li><li> Baz canlı hücreler üzerinde kapısı için bir ileri vs geri scatter plot ilgili parametreleri sıralama. 615 bir emisyon arsa Kurmak + / - 30 nm bandpass (mCherry) karşı 525 + / - 25 nm bandpass (GFP) dört parçaya bölünür olayları bölmek için, &quot;Kırmızı + Yeşil&quot;, &quot;Kırmızı + Yeşil +&quot;, &quot;Kızıl- Yeşil &quot;ve&quot; Kırmızı-Yeşil + &quot;(Şekil S2). Standart bir f nonfluorescent hücreleri kullanınveya &quot;Kırmızı-Yeşil-&quot; kadranda belirlenmesi. </li><li> 21.5 psi arasında bir basınç kılıf, 43.400 damla / sn bir damlacık sıklığı ve 20.5 psi arasında bir basınç ile örnek kriteri hücreleri. </li><li> İlk sırala (&quot;Kurtarma Modu&quot;): CSM-glukoz soğuk 250 ml içeren soğutulmuş Eppendorf tüpleri içine numunelerini. Bir soğuk mikrofuge&#39;de üst hızı (Tomy MRX-150, 15.000 rpm) Sediment 10 sn ve akış çözümü (Flow sitometri kılıf çözümü (1 mM EDTA ile PBS) BioSure Katalog No 1027) aspire. 500 ml soğuk CSM-glukoz süspanse edin. </li><li> İkinci sırala (&quot;Saflık Modu&quot;): &quot;saflık modu&quot; seçeneğini kullanarak, ilk sıralama için de sıralama yürütün. Tortu hücreler saflaştırılmış ve 500 ml 1.0 ml CSM-glikoz olarak pelet tekrar süspansiyon. Metabolik iyileşme sağlamak için 23 ° C&#39;de 24 oyuklu plakalar içinde 15 dakika süreyle çalkalanır. </li></ol> 5. DeltaVision Mikroskopi <ol><li> Aşağıdaki gibi agaroz pedleri hazırlayın: (ultra saf% 1.5 agaroz bir süspansiyon getirmekAgaroz, Invitrogen, sonra kaynatın CSM-glikoz Katalog # 15510-07), vorteks kısa ve yatay standart cam slaytların yüzeyine agaroz çözüm 0.3 ml örnek uygulamak ve ikinci bir slayt seferde onlara kapak (olmadan ) basınç uygulayarak. </li><li> 10 dakika süreyle soğutulduktan sonra, yavaşça, yatay kaydırarak üst slaytı kaldırmak pürüzsüz bir yüzey bırakmak bakımı ve Agaroz tabaka rahatsız değil. (Üst kayar kaldırıldı, hücreler ve örnek 1-2 dakika içinde uygulanabilir. Üst slaydı çıkarmadan, oda sıcaklığında bir nemli bir bölmede tutulur zaman, ped kullanım öncesi bir gün &#39;e kadar saklanabilir.) </li><li> Tortu örnekleri ve mevduat agaroz pedleri üzerinde pelet 1 ml hacimde (yüzeyine dokunmadan). Hemen bir kare No 1 lamel ile örnek kapsar. Tek taraflı bir jilet ile aşırı agaroz uzak kesin. Bir şırınga kalmaması vazelin ile hazırlıklarını mühürleyin. </li><li> Deltavision (Uygulamalı makines kullanarak Görüntü∞ / 0.17/FN26.5); binning olmadan 100x immersiyon yağı objektif (Olympus UPlanApo 100x/1.40 n). </li><li> SoftWoRx 5.0.0 programını kullanarak (z-yığınlar Deconvolve <a href="http://www.api.com/softworx.asp" target="_blank">http://www.api.com/softworx.asp</a> ) ve minimal işleme. Ardışık z-düzlemleri genellikle 0.2-0.4 mikron aralıklarla toplanmıştır. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Dönüştürülmüş haploid hücrelerde floresans şiddeti seviyesi: haploidlerin olarak floresans seviyesini Şekil S1 &#39;de gösterilmiştir. Çapraz, epifluorescent inceleme esasen tüm transformantlar GFP yeşil ve tüm mCherry transformantlar, genellikle sönük rağmen, kırmızı olduğunu göstermiştir önce. Çapraz için kullanılan tüm hücreler gerçekten floresan olduğunu sağlamak için, parlak florasan sinyali ile subpopülasyonu kullanılır. Verim: Aürkiye&#39;de ilk sıralama, Kırmızı + Yeşil + örnek (Şekil S2) genellikle 8-20 hücrelerin giriş sayısının% ve kalıcı hücre-hücre adezyonu nedeniyle belki haploid hücrelerin aşırı sayıda içerir. Yüksek zenginleştirme bir tek tür ile elde edilemediği için, kısmen saflaştırılmış örnek sonda yeniden sıralama ve ardından% 60 genlik az iki sonike olmalıdır. Hücreler Of ikinci sıralama tabi (ikinci sıralama sadece 15 dk. Gerektirir iken, 1-2 saat arasında genellikle son Kurtarma türlü), Kırmızı + Yeşil + örnekleri girişi hücrelerin 23-52% dahildir. Faz mikroskobik inceleme: Sınav faz kontrast mikroskobu ile nihai zigot hazırlık saflığı 21 preparatları (% 86% 91 arasında değişen) üzerinde yaklaşık% 90 ortalama gösterdi. Kirletici birbirleri ile iletişim içinde olan haploidlerin yeşil veya kırmızı haploidlerin veya çift ya da vardı. Şekil 3 sahip zigot yüzde tabulateshayır dostum, medial tomurcukları (Med), lateral tomurcukları (Lat) veya terminal tomurcukları (Dönem), aynı renk eşleştirilmiş haploidlerin numarası (&quot;2Same&quot;) veya farklı renk (&quot;2Hap&quot;), yanı sıra bireysel haploidlerin ( Hap). Hücreler 1.75 saat sonra hasat edildiğinde,% 50&#39;den fazla unbudded edildi ve diğer alt kategoriler (medial, lateral veya terminal tomurcukları) ile eşit temsil edilmiştir. 2.5 saat sonra her dört kategori (unbudded, medial, lateral veya terminal tomurcukları ile) zigot yaklaşık eşit sayıda vardı. Mikroskobik Gözlemler (Şekil 4): Zigotların yapı saflaştırılması sırasında değişmeden kalmasını görünür. Çapraz süresine göre, nüfusu, yukarıda açıklandığı gibi unbudded ve aşılı zigot farklı oranlarda vardı. Yeşil ve kırmızı haploidlerin hem floresan sinyal yoğunluğunda önemli farklılıklar göstermiştir beri Comparin tarafından gözlendiği gibi, diğerleri, ağırlıklı olarak yeşil iken, bazı zigot ağırlıklı olarak kırmızı idig Şekil 4 içinde birleştirilmiş görüntü için tek renkli görüntüler. GFP (MW 26kDa) çekirdeğine girer ve çekirdekleri erimiş olsanız çekirdeğinde bulunabilir unutmayın. Vakuoller siyah floresan olmayan küreler olarak göze çarpıyor. Arıtma sonunda ürün geliştirme çeşitli aşamalarında farklı bir nüfus verir. Zigot Bir uğramadıklarına füzyon etiketli. Tip B zigotlar unbudded edilir. Tip C küçük bir tomurcuk var. Tür büyük bir tomurcuk D ve E Tipi zigot sitokinez geçmesi üzeresiniz. Önceki zigot çoğu hala bir floresan olmayan medial bölümü hattı (*) sergilemek ve vakuoler &quot;devralma yapısı&quot; (I) 12 sıklıkla tomurcuk içine zigottan uzatmak için görülebilir olduğunu da unutmayın. Bazı durumlarda, yeşil sinyal kırmızı sinyali çok daha büyük bir ölçüde ortak içine dağıttı. Bu (Tartakoff, hazırlık olarak) polysomes karakteristik özelliği transfer gecikme göstermektedir. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; haploid hücre 5 ml logaritmik kültürlerin bir çift ile başlayarak, kemilüminesans algılama yöntemleri kullanarak, birçok immunoblots için yeterlidir yaklaşık 1-2 x 10 6 zigot, kurtarabilirsiniz. Biz bu hücre sayısı RNA yaklaşık 1.5 mg ayıklamak fenol-kloroform izolasyon protokolleri kullanarak. Saflaştırılmış zigot öncesinde daha fazla analiz için, soğutulmuş beri biz ° C büyüme ortamında 23 inkübasyon önerilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig1.jpg" /> Şekil 1. Zigot oluşumu Kronoloji. Haploidlerin ve diploid arasında bir ara ürün olarak zigotlar. Bu şema, klasik haploidlerin aktivasyonu (shmooing), bunların füzyon ve ilk tomurcuk oluşumunu göstermektedir. Tomurcuklar (T) ya da, (M) yanal orta (M) veya terminal olabilir. <imgalt = &quot;Şekil 1&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4197/4197fig2.jpg&quot; /&gt; Şekil 2. Zigot arıtma protokolü şematik. Glikoz ile tam bir ortam içinde agar plakalarının yüzeyinde inkübasyondan sonra, hücre karışım yıkama ile geri kazanıldı ve sonra, &quot;saflık kipinde ikinci tür takip&quot; kurtarma modunda &quot;bir ilk tür tabi tutulmuştur. &quot; Sarı renk mCherry ve GFP sinyalleri hem zigot görünür olduğunu belirtir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig3.jpg" /> Şekil 3,. Kesirler saflaştırılmış. Çiftleşme karışımlarında zigot Çeşitleri 1.75 veya nispeten erken vs nispeten daha olgun zigot zenginleştirilmiş kesirler kurtarmak için 2,5 saat sonra hasat edilmiştir. Ayrı renk tarafından belirlenmiş sekiz bağımsız deneyler, her bir zaman noktası için yapılmıştır. Grafikler zigot göreli sayıları gösterir bu hatomurcuğu mekansal farklı desenler ettik. Inkübasyon kısa süre göz önüne alındığında (oda sıcaklığında en az 2,5 saat) gözlenen tüm tomurcuklar başlangıç ​​zigotik tomurcuklanan olaylardır. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4197/4197fig4.jpg" /> Şekil 4. Zenginleştirilmiş kesirler DeltaVision incelenmesi. Tipik bir alan Deltavision mikroskobu ile incelenmiştir. Çizimler ya kırmızı ve yeşil ya da tek hem renkleri göstermektedir. Kırmızı polysomal etiketi (Rpl25p-mCherry) ve sitosolik GFP ile yeşil karşılık gelir. Boşlukları (v), tomurcukları (b), çekirdek (n), vaküoler &quot;miras yapı&quot;, (i) ve ebeveyn ayırmak için görünür bölme (*): zigotların yüksek zenginleştirme ve belirli bir hücre içi özellikleri not edin nispeten erken zigot etki alanları. Onların değişken genel renk erimiş haploidlerin göreli yoğunluğunu yansıtır. Iki parental etki muhafaza edildiği durumlardaayrı bir renk, belirteçleri (sitoplazmik GFP, mCherry etiketli polysomes) arasında dengelenme eksik oldu. Devam Time-lapse çalışmaları öncesinde polysomes çözünür GFP dağıtır. Göstermek <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4197/4197fig4large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . Tamamlayıcı Efsaneleri <img alt="Şekil S1" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS1.jpg" /> Şekil S1. Haploid hücrelerin floresans Uzak bıraktı:. MCherry etiketli polysomes ifade Hücreler yeşil bir sinyali tespit etmek için incelenmiştir. Dikdörtgen pencere negatif hücreleri önlemek için kurulmuştur. Orta Grafiği: sitozolik GFP ifade Hücreler, analiz pozitiflerin belirgin parlak büyük nüfus gösteren edildi. Uzak Sağ: mCherry etiketli polysomes ifade Hücreleri analiz edildi. Dikdörtgen (uzak solda aynıdır) parlak hücreleri içerir ve tüm verirnegatifler kaçınılmalıdır. Atama &quot;R2&quot; Belirtilen dikdörtgenin içindeki edilen hücrelerin yüzdesini gösterir. <img alt="S2 Şekil" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS2.jpg" /> S2 Şekil. Birinci ve ikinci sıralamaya Hücre dağılımı. Bu iki-renkli araziler sağ üst kadranda (R5) Yeşil + Kırmızı + hücrelerinin oranını göstermektedir. Bu oran ikinci çeşit% 52 artar. Yatay eksen: yeşil sinyal. Dikey eksen: kırmızı sinyal.

<ol>
	<li>Herskowitz, I., Oshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , 181-210 (1981).</li><li>Muller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+age+and+the+life-span+of+zygotes+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 51, 1-10 (1985).</li><li>Tartakoff, A. M., Jaiswal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+fusion+and+genome+encounter+during+yeast+zygote+formation.">Nuclear fusion and genome encounter during yeast zygote formation.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 2932-2942 (2009).</li><li>Azpiroz, R., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+mitochondrial+sorting+in+yeast+zygotes.">Patterns of mitochondrial sorting in yeast zygotes.</a> Mol. Biol. Cell. 4, 21-36 (1993).</li><li>Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+fusion+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).</li><li>Dujon, B., Jones, E., Strathern, J., Broach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance. , 505-635 (1981).</li><li>Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+yeast+mating+reaction.">Assay of yeast mating reaction.</a> Methods Enzymol. 194, 77-93 (1991).</li><li>Ydenberg, C. A., Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mating:+a+model+system+for+studying+cell+and+nuclear+fusion.">Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion.</a> Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).</li><li>Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+mating+in+yeast.">Synchronous mating in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).</li><li>Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition. , (2005).</li><li>Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUS1+regulates+the+opening+and+expansion+of+fusion+pores+between+mating+yeast.">FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).</li><li>Weisman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelles+on+the+move:+insights+from+yeast+vacuole+inheritance.">Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Saflaştırılmış zigotların durumu zigotlar Alternatif olarak hücre döngüsü yeniden giriş, hücre duvarı yeniden şekillenme, filizlenen ve kalıtım özellikleri, vs uğrayan göre transkriptomiks, proteomikler ve lipidomics yanı sıra, mekanizmalarının incelenmesi içeren biyokimyasal çalışmalar kolaylaştırması, zigotlar başlangıç ​​elde edilebilir Bir veya iki ebeveyn karakteristik mutasyonlar taşıyan suşlar ile. Bundan başka, arıtılmış zigotlar, haploid veya diploid hücrelerde içi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Ekipman </td><td> Kaynak </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> pEG220, URA3/YIp, kodlama sitoplazmik GFP 11) </td><td> E. Grote </td><td></td></tr><tr><td> pAJ1661, URA3/CEN, mCherry erimiş kodlama RPL25 </td><td> A. Johnston </td><td></td></tr><tr><td> Fisher FB120 sonikatör </td><td> Fisher Scientific </td><td></td></tr><tr><td> Süzgeçli kapaklı polipropilen tüp </td><td> BD Falcon </td><td> Ref 352235 </td></tr><tr><td> Soğutmalı mikrofuge&#39;de </td><td> Tomy </td><td> MRX-150 </td></tr><tr><td> Flow sitometri kılıf çözümü </td><td> Biosure </td><td> 1027 </td></tr><tr><td> iCyt Yansıma Modeli Akış Sitometresi </td><td> Sony </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision ters evrişim mikroskop </td><td> Uygulamalı Precision </td><td></td></tr><tr><td> Dik Epifloresans mikroskop </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapure Agaroz </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-07 </td></tr><tr><td> CSM glukoz formülasyon Notlar: agar plakaları için, sadece% 2 agar (Difco) içerir </td><td> 10 </td><td></td></tr></tbody></table>

flow cytometry-based purification of s. cerevisiae zygotes

Zigot maya dahil birçok organizmanın yaşam döngüsü içinde haploid ve diploid devletler arasındaki temel ara ürünler, (Şekil 1) 1. S. vardır cerevisiae farklı çiftleşme tipi (mata, MATalpha) haploid hücre füzyon sonucu zigotlar ve birbirlerinin çarpıcı bir asimetrik mitotik bölünmeleri 2 bir sonucu olarak en çok 20 diploid soy oluşturmak uygun stabil diploid neden olmaktadır. Zigot oluşum olaylar kompleksi sekans tarafından yönetilir: Bu işlemde, çözünür çiftleşme faktör hücre-hücre füzyon hücre döngüsü ile sonuçlanan bir kesinti kolaylaştırmak reseptör-kaynaklı sinyalleme kaskadını tetikleme, aynı soydan gelen reseptörlere bağlanır. Zigot progenitör veya kök hücre fonksiyonu için bir model olarak kabul edilebilir. Çok zigot oluşumu hakkında öğrendim olmasına rağmen ve zigot genel anlaml hücre-moleküler soruları araştırmak için kullanılmış olmasına rağmenicance, hemen hemen tüm çalışmalarda zigot 3-8 haploid hücrelerin bir çoğunluk nüfusu ile karışmış olduğu çiftleşme karışımların kullanımı yaptık. Zigot oluşumunun biyokimyasında pek çok yönü ve zigot devam ömrü böylelikle araştırılmamış kalır. Maya zigot arıtma Raporları, çökelme özellikleri 9 dayanan protokolleri açıklar, ancak bu sedimantasyon tabanlı prosedürü elimizde yaklaşık% 90 saflıkta vermemiştir. Bundan başka, hücrelerin hipertonik sorbitol maruz kaldığı dezavantajı vardır. Bu nedenle çok yönlü bir arınma prosedürü geliştirdik. Bu amaç için, kırmızı veya yeşil floresan protein eksprese eden bir çift haploid hücrelerde zigot oluşumu, çeşitli zamanlarda toplanır ve sonuçta ortaya çıkan zigot bir akış sitometrisi tabanlı bir sıralama protokol kullanılarak saflaştırılmıştır izin vermek için birlikte inkübe edildi. Bu teknik, saflık ve olgunlaşma uygun bir görsel değerlendirme sağlar. Ortalama saflığıfraksiyonu yaklaşık% 90&#39;dır. Hasat zamanlama göre, vadesi değişen derecelerde zigot telafi edilebilir. Saflaştırılmış örnekleri ilk döl kurtarma ve bu progenitör hücre sistematik olarak incelenmesi için, &quot;-omic&quot; çalışmaları için çıkış uygun bir nokta sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes at JoVE.com

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Arasında zigot arındırmak için<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Karşısında çiftleşme tipi haploit hücreler flow sitometri tabanlı bir protokol kullanarak kırmızı veya yeşil floresan zigot oluşumunu sağlamak için işbirliği İnkübe proteinler, ve fraksiyone ifade geliştirilmişti. Yüksek oranda zenginleştirilmiş fraksiyonu ilk döl müteakip &quot;-omic&quot; çalışmaları, kurtarma ve zigot morphogenesis sistematik araştırma sağlar.

Akış Sitometri tabanlı Arıtma<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigot

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

flow-cytometry-based-purification-of-s-cerevisiae-zygotes

Research

JoVE Journal

Biology

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

12.7K Görüntüleme.  Case Western Reserve University School of Medicine. Arasında zigot arındırmak için S. cerevisiae Karşısında çiftleşme tipi haploit hücreler flow sitometri tabanlı bir protokol kullanarak kırmızı veya yeşil floresan zigot oluşumunu sağlamak için işbirliği İnkübe proteinler, ve fraksiyone ifade geliştirilmişti. Yüksek oranda zenginleştirilmiş fraksiyonu ilk döl müteakip "-omic" çalışmaları, kurtarma ve zigot morphogenesis sistematik araştırma sağlar.

Video: Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

S. cerevisiae yapışma ve Agar Invasion için Testi

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Biyoloji

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

S. cerevisiae &quot;adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

S. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Fare Mayotik Hücreler Sitometrisi Arıtma

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. The simplicity and power of the yeast aging model can also be explored to study DNA damage and genome maintenance as well as their contributions to diseases during aging. Here, we describe a system to study age-dependent DNA mutations, including base substitutions, frame-shift mutations, gross chromosomal rearrangements, and homologous/homeologous recombination, as well as nuclear DNA repair activity by combining the yeast chronological life span with simple DNA damage and mutation assays. The methods described here should facilitate the identification of genes/pathways that regulate genomic instability and the mechanisms that underlie age-dependent DNA mutations and cancer in mammals.

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Here we describe a set of DNA mutation assays that can be combined with the yeast chronological life span model to study the genes/pathways that regulate or contribute to genomic DNA instability during aging.

Yaşa bağımlı Genomik İstikrarsızlık incelenmesi S. cerevisiae Kronolojik ömrü Modeli

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Yılında Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü Protein İfadesi ve Arıtma Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Cep Takip Boyalar kullanarak Hücre Bölünmesi İzleme için optimize Boyama ve Çoğalma Modelleme Yöntemleri

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

Deniz Kestanesi Zigotlar Yüksek Randımanlı Microinjections

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;