We thank Elisha Wood-Charlson, Jackie Mueller, Karen Weynberg, and Kathy Morrow for their help and constructive input on this manuscript. We also thank the crew and captain of the Hanse explorer which provided us with a perfect working environment to conduct large parts of this research. Further we would like to thank the three anonymous reviewers for their time and helpful comments to improve the manuscript. This work was funded by the NSF Dimensions of Biodiversity and PIRE awards DEB-1046413 and OISE/IIA-1243541, respectively, the Gordon and Betty Moore Foundation, Investigator Award 3781, and the CIFAR Integrated Microbial Diversity Fellowship IMB-ROHW-141679, all to FR.

The authors have nothing to disclose.

Burada sunulan yöntemler sucul ekosistemlerde viral ve mikrobiyal dinamikleri kapsamlı bir değerlendirme oluşturmak için bir araç sağlayacaktır. Onlar mikrobiyal topluluklar mevcut organik ve inorganik kaynakların ayakta stok ölçmek için ve viral ve mikrobiyal topluluk mevcut makyaj karakterize hedeflenir. Sonraki viral bolluk ve mikrobiyal bolluk ve biyokütle miktarının için, genomik sekans bilgisi onların toplum yapısını ve fonksiyonunu gösterir. Bütün yöntemler geliştirdi veya uzak alan yerlerde uygulama için izin vermek için modifiye edilmiştir. Ancak kontrollü laboratuvar ortamlarında eksikliği doğal olarak hatalar için bazı potansiyel oluşturur. Burada değerlendirilen parametreler her biri ile ilişkili bazı uyarılar tartışır. Sonraki kirlenme potansiyeli numune sırasında da analitik sürecinde hata verim potansiyeli parametrelerin bazılarını ele. Çözünmüş Organik Karbon Karbon kontaminasyon (akış aşağı örnekleme ya da bir tekne veya dalgıç yakın), numune hazırlanması sırasında (ekipman veya kasıtsız taşıma kontaminasyon) ve hatta örnek depolanması sırasında (diğer bir numune dondurucuda organik ihtiva eden numune alma prosedürleri sırasında oluşabilir çözücü / uçucu maddeler). Her bir örnek tehcir kontaminasyon ek bir kaynak teşkil gibi, mümkün olduğunca az işlem adımı olarak kirlenme davranış çeşitli kaynaklardan önlemek için. Örnek değil, asitle yıkanmış veya yakılan herhangi bir madde ile temas ettirilmemelidir. Son olarak, uçucu organik maddeler ihtiva etmeyen numuneler için özel bir depolama dondurma sisteminin tayin uzun depolama dönemlerinde numunelerinin bütünlüğünü sağlayacaktır. Örnekleri konsantre HCI ile DOC örneklerin uzun bir seyahat süresi asitlenme sırasında donmuş muhafaza edilemezse (38-41 açıklandığı gibi) uygulanabilir bir alternatif olabilir. Ölçüm doğruluğu DOC konsensüs referans malzemeler Tescil kullanılmalıdır doğrulamak içinDOC ölçüm sırasında durum daha ziyade çalışır. Onun DOC içeriği 42 çok kararlı olduğu için, özellikle derin deniz suyu (&gt; 2000 m) referanslar analitik makinenin performansını değerlendirirken değerlidir. Partikül Organik Madde Organik karbon kirlenmesini önlemek için ek olarak, POM örnekleme filtre hacminin doğruluğunu sağlamak için özel dikkat gerektirir. 500 ml hedeflenen birim herhangi bir olası nedenle sapması durumunda bu, bunun türetilmiş olan süzüntüye filtresi üzerinde yakalandı POM miktarını ilişkilendirmek için dikkat edilmesi gerekmektedir. İnorganik Besinler Organik karbon örnekleme gibi, dikkat tekneler veya atıksu deşarjları 12 gibi çeşitli kaynaklar tarafından üretilen mümkün besin örnek kontaminasyon ödenmelidir. 0.8 um bir itibari gözenek boyutlarına sahip organik karbon örnekleme için kullanılan filtreler, tüm mikrobiyal biyokütle ve sh dahil değilOuld nedenle, bu filtre etme adımı için 0.2 um filtre ile değiştirilebilir. Ayrıca, tespit limitleri besin örnekleri ile bir sorun teşkil; özellikle çok sayıda mercan kayalığı yerlerde (örneğin, Cotner ve ark. 43) etrafında oligotropik yüzey suyu. Deteksiyon limitleri kabaca yaklaşık 0.1, 0.2, ve amonyum, nitrat ve nitrit ve orto-fosfat için 0.1 umol / L (36,12,37 bakınız) Mikroskopla inceleme Mikroskopi slaytlar örnekler görüntü analizi konsantrasyon değişimleri yanında başka hataları potansiyelini verir. Örneğin, görüntüler görüş alanının bazı bölgelerinde odak dışında, ve diğerleri odak olabilir. Yüksek oranda saf bir alümina matrisi filtresi, çok katı bir filtre tipi olduğu gibi, filtrenin altında herhangi bir kalıntı bütün filtre sürgüye bir açı ile oturmak neden olabilir. Sonuç olarak, görüntü yeniden belirli bir filtre için görüş alanının farklı yerlerinde odak dışına sürekli olabilir,mikroskop uyum zellikler de içerir. Gözlenmektedir halinde filtrenin alt sağlanması, filtreler yeniden yerine takılması temiz, bu iyileştirebilir. Aynı zamanda, bazı durumlarda, virüs ve mikropların bulunabilir olduğu iki odak düzlemi mevcut olabilir. Bu montaj üzerine filtreden müstakil olma ve sayıları güvenilmez yapabilirsiniz kapak kayma alt kadar yüzen lekeli nesnelerin sonucudur. Bu nedenle her zaman süreci boyunca, numunelerin kalitesini kontrol etmek için önerilmektedir. Akış sitometrisi Mikroskobu örnekleri ile olduğu gibi, doğal bir analitik sürecin düzeltme gerektiren numuneler akım sitometri arasındaki farklılıkları meydana olabilir. Örneğin, aletin hassasiyetine bağlı olarak, loş flüoresan oluşturan Prochlorococcus hücreleri gürültü seviyesinin altında olabilir ve sayısal olmayacaktır. Boncuk onaylamak için, örneğin bir iç numune kontrol (olarak hizmet ettiğini cihazın respfloresan sinyalleri onse günden güne tutarlı (ve çalışma sırasında kendisi sabit kalır). Bilinen yoğunluklarda bu örneğe eklendi, bunlar da örnek hacim akışını kontrol etmek için bir iç kontrol olarak görev yapabilir. Ancak, her zaman çözülmüş ve 96 oyuklu plaka çalışmalar arasında işleme örneği için bir ek biyolojik kontrol sağlamak için, ilgi konusu örnekleri ile birlikte lekeli bir önceden dondurulmuş &quot;standart&quot; deniz suyu örneğinin bir bölümüne çalıştırmak için tavsiye edilir. Yere bağlı olarak, deniz suyu örnekleri birbirinden çok farklı görünebilir. &quot;Temsilcisi&quot; popülasyonları sıralama ve daha sonra bir epifluorescent mikroskobu (EM) kapsamında görüntüleme hızlı ya Synechococcus sp. Veya fotosentetik ökaryotlar gibi fitoplankton popülasyonlarını doğrulamak için iyi bir yol olabilir. Onlar çok hızlı solmaya çünkü Prochlorococcus hücreler EM altında genellikle görünmez. Buna ek olarak, bir, Synechococcus sp klorofil için. Ayrıca, ph içerenklorofil A (660-700 nm) daha kısa dalga boyunda (540-630 nm) ışık yayar otopigment phycoeurythrin (PE). Synechococcus hücreler mavi / yeşil ışık (470-490 nm) ile heyecanlı zaman 510 nm altında ışığın tüm dalga boylarını kaldırır bir emisyon filtresi altında inceledi, onlar altın görünecektir. Aynı ışık dalga boyu ile uyarıldığı zaman Karşılaştırma ile, ökariyotik fraksiyonu, kırmızı bakacağız. Viral Metagenomiks Bu VLP konsantrasyon ve depolama süreci kurtarıldı toplumu etkilediği unutulmamalıdır. Enfeksiyon, viral parçacık kaybı sürecinin her aşamasında meydana gelebilir ve bu yüzden viral saflaştırma ve zenginleştirme protokolleri seçimi sonuçta ortaya çıkan virüs metagenomes 44,45,18 gözlenen taksonomik bileşim ve çeşitliliğini etkileyebilir. Numunelerin Konsantrasyon TFF&#39;ye 19 veya kimyasal-bazlı çökeltme 20 kullanılarak yapılabilir. Kimyasal bazlı yaklaşım, Posit içindeively demir iyonları çözeltisi kabarırlar ve 8 mikron filtre kullanılarak geri kazanılabilir büyük (&gt; 8 um) demir viral kompleksler oluşturarak doğal olarak negatif yüklü bir viral partikülleri bağlanan ücret. Daha sonra demir viral partikülleri kenetlendiği ve nükleik asit ekstre için 20 konsantre edilmiş viral partikülleri bırakarak, magnezyum, askorbik asit ve EDTA kullanılarak yeniden çözündürülür. Bu iki akım yöntemleri karşılaştırarak sonra, biz demir klorür yöntemi TFF viral konsantrasyona göre daha az zaman alır, ama bazı uyarılar verebilir sonucuna varılmıştır. Bu demir viral bu ayrışma ve çözünme Bulunan gerektiren iki kat çözünme askorbik asit bozulmadığında sürdürülebilmesi için rapor 20&#39;den fazla konsantre edilmiş, magnezyum-askorbik asit-EDTA çözeltisi. Kenara bu sorundan, protokol 0.2 mikron süzme kullanılarak mikrobiyal kirlilikleri kaldırarak, yalnız boyut-fraksinasyonu viral partikülleri arındırır. Büyük virüsler filt geçmezlerer (örneğin, Yang ve ark. 46) ve böylece metagenome tespit olmayacak, bazı bakteriler yaparken (McDole, yayınlanmamış veri). Büyük virüslere karşı ayrımcılık yaparken bu bakteriyel kontaminasyon sonuçlanır. Bu özel bir sorun tam da TFF konsantrasyonu ile bağlantılı olarak mikropların kaldırılması için geçerlidir. Kloroformla muamele dış lipid zarlar 47 ile kloroform duyarlı virüsleri uzaklaştırmak üzere gösterilmiş olduğu gibi, bazı çalışmalarda, 0.22 um filtre bakterilerin büyük bir kısmı bertaraf etmek için kullanılabilir olduğunu düşündürmektedir. Ayrıca, sunulan yöntem esas olarak bakteriyofaj, deniz ortamında genetik malzemenin en bol bulunan taşıyıcı hedef olduğunu belirtmek gerekir. Faj genelde düşünüldüğü değil çünkü yaygın onlar kloroform tedaviye daha dirençli lipidler 48 içeren. Bildiğimiz kadarıyla bir &quot;catch-all&quot; yöntemi bugüne kadar yok. Burada sunulan yöntem, ou uyarlanmıştırkutup sistemlerine tropikal kapsayan çeşitli deniz ortamlarda son 10 yılda r saha deneyimi. Mikrobiyal Metagenomiks Mikroplar (örneğin, bakteri ve arkebakteriler) için Metagenomic kütüphanelerin inşa edilmesi, bu da kütüphane hazırlanması için gerekli olan en az bir DNA konsantrasyonları üretmek için daha kolay olduğu gibi virüs metagenomes daha basittir. Çoklu değiştirme amplifikasyonu (MDA) dayalı bağlayıcı amplifikasyon shotgun kitaplıkları (LASLs) 17,49,50 ve tüm genom amplifikasyonu sekanslama için yeterli bir DNA üretmek için iki en yaygın olarak kullanılan yöntemlerdir. Mikrobiyal metagenomes yüksek DNA konsantrasyonları elde etmek MDA kullanımı bazen gereklidir. Ancak bu tür dinoflagellat minicircles bir overamplification olarak dizi verilerinin kirliliklere neden olabilir. MDA yöntemler olmayan nicel sonuçlar 51,52 ile sonuçlanan, tercihen tek-sarmallı ve dairesel DNA&#39;nın çoğaltılması için önceden bilinmektedir. Optimize LASLs 50 dolayısıyla mikrobik ve sıralama için viral metagenomic DNA hem yükselterek daha iyi bir alternatif olarak hizmet verebilir yaklaşım. Bu LASLs yaklaşım, birden çok adım vardır gelişmiş donanım gerektirir ve dsDNA şablonları ile sınırlı olduğunu not etmek önemlidir. Ayrıca, doku, DNA ekstraksiyon kiti Gram pozitif ve Gram negatif filumayla hem DNA ayıklamak için gösterilmiştir, ancak etkili parçalanmasıyla inatçı mikrobiyal takson veya bunların ilişkili yapılar için henüz doğrulanmadı (örneğin, belirli archaea, endosporlar, ya da mantar sporları) . Bu nedenle boncuk dayak aşaması bazı mikropların DNA elde etmek için gerekli olabilir. Bu kapsamlı değerlendirmeler viral ve mikrobiyal ekosistem işleyişi daha iyi anlaşılmasına neden olacaktır. Birkaç çalışma önerilen tüm parametreleri değerlendirmek için çaba üstlenmiş olsa da, birçok seçilmiş olanları soruşturma edilmiştir. Nelson ve diğ. 53 betw bağlantı önerilendeniz sularında göre hem DOC ve Bacterioplankton konsantrasyonlarda een özel resif habitatları ve fakirleşme. Bu konsantrasyon değişiklikler Bacterioplankton topluluklar farklı farklılaşmalar ile eşlik etti. Dinsdale ve diğ. 5, artan insan kaynaklı etki mikrobiyal hücreler ve virüs benzeri parçacıkların 10 kata kadar yüksek bolluk eşlik ettiğini göstermiştir. Yaşadığı çevre adalarda deniz sularında Mikrobiyal topluluklar da heterotroflara ve potansiyel patojenlerin 5 büyük kesirler vardı. Nihayet McDole vd. 4 insan faaliyetleri macrobes pahasına, mikroplara enerji kayması olduğunu, microbialization puanı tanıtarak gösterdi. Spesifik mikrobiyal ve su kimyası parametreleri üzerinde duruldu Bu çalışmalar, deniz ekosistemlerinin biyokimyasal yapısına yeni bakış açıları sağlayacaktır. Sıcaklık ve pH değerleri, balık biyokütle ve diversi gibi - ekosistem izleme çabalarının geleneksel verileri birleştirerekty, bentik kapağı, ya da insan darbeye maruz kalma - su kimyası ve mikrobiyal değerlendirmeler ile, muhtemelen daha ayrıntılı hedeflenen koruma çabalarına neden olabilir daha duyarlı çevre izleme çabaları, neden olacaktır.

Deniz ekosistemlerinin yırtıcı hayvanları biyokütle elde edilebilen besin değerinde gelen değişikliklere neden düzensizlikler geniş tabi tutulur. Son on yılda, birden fazla çalışmalar deniz ekosistemleri 1-4 mikrobiyal toplulukların önemini göstermiştir. Bu, bakteriyel ve viral eden değişiklikler yakın deniz ortamları 5 genel bozulması ile bağlantılı olduğu görülmektedir. Bu değişiklikler oksijen kullanılabilirliği veya karbon remineralizasyonu 6,7 olarak su kolonunda değişmiş jeokimyasının tarafından kolaylaştırılabilir. Makroorganizmalarının, su kimyası ve mikrobiyal aktivite geri besleme döngüsü arasındaki bağımlılık sonucunda ekosistem bozulma 8 hızını hızlandırabilir. 1970&#39;li ve 80&#39;li yıllarda çok sayıda girişimleri deniz ekosistemlerinde 9-11 biyokimyasal döngüleri çözülmeye yapılmıştır. Bu erken çalışmalar için temel zorluklardan biri eksikliği oldustandart yaklaşımlar değerlendirildi biyokimyasal parametreleri ölçmek için. Öncelikle deniz suyu besin 12,13 mevcut protokoller, oturuyormuş, karbon dinamiklerinin değerlendirilmesi ve mikrobiyal topluluk yapısı mevcut araç ve yöntemlerle sınırlı. JGOFS EqPac yöntemler karşılaştırması ile, keskin ve ark. 14, ilk kez çözülmüş organik karbon (DOC), konsantrasyon değerlendirmeler için güvenilir ve standart bir protokol için önerilmektedir. 2000&#39;lerin başında analitik zorluklar, büyük ölçüde çözüldüğünü mikrobiyal topluluk için mevcut kaynakları belirlemek ve (DeLong 15) kurulmuştur kontrollü kültür ortamlarında mikrobiyal topluluklar karakterize etmek yaklaşımları için. O zaman geleneksel sıralama yöntemleri büyük ölçüde ekili klonal kültürleri dayanıyordu. Doğal örneklerinin Erken çevre gen sıralama mikrobiyal biyoçeşitlilik çoğunluğu Cultiv tarafından kaçırılmış olduğunu, ancak, ortayatirme tabanlı yöntemler 16. 2002 yılında Breitbart ve ark. 17 uncultured deniz virüs topluluklarının tüm genomunu dizilemek için bir yöntem kurma çevre deniz suyu örneklerinde viral topluluğunu ifade etmek için ilk kez tüfek sıralama kullanılır. En kültürüne zor gibi mevcut mikrobiyal değerlendirmeler kapsamında, virüsler hala, özellikle altında çalışılmış kalır ve böyle 16S ribozomal RNA (rRNA), tipik çeşitliliği ve toplum profilleme değerlendirmek için kullanılan genler bir evrensel korunmuş işaretleyici yoksundur. Metagenomic sıralama yaklaşım karmaşık viral toplulukları incelemek için kültür-bağımlı ve gen hedefli yöntemlerine bir alternatif sağlar. Deniz suyundan üretilen ilk viral metagenomes Sanger sıklıklaştırıcı 17 kullanılarak dizildi iken, yeni nesil dizileme teknolojileri ve gelişmiş moleküler tekniklerin geliştirilmesi metagenomic çalışmalarda 18 hızlı bir artışa yol açmıştır </s&gt; kadar. Viral metagenomics için mevcut laboratuar akışı bir nükleik asit (DNA veya RNA) ekstre etme, bir kütüphane hazırlanması ve sekanslama 19-21 ardından viral partiküllerin ayrılması, zenginleştirme ve / veya konsantrasyonunu içermektedir. Dünya esastır etrafında çeşitli sistemlerde veri setleri karşılaştırarak, sucul ekosistemlerde viral, mikrobiyal ve biyokimyasal işleyişi üzerinde mevcut bilgilerini ilerletmek için. Ancak, kurulan protokolleri büyük ölçüde kolayca erişilebilir laboratuvar imkanları ile kıyıya yakın ortamlar için geliştirilmiştir. Böylece, standart alan yöntemlerin eksikliği, bu çapraz ekosistem karşılaştırmalar engellemektedir. Burada iyice test getiriyordu ve iyi Uzak alan yerlerde kullanılmak için sanat araştırma protokollerinin devlet uyarlamalarını standardize. Bu yöntemler, son on 5,22 kapsayan birçok çalışmada kullanmak yarar ve şu anda NOAA yanı sıra, çeşitli deniz laboratuarlar tarafından kullanılanResif Değerlendirme ve Pasifik Okyanusu 4 genelinde İzleme Programı (RAMPA). Örnekleme protokoller su kimyası parametreleri (inorganik ve organik karbon konsantrasyonları, inorganik besin konsantrasyonu), viral ve mikrobiyal bereket include (direkt bakteri sayıları, direkt viral sayıları ve heterotroftan oranları vs autotroph değerlendirmek için flow sitometri) ve viral ve mikrobiyal topluluk yapısı ve metagenomic analizi ile metabolik potansiyel (genel bir bakış için bakınız Şekil 1). Burada tarif edilen yöntem ile elde edilen sonuçlar, kapsamlı akuatik ekosistemlere karakterize etmek için gerekli olan ana biyokimyasal arka parametreleri aydınlatmak için gereklidir.

<table><tbody><tr><td>Niskin collection and processing units (Hatay Niskins)</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;Figure 1&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Filtration setup</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;Figure 1&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>32-36% Hydrochloric acid (HCl)</td><td>Fisher Sci</td><td>A508-212</td><td></td></tr><tr><td>High-density polyethylene (HDPE) container</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, 5 Gallon HDPE UN Certified Pail with Snap-On Lid</td></tr><tr><td>Combustion oven (550 &amp;deg;C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 ml HDPE vials&amp;nbsp;</td><td>Fisher Sci</td><td>02-896-2B</td><td></td></tr><tr><td>25 mm GF/F filter</td><td>Fisher Sci</td><td>09-874-64</td><td></td></tr><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>Fisher Sci</td><td>XX62-000-06</td><td></td></tr><tr><td>Sterile, non-powdered gloves</td><td>Fisher Sci</td><td>19-170-010B</td><td></td></tr><tr><td>Bilge pump&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Thirsty Mate 124PF</td></tr><tr><td>20 L collapsible low-density polyethylene carboy</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Reliance Fold A Carrier II</td></tr><tr><td>Tangential flow filter (TFF) ultrafiltration hollow fiber cartridges</td><td>Amersham</td><td>CFP-2-E-9A</td><td></td></tr><tr><td>Platinum-cured silicon tubing for TFF</td><td>Cole Parmer</td><td>96440-82</td><td></td></tr><tr><td>Hose clamps</td><td>Cole Parmer</td><td>P-68007-23</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-77410-10</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH) solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>21162</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m Polycarbonate track-etched membrane filter</td><td>Fisher Sci</td><td>09-300-61</td><td></td></tr><tr><td>8.0 &amp;micro;m Polycarbonate track-etched membrane filter</td><td>Fisher Sci</td><td>09-300-57</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m Polyvinylidene difluoride cylindrical filter</td><td>Fisher Sci</td><td>SVGP01050</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m Polyvinylidene difluoride cylindrical filter</td><td>Fisher Sci</td><td>SVHV010RS</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic nylon mesh</td><td>Sefar</td><td>03-125-37</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Plastic scintillation bottle</td><td>Fisher Sci</td><td>03-341-72C</td><td></td></tr><tr><td>Clean bucket (10-20 L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>32% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>25% Glutaraldehyde</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.02 &amp;micro;m High-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring&amp;nbsp;</td><td>Fisher Sci</td><td>6809-6002</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m High-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring</td><td>Fisher Sci</td><td>6809-6022</td><td></td></tr><tr><td>10,000x SYBR Gold nucleic acid stain</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>DAPI solution 25 &amp;micro;g/ml</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Molecular grade water</td><td>sigma aldrich</td><td>W-4502</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Fisher Sci</td><td>BP351-500</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Fisher Sci</td><td>BP399-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Sci</td><td>G31-500</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Fisher Sci</td><td>12-550-123</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher Sci</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>Delicate task wipe&amp;nbsp;</td><td>Fisher Sci</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>Slide station with vacuum pump</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;Figure 3&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DNA extraction kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952.1</td><td>Nucleospin tissue kit</td></tr><tr><td>Proteinase K (20 mg/ml)</td><td>Lifetechnologies</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>200-proof Ethanol</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15058</td><td></td></tr><tr><td>Red cap: Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler&amp;nbsp;</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45503-88</td><td></td></tr><tr><td>Cesium chloride (CsCl)</td><td>Fisher Sci</td><td>bp1595-500</td><td></td></tr><tr><td>60 ml Syringe</td><td>Fisher Sci</td><td>13-6898</td><td></td></tr><tr><td>0.02 &amp;micro;m Alumina matrix disposable syringe filter</td><td>Fisher Sci</td><td>O992613</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-clear centrifuge tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-swinging bucket rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>333790</td><td>SW41 Ti Rotor&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DNase I (100 units/&amp;micro;l)</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Fisher Sci</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Fisher Sci</td><td>BP228-100</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>sigma aldrich</td><td>G-1767</td><td></td></tr><tr><td>1x Tris-EDTA (TE) pH 8.0</td><td>Fisher Sci</td><td>BP2473-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Fisher Sci</td><td>02674-25</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;g/ml Proteinase K</td><td>Fisher Sci</td><td>BP1700-500</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Sci</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1</td><td>sigma aldrich</td><td>p3803</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Sci</td><td>BP2618-500</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Oak Ridge tube</td><td>Fisher Sci</td><td>05-562-16B</td><td></td></tr></tbody></table>

unraveling the unseen players in the ocean - a field guide to water chemistry and marine microbiology

Burada uzak deniz ortamlarında kullanım için uyarlanmış iyice test ve standardize araştırma protokolleri bir dizi tanıtmak. Örnekleme protokolleri mikrobiyal topluluğun (çözünmüş organik karbon, partikül organik madde, inorganik besinler) için mevcut kaynakların değerlendirilmesi ve doğrudan viral ve mikrobiyal sayım yoluyla viral ve bakteriyel toplulukların kapsamlı bir açıklama (autofluorescent mikrop numaralandırma içerir ve viral ve mikrobiyal metagenomes inşaatı). Biz zaten kurulmuş protokolleri ve geliştirilen en son bazı teknikler içeren bilimsel disiplinlerin bir dağınık alanını temsil yöntemleri, bir arada kullanın. Viral ve bakteriyel topluluk karakterizasyonu için kullanılan, özellikle metagenomic dizileme teknikleri, ancak son yıllarda kurulmuştur, ve böylece hala sürekli iyileştirme tabi tutulur. Bu örnekleme ve örnek işleme prosedürleri Curren çeşitli yol açmıştırTLY kullanım. Burada sunulan yöntemlerin seti toplamak ve çevre örnekleri işlemek için güncel yaklaşım kadar bir sağlar. Bu protokoller ile ele Parametreler karakterize ve viral ve mikrobiyal topluluk dinamiklerinin altında yatan mekanizmaları anlamak için gerekli bilgilere minimum verim. Bu kapsamlı araştırmalar yapmak için yönergeleri takip etmek kolay verir ve her tekniğe uygun kritik adımları ve potansiyel uyarılar tartışır.

Mikroskopla inceleme Mikroskopi örnekleri ve istenilen kalitede olmasını sağlamak için derhal analiz edilmelidir olabilir. Bolluk ve bakteri topluluğunun büyüklüğü dağılımını ölçmek için, DAPI slaytlar Epifloresans mikroskobu ile incelenir: (Şekil 6A) (uyarma / emisyon. 358/461 nm, McDole ark 2012 bakınız). Hücre sayımı ve boyutları görüntüleme yazılımı (örneğin, ImagePro veya ImageJ) kullanılarak toplanabilir. Tüm hücreler, aşağıdaki denklemi kullanarak, yarı küresel kapaklar ile silindirlerin şekline sahip varsayımı yaparak elde edilir uzunluk ve genişlik ölçümleri hücre hacimleri (V) &#39;den: V = π / 4 × 2 w (L - / &#39;3 w) L uzunluğu ve w, burada her bir hücre 23,4 arasında genişliğidir. Mikrobiyal biyokütle sonra fo önceden kurulmuş boyutu-bağımlı ilişkileri kullanılarak tahmin edilebilirr deniz mikrobiyal topluluklar 24. Genellikle deniz bakteri 0.1-4 mikron uzunluğunda değişir, ancak bazı yerlerde ~ 8 mikron kadar gidin. DAPI ile boyanmış filtreler (0.2 mikron) sadece bakterileri gösterecektir ederken, SYBR Altın leke (0.02 mikron) için kullanılan filtreler bakteri ve virüs içermez. Virüslerin bolluğu ölçülmesi mikroplar için aynı protokol izlenmiş, ancak 325-375 nm&#39;lik bir eksitasyon kullanılacak ve maksimum emisyonu 537 nm (Şekil 6B) yer almaktadır. Niceliksel veri oluşturmak için örnekleme hacminin, orjinal numune içinde viral bolluğuna bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. Doğru hacimli iyi suyun belirli bir vücut için ampirik olarak belirlenir filtre. Viral konsantrasyonları ile örneklerini içeren mikrograflar örnekleri, Şekil 7&#39;de gösterilmektedir. Önceki çalışmaların sonuçları Microbe bu virüs önermekoranları (VMR), genellikle mercan resif sistemlerde yaklaşık 6 ortalama (Knowles, yayınlanmamış veri), sucul sistemlerde 25-29 1-50 aralığı, ve arasında 3 ve 20. Akış sitometrisi Doğrudan sayımı ve mikrobiyal topluluğun büyüklüğü tahmin ek olarak, akış sitometrisi ile, heterotrofik mikroplara ototrofik oranının değerlendirilmesi daha Toplanan numunelerden (Şekil 8 &#39;de verilen çıkış sitometri örnek teşkil eden bir akış) elde edilebilir. Toplam bakteri hücre sayısını belirlemek için örnekler SYBR Green I ile boyanmış ve bir 530/30 bant-geçiş filtresi ile, bir foto-multiplikatör tüpü tespiti için kullanılır. Klorofil ve phycoerytherin (585/42 bant-geçiş filtresi) (arka 675-735 nm arasında bir aralıkta ortaya çıkan geri LP aynalara) bir kanal, boyanmadan örneklerde ototrofların bolluğu saymak için kullanılır. Heterotrofik mikropların bolluğu, olmayan girdilerin gelen ototrofik sayıları belirlemek içinlekeli kısım, daha sonra SYBR lekeli toplam sayısı (McDole ve ark. sunulan) çıkartılır. Viral Metagenomiks Viral metagenomik toplum yapısını ve işlevini belirlemek için toplam genomik sekans bilgileri kullanılarak, viral ekoloji bir kültür-bağımsız bir moleküler yaklaşım kullanır. Metagenomiks küresel ölçeklerde 30 karmaşıklığı ve yerel 17 viral toplulukların çeşitliliği anlayışımızı ilerlemektedir. Viral metagenomic verilerin analizi için biyoinformatik araçlar geniş bir dizi son gelişmeler metagenomics merceğinden daha kapsamlı bir bakış virosphere ve izin, hesaplamalı darboğazları azalmıştır. Burada sunulan yöntemler, konsantrasyonu artıkları ve selüler malzemenin ayrılması için ağ gözü, büyük gözenekli naylon ile ön filtreleme bir kombinasyonu kullanılarak deniz suyundan izole edilmesini ve viral partiküllerin zenginleştirme vurgulamakTFF, (Şekil 3) ve daha sonraki bir 0.45 um filtre ile numuneler daha büyük hücreler ayıklandı. Bu yöntem kabaca bize küçük hacimlerde aşağı süreçlerini gerçekleştirmek için izin veren bir 100x konsantre örnek (Şekil 5B-5E) üretir. Viral lizat kalan herhangi bir mikrobik hücrelerin büyümesini engelleyen ve bu yüzden alan istasyonu ve laboratuar arasında uzun geçiş süresi esnasında, örneğin viral miktarındaki değişim için, kloroform genellikle depolama için% 2&#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar ilave edilir. Izolasyon ve VLPler Saflaştırma işleminden sonra, örneğin SYBR Gold gibi nükleik asit boyaları ile birlikte bir epifluorışıma mikroskopi viral partiküllerin varlığı ve saflık (Şekiller 5B-5 £) doğrulamak için kullanılır. Burada, Güney Line Adası mercan kayalığı iki viral metagenomes sunmak, özellikle, Starbuck (STAR7) ve Millennium (CAR9; önceden Caroline olarak da bilinir) adaları. 120 uL sam toplam hacmibölüm 3.7 ve 5.2&#39;de anlatıldığı gibi ple su 10 metre derinlikte her siteden toplanmış ve işlenmiştir. Paragraf 4 (Şekil 5B) &#39;de tarif edilen yönteme göre belirlenmiş olarak sezyum klorür gradyanı ile santrifüjleme saflaştırılan VLPler CAR9 (Şekil 5D), 3.3 8 x 10 parçacık / ml STAR7 için ml başına 2.9 x 10 9 parçacıklar olmuştur. Bu örneklerden izole DNA toplam miktarı yaklaşık 400 NanoDrop ölçümüne dayanan ng. DNA dizi verilerinin özellikleri Tablo 1&#39;de sunulmuştur. Mevcut veritabanları kullanılarak benzerlik araştırmaları dayanarak Phi29 polimeraz kullanılarak büyütülmüş ve 2011 yılında Çevre Genomik Çekirdek tesisi ile dizildi, dizilerin çoğunluğunun (&gt;% 70) sık sık sona erdi uncharacterized, yani, bilinmeyen kökenleri ve işlevleri. Benzer şekilde, burada sunulan iki viromes bilinmeyen dizilerin fazla% 97 sunulmaktadır. Bunun bir sonucu olarak, veritabanı olmayanbağımlı analiz analizi için kullanılan ve (viral metagenomics içinde &quot;karanlık madde&quot; araştırma fırsat yeni bir kol açıldı Seguritan ve ark. baskıda). Mikrobiyal Metagenomiks Mikrobiyal metagenomes analizi mikrobiyal topluluk mevcut karakterizasyonu ve bu toplulukların işlevsel açıklaması için izin verir. Örnekler macrobial toplum yapısındaki değişikliklere veya mevcut besin ve türlerin zenginliği ve onların baskın metabolik yollar (; Kelly ve ark 2014. Şekil 9) arasındaki patojenlerin ve şiddeti 5,22 veya karşılaştırmaların varlığı tahminlerini içermektedir. Su Kimyası Su kimyası parametreler genellikle istenen verileri oluşturmak için kapsamlı analitik işleme almak; DOC analizi için numuneler yüksek sıcaklık katalitik oksidasyon 31,3 yoluyla ölçülecektir2, Akış Enjeksiyon Analizi 36,12,37 tarafından elementer analizör 33-35, ve inorganik besin bağlanmış izotop oranı kütle spektrometresi ile partikül organik madde (POM). Tüm analizler başarıyla tamamlanmasından sonra, olarak Tablo 1&#39;de gösterilen bilgiler mikrobik ve viral toplulukların karakterizasyonu tamamlamak için hazır olacaktır. Bu bilgiler organik karbon ve azot örneklerinin kararlı izotop oranları ile iltifat olabilir ve ototrofların ve heterotroflara arasındaki oranlar (McDole ark. Sunulmuştur) (Haas vd. 35 bakınız). <img alt="Şekil 1," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig1highres.jpg" width="600" /> Protokol bölümünde açıklanan yöntemlerden Şekil 1. Bakış. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig1highres.jpg" target="_blank">Bu Figu büyük halini görmek için buraya tıklayınız</a>yeniden. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52131/52131fig2highres.jpg" /> Şekil 2. Örnek işleme teçhizat kurulum. Burada tanıtılan filtrasyon kurulumu (şematik çizim, gerçek resmi sağ paneli sol) mutlaka örnekleri oluşturmak için gerekli değildir ama önemli ölçüde sürecini hızlandırmak olacaktır. Kurulum (1) Hatay Niskin birimleri monte edildiği bir arka yüzün oluşur. Aşağı bakan çıkış üzerinde, İstanbul Niskin birimleri içindeki filtre tutucuları (2) silikon boru ile bağlanır. Bu HDPE örnekleme şişeleri içine konusu filtrenin içinden örneklenen su geçiş (3) hemen altına monte edelim. Süzme işlemi, bir manometre (5) ile düzenlenir ve bir basınçlı hava (4) vasıtasıyla, hızlandırılır. Bir taşma havzası HDPE şişelere veya POM filtrasyon değişimi sırasında suyun dökülmesini önler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig2highres.jpg" target="_blank">Lütfen</a>Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayın. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52131/52131fig3highres.jpg" /> . Naylon (Thurber ve ark. 19 değiştirilmiş) Şekil 3. Teğetsel akış filtre sırası süzüldü file numune su teğet akış filtresi, bir peristaltik pompa (2) ile hazne (1) pompalanır (3). Backpressure yokluğunda geri besleme hattı (4) boyunca hazne (1), numune su döner. Geri-basınç geri dönüş hattı üzerinde bir hortum kelepçesi (5) uygulandığı zaman, suyun filtre içinden geçer ve atıldı ve süzülen madde rezervuarı (6) gönderilir. Tüm numune su boru hatlarında konsantre edilir kadar süzüntü hattı üzerinden konsantre edilir olarak numune su değiştirilir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52131/52131fig4highres.jpg" /> Şekil 4. Mikroskop slayt filtrasyon kurulum.Eşit ilgili alumina matris filtre üzerinde DAPI ve SYBR altın lekeli örnekleri arasında dağıtmak için (1), filtreler bir kelepçe (4) ile filtre manifoldu filtre kulesi (2) ve sap arasına yerleştirilmiş ve sabit olması gerekmektedir. Bir basınç ayarlı vakum (5) filtrasyon işlemi (şematik çizim üst, gerçek resmi alt panel) hızlandıracaktır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig4highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52131/52131fig5highres.jpg" /> Şekil 5. saflaştırılması ve faj partiküllerinin konsantrasyonu. Her bir sezyum klorür yoğunluk gradyanı, 1 ml bir toplam ön-muamele edilmiş numune (A) gelen her bir önceki diğer üstüne katmanlı. Her bir katman, ultra-santrifüj sonrasında çıkarılmasını kolaylaştırmak için, iç lastiğin dışında işaretlenmelidir. Tüp ex açılabileceği kırmızı ok işaretleriVLP fraksiyonu gastrointestinal sistem. STAR7 (B) ve CAR9 (D) 0.45 um filtreden Örnek viral konsantrelerin Epifloresans mikrograflar: Viral konsantrelerin Mikrograflan (BE). Sadece VLPler (beyaz oklar) sezyum klorür gradyan ultrasantrifüjü sonra geriye kalan ise bakteri hücreleri de dahil olmak üzere büyük parçacıklar, STAR7 (B) ve CAR9 (D) örnekleri hem de 0.45 mikron filtratlardan görünür; Yıldız 7 (C) ve CAR9 (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig5highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52131/52131fig6highres.jpg" /> Şekil (A) DAPI ve (B) SYBR Altın lekeli slayt örnek analizinden DAPI ve SYBR Altın mikrografisidir analizi. Screenshot 6. Örnek. (A) Boy ve tüm genişliği (mm) parçacıkları vurgulanır(= Mikroplar) bir görüntüleme programı yardımı ile değerlendirilebilir. Görüntü merkezinde toplanmasını edin. Bu kümeler analizi virüslere sırasında (B). Müteakip analize dahil edilmesi gerekir ve bakteri VLP&#39;lerin ve hücresel boyut aralıkları (kırmızı VLP&#39;de, hücresel yeşil) içine eşikten tarafından binned gerekir. Genellikle ilgili görüntüleme programı tarafından Uncategorized bazı zayıf VLPlerin olduğunu unutmayın. Gibi soluk beyaz noktalar gözüken bu VLPlerin elle sayılır ve otomatik viral sayımları eklenmesi gerekir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig6highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/52131/52131fig7highres.jpg" /> Şekil SYBR Altın 7. Konsantrasyonları lekeli örnekleri. SYBR lekeli virüs örneklerinin çeşitli numaralarını içeren 0.02 alümina matris filtre Mikrograflan. Panel A af gösterirB gösterilen filtre üzerinde konsantrasyonları güvenilir sayımları için çok düşük çok yüksek ve C iken ilter, süzülmüş deniz suyu uygun bir miktarını içerir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig7highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 8," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig8highres.jpg" width="600" /> Şekil resif su numunesinin analizi çıkış akış sitometri 8. Sonuçlar. Panel (A), yalnızca enstrüman ayarları ile en az bir arka plan kontrol etmek için kullanılan, sarı-yeşil flüoresan mikro küreler (0.75 um) ile moleküler sınıf su göstermektedir. Panel (B) tanecikler halen ototrofların populasyonunda birlikte, aynı konumda görülebilir ki, A. Not aynı olarak ayarlar ve düzeni ile resif su numune çalışması çıkışını göstermektedir. (C) </strong&gt; arka kapısı için akışını sitometreden SYBR pozitif olayları (ototrofik + heterotrofik sayısı) ve minimize arka plan hedefleme kullanılır (B), gibi aynı örnek. (D) SYBR Green I. kullanılması ile boyandı temsilcisi resif su numunesi (C) kurulan yolluk, toplam mikrop sayımları elde edildi ve klorofil otofloresans bölümlenmiş heterotrofik ve ototrofik mikroplar. (McDole ve ark. 4) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig8highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 9," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig9highres.jpg" width="600" /> Şekil mikrobiyal metagenome 9. Verilerin örneği. Mikrobiyal metagenomic dizi verilerine ve site bağımlı değişkenler arasında Desenler. Synechococcus burada, göreceli bolluk </em,&gt; spp. olumlu Pelagibacter spp ise, mercan yüzde kapağı ile ilişkili olduğu saptandı. (paneller sol) değildi. DNA tamiri için metabolik yolu tüm metagenomes (sağ panel) arasında tutarlı iken eşli transfer için metabolik yolu olumlu, nitrat konsantrasyonları ile ilişkili olduğu saptandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig9highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> STAR 7 </td><td> CAR9 </td></tr><tr><td> Toplam Sayısı okur </td><td> 939.311 </td><td> 591.600 </td></tr><tr><td> Önceden işlenmiş sayısı okur </td><td> 579.664 </td><td> 360.246 </td></tr><tr><td> Dizi Uzunluk ortalama (bp) </td><td> 395 ± 131 </td><td> 451 ± 159 </td></tr><tr><td> Açıklamalı sekanslar (%) </td><td> 42.218 (% 7.3) </td&gt; <td> 9117 (% 2.5) </td></tr><tr><td> Bilinmeyen (%) </td><td> 537.446 (% 92.7) </td><td> 351.129 (% 97.5) </td></tr></tbody></table> Güney Hattı Adaları, Starbuck ve Millennium oluşturulan iki viromes Tablo 1. Veri özellikleri. Şerhin derecesi MG-RAST sunucusu kullanarak blat dayanmaktadır. <img alt="Tablo 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52131/52131table2.jpg" width="700" /> Bir seferi sırasında çeşitli sitelerden veri gösteren Tablo 2. Temsilcisi sonuçları. Burada değerlendirilen parametreler mikrobik ve viral bolluğu ile eşleştirilmiş su kimyası ölçümleri içerir. Tablosu ayrıca her bir numune noktası için ilgili Metagenomic verilerine gönderme yapan bir dosya adı içerir. Karbon ve inorganik besin konsantrasyonu umol / L cinsinden verilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131table2.jpg" target="_blank">edin</a>Bu tablonun büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayın.

Watch this Scientific Journal Video about Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology at JoVE.com

Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.

Su Kimya ve Deniz Mikrobiyoloji A Field Guide - Okyanusu&#39;nda gaybı Oyuncular çözülüyor

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling ...

unraveling-unseen-players-ocean-field-guide-to-water-chemistry-marine

Research

JoVE Journal

Environment

25.5K Görüntüleme.  San Diego State University. Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments. 

Video: Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) Fluorometry

Conventional methods for experimental manipulation of microalgae have employed large volumes of culture (20 ml to 5 L), so that the culture can be subsampled throughout the experiment1&#8211;7. Subsampling of large volumes can be problematic for several reasons: 1) it causes variation in the total volume and the surface area:volume ratio of the culture during the experiment; 2) pseudo-replication (i.e., replicate samples from the same treatment flask8) is often employed rather than true replicates (i.e., sampling from replicate treatments); 3) the duration of the experiment is limited by the total volume; and 4) axenic cultures or the usual bacterial microbiota are difficult to maintain during long-term experiments as contamination commonly occurs during subsampling.
The use of microtiter plates enables 1 ml culture volumes to be used for each replicate, with up to 48 separate treatments within a 12.65 x 8.5 x 2.2 cm plate, thereby decreasing the experimental volume and allowing for extensive replication without subsampling any treatment. Additionally, this technique can be modified to fit a variety of experimental formats including: bacterial-algal co-cultures, algal physiology tests, and toxin screening9&#8211;11. Individual wells with an alga, bacterium and/or co-cultures can be sampled for numerous laboratory procedures including, but not limited to: WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry, microscopy, bacterial colony forming unit (cfu) counts and flow cytometry. The combination of the microtiter plate format and WATER-PAM fluorometry allows for multiple rapid measurements of photochemical yield and other photochemical parameters with low variability between samples, high reproducibility and avoids the many pitfalls of subsampling a carboy or conical flask over the course of an experiment.

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated WATER-PAM Fluorometry

The goal of this procedure is to demonstrate the reproducibility and adaptability of using a microtiter plate format for microalgal screening. This rapid screen combines WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry to measure photosynthetic yield as an indicator of Photosystem II (PSII) health with small volume bacterial-algal co-cultures.

Küçük Hacim Biyodeneyler SU-Pulse-Genlik Modülasyonlu (SU-PAM) fluorometri Kullanma Bakteriyel / Fitoplankton Co-kültür değerlendirilmesi için

Conventional methods for experimental manipulation of microalgae have employed large volumes of culture (20 ml to 5 L), so that the culture can be ...

Çevre

Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and biogeochemical flux. However, to take advantage of nutrient patches in the ocean, swimming microbes must overcome the influences of physical forces including molecular diffusion and turbulent shear, which will limit the availability of patches and the ability of bacteria to locate them. Until recently, methodological limitations have precluded direct examinations of microbial behaviour within patchy habitats and realistic small-scale flow conditions. Hence, much of our current knowledge regarding microbial behaviour in the ocean has been procured from theoretical predictions. To obtain new information on microbial foraging behaviour in the ocean we have applied soft lithographic fabrication techniques to develop 2 microfluidic devices, which we have used to create (i) microscale nutrient patches with dimensions and diffusive characteristics relevant to oceanic processes and (ii) microscale vortices, with shear rates corresponding to those expected in the ocean. These microfluidic devices have permitted a first direct examination of microbial swimming and chemotactic behaviour within a heterogeneous and dynamic seascape. The combined use of epifluorescence and phase contrast microscopy allow direct examinations of the physical dimensions and diffusive characteristics of nutrient patches, while observing the population-level aggregative response, in addition to the swimming behaviour of individual microbes. These experiments have revealed that some species of phytoplankton, heterotrophic bacteria and phagotrophic protists are adept at locating and exploiting diffusing microscale resource patches within very short time frames. We have also shown that up to moderate shear rates, marine bacteria are able to  fight the flow  and swim through their environment at their own accord. However, beyond a threshold high shear level, bacteria are aligned in the shear flow and are less capable of swimming without disturbance from the flow. Microfluidics represents a novel and inexpensive approach for studying aquatic microbial ecology, and due to its suitability for accurately creating realistic flow fields and substrate gradients at the microscale, is ideally applicable to examinations of microbial behaviour at the smallest scales of interaction.  We therefore suggest that microfluidics represents a valuable tool for obtaining a better understanding of the ecology of microorganisms in the ocean.

The fabrication of microfluidic channels and their implementation in experiments for studying the chemotactic foraging behaviour of marine microbes within a patchy nutrient seascape and the swimming behaviour of bacteria within shear flow are described.

Mikro Ölçekli Besin Katmanlar Deniz Mikro-organizmalar kemotaktik Tepki

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and ...

Biyoloji

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

VacuSIP, bir Geliştirilmiş INEX Yöntemi için<em&gt; In Situ</em&gt; Partikül Ölçümü ve Çözünmüş bileşikler Aktif Süspansiyon besleme üniteleri İşlenmiş

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and ...

A Simple Approach to Manipulate Dissolved Oxygen for Animal Behavior Observations

The ability to manipulate dissolved oxygen (DO) in a laboratory setting has significant application to investigate a number of ecological and organismal behavior questions. The protocol described here provides a simple, reproducible, and controlled method to manipulate DO to study behavioral response in aquatic organisms resulting from hypoxic and anoxic conditions. While performing degasification of water with nitrogen is commonly used in laboratory settings, no explicit method for ecological (aquatic) application exists in the literature, and this protocol is the first to describe a protocol to degasify water to observe organismal response. This technique and protocol were developed for direct application for aquatic macroinvertebrates; however, small fish, amphibians, and other aquatic vertebrates could be easily substituted. It allows for easy manipulation of DO levels ranging from 2 mg/L to 11 mg/L with stability for up to a 5 min animal-observation period. Beyond a 5 min observation period water temperatures began to rise, and at 10 min DO levels became too unstable to maintain. The protocol is scalable to the study organism, reproducible, and reliable, allowing for rapid implementation into introductory teaching labs and high-level research applications. The expected results of this technique should relate dissolved oxygen changes to behavioral responses of organisms.

This article describes a simple and reproducible protocol to manipulate dissolved oxygen conditions in a laboratory setting for animal behavior studies. This protocol may be used in both teaching and research laboratory settings to evaluate organismal response of macroinvertebrates, fishes, or amphibians to changes in dissolved oxygen concentration.

Basit Yaklaşım Hayvan Davranışı Gözlemleri Çözünmüş Oksijen işlemek için

The ability to manipulate dissolved oxygen (DO) in a laboratory setting has significant application to investigate a number of ecological and organismal ...

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food webs. Toxicity testing based on microorganisms are widely used because they are relatively quick, reproducible, cheap, and are not associated with ethical issues. Here, we describe an ecotoxicological method to evaluate the biological response of the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method assesses the acute toxicity of chemical compounds, including new contaminants such as nanoparticles, as well as environmental samples. The endpoint is the reduction of bacterial culturability (i.e., the capability to replicate and form colonies) due to exposure to a toxicant. This reduction can be generally referred to as mortality. The test allows for the determination of the LC50, the concentration that causes a 50% decrease of bacteria actively replicating and forming colonies, after a 6 h exposure. The culturable bacteria are counted in terms of colony forming units (CFU), and the &#34;mortality&#34; is evaluated and compared to the control. In this work, the toxicity of copper sulphate (CuSO4) was evaluated. A clear dose-response relationship was observed, with a mean LC50 of 1.13 mg/L, after three independent tests. This protocol, compared to existing methods with microorganisms, is applicable in a wider range of salinity and has no limitations for colored/turbid samples. It uses saline solution as the exposure medium, avoiding any possible interferences of growth medium with the investigated contaminants. The LC50 calculation facilitates comparisons with other bioassays commonly applied to ecotoxicological assessments of the marine environment.

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

This work describes a new protocol to assess the ecotoxicity of pollutants, including emerging contaminants such as nanomaterials, using the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method allows for the determination of the LC50, or mortality, the concentration that causes a 50% decrease in bacteria culturability, after a 6 h exposure.

Deniz Bakterileri ile Ekotoksikolojik Yöntem<emVibrio anguillarum</em&gt; Çevresel Kirleticilerin Akut Zehirliliğini Değerlendirmek

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food ...

Seawater Sampling and Collection

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass concentration, nucleic acid purification, cell abundance, nutrient and trace gas analyses. For today's demonstration samples were collected from the deck of the HMS John Strickland operating in Saanich Inlet. An A-frame derrick, with a multi-purpose winch and cable system, is used in combination with Niskin or Go-Flo water sampling bottles. Conductivity, Temperature, and Depth (CTD) sensors are also used to sample the underlying water mass. To minimize outgassing, trace gas samples are collected first.  Then, nutrients, water chemistry, and cell counts are determined. Finally, waters are collected for biomass filtration. The set-up and collection time for a single cast is ~1.5 hours at a maximum depth of 215 meters. Therefore, a total of 6 hours is generally needed to complete the collection series described here.

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass concentration, nucleic acid purification, cell abundance, nutrient and trace gas analyses.

Deniz suyu Örnekleme ve Tahsilat

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass ...

Large Volume (20L+) Filtration of Coastal Seawater Samples

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For this method, samples were collected from the deck of the HMS John Strickland operating in Saanich Inlet. This video documents large volume (&ge;20 L) filtration of microbial biomass, ranging between 0.22&mu;m and 2.7&mu;m in diameter, from the water column. Two 20L samples can be filtered simultaneously using a single pump unit equipped with four rotating heads. Filtration is done in the field on extended trips, or immediately upon return for day trips. It is important to record the amount of water passing through each sterivex filter unit. To prevent biofilm formation between sampling trips, all filtration equipment must be rinsed with dilute HCl and deionized water and autoclaved immediately after use. This procedure will take approximately 5 hours plus an additional hour for clean up.

Large Volume 20L+ Filtration of Coastal Seawater Samples

This video documents large volume (&ge;20 L) filtration of microbial biomass, ranging between 0.22&mu;m and 2.7&mu;m in diameter, from the water column.

Büyük Hacimli Kıyı Deniz suyu Örnekleri (20L +) Filtrasyon

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For this method, ...

Small Volume (1-3L) Filtration of Coastal Seawater Samples

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For today s demonstration samples were collected from the deck of the HMS John Strickland operating in Saanich Inlet. This video documents small volume (~1 L) filtration of microbial biomass from the water column. The protocol is an extension of the large volume sampling protocol described earlier, with one major difference: here, there is no pre-filtration step, so all size classes of biomass are collected down to the 0.22 &mu;m filter cut-off. Samples collected this way are ideal for nucleic acid analysis. The set-up, filtration, and clean-up steps each take about 20-30 minutes. If using two peristaltic pumps simultaneously, up to 8 samples may be filtered at the same time. To prevent biofilm formation between sampling trips, all filtration equipment must be rinsed with dilute HCl and deionized water and autoclaved immediately after use.

Small Volume 1-3L Filtration of Coastal Seawater Samples

This video documents small volume (~1 L) filtration of microbial biomass from the water column.

Kıyı Deniz suyu Örnekleri Küçük Hacim (1-3L) Filtrasyon

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For today s ...

A Practical and Low-Cost Setup to Measure Methane in Aqueous Samples

Measuring Dissolved Methane in Aquatic Ecosystems Using An Optical Spectroscopy Gas Analyzer

Measuring greenhouse gas (GHG) fluxes and pools in ecosystems are becoming increasingly common in ecological studies due to their relevance to climate change. With it, the need for analytical platforms adaptable to measuring different pools and fluxes within research groups also grows. This study aims to develop a procedure to use portable optical spectroscopy-based gas analyzers, originally designed and marketed for gas flux measurements, to measure GHG concentrations in aqueous samples. The protocol involves the traditional headspace equilibration technique followed by the injection of a headspace gas subsample into a chamber connected through a closed loop to the inlet and outlet ports of the gas analyzer. The chamber is fabricated from a generic mason jar and simple laboratory supplies, and it is an ideal solution for samples that may require pre-injection dilution. Methane concentrations measured with the chamber are tightly correlated (r2 &#62; 0.98) with concentrations determined separately through gas chromatography-flame ionization detection (GC-FID) on subsamples from the same vials. The procedure is particularly relevant for field studies in remote areas where chromatography equipment and supplies are not readily available, offering a practical, cheaper, and more efficient solution for measuring methane and other dissolved greenhouse gas concentrations in aquatic systems.

This study demonstrates an approach to measure methane gas concentrations in aqueous samples using portable optical analyzers coupled to an injection chamber in a closed loop. The results are similar to conventional gas chromatography, presenting a practical and low-cost alternative particularly suitable for remote field studies.

Measuring greenhouse gas (GHG) fluxes and pools in ecosystems are becoming increasingly common in ecological studies due to their relevance to climate ...

A Toxicological and Ecotoxicological Assay Based on Mussel (Mytilus galloprovincialis) Hemocytes Motility

Hemocytes are the circulating immune-competent cells in bivalve mollusks and play a key role in several important functions of cell-mediated innate immunity. During the early stages of the immune response, hemocytes actively migrate to the site of infection. This inherent motility is a fundamental characteristic of these cells. It represents a key cellular function that integrates multiple processes, such as cell adhesion, cell signaling, cytoskeletal dynamics, and changes in cell volume. Therefore, alterations in cell motility following exposure to drugs or pollutants can serve as a useful toxicological endpoint. Despite the fundamental role of cell motility in cellular physiology, it has been poorly investigated from a toxicological perspective. This work proposes a novel in vitro method for the rapid and sensitive assessment of the toxicity and ecotoxicity of pollutants, based on evaluating the hemocyte motility of Mytilus galloprovincialis. We developed a cell motility assay on hemocytes adhering to the bottom of a 96-well polystyrene microplate. Following exposure to increasing concentrations of drugs, cell trajectories, and velocities were quantified by cell tracking under time-lapse microscopy, allowing us to measure the effects on hemocyte motility. Due to the ease of hemocyte collection from the animals in a relatively non-invasive manner, the proposed method offers an alternative test for screening the effects and mechanisms of action of pollutants and drugs. It aligns with the 3Rs (Replacement, Reduction, and Refinement) criteria, addressing ethical concerns and contributing to the reduction of vertebrate in vivo animal testing.

The article proposes a novel in vitro method for the rapid and sensitive assessment of the toxicity and ecotoxicity of pollutants, based on the motility of Mytilus galloprovincialis hemocytes. The method aims to contribute to the development of more ethical and sensitive toxicological and ecotoxicological exposure tests.

Midye (Mytilus galloprovincialis) Hemosit Motilitesine Dayalı Toksikolojik ve Ekotoksikolojik Bir Test

Hemocytes are the circulating immune-competent cells in bivalve mollusks and play a key role in several important functions of cell-mediated innate ...

Su Kimya ve Deniz Mikrobiyoloji A Field Guide - Okyanusu'nda gaybı Oyuncular çözülüyor

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler