Bu yöntem pankreas adacık soy farklılaşması hakkında pankreas adacık alanında anahtar sorulara cevap olabilir, olgunlaşma, ve rejenerasyon. Bu tekniğin ana avantajı yüksek kaliteli tek hücreli RNA sıralama veri üretimi için tek pankreas adacık hücrelerinin toplanması sağlar. Bu tekniğin uygulanması patolojik koşullar üzerinde pankreas endokrin tek hücrelerin transkripsiyonomik analizi ile diyabet ve diğer pankreas endokrin ile ilgili hastalıkların tedavisi doğru uzanır.
Perfüzyon için pankreasDar safra kanalına iğne nin takılması zor olabilir gibi bu yöntemin görsel gösteri zordur. Embriyonik gün 17.5 embriyolar için. Karın boşluğu açıldıktan sonra, soğuk PBS içeren altı santimetre siyah alt çanak visseral doku aktarmak için dirsek cımbız kullanın.
Visseral doku dan pankreas ayırmak için forceps kullanın. Ve pankreas dokusunu 20 mililitrelik bir şişeye yerleştirin beş mililitre soğuk kollajenaz solüsyonu. Doğum sonrası gün sıfır dan 15 fareiçin, dikkatle kollajenaz içine doku yerleştirmeden önce pankreas tüm lobları incelemek.
Doğum sonrası gün için 18-60 fareler, ilk ksifoid kaldırmak ve karın boşluğunun sağ tarafında bağırsak ayıklayın. Safra kesesi ve ortak safra kanalı ortaya çıkarmak için her iki tarafa karaciğerin sol ve sağ medial loblar itin. Ve çift°yoleni, safra kanalının duodenuma girdiği yeri kuşatmak için üst ve alt konumlardaki bir çift küçük damar kelepçesiyle kenetle.
Daha sonra, soğuk kollajenaz çözeltisi ile 30 gauge iğne ile donatılmış bir 5 mililitreş yükleyin. Ve safra kesesi içine iğne ucu eklemek için mikroskop kullanın. Dikkatle ve sorunsuz ortak safra kanalı ile iğne işlemek.
Ve farenin boyutuna göre kollajenaz çözeltisi bir ila beş mililitre ile pankreas perfuse için piston depress. Çözeltinin tamamı perfüzyon edildiğinde, pankreası hemen beş mililitre taze soğuk kollajenaz çözeltisi içeren 20 mililitrelik bir şişeye aktarmak için forseps kullanın. Tüm pankreas dokusu toplandığında, üç dakika boyunca 37 derece santigrat su banyosu nda şişe yerleştirin, nazik sallayarak üç ila beş dakika takip.
Daha sonra sindirilmiş ürünü 0,25 milimetrelik naylon süzgeçten 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne süzün. Ve iyice süzgeç yıkamak için buz gibi PBS içeren 20 mililitrelik şırınga kullanın. Doğum sonrası gün için 18-60 pankreata, filtreli örnek santrifüj ve soğuk PBS 30 mililitre doku resuspend.
Sonra altı santimetre siyah alt çanak içine doku süspansiyon decant, ve soğuk PBS küçük bir hacim içeren 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp içine transfer için adacıkları almak için 200 mikrolitrelik pipet ve bir diseksiyon mikroskop kullanın. Embriyonik gün için 17.5 doğum sonrası gün 15 pankreata, filtrelenmiş pankreas dokusu santrifüj ve 37 derece santigrat su banyosunda dört dakikalık kuluçka için tripsin-EDTA çözeltisi pelet resuspend. Kuluçka sonunda, yavaşça 200 mikrolitrelik pipet ile bir dakika için pelet oranı deneyin, sindirim durdurmak için nazik bir girdap ile soğuk fetal sığır serum 0,5 kat hacmi nin eklenmesi izledi.
Sonra santrifüj tarafından sindirimi toplamak ve akış sitometri tarafından sıralamak için 5 mililitreLIK FACS tüp FACS tampon 200 mikrolitre hücreleri yeniden askıya. Tek hücre toplama ve lysis için, aliquot taze hazırlanmış hücre lisis tampon sekiz şerit PCR tüpleri içine, ve her içine tek bir hücre aktarın. RNA'nın salınımı için hücreleri dinlendirmek için örnekleri girdap, ardından 4 santigrat derecede 30 saniye santrifüj ve buzda hemen depolanma.
Ters transkripsiyon için, 72 santigrat derece üç dakika boyunca lysates kuluçka ve buz üzerinde bir dakika. Numuneleri kısaca 4 derece santigrat derecede 30 saniye santrifüj edin ve her numuneiçin toplam hacmi 10 mikrolitreye çıkarmak için her numuneye 5,7 mikrolitre ters transkripsiyon karışımı ekleyin. Nazik girdap ve santrifüjden sonra, örnekleri bir termocycler'a yükleyin ve ters transkripsiyon programını başlatın.
Polimeraz zincir reaksiyonu preamplifikasyonu veya PCR için, ilk iplikçik reaksiyonlarını içeren her numuneye 15 mikrolitre PCR karışımı ekleyin ve ardından nazik girdap ve santrifüj ekleyin. Daha sonra numuneleri termocycler'a yükleyin ve PCR programını başlatın. PCR arınması için, her numuneye 25 mikrolitre resuspended DNA saflaştırma boncukekleyin ve girdap ile iyice karıştırın.
Daha sonra boncukların yerleşmesini önlerken sıvıyı toplamak için numuneleri oda sıcaklığında hızlıbir şekilde döndürün. Oda sıcaklığında beş dakika sonra, numuneleri uygun bir manyetik standa yerleştirin, çözelti temizolduğunda süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın. Boncukları 200 mikrolitre taze hazırlanmış %80 etanolte iki 30 saniyelik yıkama ile yıkayın.
Ve ikinci yıkamadan sonra kalan etanol atın. Boncuklar hava kuruduktan sonra, 11 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin ve ardından dna hedefini boncuklardan uzaklaştırın ve ardından girdap lar ekleyin. Daha sonra numuneleri hızlı bir şekilde santrifüj edin, çözüm temizolana kadar numuneleri manyetik standa geri verin ve her numunenin 10 mikrolitresini yeni bir PCR tüpüne aktarın.
Başarıyla güçlendirilmiş cDNA 500 baz çiftleri üzerinde tam uzunlukta olmalı ve 1,5 ila iki kilo baz çiftleri zenginleştirilmiş olmalıdır. Ayrıca, genellikle insülin bir RFP artı hücrelerde gözlenen cDNA 500-600 baz çifti zenginleştirme vardır, hangi insülin transkript temsil edebilir. Ancak, 100 baz çiftine yakın cDNA parçaları genellikle aşırı astarlardan kaynaklanan ve DNA arınma adımı tekraredilerek çıkarılması gereken astar dimerlerdir.
100 ile 500 baz çifti arasındaki cDNA parçaları genellikle bozulmuş cDNA'yı temsil eder, bu da rnase kontaminasyonu gibi kötü hücre durumu veya bölge sorunlarının neden olduğu ve dışlanması gereken cDNA'yı temsil eder. CDNA kütüphanelerinin diziliş için saflaştırılmasından sonra, 250 ile 450 baz çifti arasında değişen cDNA, dna arınma boncuklarının birinci ve ikinci tur saflaştırmaya eklenmesiyle elde edilebilir. DNA boncuk arınması sonra, sıralama kalite puanı sıralama kalite değerlendirmesi sırasında 30'dan büyük olmalıdır.
Downstream analizleri için yüksek kaliteli hücreler elde etmek için, 0,5 milyondan az eşlenen okumaya veya 4.000'den az tespit edilmiş gene sahip hücreler dışlanır, bu da farklı hücre gruplarının karakterizasyonunu ve temel bileşen analizi ve hiyerarşik kümelenmeden sonra farklı gruplarda heterojen olarak ifade edilen genlerin tanımlanmasını kolaylaştırır. Bu prosedürü çalışırken, bu sindirim üzerinde adacık önlemek ve tek hücreli işlemler sırasında RNase ücretsiz bir ortam korumak için kollajenaz sindirim önce hızlı bir şekilde pankreas perfüzyon hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, adacık yapısının görselleştirilmesini kolaylaştırmak ve hücresel yanıtları ve ilaç stimülasyonunun incelenmesi için adacık görüntüleme ve kültür gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.
Geliştirme den sonra, bu teknik adacık soy gelişimi ve rejenerasyon mekanizmaları keşfetmek için pankreas araştırma alanında araştırmacılar için yol açtı, memelilerde diyabet ilerlemesi gibi.
