Biz onun teknik destek için bu yazının ve Doug Hamilton eleştiri için Ann Grimm ve Michael Zimmerman teşekkür etmek istiyorum.

1. Teğet Akış Hollow-fiber Ultrafiltrasyon Prosedürü <ol><li> Tamponlar ve çözeltilerinin hazırlanması: Elüsyon çözeltisi (1 L): Distile su 1 L 0,1 g sodyum polifosfat, 0.1 ml Tween-80 ve 0.01 ml Y-30 köpük eklemek için. </li><li> Bir biyolojik güvenlik kabini filtre montajı (Şekil 1) hazırlayın: <ol><li> Bir Masterflex I / P hassas fırçasız Sürücüye bağlı bir Masterflex I / P Kolay Yük pompa kafası ile Masterflex I / P 73 laboratuvar tüp takın. </li><li> Bir vidalı kelepçe ile pompa kafası upstream bir NPT şube T-konnektör takılmış 0-60 psi, gliserin dolu basıncı göstergesi tüp sabitleyin ve pompa kafası bir HDPE T-konnektör aşağı için. </li><li> Bir Nalgene Masterflex L / S 15 laboratuvar boru ile 53-B dolum / havalandırma kapağı ve bir T-bağlayıcısı uyan ve 1 L Nalgene ağır polipropilen şişe sağlamca tarafından retentat şişe takılacak. </li><li> Masterflex L / S 24 tüp w FitITH bir tutam kelepçe (tutam kelepçe 2) ve HDPE T-konnektörüne retentat şişe bağlayın. </li><li> Manometre gelen Asahi Kasei için Masterflex L / S 24 laboratuar boru bağlayın vidalı kelepçe ile 25S yüksek akılı diyalizer Rexeed ve diyalizer gelen retentat şişeye. Boş elyaf Ultrafiltreler için boru bağlamak için ¼ &quot;ID boruları karşılamak için tasarlanmış ısmarlama DIN bağdaştırıcılarını kullanın. </li><li> Bir tutam kelepçe (tutam kelepçe 1) Masterflex L / S 24 laboratuvar tüp Fit ve numune alımı hattı olarak hareket etmek kaldırıldı ucu ve pamuk yumağı ile 10 ml plastik pipet bağlayın ve sonra HDPE için tüp takmak T- konektörü. </li><li> Bir rampa filtrenin çıkış ucu yakınında bulunan atık noktasına hortum ve kelepçe ile bağlanmak Masterflex L/S-36 laboratuar hortumun bir ucunu takın. Atık kap içinde diğer ucu yerleştirin. </li></ol></li><li> % 0.01 (a / h) 10 L su örneği sodyum polifosfat ve 3 dakika boyunca karıştırılır. </li><li> Tutam kelepçe 2 kapatınve retentat şişeden havalandırma kapağı çıkarın. Diğer tüm kelepçeler açık olması gerekir. </li><li> Manometre (sol aşağıdaki Şekil 1 hakkı) için T-konnektör gelen sıvı taşımak için pompa yönünü ayarlayın. Maksimum hız% 25 pompa hızını ayarlayın ve pompa açın. </li><li> Retentat şişenin 2/3 tam, açık tutam kelepçe 2 ve hızlı bir şekilde retentat şişe havalandırma kapağını değiştirdiğinizde. Hatları ve sızıntıların olmadığından emin olmak için bağlantı parçaları, her kontrol edin. </li><li> Yavaş yavaş sızıntı kontrol, istenilen filtrasyon hızı (yaklaşık 1.5 L / dk) pompa hızını artırmak. Bir mezun silindir ve bir zaman sayacı veya akış ölçer kullanarak, atık su hattı (Şekil 1&#39;de mavi L / S 36 tüp) ve çıkışlarında suyun süzüntü hızını kontrol edin. Hava kabarcıkları tipik olarak zor stabil bir basınç ve filtrasyon oranı elde etmek için filtre yapım çıkış ucunda oluşturabilirler. Bu, bir an için elle atık su hattı sıkıştırarak düzeltilir. Bu, eylemgenellikle süzüntü noktasına hava kabarcığı coax ve atık su hattı üzerinden çıkmak için. Bezelye büyüklüğünde hava kabarcıkları genellikle kaçınılmaz olduğunu akılda tutarak, gerektiği gibi tekrarlayın. </li><li> Filtrasyon işlemi izleyin. Gerektiği gibi basınç ve filtrasyon hızını ölçün ve kaydedin. Basıncı 20 psi aşmamalıdır. Bu filtrasyon hızı 2.0 L / dk geçmemelidir önerilir. Bu retentat şişe içinde su hacmi boşaltmaktadır hiç sağlamak için izlenir olması önemlidir. Bu artırmak veya biraz azaltmak için ses seviyesi normaldir. Retentat şişede su hacmine göre 1/3 dolu düşerse, havalandırma kapağını ve yakın tutam retentat şişe hattı 2 kelepçe. Yaklaşık 2/3 geri ses getir, kelepçe açmak ve hızlı bir sızdırmazlık sağlanması, havalandırma kapağı değiştirin. Retentat şişe hacmi hızla ve sürekli düşerse, retentat şişe kapağı sıkı ve havalandırma kapağı sıkıca yerinde olduğundan emin olun ve bu tubing su numunesi ile temas halen devam etmektedir. Bu sorunları meydana değilseniz, o zaman retentat şişe kapağı içinde mühür kötü olduğunu ve değiştirilmesi gerektiğini muhtemeldir. </li><li> Numune kabı boş olduğunda, hemen yakın tutam kelepçe 1, maksimum% 20 pompa hızını azaltmak, retentat şişeden havalandırma kapağını ve rampa kelepçe kapatın. </li><li> Rampa kelepçe sıkma veya gevşeterek yaklaşık 200 ml retentat şişede örnek ses seviyesini ayarlayın. Hacminin yaklaşık 200 ml sonra, elüsyon adım (1,11-1,12) için rampa kelepçe sıkmak. </li><li> Örnek kabına elüsyon çözeltisi 500 ml ilave edilir ve kabın içine durulanır. Elüsyon çözeltisi içeren bir kaba Örnek uptake hattına bağlı 10 ml pipetle yerleştirin. Rampa kelepçe kapalı olduğundan emin olun. Açık tutam 1 kelepçe ve yakın tutam elüsyon çözüm çizmek için bir an 2 kelepçe. </li><li> Elüsyon çözeltisi 500 ml kadar çekilir sonraYakın, 1 kelepçe ve açık bir tutam kelepçe 2 çimdik. Elüsyon çözüm maksimum% 20 bir pompa hızı ile 5 dakika dolaşmasına izin verin. </li><li> Atık su hattı üzerinde rampa kelepçe sıkma veya gevşeterek yaklaşık 100 ml retentat şişede örnek ses seviyesini ayarlayın. Rampa kelepçesini sıkın ve örnek 1 dakika dolaşmasına izin verin. Retentat şişe numune hacmi sağlayarak tüp içine hava çekerek kaçının retentat şişe giren L / S 15 tüp karşılamak için yeteri kadar yüksektir. </li><li> Retentat şişeye örnek zorlar pompa yönünü tersine çevirmek. Pompa retentat şişede ~ 225 ml ve sonuç olarak toplam 20 saniye boyunca ters çalışmasına izin ver. Pompa kapatın. </li><li> Pompa kafasından Masterflex I / P 73 tüp çıkarın ve manometre kesin. Boş elyaf Ultrafiltreler çıkmadan Masterflex L / S 24 tüp ayırın. Içine kalan örnek zorlamak için retentat şişe üstünde boru tutunşişe retentat. </li><li> Şişeden tüm boru kesin olmayan bir havalandırma kapağı ile havalandırma kapağı değiştirin. </li><li> ~ 225 ml retentat ile IMS / IFA prosedürü devam edin. </li></ol> 2. İmmunomanyetik Ayırma İşlemi <ol><li> Tamponlar ve çözeltilerinin hazırlanması: <ol><li> Cryptosporidium / Giardia kombo kiti oda sıcaklığına ulaşmasını: Dynabeads dahil tamponlar izin verin. </li><li> 1X SL-tampon A: 10X SL-tampon A 9 ml distile su 1 ml ekleyin. </li></ol></li><li> Etiketli 250 ml konik santrifüj tüpüne retentat şişe sıvı ~ 225 ml aktarın. Reaktif 10 ml su ile iki kez retentat şişede, durulama ve konik bir santrifüj tüpüne durulama ekleyin. 4. 15 dakika ° hiçbir fren C için 1500 xg&#39;de süspansiyon santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle pelet hacmi her 0.5 ml (yani aspirat 1 için hava-su arayüzünden dolu pelet yukarıdaki 5 ml supernatant aspire5 1.3 ml&#39;lik bir hacim pelet yukarıda ml ve aspirasyon 0.5 ml veya daha az) bir pelet için 5 ml kadar. </li><li> Iyice vorteks ve / veya karıştırma pipet ile süpernatan içine pelletini. 1 ml içeren düz kenarlı Dynal L10 tüpüne sıvı her 5 ml hacimde transfer A ve SL-tampon B. 10X reaktif su 2.5 ml ile iki kez konik santrifüj tüpüne yıkayın ve durulama eklemek SL-tampon 10X her tamponlar dahil olmak üzere, L10 tüpe 12 ml toplam hacme getirmek L10 tüp. </li><li> L10 tüpüne 100 ul iyi karıştırılmış tekrar süspanse edilir, anti-Cryptosporidium ve anti-Giardia Dynabeads her bir ekleme. Bir rotator karıştırıcı oda sıcaklığında 1 saat 18 rpm&#39;de L10 tüp döndürün. </li><li> MPC-6 mıknatıs ve hafifçe elini kaya 2 dakika tüp uçtan uca, 180 ° karşı L10 tüpün düz tarafı yerleştirin. </li><li> Mıknatıs yüzü MPC-6 mıknatıs L10 tüp tutmak kadar, boncuk / (oo) kist kompleksleri bou uzak süpernatantı boşaltacaktırmıknatısa nd. Mıknatıs gelen L10 tüpünü çıkarın ve A tüpüne 1X SL-tamponu 0.5 ml ekleyin. Dikey konumda mıknatıslı MPC-S düzenlenen bir 1,5 ml mikrosantrifüj tüpe A SL-tampon 1X 0.5 ml iki ek durulama kullanarak süspansiyonu aktarın. </li><li> Yavaşça 1 dakika MPC-S mıknatıs 180 ° tüp sallayın. Yerde mıknatıs, mikrosantrifüj borusunun alt yönelik bir Pasteur pipet kullanılarak süpernatan aspire. </li><li> Mikrosantrifüj tüpünün ön tarafına 1X PBS 1 ml ekleyin, mıknatıs kaldırmak ve boncuklar süspanse kadar sadece hafifçe tüpü sallayın. Dikey konumda mıknatıs değiştirin ve yavaşça 1 dakika tüp 180 ° sallayın. PBS mümkün olduğunca fazla enkaz olarak kaldırmak için bir Pasteur pipeti kullanarak, boncuk pelet bozmadan, durulama aspire. </li><li> Mıknatıs kaldırmak ve mikrosantrifüj tüpün arka yüzüne su reaktif 50 ul ilave edin. Vorteks 50 saniye boyunca tam hızda tüp,daha sonra, bir 30 ikinci bir vorteks takiben 10 dakika boyunca 80 ° C&#39;de inkübe edilir tüpü. Mıknatısa boncuklar bağlayıcı ve sıvı içinde (oo) kistler bırakarak, eğimli bir konumda MPC-S içine mıknatıs yerini alır. Bir SingleSpot iyi slayt için (oo) kist süspansiyon uygulayın. </li><li> İlk ayrışma içeren, aynı zamanda, sıvı uygulanması, adım 2.10 tekrarlanır. 37 ° C slayt iyi slayt için süspansiyon kuruması için 1 saat boyunca sıcak koyun slayt. </li></ol> 3. Boyama ve Sınav <ol><li> Tamponlar ve çözeltilerinin hazırlanması: DAPI çözeltisi çalışmaktadır: 1X PBS ile 25 ml&#39;ye DAPI stok solüsyonu (metanol içinde 2 mg / ml) 25 ul ekleyin. Mağaza stok ve 1 ° C ve karanlıkta 10 ° C arasında çalışma çözümleri. </li><li> Ayrıca sürgüye metanol 50 ul uygulamak ve oda sıcaklığında kurumaya bırakılır. </li><li> Ayrıca sürgüye çalışma DAPI solüsyonu 50 ul ekleyin ve oda sıcaklığında 2 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Bir Kimwi kullanınpe kuyudan DAPI fitil için. EasyStain 50 ul uygulayın. 30 dakika boyunca 35 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Bir Kimwipe ile iyi kapalı leke ve sonra yavaş yavaş iyi kenar üzerinde akmasını, soğuk EasyStain sabitleme tampon 300 ul ekleyin Wick. Oda sıcaklığında 2 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Iyi olan tampon fitil ve EasyStain Montaj Orta 10 ul uygulamak için bir Kimwipe kullanın. </li><li> Dikkatle oluşabilecek kabarcıkları çıkarırken, bir kapak kayma geçerlidir. Net oje ile kapak kayma sürün. </li><li> Bir ookist veya kist andıran oval veya yuvarlak elma-yeşil flüoresan nesneler için, toplam 200X büyütmede, FITC filtresi kullanarak tüm slayt tarayın. Ayrıca 1000X toplam büyütmede, 1000X toplam büyütmede DAPI filtresi ile ve daha sonra DIC ile tüm bu nesneleri inceleyin. Kalibre edilmiş bir oküler mikrometre ve morfolojik özellikleri kullanarak boyutu kaydedin. </li><li> Belge sonuçları. </li></ol> Not: Ek buluOrijinal prosedürü hakkında bilgi ver-EPA Method 1623 12 Aralık 2005 sürümü bulunabilir. Açıklanan teğet akış boş elyaf ultrafiltrasyon prosedürü EPA Method 1623 Bölüm 12.0 yerine kullanılır. Isı ayrışma EPA Method 1623 Bölüm 13.3.3 değiştirir. Bu prosedür, aynı zamanda ilave PBS bölümü 13.3.2.16 sonra Metot 1623 Aralık 2005 versiyonu içine sokulabilmektedir IMS durulama işlemi sırasında açıklanmaktadır. Bu değişiklikler dahil olmak üzere EPA Method 1623 için kullanılan sarf malzemeleri, reaktifler ve ekipmanların tam listesi ekipman listesi yer almaktadır. 4. Temsilcisi Sonuçlar Filtrasyon ve immunomanyetik ayırma işlemleri ile telafi ookistleri Cryptosporidium ve Giardia kistleri mikroskobik inceleme ile tespit edilir. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi toplam 200X büyütmede, her organizmanın tipik bir boyama desen, boyut ve şekle sergileyen </strong&gt; daha 1000X toplam büyütmede immersiyon yağı ile gözlem altında tutulmalıdır. Bu. Tipik tanımlayıcı özellikler veya olumlu kimlik ekarte olur atipik özellikler ya ölçülmesi ve tanımlanması için izin verecektir Cryptosporidium küresel nesnesine bir oval olan parlak vurgulanan kenarları (Şekil 3A parlak elma yeşili FITC floresanı sergileyen çapı 4 ila 6 mikron ). Yeşil bir jant ve belirgin bir çekirdek (DAPI negatif), yoğun mavi iç boyama, veya en fazla dört ayrı, gök mavisi çekirdeklerin (DAPI ile açık mavi iç boyaması: DAPI UV ile bir ookist aşağıdaki tipik özelliği kategorilerden birini sergileyecek pozitif - Şekil 3B). Atipik özellikler renk, yapı, ya DAPI floresans (örneğin, çok lekeli çekirdekleri, kırmızı iç yapıları floresanlama) sapmalar vardır. Flüoresan nesnenin tipik FITC ve DAPI boyaması için kriterleri karşıladığı takdirde, diferansiyel girişim con kullanılarak incelenirkontrast (DIC). Nesnesi, hücre duvarı süsleme veya hücre doldurma bir veya iki büyük çekirdek gibi atipik harici veya dahili morfolojik özellikleri incelenmiştir. Atipik yapılar tespit değilseniz, nesnenin toplam IFA sayısı kaydedildi ve boş bir amorf yapı olarak veya mevcut 03:59 sporozoitlerine (Şekil 3C) ile kategorize edilir. Benzer şekilde, Giardia benzeri nesneleri FITC ve DAPI boyama gibi axonemes, medyan organları ve çekirdekleri gibi DIC özellikleri yönünden incelenir Giardia kistleri ovoid elma-yeşil parlak nesneler, 8 yuvarlak -. 5 tarafından uzun 18 um - 15 mikron parlak vurgulanan kenarları (Şekil 3B) ile geniş. DAPI UV ile, Giardia kist DAPI negatif boyama veya DAPI pozitif özellikleri (Şekil 3E) sergileyecek. Cryptosporidium için tarif edildiği gibi floresan nesne ile aynı şekilde, tipik ve atipik özellikler için DIC tarafından incelenmiştir.Atipik gözlenen değilse, nesnenin toplam IFA sayısı kaydedilir ve boş içeren amorf yapısında olarak, ya da bu iç yapı (Şekil 3F) bir veya daha fazla türü ile sınıflandırılmaktadır. Atipik özelliklere sahip görülmektedir herhangi bir organizmanın (oo) kist olarak sayılmamalıdır. Çevre örneklerinin mikroskobik analizi otomatik floresan veya FITC-konjuge anti-Cryptosporidium ve / veya anti-Giardia antikorları 1 ile çapraz reaksiyona girebilir organizmalar olduğu gibi zor olabilir. Bir analist su mikrop ve Cryptosporidium ve Giardia belirlenmesi deneyim kazanmak için slaytlar gözden onlarca aşina olması önerilir. En az üç (oo) pozitif boyanma kontrolü slaytta kistler önce mikroskop her oturumuna karakterize edilmelidir. Kalite kontrol örneklerinde yüzde rec belirlemek için (oo) kistleri ile çivili olabilirHesaplama kullanarak her protozoon için over: (Oo) kist Yüzde Kurtarma = ((QC Örnek Sayısı - Unspiked Örnek gelen sayın) / Spike) x 100. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig1.jpg" /> Şekil 1. Teğet akış boş elyaf ultrafiltrasyon sisteminin grafik gösterimi. Tüp yardım için renk kodlu olan sistem montaj olduğunu. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig2.jpg" /> Şekil 2. Cryptosporidium ve Giardia (oo) kistler Temsilcisi floresan görüntü. Ookistleri Cryptosporidium ve Giardia kistleri FITC etiketli anti-Cryptosporidium / Giardia antikor ile boyandı. Oklar, Giardia kistleri, ok uçları, Cryptosporidium ookistleri. Dört Cryptosporidium ookistleri ve altı Giardia kistleri toplam odak düzlemi bulundu. Örnekleri gözlemler200X büyütme altında ed. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig3.jpg" /> . Karakterizasyonu için kullanılan Cryptosporidium ookistleri ve Giaridia kistlerin Şekil 3 Temsilcisi mikroskobik görüntüleri Cryptosporidium ookistleri (A - C).. Dört farklı gök mavisi DAPI çekirdekleri (B) ve oosit başına 1-4 sporozoitlerine (S) (C) kadar içeren parlak vurgulanan kenarları (A) çapında küresel nesneleri 4 ila 6 mikron parlak elma yeşili FITC floresans. Giardia kistleri (D - F). Ovoid nesnelere yuvarlak 8 Brilliant elma-yeşil floresans FITC - 5 tarafından uzun 18 um - dört gök mavisi DAPI çekirdek (E) kadar içeren parlak vurgulanan kenarları (D) ve bu tür bir veya daha fazla belirgin bir iç yapısı ile geniş 15 mikron çekirdek olarak (N), medyan gövdesi (M) ve ya axonemes (A) (F). Beyaz oklar, parlak elma yeşili floresans boyama ookistleri Cryptosporidium ve Giardia kistleri woturumlarda; beyaz ok uçları, DAPI pozitif çekirdek. Örnekler 1000X büyütme altında görülmektedir.

<ol>
	<li>DiGiorgio, C. L., Gonzalez, D. A., Huitt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptosporidium+and+Giardia+recoveries+in+natural+waters+by+using+Environmental+Protection+Agency+Method+1623.">Cryptosporidium and Giardia recoveries in natural waters by using Environmental Protection Agency Method 1623.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5952 (2002).</li><li>Hill, V. R., Kahler, A. M., Jothikumar, N., Johnson, T. B., Hahn, D., Cromeans, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multistate+evaluation+of+an+ultrafiltration-based+procedure+for+simultaneous+recovery+of+enteric+microbes+in+100-liter+tap+water+samples.">Multistate evaluation of an ultrafiltration-based procedure for simultaneous recovery of enteric microbes in 100-liter tap water samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 4218-4225 (2007).</li><li>Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Hahn, D., Narayanan, J., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Amburgey, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+method+for+simultaneous+recovery+of+diverse+microbes+in+drinking+water+by+ultrafiltration+with+sodium+polyphosphate+and+surfactants.">Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 6878-6884 (2005).</li><li>Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Hahn, D., Amburgey, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+hollow-fiber+ultrafiltration+to+the+USEPA+VIRADEL+technique+and+USEPA+method+1623.">Comparison of hollow-fiber ultrafiltration to the USEPA VIRADEL technique and USEPA method 1623.</a> J. Environ. Qual. 38, 822-825 (2009).</li><li>Holowecky, P. M., James, R. R., Lorch, D. P., Straka, S. E., Lindquist, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+ultrafiltration+cartridges+for+a+water+sampling+apparatus.">Evaluation of ultrafiltration cartridges for a water sampling apparatus.</a> J. Appl. Microbiol. 106, 738-7347 (2009).</li><li>Lindquist, H. D., Harris, S., Lucas, S., Hartzel, M., Riner, D., Rochele, P., Deleon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+ultrafiltration+to+concentrate+and+detect+Bacillus+anthracis,+Bacillus+atrophaeus+subspecies+globigii,+and+Cryptosporidium+parvum+in+100-liter+water+samples.">Using ultrafiltration to concentrate and detect Bacillus anthracis, Bacillus atrophaeus subspecies globigii, and Cryptosporidium parvum in 100-liter water samples.</a> J. Microbiol. Methods. 70, 484-492 (2007).</li><li>Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+1MDS+electropositive+microfilters+for+simultaneous+recovery+of+multiple+microbe+classes+from+tap+water.">Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water.</a> J. Microbiol. Methods. 68, 260-266 (2007).</li><li>Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+hollow-fiber+ultrafiltration+primary+concentration+of+pathogens+and+secondary+concentration+of+viruses+from.">Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from.</a> 176, 38-45 (2011).</li><li>Shaw, N. J., Villegas, L. F., Eldred, B. J., Gaynor, D. H., Warden, P. S., Pepich, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+to+EPA+Method+1623+to+address+a+unique+seasonal+matrix+effect+encountered+in+some+U.S.+source+waters.">Modification to EPA Method 1623 to address a unique seasonal matrix effect encountered in some U.S. source waters.</a> J. Microbiol. Methods. 75, 445-448 (2008).</li><li>Simmons, O. D., Sobsey, M. D., Heaney, C. D., Schaefer, F. W., Francy, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+and+detection+of+Cryptosporidium+oocysts+in+surface+water+samples+by+method+1622+using+ultrafiltration+and+capsule+filtration.">Concentration and detection of Cryptosporidium oocysts in surface water samples by method 1622 using ultrafiltration and capsule filtration.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 1123-1127 (2001).</li><li>Sobsey, M. D., Glass, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+water+quality+on+enteric+virus+concentration+by+microporous+filter+methods.">Influence of water quality on enteric virus concentration by microporous filter methods.</a> Appl. Environ. Microbiol. 47, 956-9560 (1984).</li><li>USEPA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+1623:+Cryptosporidium+and+Giardia+in+Water+by+Filtration/IMS/FA.">Method 1623: Cryptosporidium and Giardia in Water by Filtration/IMS/FA.</a> Office of Water. 815-R-05-002, (2005).</li><li>Ware, M. W., Wymer, L., Lindquist, H. D., Schaefer, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+alternative+IMS+dissociation+procedure+for+use+with+Method+1622:+detection+of+Cryptosporidium+in+water.">Evaluation of an alternative IMS dissociation procedure for use with Method 1622: detection of Cryptosporidium in water.</a> J. Microbiol. Methods. 55, 575-583 (2003).</li><li>Zuckerman, U., Tzipori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portable+continuous+flow+centrifugation+and+method+1623+for+monitoring+of+waterborne+protozoa+from+large+volumes+of+various+water+matrices.">Portable continuous flow centrifugation and method 1623 for monitoring of waterborne protozoa from large volumes of various water matrices.</a> J. Appl. Microbiol. 100, 1220-1227 (2006).</li></ol>

Amerika Birleşik Devletleri Çevre Koruma Ajansı Yeraltı Suyu ve İçme Suyu Teknik Destek Merkezi&#39;nin Ofisi işbirliği ile Araştırma ve Geliştirme kendi Ofisi aracılığıyla burada açıklanan araştırma finanse. Tüm çalışmalar US EPA, Cincinnati, Ohio yerinde desteklenmiştir. Bu makalede açıklanan bilgiler Shaw Çevre ve Altyapı, Inc sözleşme kapsamında Amerika Birleşik Devletleri Çevre Koruma Ajansı (Sözleşme EP-C-06-031) tarafından kısmen veya tamamen finanse edilmiş olsa da, mutlaka görüşünü yansıtmaz Ajansı ve hiçbir resmi ciro sonucuna varılamaz. Bu Ajansı gözden geçirilir ve yayın için onaylanmıştır.

Teğetsel akış boş elyaf ultrafiltrasyon Cryptosporidium ookistleri ve su Giardia kistlerinin başlangıç ​​konsantrasyonu için alternatif ve etkili bir tekniktir. İçi boş elyaf ultrafiltrasyon geleneksel filtreler daha ucuzdur. Farklı su matrisler çeşitli Cryptosporidium ookistleri ve Giardia kistleri konsantre yeteneğine sahiptir yana EPA Method 1623 için kullanılan mevcut filtrasyon teknikleri için yararlı bir alternatiftir. Diğer çoğu filtrasyon yöntemleri olduğu gibi, boş elyaf ultrafiltrasyon son derece bulanık örnekleri ile kirlenme eğilimli. Yüksek basınçlı su filtresi kirlenme sonucu olurdu; bu nedenle filtrasyon çalışması sırasında basıncı izlemek için tavsiye edilir. Cryptosporidium ookistleri ve Giardia kistler ek olarak, oyuk-fiber ultrafiltrasyon bakteri ve virüsler 1-3,5,8 konsantre yeteneğine sahip olduğu gösterilmiştir. İçi boş elyaf ultrafiltrasyon oBu yöntemde utlined tek bir örnek olarak birden organizmalar konsantre etmek için kullanılabilir. Bu, 200 ve 250 ml arasında nihai bir hacim elde etmek (oo) kist kaybına neden olabilir bu ekstra santrifüj adımları böylece konsantrasyon prosedürü kritik son adım, (adım 2.2) kaçınılmalıdır olduğu dikkat çekicidir. Retentat şişe içine tüm ookistleri veya kistler zorlamak için yeterince sıvı hacmi söz konusu olamayacağından Ancak, şişe hacmi çok düşük bırakabilirsiniz verimleri üzerindeki olumsuz etkileri olabilir. Bu nedenle, 200 ve 250 ml arasında bir nihai hacmi sağlamak için tavsiye edilir. Isıl ayrışma Yöntem, 1623 yılında asit ayrışma adıma bir alternatiftir. Bu alternatif adım Cryptosporidium ookist kurtarma geliştirmek ve nehir veya su reaktif 9 ya izole, yöntem farklılıkları azaltmak için gösterilmiştir. Asit ve ısı ayrışma yöntemlerinin yan yana karşılaştırma göstermiştir ki çözülme için ısı kullanımıte immunomanyetik boncuklar organizmalar Cryptosporidium ve Giardia hem de yüksek ortalama kurtarma üretti. Buna ek olarak, Cryptosporidium ve Giardia kurtarma hassasiyeti asit ayrışma 9 ile karşılaştırıldığında ısı ayrışma ile işlenen örneklerin daha iyiydi. Konsantrasyonu adım olarak HFUF ile birleşmesiyle bir çok mikroorganizma konsantre olma yeteneği sunarak daha fazla esneklik sağlar. Buna ek olarak mevcut Yöntem 1623 filtreleme seçenekleri daha az pahalı bir alternatif.

<table border="1"><tbody><tr><td> Ekipman / Reaktif </td><td> Satıcı </td><td> # Kataloğa </td></tr><tr><td> Asahi Kasei 25 S / R ıslak boş elyaf ultrafilters Rexeed </td><td> Tıp Dial </td><td> REXEED25S / R </td></tr><tr><td> I / P 73 (Masterflex R-3603) ya da eşdeğeri </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.408-73 </td></tr><tr><td> L / S 24 (Masterflex Platin-cured) veya eşdeğeri </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96.410-24 </td></tr><tr><td> L / S 15 (Masterflex Platin-cured) veya eşdeğeri </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96.410-15 </td></tr><tr><td> L / S 36 (Masterflex Platin-cured) veya eşdeğeri </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96.410-36 </td></tr><tr><td> I / P Precision Drive Fırçasız </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-77.410-10 </td></tr><tr><td> I / P Kolay Yükleme Pompa Merkez </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-77601-10 </td></tr><tr><td> Siyah HDPE Te, 1/4 &quot;x 3/8&quot; x 3/8 &quot; </td><td> ABD Plastik </td><td> 62064 </td></tr><tr><td> Masterflex T-konnektör L / S 15-25 </td><td> Cole Parmer </td><td> EG-30.613-12 </td></tr><tr><td> Nalgene ağır pp 1 L şişe </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.257-10 </td></tr><tr><td> 10 ml pipet </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-11C </td></tr><tr><td> 1/4 &quot;boru için Nalgene doldurma / havalandırma kapağı, 53B </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.258-10 </td></tr><tr><td> Basınç ölçer </td><td> Cole Parmer </td><td> A-680-46-10 </td></tr><tr><td> Düz kaplin, NPT (F), 1/4 &quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.469-18 </td></tr><tr><td> NPT şube tee, doğal pp </td><td> Cole Parmer </td><td> A-30610-75 </td></tr><tr><td> Çimdik kelepçeler, 1/2 &quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.833-00 </td></tr><tr><td> Custom uygun DIN adaptörleri </td><td> Kalıplı Ürünler Corp </td><td> MPC-855NS.250 </td></tr><tr><td> Zil standı </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-670B </td></tr><tr><td> Zil standı kelepçeler </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-769-6Q </td></tr><tr><td> Keck rampa kelepçe, 14mm </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.835-10 </td></tr><tr><td> Sodyum polifosfat </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 305553 </td></tr><tr><td> Sodyum tiyosülfat pentahidrat </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 72050 </td></tr><tr><td> Köpük önleyici Y-30 emülsiyon </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A5758 </td></tr><tr><td> Tween-80 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P1754 </td></tr><tr><td> 10 L katlanabilir yüksek yoğunluklu polietilen cubitainer </td><td> VWR </td><td> IR314-0025 </td></tr><tr><td> Şişelik Santrifüj </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-663-103 </td></tr><tr><td> 250 ml konik bir santrifüj tüpünde </td><td> Corning </td><td> 430776 </td></tr><tr><td> Tek huni </td><td> Cole Parmer </td><td> U-6122-10 </td></tr><tr><td> Şişe yıkayın </td><td> Cole Parmer </td><td> U-06252-40 </td></tr><tr><td> Santrifüj </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra X-15R </td></tr><tr><td> Swinging kova rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> ARIES SX4750 </td></tr><tr><td> 250 ml konik tüpler için kova adaptörleri santrifüjleyin </td><td> Beckman Coulter </td><td> 349849 </td></tr><tr><td> 200 ul çapı büyük pipet uçları </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-707-134 </td></tr><tr><td> VacuShield Filtre </td><td> Gelman </td><td> 629-4402 </td></tr><tr><td> 5 ml pipet </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-11D </td></tr><tr><td> Dynabeads: Cryptosporidium / Giardia kombo kiti </td><td> BenDEXX </td><td> 73002 </td></tr><tr><td> 50 ml konik bir santrifüj tüpünde </td><td> Şahin </td><td> 352098 </td></tr><tr><td> Dynal L10 yassı yüzlü tüpler </td><td> Idexx </td><td> 74003 </td></tr><tr><td> Timer </td><td> VWR </td><td> 23609-202 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-6 mıknatıs </td><td> Idexx </td><td> 12002D </td></tr><tr><td> 1 ml pipetler </td><td> VWR </td><td> 53283-700 </td></tr><tr><td> 1.5 ml az yapışma mikrosantrifüj tüpleri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-320 </td></tr><tr><td> 1000 ul pipet ve ilgili bariyer ipuçları </td><td> Gilson </td><td> P1000/DF1000ST </td></tr><tr><td> 100 ul pipet ve ilgili bariyer ipuçları </td><td> Gilson </td><td> P100/DF100ST </td></tr><tr><td> 9 inç Pasteur pipetler </td><td> VWR </td><td> 14672-412 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-S mıknatıs </td><td> Idexx</td><td> 12020D </td></tr><tr><td> Girdap </td><td> VWR </td><td> 14216-188 </td></tr><tr><td> Dynabeads rotator karıştırıcı </td><td> Idexx </td><td> 94701 </td></tr><tr><td> Isı blok </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-718-2 </td></tr><tr><td> Lab Armor Boncuk </td><td> Lab Zırh </td><td> 42370-750 </td></tr><tr><td> Dijital termometre </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15-077-60 </td></tr><tr><td> Fosfat tampon tuzlu 1X pH 7.4 (1X PBS) </td><td> Sigma </td><td> P4417 </td></tr><tr><td> Tek Nokta slaytlar </td><td> Idexx </td><td> 30201 </td></tr><tr><td> Cam Kapak </td><td> Corning </td><td> 287018 </td></tr><tr><td> Doğrudan kiti EasyStain </td><td> BTF </td><td> - </td></tr><tr><td> 10 ul pipet ve ilgili bariyer ipuçları </td><td> Gilson </td><td> P10 &amp; DF10ST </td></tr><tr><td> 4 &#39;, 6&#39;-Diamidino-2-fenil indol dihidroklorid (DAPI) </td><td> Sigma </td><td> D9542 </td></tr><tr><td> Tırnak cilası Temizle </td><td> Fisher Scientific </td><td> S30697 </td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> L6815 </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Kimberly Clark </td><td> 34155 </td></tr><tr><td> Kuluçka makinesi </td><td> Boekel Bilimsel </td><td> 133000 </td></tr><tr><td> sıcak kaydırın </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-474-521 </td></tr><tr><td> Daldırma yağ, A ND = 1.515 yazın </td><td> Nikon </td><td> MXA20234 </td></tr><tr><td> DIC yetenekleri ile Nikon 90i mikroskop </td><td> Nikon </td><td> MBA 77000 </td></tr><tr><td> Planı APO 100X yağlı objektif </td><td> Nikon </td><td> MRD01901 </td></tr><tr><td> Akroma 20X planlayın </td><td> Nikon </td><td> MRL00202 </td></tr><tr><td> FITC filtresi </td><td> Nikon </td><td> 96302 </td></tr><tr><td> DAPI filtresi </td><td> Nikon </td><td> 96301 </td></tr><tr><td> Floresan aydınlatma X-cite </td><td> Nikon </td><td> 87540 </td></tr><tr><td> Lens kağıt </td><td> Nikon </td><td> 76997 </td></tr><tr><td> Biohazard tek torba </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01-829D </td></tr><tr><td> Biohazard tasfiye edin </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-827-117 </td></tr><tr><td> % 3 hidrojen peroksit </td><td> VWR </td><td> BDH3540-2 </td></tr><tr><td> Ağartıcı </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1952030 </td></tr><tr><td> Wypall </td><td> Kimberly Clark </td><td> 34790 </td></tr></tbody></table>

a modified epa method 1623 that uses tangential flow hollow-fiber ultrafiltration and heat dissociation steps to detect waterborne cryptosporidium and giardia spp.

Cryptosporidium ve Giardia türlerin neden olan su kaynaklı ishal salgınları dünyada protozoa en yaygın ikisidir. Daha iyi bu patojenlerin prevalans karakterize etmek için, EPA Method 1623 geliştirilen ve ABD içme sularında bu organizmaların düzeylerini izlemek için kullanılan 12 sağlamaktadır. Metodu, üç ana bölümden oluşur; birinci ham yüzeyi su en az 10 L süzüldü edildiği Örnek konsantrasyonudur. Organizmalar ve tuzağa enkaz sonra filtreden yıkandı ve daha örnek konsantre santrifüje edilir. Yöntemin ikinci bölümü konsantre su numunesi özellikle konsantre enkaz gelen parazitler belirli çıkarılması için izin ookistleri Cryptosporidium ve Giardia kistleri bağlamak immunomanyetik boncuk için uygulanan bir immunomanyetik ayırma işlemi kullanır. Bunlar (oo) kistler sonra bir asit ayrışma Proce tarafından manyetik boncuk ayrıdırDure. Yöntemin son bölümü (oo) kistler bir slayt, lekeli uygulanır ve mikroskop ile numaralandırılan immünofloresan boyama ve numaralandırmasıdır. Envirochek filtreleri (Pall Corporation, Ann Arbor, MI), Envirochek HV filtreler (Pall Corporation), Filta-Max filtreler (Idexx, Westbrook, MA): Yöntem 1623 suda ookistleri Cryptosporidium ve Giardia kistleri yakalamak için dört halka örnek konsantrasyonu sistemleri vardır veya Sürekli Akış Santrifüj (Haemonetics, Braintree, MA). Ancak, Cryptosporidium ve Giardia (oo) kist kurtarma 1,14 kullanılan su kaynağı matrisi ve filtreleri bağlı olarak büyük farklılıklar var. Yeni teğet akış boş elyaf ultrafiltrasyon (HFUF) sistemi kısa bir süre Cryptosporidium ookistleri geri at daha verimli ve daha sağlam olması gösterilmiştir ve çeşitli su matrislerinden Giardia kistleri, dahası, diğer kapsül filtre seçeneği daha ucuzdurs ve aynı anda birden fazla patojen 1-3,5-8,10,11 konsantre olabilirsiniz. Ayrıca, Hill ve arkadaşları tarafından daha önceki çalışmalarda doğrudan Envirochek HV filtreleri 4 ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde HFUF Cryptosporidium ookistleri kurtarma geliştirilmiş olduğunu göstermiştir. Mevcut yöntem ek olarak modifiye metodu performansını iyileştirmek için rapor edilmiştir. Isı ile ayrışma asidin ayrılması prosedüre değiştirilmesi bazı matrisler 9,13 içinde manyetik boncuklar Cryptosporidium ayırma daha etkili olduğu gösterilmiştir. Bu protokol, ısı ile ayrışma adım yeni HFUF filtrasyon sistemini kullanan bir modifiye Yöntem 1623 açıklanmaktadır. Bu modifiye Yöntemi ile HFUF kullanımı mevcut EPA Method 1623 filtreleme seçenekleri için daha ucuz bir alternatif olduğunu ve bir çok mikroorganizma konsantrasyonunu izin vererek daha fazla esneklik sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Bu protokol, su bazlı tespiti için alternatif adımlar olarak teğet akış boş elyaf ultrafiltrasyon numune konsantrasyonu sisteminin kullanımı ve ısı ayrışma açıklar<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; Ve<em&gt; Giardia</emEPA Method 1623 kullanarak&gt; türler.

Su bazlı Algılamak için Teğet Akış Hollow-fiber Ultrafiltrasyon ve Isı Disosiyasyon Adımlar kullanır A Modifiye EPA Method 1623<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; Ve<em&gt; Giardia spp.</em

Cryptosporidium and Giardia species are two of the most prevalent protozoa that cause waterborne diarrheal disease outbreaks worldwide. To better ...

a-modified-epa-method-1623-that-uses-tangential-flow-hollow-fiber

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

20.3K Görüntüleme.  Office of Research and Development, US Environmental Protection Agency. Bu protokol, su bazlı tespiti için alternatif adımlar olarak teğet akış boş elyaf ultrafiltrasyon numune konsantrasyonu sisteminin kullanımı ve ısı ayrışma açıklar Cryptosporidium Ve Giardia türler.

Video: A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

Hücreler stellat Yedi Adımda

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

DNA ekstraksiyonu için A Simple Chelex Protokolü<em&gt; Anofel</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important plant parasitic nematodes. The microscopic second-stage juvenile (J2), molted once in the egg, is the infective stage. The J2s hatch from the eggs, move freely in the soil within a film of water, and locate root tips of suitable plant species. After penetrating the plant root, they migrate towards the vascular cylinder where they establish a feeding site and initiate feeding using their stylets. The multicellular feeding site is comprised of several enlarged multinuclear cells called 'giant cells' which are formed from cells that underwent karyokinesis (repeated mitosis) without cytokinesis. Neighboring pericycle cells divide and enlarge in size giving rise to a typical gall or root knot, the characteristic symptom of root-knot nematode infection. Once feeding is initiated, J2s become sedentary and undergo three additional molts to become adults. The adult female lays 150-250 eggs in a gelatinous matrix on or below the surface of the root. From the eggs new infective J2s hatch and start a new cycle. The root-knot nematode life cycle is completed in 4-6 weeks at 26-28&deg;C.
Here we present the traditional protocol to infect plants, grown in pots, with root-knot nematodes and two methods for high-throughput assays. The first high-throughput method is used for plants with small seeds such as tomato while the second is for plants with large seeds such as cowpea and common bean. Large seeds support extended seedling growth with minimal nutrient supplement. The first high throughput assay utilizes seedlings grown in sand in trays while in the second assay plants are grown in pouches in the absence of soil. The seedling growth pouch is made of a 15.5 x 12.5cm paper wick, folded at the top to form a 2-cm-deep trough in which the seed or seedling is placed. The paper wick is contained inside a transparent plastic pouch. These growth pouches allow direct observation of nematode infection symptoms, galling of roots and egg mass production, under the surface of a transparent pouch. Both methods allow the use of the screened plants, after phenotyping, for crossing or seed production. An additional advantage of the use of growth pouches is the small space requirement because pouches are stored in plastic hanging folders arranged in racks.

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Two distinct methods to screen plants with root-knot nematodes are described. The described approaches include high-throughput screens with nematodes in a nondestructive manner facilitating the use of these plants in breeding programs.

Kök-ur Nematod ile Yüksek ve Düşük Throughput Ekranlar Meloidogyne spp.</em

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important ...

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular environment. In order to increase throughput, FISH can be combined with flow cytometry (flow-FISH) to enable the detection of targeted nucleic acid sequences in thousands of individual cells. As a result, flow-FISH offers a distinct advantage over lysate/ensemble-based nucleic acid detection methods because each cell is treated as an independent observation, thereby permitting stronger statistical and variance analyses. These attributes have prompted the use of FISH and flow-FISH methods in a number of different applications and the utility of these methods has been successfully demonstrated in telomere length determination1,2, cellular identification and gene expression3,4, monitoring viral multiplication in infected cells5, and bacterial community analysis and enumeration6.
Traditionally, the specificity of FISH and flow-FISH methods has been imparted by DNA oligonucleotide probes. Recently however, the replacement of DNA oligonucleotide probes with nucleic acid analogs as FISH and flow-FISH probes has increased both the sensitivity and specificity of each technique due to the higher melting temperatures (Tm) of these analogs for natural nucleic acids7,8. Locked nucleic acid (LNA) probes are a type of nucleic acid analog that contain LNA nucleotides spiked throughout a DNA or RNA sequence9,10. When coupled with flow-FISH, LNA probes have previously been shown to outperform conventional DNA probes7,11 and have been successfully used to detect eukaryotic mRNA12 and viral RNA in mammalian cells5.
Here we expand this capability and describe a LNA flow-FISH method which permits the specific detection of RNA in bacterial cells (Figure 1). Specifically, we are interested in the detection of small non-coding regulatory RNA (sRNA) which have garnered considerable interest in the past few years as they have been found to serve as key regulatory elements in many critical cellular processes13. However, there are limited tools to study sRNAs and the challenges of detecting sRNA in bacterial cells is due in part to the relatively small size (typically 50-300 nucleotides in length) and low abundance of sRNA molecules as well as the general difficulty in working with smaller biological cells with varying cellular membranes. In this method, we describe fixation and permeabilzation conditions that preserve the structure of bacterial cells and permit the penetration of LNA probes as well as signal amplification steps which enable the specific detection of low abundance sRNA (Figure 2).

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

A novel high-throughput method is described that enables the detection and relative quantitation of small RNA and mRNA expression from single bacterial cells using locked nucleic acid probes and flow cytometry-fluorescence in situ hybridization.

Kilitli Nükleik Asit Sitometrisi-floresan Yerinde Hibridizasyon (LNA akış FISH): Bakteriyel Küçük RNA Algılama Yöntemi

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Glass Wool Filters for Concentrating Waterborne Viruses and Agricultural Zoonotic Pathogens

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration. Concentration methods tend to be specific for a particular pathogen group, for example US Environmental Protection Agency Method 1623 for Giardia and Cryptosporidium1, which means multiple methods are required if the sampling program is targeting more than one pathogen group. Another drawback of current methods is the equipment can be complicated and expensive, for example the VIRADEL method with the 1MDS cartridge filter for concentrating viruses2. In this article we describe how to construct glass wool filters for concentrating waterborne pathogens. After filter elution, the concentrate is amenable to a second concentration step, such as centrifugation, followed by pathogen detection and enumeration by cultural or molecular methods. The filters have several advantages. Construction is easy and the filters can be built to any size for meeting specific sampling requirements. The filter parts are inexpensive, making it possible to collect a large number of samples without severely impacting a project budget. Large sample volumes (100s to 1,000s L) can be concentrated depending on the rate of clogging from sample turbidity. The filters are highly portable and with minimal equipment, such as a pump and flow meter, they can be implemented in the field for sampling finished drinking water, surface water, groundwater, and agricultural runoff. Lastly, glass wool filtration is effective for concentrating a variety of pathogen types so only one method is necessary. Here we report on filter effectiveness in concentrating waterborne human enterovirus, Salmonella enterica, Cryptosporidium parvum, and avian influenza virus.

Glass wool filters have been used to concentrate waterborne viruses by a number of research groups around the world. Here we show a simple approach for constructing glass wool filters and demonstrate the filters are also effective in concentrating waterborne viral, bacterial and protozoan pathogens.

Konsantre Su Bazlı Virüsler ve Tarım Zoonotik Patojenler için Cam Yünü Filtreler

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration.  Concentration methods tend to be specific for a ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Neutrophils are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first to appear at sites of inflammation and infection, thus becoming the first line of defense against invading microorganisms. Neutrophils possess important antimicrobial functions such as phagocytosis, release of lytic enzymes, and production of reactive oxygen species. In addition to these important defense functions, neutrophils perform other tasks in response to infection such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. Cytokines recruit other leukocytes that help clear the infection, and inhibition of apoptosis allows the neutrophil to live longer at the site of infection. These functions are regulated at the level of transcription. However, because neutrophils are short-lived cells, the study of transcriptionally regulated responses in these cells cannot be performed with conventional reporter gene methods since there are no efficient techniques for neutrophil transfection. Here, we present a simple and efficient method that allows detection and quantification of nuclear factors in isolated and immunolabeled nuclei by flow cytometry. We describe techniques to isolate pure neutrophils from human peripheral blood, stimulate these cells with anti-receptor antibodies, isolate and immunolabel nuclei, and analyze nuclei by flow cytometry. The method has been successfully used to detect NF-&kappa;B and Elk-1 nuclear factors in nuclei from neutrophils and other cell types. Thus, this method represents an option for analyzing activation of transcription factors in isolated nuclei from a variety of cell types.

Neutrophils are the most abundant leukocytes in blood. Neutrophils possess transcriptionally regulated functions such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. These functions can be studied with the method presented here, which allows detection and quantification of nuclear factors by flow cytometry in isolated nuclei

Akım Sitometri tarafından İnsan Nötrofiller Nükleer Faktör Aktivasyon Algılama Basit ve Verimli Yöntemi

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

Görüntü tabanlı Sitometrisi Tekniği Granülosit Fonksiyonu Değişiklikleri değerlendirin<em&gt; İn Vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

İnfiltratif Lenfositlerinin Analiz Olmayan enzimatik ayırmak Taze İnsan Dokusuna Basit ve Hızlı Protokolü

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, which are expressed as minimum inhibitory concentrations (MICs) are used in research for antimicrobial development and monitoring of resistance development and in the clinical setting for antimicrobial therapy guidance. Dalbavancin is a semi-synthetic lipoglycopeptide antimicrobial agent that was approved in May 2014 by the Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of acute bacterial skin and skin structure infections caused by Gram-positive organisms. The advantage of dalbavancin over current anti-staphylococcal therapies is its long half-life, which allows for once-weekly dosing. Dalbavancin has activity against Staphylococcus aureus (including both methicillin-susceptible S. aureus [MSSA] and methicillin-resistant S. aureus [MRSA]), coagulase-negative staphylococci, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus anginosus group, &#946;-hemolytic streptococci and vancomycin susceptible enterococci. Similar to other recent lipoglycopeptide agents, optimization of CLSI and ISO broth susceptibility test methods includes the use of dimethyl sulfoxide (DMSO) as a solvent when preparing stock solutions and polysorbate 80 (P80) to alleviate adherence of the agent to plastic. Prior to the clinical studies and during the initial development of dalbavancin, susceptibility studies were not performed with the use of P-80 and MIC results tended to be 2-4 fold higher and similarly higher MIC results were obtained with the agar dilution susceptibility method. Dalbavancin was first included in CLSI broth microdilution methodology tables in 2005 and amended in 2006 to clarify use of DMSO and P-80. The broth microdilution (BMD) procedure shown here is specific to dalbavancin and is in accordance with the CLSI and ISO methods, with step-by-step detail and focus on the critical steps added for clarity.

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

Dalbavansin için Başvuru sıvı mikrodilüsyon yöntemi<em&gt; İn Vitro</emAerobik Olarak Büyüyen Bakterilerin&gt; Duyarlılık Testi

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of monocytes induces effector functions and a concomitant shift from oxidative to glycolytic metabolism that is accompanied by increased glucose transporter expression. This increased glycolytic metabolism is also observed for trained immunity of monocytes, a form of innate immunological memory. Although in vitro protocols examining glucose transporter expression and glucose uptake by monocytes have been described, none have been examined by multi-parametric flow cytometry in whole blood. We describe a multi-parametric flow cytometric protocol for the measurement of fluorescent glucose analog 2-NBDG uptake in whole blood by total monocytes and the classical (CD14++CD16-), intermediate (CD14++CD16+) and non-classical (CD14+CD16++) monocyte subpopulations. This method can be used to examine glucose transporter expression and glucose uptake for total monocytes and monocyte subpopulations during homeostasis and inflammatory disease, and can be easily modified to examine glucose uptake for other leukocytes and leukocyte subpopulations within blood.

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

Basit Akım Sitometrisi Yöntemi Tüm Kan Monosit subpopulations için glikoz alımını ve Glikoz Transporter Anlatım Tedbir

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...