We thank Elisha Wood-Charlson, Jackie Mueller, Karen Weynberg, and Kathy Morrow for their help and constructive input on this manuscript. We also thank the crew and captain of the Hanse explorer which provided us with a perfect working environment to conduct large parts of this research. Further we would like to thank the three anonymous reviewers for their time and helpful comments to improve the manuscript. This work was funded by the NSF Dimensions of Biodiversity and PIRE awards DEB-1046413 and OISE/IIA-1243541, respectively, the Gordon and Betty Moore Foundation, Investigator Award 3781, and the CIFAR Integrated Microbial Diversity Fellowship IMB-ROHW-141679, all to FR.

The authors have nothing to disclose.

Burada sunulan yöntemler sucul ekosistemlerde viral ve mikrobiyal dinamikleri kapsamlı bir değerlendirme oluşturmak için bir araç sağlayacaktır. Onlar mikrobiyal topluluklar mevcut organik ve inorganik kaynakların ayakta stok ölçmek için ve viral ve mikrobiyal topluluk mevcut makyaj karakterize hedeflenir. Sonraki viral bolluk ve mikrobiyal bolluk ve biyokütle miktarının için, genomik sekans bilgisi onların toplum yapısını ve fonksiyonunu gösterir. Bütün yöntemler geliştirdi veya uzak alan yerlerde uygulama için izin vermek için modifiye edilmiştir. Ancak kontrollü laboratuvar ortamlarında eksikliği doğal olarak hatalar için bazı potansiyel oluşturur. Burada değerlendirilen parametreler her biri ile ilişkili bazı uyarılar tartışır. Sonraki kirlenme potansiyeli numune sırasında da analitik sürecinde hata verim potansiyeli parametrelerin bazılarını ele. Çözünmüş Organik Karbon Karbon kontaminasyon (akış aşağı örnekleme ya da bir tekne veya dalgıç yakın), numune hazırlanması sırasında (ekipman veya kasıtsız taşıma kontaminasyon) ve hatta örnek depolanması sırasında (diğer bir numune dondurucuda organik ihtiva eden numune alma prosedürleri sırasında oluşabilir çözücü / uçucu maddeler). Her bir örnek tehcir kontaminasyon ek bir kaynak teşkil gibi, mümkün olduğunca az işlem adımı olarak kirlenme davranış çeşitli kaynaklardan önlemek için. Örnek değil, asitle yıkanmış veya yakılan herhangi bir madde ile temas ettirilmemelidir. Son olarak, uçucu organik maddeler ihtiva etmeyen numuneler için özel bir depolama dondurma sisteminin tayin uzun depolama dönemlerinde numunelerinin bütünlüğünü sağlayacaktır. Örnekleri konsantre HCI ile DOC örneklerin uzun bir seyahat süresi asitlenme sırasında donmuş muhafaza edilemezse (38-41 açıklandığı gibi) uygulanabilir bir alternatif olabilir. Ölçüm doğruluğu DOC konsensüs referans malzemeler Tescil kullanılmalıdır doğrulamak içinDOC ölçüm sırasında durum daha ziyade çalışır. Onun DOC içeriği 42 çok kararlı olduğu için, özellikle derin deniz suyu (&gt; 2000 m) referanslar analitik makinenin performansını değerlendirirken değerlidir. Partikül Organik Madde Organik karbon kirlenmesini önlemek için ek olarak, POM örnekleme filtre hacminin doğruluğunu sağlamak için özel dikkat gerektirir. 500 ml hedeflenen birim herhangi bir olası nedenle sapması durumunda bu, bunun türetilmiş olan süzüntüye filtresi üzerinde yakalandı POM miktarını ilişkilendirmek için dikkat edilmesi gerekmektedir. İnorganik Besinler Organik karbon örnekleme gibi, dikkat tekneler veya atıksu deşarjları 12 gibi çeşitli kaynaklar tarafından üretilen mümkün besin örnek kontaminasyon ödenmelidir. 0.8 um bir itibari gözenek boyutlarına sahip organik karbon örnekleme için kullanılan filtreler, tüm mikrobiyal biyokütle ve sh dahil değilOuld nedenle, bu filtre etme adımı için 0.2 um filtre ile değiştirilebilir. Ayrıca, tespit limitleri besin örnekleri ile bir sorun teşkil; özellikle çok sayıda mercan kayalığı yerlerde (örneğin, Cotner ve ark. 43) etrafında oligotropik yüzey suyu. Deteksiyon limitleri kabaca yaklaşık 0.1, 0.2, ve amonyum, nitrat ve nitrit ve orto-fosfat için 0.1 umol / L (36,12,37 bakınız) Mikroskopla inceleme Mikroskopi slaytlar örnekler görüntü analizi konsantrasyon değişimleri yanında başka hataları potansiyelini verir. Örneğin, görüntüler görüş alanının bazı bölgelerinde odak dışında, ve diğerleri odak olabilir. Yüksek oranda saf bir alümina matrisi filtresi, çok katı bir filtre tipi olduğu gibi, filtrenin altında herhangi bir kalıntı bütün filtre sürgüye bir açı ile oturmak neden olabilir. Sonuç olarak, görüntü yeniden belirli bir filtre için görüş alanının farklı yerlerinde odak dışına sürekli olabilir,mikroskop uyum zellikler de içerir. Gözlenmektedir halinde filtrenin alt sağlanması, filtreler yeniden yerine takılması temiz, bu iyileştirebilir. Aynı zamanda, bazı durumlarda, virüs ve mikropların bulunabilir olduğu iki odak düzlemi mevcut olabilir. Bu montaj üzerine filtreden müstakil olma ve sayıları güvenilmez yapabilirsiniz kapak kayma alt kadar yüzen lekeli nesnelerin sonucudur. Bu nedenle her zaman süreci boyunca, numunelerin kalitesini kontrol etmek için önerilmektedir. Akış sitometrisi Mikroskobu örnekleri ile olduğu gibi, doğal bir analitik sürecin düzeltme gerektiren numuneler akım sitometri arasındaki farklılıkları meydana olabilir. Örneğin, aletin hassasiyetine bağlı olarak, loş flüoresan oluşturan Prochlorococcus hücreleri gürültü seviyesinin altında olabilir ve sayısal olmayacaktır. Boncuk onaylamak için, örneğin bir iç numune kontrol (olarak hizmet ettiğini cihazın respfloresan sinyalleri onse günden güne tutarlı (ve çalışma sırasında kendisi sabit kalır). Bilinen yoğunluklarda bu örneğe eklendi, bunlar da örnek hacim akışını kontrol etmek için bir iç kontrol olarak görev yapabilir. Ancak, her zaman çözülmüş ve 96 oyuklu plaka çalışmalar arasında işleme örneği için bir ek biyolojik kontrol sağlamak için, ilgi konusu örnekleri ile birlikte lekeli bir önceden dondurulmuş &quot;standart&quot; deniz suyu örneğinin bir bölümüne çalıştırmak için tavsiye edilir. Yere bağlı olarak, deniz suyu örnekleri birbirinden çok farklı görünebilir. &quot;Temsilcisi&quot; popülasyonları sıralama ve daha sonra bir epifluorescent mikroskobu (EM) kapsamında görüntüleme hızlı ya Synechococcus sp. Veya fotosentetik ökaryotlar gibi fitoplankton popülasyonlarını doğrulamak için iyi bir yol olabilir. Onlar çok hızlı solmaya çünkü Prochlorococcus hücreler EM altında genellikle görünmez. Buna ek olarak, bir, Synechococcus sp klorofil için. Ayrıca, ph içerenklorofil A (660-700 nm) daha kısa dalga boyunda (540-630 nm) ışık yayar otopigment phycoeurythrin (PE). Synechococcus hücreler mavi / yeşil ışık (470-490 nm) ile heyecanlı zaman 510 nm altında ışığın tüm dalga boylarını kaldırır bir emisyon filtresi altında inceledi, onlar altın görünecektir. Aynı ışık dalga boyu ile uyarıldığı zaman Karşılaştırma ile, ökariyotik fraksiyonu, kırmızı bakacağız. Viral Metagenomiks Bu VLP konsantrasyon ve depolama süreci kurtarıldı toplumu etkilediği unutulmamalıdır. Enfeksiyon, viral parçacık kaybı sürecinin her aşamasında meydana gelebilir ve bu yüzden viral saflaştırma ve zenginleştirme protokolleri seçimi sonuçta ortaya çıkan virüs metagenomes 44,45,18 gözlenen taksonomik bileşim ve çeşitliliğini etkileyebilir. Numunelerin Konsantrasyon TFF&#39;ye 19 veya kimyasal-bazlı çökeltme 20 kullanılarak yapılabilir. Kimyasal bazlı yaklaşım, Posit içindeively demir iyonları çözeltisi kabarırlar ve 8 mikron filtre kullanılarak geri kazanılabilir büyük (&gt; 8 um) demir viral kompleksler oluşturarak doğal olarak negatif yüklü bir viral partikülleri bağlanan ücret. Daha sonra demir viral partikülleri kenetlendiği ve nükleik asit ekstre için 20 konsantre edilmiş viral partikülleri bırakarak, magnezyum, askorbik asit ve EDTA kullanılarak yeniden çözündürülür. Bu iki akım yöntemleri karşılaştırarak sonra, biz demir klorür yöntemi TFF viral konsantrasyona göre daha az zaman alır, ama bazı uyarılar verebilir sonucuna varılmıştır. Bu demir viral bu ayrışma ve çözünme Bulunan gerektiren iki kat çözünme askorbik asit bozulmadığında sürdürülebilmesi için rapor 20&#39;den fazla konsantre edilmiş, magnezyum-askorbik asit-EDTA çözeltisi. Kenara bu sorundan, protokol 0.2 mikron süzme kullanılarak mikrobiyal kirlilikleri kaldırarak, yalnız boyut-fraksinasyonu viral partikülleri arındırır. Büyük virüsler filt geçmezlerer (örneğin, Yang ve ark. 46) ve böylece metagenome tespit olmayacak, bazı bakteriler yaparken (McDole, yayınlanmamış veri). Büyük virüslere karşı ayrımcılık yaparken bu bakteriyel kontaminasyon sonuçlanır. Bu özel bir sorun tam da TFF konsantrasyonu ile bağlantılı olarak mikropların kaldırılması için geçerlidir. Kloroformla muamele dış lipid zarlar 47 ile kloroform duyarlı virüsleri uzaklaştırmak üzere gösterilmiş olduğu gibi, bazı çalışmalarda, 0.22 um filtre bakterilerin büyük bir kısmı bertaraf etmek için kullanılabilir olduğunu düşündürmektedir. Ayrıca, sunulan yöntem esas olarak bakteriyofaj, deniz ortamında genetik malzemenin en bol bulunan taşıyıcı hedef olduğunu belirtmek gerekir. Faj genelde düşünüldüğü değil çünkü yaygın onlar kloroform tedaviye daha dirençli lipidler 48 içeren. Bildiğimiz kadarıyla bir &quot;catch-all&quot; yöntemi bugüne kadar yok. Burada sunulan yöntem, ou uyarlanmıştırkutup sistemlerine tropikal kapsayan çeşitli deniz ortamlarda son 10 yılda r saha deneyimi. Mikrobiyal Metagenomiks Mikroplar (örneğin, bakteri ve arkebakteriler) için Metagenomic kütüphanelerin inşa edilmesi, bu da kütüphane hazırlanması için gerekli olan en az bir DNA konsantrasyonları üretmek için daha kolay olduğu gibi virüs metagenomes daha basittir. Çoklu değiştirme amplifikasyonu (MDA) dayalı bağlayıcı amplifikasyon shotgun kitaplıkları (LASLs) 17,49,50 ve tüm genom amplifikasyonu sekanslama için yeterli bir DNA üretmek için iki en yaygın olarak kullanılan yöntemlerdir. Mikrobiyal metagenomes yüksek DNA konsantrasyonları elde etmek MDA kullanımı bazen gereklidir. Ancak bu tür dinoflagellat minicircles bir overamplification olarak dizi verilerinin kirliliklere neden olabilir. MDA yöntemler olmayan nicel sonuçlar 51,52 ile sonuçlanan, tercihen tek-sarmallı ve dairesel DNA&#39;nın çoğaltılması için önceden bilinmektedir. Optimize LASLs 50 dolayısıyla mikrobik ve sıralama için viral metagenomic DNA hem yükselterek daha iyi bir alternatif olarak hizmet verebilir yaklaşım. Bu LASLs yaklaşım, birden çok adım vardır gelişmiş donanım gerektirir ve dsDNA şablonları ile sınırlı olduğunu not etmek önemlidir. Ayrıca, doku, DNA ekstraksiyon kiti Gram pozitif ve Gram negatif filumayla hem DNA ayıklamak için gösterilmiştir, ancak etkili parçalanmasıyla inatçı mikrobiyal takson veya bunların ilişkili yapılar için henüz doğrulanmadı (örneğin, belirli archaea, endosporlar, ya da mantar sporları) . Bu nedenle boncuk dayak aşaması bazı mikropların DNA elde etmek için gerekli olabilir. Bu kapsamlı değerlendirmeler viral ve mikrobiyal ekosistem işleyişi daha iyi anlaşılmasına neden olacaktır. Birkaç çalışma önerilen tüm parametreleri değerlendirmek için çaba üstlenmiş olsa da, birçok seçilmiş olanları soruşturma edilmiştir. Nelson ve diğ. 53 betw bağlantı önerilendeniz sularında göre hem DOC ve Bacterioplankton konsantrasyonlarda een özel resif habitatları ve fakirleşme. Bu konsantrasyon değişiklikler Bacterioplankton topluluklar farklı farklılaşmalar ile eşlik etti. Dinsdale ve diğ. 5, artan insan kaynaklı etki mikrobiyal hücreler ve virüs benzeri parçacıkların 10 kata kadar yüksek bolluk eşlik ettiğini göstermiştir. Yaşadığı çevre adalarda deniz sularında Mikrobiyal topluluklar da heterotroflara ve potansiyel patojenlerin 5 büyük kesirler vardı. Nihayet McDole vd. 4 insan faaliyetleri macrobes pahasına, mikroplara enerji kayması olduğunu, microbialization puanı tanıtarak gösterdi. Spesifik mikrobiyal ve su kimyası parametreleri üzerinde duruldu Bu çalışmalar, deniz ekosistemlerinin biyokimyasal yapısına yeni bakış açıları sağlayacaktır. Sıcaklık ve pH değerleri, balık biyokütle ve diversi gibi - ekosistem izleme çabalarının geleneksel verileri birleştirerekty, bentik kapağı, ya da insan darbeye maruz kalma - su kimyası ve mikrobiyal değerlendirmeler ile, muhtemelen daha ayrıntılı hedeflenen koruma çabalarına neden olabilir daha duyarlı çevre izleme çabaları, neden olacaktır.

Deniz ekosistemlerinin yırtıcı hayvanları biyokütle elde edilebilen besin değerinde gelen değişikliklere neden düzensizlikler geniş tabi tutulur. Son on yılda, birden fazla çalışmalar deniz ekosistemleri 1-4 mikrobiyal toplulukların önemini göstermiştir. Bu, bakteriyel ve viral eden değişiklikler yakın deniz ortamları 5 genel bozulması ile bağlantılı olduğu görülmektedir. Bu değişiklikler oksijen kullanılabilirliği veya karbon remineralizasyonu 6,7 olarak su kolonunda değişmiş jeokimyasının tarafından kolaylaştırılabilir. Makroorganizmalarının, su kimyası ve mikrobiyal aktivite geri besleme döngüsü arasındaki bağımlılık sonucunda ekosistem bozulma 8 hızını hızlandırabilir. 1970&#39;li ve 80&#39;li yıllarda çok sayıda girişimleri deniz ekosistemlerinde 9-11 biyokimyasal döngüleri çözülmeye yapılmıştır. Bu erken çalışmalar için temel zorluklardan biri eksikliği oldustandart yaklaşımlar değerlendirildi biyokimyasal parametreleri ölçmek için. Öncelikle deniz suyu besin 12,13 mevcut protokoller, oturuyormuş, karbon dinamiklerinin değerlendirilmesi ve mikrobiyal topluluk yapısı mevcut araç ve yöntemlerle sınırlı. JGOFS EqPac yöntemler karşılaştırması ile, keskin ve ark. 14, ilk kez çözülmüş organik karbon (DOC), konsantrasyon değerlendirmeler için güvenilir ve standart bir protokol için önerilmektedir. 2000&#39;lerin başında analitik zorluklar, büyük ölçüde çözüldüğünü mikrobiyal topluluk için mevcut kaynakları belirlemek ve (DeLong 15) kurulmuştur kontrollü kültür ortamlarında mikrobiyal topluluklar karakterize etmek yaklaşımları için. O zaman geleneksel sıralama yöntemleri büyük ölçüde ekili klonal kültürleri dayanıyordu. Doğal örneklerinin Erken çevre gen sıralama mikrobiyal biyoçeşitlilik çoğunluğu Cultiv tarafından kaçırılmış olduğunu, ancak, ortayatirme tabanlı yöntemler 16. 2002 yılında Breitbart ve ark. 17 uncultured deniz virüs topluluklarının tüm genomunu dizilemek için bir yöntem kurma çevre deniz suyu örneklerinde viral topluluğunu ifade etmek için ilk kez tüfek sıralama kullanılır. En kültürüne zor gibi mevcut mikrobiyal değerlendirmeler kapsamında, virüsler hala, özellikle altında çalışılmış kalır ve böyle 16S ribozomal RNA (rRNA), tipik çeşitliliği ve toplum profilleme değerlendirmek için kullanılan genler bir evrensel korunmuş işaretleyici yoksundur. Metagenomic sıralama yaklaşım karmaşık viral toplulukları incelemek için kültür-bağımlı ve gen hedefli yöntemlerine bir alternatif sağlar. Deniz suyundan üretilen ilk viral metagenomes Sanger sıklıklaştırıcı 17 kullanılarak dizildi iken, yeni nesil dizileme teknolojileri ve gelişmiş moleküler tekniklerin geliştirilmesi metagenomic çalışmalarda 18 hızlı bir artışa yol açmıştır </s&gt; kadar. Viral metagenomics için mevcut laboratuar akışı bir nükleik asit (DNA veya RNA) ekstre etme, bir kütüphane hazırlanması ve sekanslama 19-21 ardından viral partiküllerin ayrılması, zenginleştirme ve / veya konsantrasyonunu içermektedir. Dünya esastır etrafında çeşitli sistemlerde veri setleri karşılaştırarak, sucul ekosistemlerde viral, mikrobiyal ve biyokimyasal işleyişi üzerinde mevcut bilgilerini ilerletmek için. Ancak, kurulan protokolleri büyük ölçüde kolayca erişilebilir laboratuvar imkanları ile kıyıya yakın ortamlar için geliştirilmiştir. Böylece, standart alan yöntemlerin eksikliği, bu çapraz ekosistem karşılaştırmalar engellemektedir. Burada iyice test getiriyordu ve iyi Uzak alan yerlerde kullanılmak için sanat araştırma protokollerinin devlet uyarlamalarını standardize. Bu yöntemler, son on 5,22 kapsayan birçok çalışmada kullanmak yarar ve şu anda NOAA yanı sıra, çeşitli deniz laboratuarlar tarafından kullanılanResif Değerlendirme ve Pasifik Okyanusu 4 genelinde İzleme Programı (RAMPA). Örnekleme protokoller su kimyası parametreleri (inorganik ve organik karbon konsantrasyonları, inorganik besin konsantrasyonu), viral ve mikrobiyal bereket include (direkt bakteri sayıları, direkt viral sayıları ve heterotroftan oranları vs autotroph değerlendirmek için flow sitometri) ve viral ve mikrobiyal topluluk yapısı ve metagenomic analizi ile metabolik potansiyel (genel bir bakış için bakınız Şekil 1). Burada tarif edilen yöntem ile elde edilen sonuçlar, kapsamlı akuatik ekosistemlere karakterize etmek için gerekli olan ana biyokimyasal arka parametreleri aydınlatmak için gereklidir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1307">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:217px;">Company</td>
			<td style="width:149px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:325px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Niskin collection and processing units (Hatay Niskins)</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filtration setup&#160;</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">32 &#8211; 36 % Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>A508-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">High-density polyethylene (HDPE) container</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>e.g., 5 Gallon HDPE UN Certified Pail with Snap-On Lid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Combustion oven (550&#176; C)</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 ml HDPE vials&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">02-896-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">25 mm GF/F filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>09-874-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>XX62-000-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile, non-powdered gloves</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">19-170-010B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bilge pump&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>e.g., Thirsty Mate 124PF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 l collapsible low-density polyethylene carboy&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>e.g., Reliance Fold A Carrier II</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tangential flow filter (TFF) ultrafiltration hollow fiber cartridges</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>CFP-2-E-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Platinum-cured silicon tubing for TFF</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>96440-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hose clamps</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>P-68007-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Peristaltic pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-77410-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide (NaOH) solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>21162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 &#181;m polycarbonate Track-Etched Membrane filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>09-300-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8.0 &#181;m polycarbonate Track-Etched Membrane filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>09-300-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.22 &#181;m polyvinylidene difluoride cylindrical filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45 &#181;m polyvinylidene difluoride cylindrical filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>SVHV010RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synthetic nylon mesh</td>
			<td>Sefar</td>
			<td>03-125-37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 ml plastic scintillation bottle&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>03-341-72C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clean bucket (10 - 20 L)</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">32 % paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25 % glutaraldehyde</td>
			<td style="width:217px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.02 &#181;m high-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>6809-6002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 &#181;m&#160; high-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>6809-6022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10,000 X SYBR Gold nucleic acid stain&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">DAPI solution 25 &#181;g ml-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molecular grade water</td>
			<td>sigma aldrich</td>
			<td>W-4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ascorbic Acid</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>BP351-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP399-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>G31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope slide</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>12-550-123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coverslip</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Delicate task wipe&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slide Station with vacuum pump</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">DNA extraction kit</td>
			<td style="width:217px;">Macherey-Nagel</td>
			<td>740952.1</td>
			<td>Nucleospin tissue kit</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Proteinase K (20 mg ml-1)</td>
			<td style="width:217px;">Lifetechnologies</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200-proof 100% Ethanol</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Red cap: Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45503-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cesium chloride (CsCl)</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>bp1595-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 ml syringe</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>13-6898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.02 &#181;m alumina matrix disposable syringe filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>O992613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">Ultra-clear centrifuge tubes</td>
			<td style="width:217px;">Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra - swinging bucket rotor</td>
			<td style="width:217px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:149px;">333790</td>
			<td>SW41 Ti Rotor&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">DNase I (100 u &#181;l-1)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>260913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EDTA</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP2482-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP228-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycogen</td>
			<td style="width:217px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:149px;">G-1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 % Ethanol (200-proof)</td>
			<td style="width:217px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:149px;">15058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 X Tris-EDTA (TE) pH 8.0</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP2473-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">02674-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">20 &#956;g ml-1 Proteinase K</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP1700-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP1145-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1</td>
			<td style="width:217px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:149px;">p3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP2618-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">50ml Oak Ridge Tube&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">05-562-16B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unraveling the unseen players in the ocean - a field guide to water chemistry and marine microbiology

Burada uzak deniz ortamlarında kullanım için uyarlanmış iyice test ve standardize araştırma protokolleri bir dizi tanıtmak. Örnekleme protokolleri mikrobiyal topluluğun (çözünmüş organik karbon, partikül organik madde, inorganik besinler) için mevcut kaynakların değerlendirilmesi ve doğrudan viral ve mikrobiyal sayım yoluyla viral ve bakteriyel toplulukların kapsamlı bir açıklama (autofluorescent mikrop numaralandırma içerir ve viral ve mikrobiyal metagenomes inşaatı). Biz zaten kurulmuş protokolleri ve geliştirilen en son bazı teknikler içeren bilimsel disiplinlerin bir dağınık alanını temsil yöntemleri, bir arada kullanın. Viral ve bakteriyel topluluk karakterizasyonu için kullanılan, özellikle metagenomic dizileme teknikleri, ancak son yıllarda kurulmuştur, ve böylece hala sürekli iyileştirme tabi tutulur. Bu örnekleme ve örnek işleme prosedürleri Curren çeşitli yol açmıştırTLY kullanım. Burada sunulan yöntemlerin seti toplamak ve çevre örnekleri işlemek için güncel yaklaşım kadar bir sağlar. Bu protokoller ile ele Parametreler karakterize ve viral ve mikrobiyal topluluk dinamiklerinin altında yatan mekanizmaları anlamak için gerekli bilgilere minimum verim. Bu kapsamlı araştırmalar yapmak için yönergeleri takip etmek kolay verir ve her tekniğe uygun kritik adımları ve potansiyel uyarılar tartışır.

Mikroskopla inceleme Mikroskopi örnekleri ve istenilen kalitede olmasını sağlamak için derhal analiz edilmelidir olabilir. Bolluk ve bakteri topluluğunun büyüklüğü dağılımını ölçmek için, DAPI slaytlar Epifloresans mikroskobu ile incelenir: (Şekil 6A) (uyarma / emisyon. 358/461 nm, McDole ark 2012 bakınız). Hücre sayımı ve boyutları görüntüleme yazılımı (örneğin, ImagePro veya ImageJ) kullanılarak toplanabilir. Tüm hücreler, aşağıdaki denklemi kullanarak, yarı küresel kapaklar ile silindirlerin şekline sahip varsayımı yaparak elde edilir uzunluk ve genişlik ölçümleri hücre hacimleri (V) &#39;den: V = π / 4 × 2 w (L - / &#39;3 w) L uzunluğu ve w, burada her bir hücre 23,4 arasında genişliğidir. Mikrobiyal biyokütle sonra fo önceden kurulmuş boyutu-bağımlı ilişkileri kullanılarak tahmin edilebilirr deniz mikrobiyal topluluklar 24. Genellikle deniz bakteri 0.1-4 mikron uzunluğunda değişir, ancak bazı yerlerde ~ 8 mikron kadar gidin. DAPI ile boyanmış filtreler (0.2 mikron) sadece bakterileri gösterecektir ederken, SYBR Altın leke (0.02 mikron) için kullanılan filtreler bakteri ve virüs içermez. Virüslerin bolluğu ölçülmesi mikroplar için aynı protokol izlenmiş, ancak 325-375 nm&#39;lik bir eksitasyon kullanılacak ve maksimum emisyonu 537 nm (Şekil 6B) yer almaktadır. Niceliksel veri oluşturmak için örnekleme hacminin, orjinal numune içinde viral bolluğuna bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. Doğru hacimli iyi suyun belirli bir vücut için ampirik olarak belirlenir filtre. Viral konsantrasyonları ile örneklerini içeren mikrograflar örnekleri, Şekil 7&#39;de gösterilmektedir. Önceki çalışmaların sonuçları Microbe bu virüs önermekoranları (VMR), genellikle mercan resif sistemlerde yaklaşık 6 ortalama (Knowles, yayınlanmamış veri), sucul sistemlerde 25-29 1-50 aralığı, ve arasında 3 ve 20. Akış sitometrisi Doğrudan sayımı ve mikrobiyal topluluğun büyüklüğü tahmin ek olarak, akış sitometrisi ile, heterotrofik mikroplara ototrofik oranının değerlendirilmesi daha Toplanan numunelerden (Şekil 8 &#39;de verilen çıkış sitometri örnek teşkil eden bir akış) elde edilebilir. Toplam bakteri hücre sayısını belirlemek için örnekler SYBR Green I ile boyanmış ve bir 530/30 bant-geçiş filtresi ile, bir foto-multiplikatör tüpü tespiti için kullanılır. Klorofil ve phycoerytherin (585/42 bant-geçiş filtresi) (arka 675-735 nm arasında bir aralıkta ortaya çıkan geri LP aynalara) bir kanal, boyanmadan örneklerde ototrofların bolluğu saymak için kullanılır. Heterotrofik mikropların bolluğu, olmayan girdilerin gelen ototrofik sayıları belirlemek içinlekeli kısım, daha sonra SYBR lekeli toplam sayısı (McDole ve ark. sunulan) çıkartılır. Viral Metagenomiks Viral metagenomik toplum yapısını ve işlevini belirlemek için toplam genomik sekans bilgileri kullanılarak, viral ekoloji bir kültür-bağımsız bir moleküler yaklaşım kullanır. Metagenomiks küresel ölçeklerde 30 karmaşıklığı ve yerel 17 viral toplulukların çeşitliliği anlayışımızı ilerlemektedir. Viral metagenomic verilerin analizi için biyoinformatik araçlar geniş bir dizi son gelişmeler metagenomics merceğinden daha kapsamlı bir bakış virosphere ve izin, hesaplamalı darboğazları azalmıştır. Burada sunulan yöntemler, konsantrasyonu artıkları ve selüler malzemenin ayrılması için ağ gözü, büyük gözenekli naylon ile ön filtreleme bir kombinasyonu kullanılarak deniz suyundan izole edilmesini ve viral partiküllerin zenginleştirme vurgulamakTFF, (Şekil 3) ve daha sonraki bir 0.45 um filtre ile numuneler daha büyük hücreler ayıklandı. Bu yöntem kabaca bize küçük hacimlerde aşağı süreçlerini gerçekleştirmek için izin veren bir 100x konsantre örnek (Şekil 5B-5E) üretir. Viral lizat kalan herhangi bir mikrobik hücrelerin büyümesini engelleyen ve bu yüzden alan istasyonu ve laboratuar arasında uzun geçiş süresi esnasında, örneğin viral miktarındaki değişim için, kloroform genellikle depolama için% 2&#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar ilave edilir. Izolasyon ve VLPler Saflaştırma işleminden sonra, örneğin SYBR Gold gibi nükleik asit boyaları ile birlikte bir epifluorışıma mikroskopi viral partiküllerin varlığı ve saflık (Şekiller 5B-5 £) doğrulamak için kullanılır. Burada, Güney Line Adası mercan kayalığı iki viral metagenomes sunmak, özellikle, Starbuck (STAR7) ve Millennium (CAR9; önceden Caroline olarak da bilinir) adaları. 120 uL sam toplam hacmibölüm 3.7 ve 5.2&#39;de anlatıldığı gibi ple su 10 metre derinlikte her siteden toplanmış ve işlenmiştir. Paragraf 4 (Şekil 5B) &#39;de tarif edilen yönteme göre belirlenmiş olarak sezyum klorür gradyanı ile santrifüjleme saflaştırılan VLPler CAR9 (Şekil 5D), 3.3 8 x 10 parçacık / ml STAR7 için ml başına 2.9 x 10 9 parçacıklar olmuştur. Bu örneklerden izole DNA toplam miktarı yaklaşık 400 NanoDrop ölçümüne dayanan ng. DNA dizi verilerinin özellikleri Tablo 1&#39;de sunulmuştur. Mevcut veritabanları kullanılarak benzerlik araştırmaları dayanarak Phi29 polimeraz kullanılarak büyütülmüş ve 2011 yılında Çevre Genomik Çekirdek tesisi ile dizildi, dizilerin çoğunluğunun (&gt;% 70) sık sık sona erdi uncharacterized, yani, bilinmeyen kökenleri ve işlevleri. Benzer şekilde, burada sunulan iki viromes bilinmeyen dizilerin fazla% 97 sunulmaktadır. Bunun bir sonucu olarak, veritabanı olmayanbağımlı analiz analizi için kullanılan ve (viral metagenomics içinde &quot;karanlık madde&quot; araştırma fırsat yeni bir kol açıldı Seguritan ve ark. baskıda). Mikrobiyal Metagenomiks Mikrobiyal metagenomes analizi mikrobiyal topluluk mevcut karakterizasyonu ve bu toplulukların işlevsel açıklaması için izin verir. Örnekler macrobial toplum yapısındaki değişikliklere veya mevcut besin ve türlerin zenginliği ve onların baskın metabolik yollar (; Kelly ve ark 2014. Şekil 9) arasındaki patojenlerin ve şiddeti 5,22 veya karşılaştırmaların varlığı tahminlerini içermektedir. Su Kimyası Su kimyası parametreler genellikle istenen verileri oluşturmak için kapsamlı analitik işleme almak; DOC analizi için numuneler yüksek sıcaklık katalitik oksidasyon 31,3 yoluyla ölçülecektir2, Akış Enjeksiyon Analizi 36,12,37 tarafından elementer analizör 33-35, ve inorganik besin bağlanmış izotop oranı kütle spektrometresi ile partikül organik madde (POM). Tüm analizler başarıyla tamamlanmasından sonra, olarak Tablo 1&#39;de gösterilen bilgiler mikrobik ve viral toplulukların karakterizasyonu tamamlamak için hazır olacaktır. Bu bilgiler organik karbon ve azot örneklerinin kararlı izotop oranları ile iltifat olabilir ve ototrofların ve heterotroflara arasındaki oranlar (McDole ark. Sunulmuştur) (Haas vd. 35 bakınız). <img alt="Şekil 1," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig1highres.jpg" width="600" /> Protokol bölümünde açıklanan yöntemlerden Şekil 1. Bakış. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig1highres.jpg" target="_blank">Bu Figu büyük halini görmek için buraya tıklayınız</a>yeniden. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52131/52131fig2highres.jpg" /> Şekil 2. Örnek işleme teçhizat kurulum. Burada tanıtılan filtrasyon kurulumu (şematik çizim, gerçek resmi sağ paneli sol) mutlaka örnekleri oluşturmak için gerekli değildir ama önemli ölçüde sürecini hızlandırmak olacaktır. Kurulum (1) Hatay Niskin birimleri monte edildiği bir arka yüzün oluşur. Aşağı bakan çıkış üzerinde, İstanbul Niskin birimleri içindeki filtre tutucuları (2) silikon boru ile bağlanır. Bu HDPE örnekleme şişeleri içine konusu filtrenin içinden örneklenen su geçiş (3) hemen altına monte edelim. Süzme işlemi, bir manometre (5) ile düzenlenir ve bir basınçlı hava (4) vasıtasıyla, hızlandırılır. Bir taşma havzası HDPE şişelere veya POM filtrasyon değişimi sırasında suyun dökülmesini önler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig2highres.jpg" target="_blank">Lütfen</a>Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayın. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52131/52131fig3highres.jpg" /> . Naylon (Thurber ve ark. 19 değiştirilmiş) Şekil 3. Teğetsel akış filtre sırası süzüldü file numune su teğet akış filtresi, bir peristaltik pompa (2) ile hazne (1) pompalanır (3). Backpressure yokluğunda geri besleme hattı (4) boyunca hazne (1), numune su döner. Geri-basınç geri dönüş hattı üzerinde bir hortum kelepçesi (5) uygulandığı zaman, suyun filtre içinden geçer ve atıldı ve süzülen madde rezervuarı (6) gönderilir. Tüm numune su boru hatlarında konsantre edilir kadar süzüntü hattı üzerinden konsantre edilir olarak numune su değiştirilir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52131/52131fig4highres.jpg" /> Şekil 4. Mikroskop slayt filtrasyon kurulum.Eşit ilgili alumina matris filtre üzerinde DAPI ve SYBR altın lekeli örnekleri arasında dağıtmak için (1), filtreler bir kelepçe (4) ile filtre manifoldu filtre kulesi (2) ve sap arasına yerleştirilmiş ve sabit olması gerekmektedir. Bir basınç ayarlı vakum (5) filtrasyon işlemi (şematik çizim üst, gerçek resmi alt panel) hızlandıracaktır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig4highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52131/52131fig5highres.jpg" /> Şekil 5. saflaştırılması ve faj partiküllerinin konsantrasyonu. Her bir sezyum klorür yoğunluk gradyanı, 1 ml bir toplam ön-muamele edilmiş numune (A) gelen her bir önceki diğer üstüne katmanlı. Her bir katman, ultra-santrifüj sonrasında çıkarılmasını kolaylaştırmak için, iç lastiğin dışında işaretlenmelidir. Tüp ex açılabileceği kırmızı ok işaretleriVLP fraksiyonu gastrointestinal sistem. STAR7 (B) ve CAR9 (D) 0.45 um filtreden Örnek viral konsantrelerin Epifloresans mikrograflar: Viral konsantrelerin Mikrograflan (BE). Sadece VLPler (beyaz oklar) sezyum klorür gradyan ultrasantrifüjü sonra geriye kalan ise bakteri hücreleri de dahil olmak üzere büyük parçacıklar, STAR7 (B) ve CAR9 (D) örnekleri hem de 0.45 mikron filtratlardan görünür; Yıldız 7 (C) ve CAR9 (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig5highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52131/52131fig6highres.jpg" /> Şekil (A) DAPI ve (B) SYBR Altın lekeli slayt örnek analizinden DAPI ve SYBR Altın mikrografisidir analizi. Screenshot 6. Örnek. (A) Boy ve tüm genişliği (mm) parçacıkları vurgulanır(= Mikroplar) bir görüntüleme programı yardımı ile değerlendirilebilir. Görüntü merkezinde toplanmasını edin. Bu kümeler analizi virüslere sırasında (B). Müteakip analize dahil edilmesi gerekir ve bakteri VLP&#39;lerin ve hücresel boyut aralıkları (kırmızı VLP&#39;de, hücresel yeşil) içine eşikten tarafından binned gerekir. Genellikle ilgili görüntüleme programı tarafından Uncategorized bazı zayıf VLPlerin olduğunu unutmayın. Gibi soluk beyaz noktalar gözüken bu VLPlerin elle sayılır ve otomatik viral sayımları eklenmesi gerekir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig6highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/52131/52131fig7highres.jpg" /> Şekil SYBR Altın 7. Konsantrasyonları lekeli örnekleri. SYBR lekeli virüs örneklerinin çeşitli numaralarını içeren 0.02 alümina matris filtre Mikrograflan. Panel A af gösterirB gösterilen filtre üzerinde konsantrasyonları güvenilir sayımları için çok düşük çok yüksek ve C iken ilter, süzülmüş deniz suyu uygun bir miktarını içerir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig7highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 8," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig8highres.jpg" width="600" /> Şekil resif su numunesinin analizi çıkış akış sitometri 8. Sonuçlar. Panel (A), yalnızca enstrüman ayarları ile en az bir arka plan kontrol etmek için kullanılan, sarı-yeşil flüoresan mikro küreler (0.75 um) ile moleküler sınıf su göstermektedir. Panel (B) tanecikler halen ototrofların populasyonunda birlikte, aynı konumda görülebilir ki, A. Not aynı olarak ayarlar ve düzeni ile resif su numune çalışması çıkışını göstermektedir. (C) </strong&gt; arka kapısı için akışını sitometreden SYBR pozitif olayları (ototrofik + heterotrofik sayısı) ve minimize arka plan hedefleme kullanılır (B), gibi aynı örnek. (D) SYBR Green I. kullanılması ile boyandı temsilcisi resif su numunesi (C) kurulan yolluk, toplam mikrop sayımları elde edildi ve klorofil otofloresans bölümlenmiş heterotrofik ve ototrofik mikroplar. (McDole ve ark. 4) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig8highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 9," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig9highres.jpg" width="600" /> Şekil mikrobiyal metagenome 9. Verilerin örneği. Mikrobiyal metagenomic dizi verilerine ve site bağımlı değişkenler arasında Desenler. Synechococcus burada, göreceli bolluk </em,&gt; spp. olumlu Pelagibacter spp ise, mercan yüzde kapağı ile ilişkili olduğu saptandı. (paneller sol) değildi. DNA tamiri için metabolik yolu tüm metagenomes (sağ panel) arasında tutarlı iken eşli transfer için metabolik yolu olumlu, nitrat konsantrasyonları ile ilişkili olduğu saptandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig9highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> STAR 7 </td><td> CAR9 </td></tr><tr><td> Toplam Sayısı okur </td><td> 939.311 </td><td> 591.600 </td></tr><tr><td> Önceden işlenmiş sayısı okur </td><td> 579.664 </td><td> 360.246 </td></tr><tr><td> Dizi Uzunluk ortalama (bp) </td><td> 395 ± 131 </td><td> 451 ± 159 </td></tr><tr><td> Açıklamalı sekanslar (%) </td><td> 42.218 (% 7.3) </td&gt; <td> 9117 (% 2.5) </td></tr><tr><td> Bilinmeyen (%) </td><td> 537.446 (% 92.7) </td><td> 351.129 (% 97.5) </td></tr></tbody></table> Güney Hattı Adaları, Starbuck ve Millennium oluşturulan iki viromes Tablo 1. Veri özellikleri. Şerhin derecesi MG-RAST sunucusu kullanarak blat dayanmaktadır. <img alt="Tablo 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52131/52131table2.jpg" width="700" /> Bir seferi sırasında çeşitli sitelerden veri gösteren Tablo 2. Temsilcisi sonuçları. Burada değerlendirilen parametreler mikrobik ve viral bolluğu ile eşleştirilmiş su kimyası ölçümleri içerir. Tablosu ayrıca her bir numune noktası için ilgili Metagenomic verilerine gönderme yapan bir dosya adı içerir. Karbon ve inorganik besin konsantrasyonu umol / L cinsinden verilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131table2.jpg" target="_blank">edin</a>Bu tablonun büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayın.

Watch this Scientific Journal Video about Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology at JoVE.com

Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.

Su Kimya ve Deniz Mikrobiyoloji A Field Guide - Okyanusu&#39;nda gaybı Oyuncular çözülüyor

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling ...

unraveling-unseen-players-ocean-field-guide-to-water-chemistry-marine

Research

JoVE Journal

Environment

25.2K Görüntüleme.  San Diego State University. Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments. 

Video: Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is not an appropriate measure for its availability; bioavailability rather depends on the dynamic interplay of potential mass transfer (flux) of a compound to a microbial cell and the capacity of the latter to degrade the compound. In water-unsaturated parts of the soil, mycelia have been shown to overcome bioavailability limitations by actively transporting and mobilizing organic compounds over the range of centimeters. Whereas the extent of mycelia-based transport can be quantified easily by chemical means, verification of the contaminant-bioavailability to bacterial cells requires a biological method. Addressing this constraint, we chose the PAH fluorene (FLU) as a model compound and developed a water unsaturated model microcosm linking a spatially separated FLU point source and the FLU degrading bioreporter bacterium Burkholderia sartisoli RP037-mChe by a mycelial network of Pythium ultimum. Since the bioreporter expresses eGFP in response of the PAH flux to the cell, bacterial FLU exposure and degradation could be monitored directly in the microcosms via confocal laser scanning microscopy (CLSM). CLSM and image analyses revealed a significant increase of the eGFP expression in the presence of P. ultimum compared to controls without mycelia or FLU thus indicating FLU bioavailability to bacteria after mycelia-mediated transport. CLSM results were supported by chemical analyses in identical microcosms. The developed microcosm proved suitable to investigate contaminant bioavailability and to concomitantly visualize the involved bacteria-mycelial interactions.

A whole cell bioreporter assay with Burkholderia sartisoli RP037-mChe was developed to detect fractions of an organic contaminant (i.e., fluorene) available for bacterial degradation after active transport by mycelia bridging air-filled pores in a water unsaturated model system.

A Whole Hücre Bioreporter Yaklaşımı Su Doymamış Sistemleri Organik Kontaminantların Taşıma ve Biyoyararlanımını Değerlendirmek için

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is ...

Çevre

A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with the goal of examining the ecological functions of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. The result has been a progression of protocols that have increasingly refined the ecological relevance of the experimental approach. Here we present the most up-to-date version of a fish-feeding laboratory bioassay that enables investigators to assess the antipredatory activity of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. Organic metabolites of all polarities are exhaustively extracted from the tissue of the target organism and reconstituted at natural concentrations in a nutritionally appropriate food matrix. Experimental food pellets are presented to a generalist predator in laboratory feeding assays to assess the antipredatory activity of the extract. The procedure described herein uses the bluehead, Thalassoma bifasciatum, to test the palatability of Caribbean marine invertebrates; however, the design may be readily adapted to other systems. Results obtained using this laboratory assay are an important prelude to field experiments that rely on the feeding responses of a full complement of potential predators. Additionally, this bioassay can be used to direct the isolation of feeding-deterrent metabolites through bioassay-guided fractionation. This feeding bioassay has advanced our understanding of the factors that control the distribution and abundance of marine invertebrates on Caribbean coral reefs and may inform investigations in diverse fields of inquiry, including pharmacology, biotechnology, and evolutionary ecology.

This bioassay employs a model predatory fish to assess the presence of feeding-deterrent metabolites from organic extracts of the tissues of marine organisms at natural concentrations using a nutritionally comparable food matrix.

Bir Balık-besleme Laboratuvar biyodeneyinde Deniz Organizmaların Dokular Sekonder Metabolitlerin Antipredatory Aktivite değerlendirmek için

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with ...

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA libraries are needed for optimal results from next-generation sequencing. Environmental samples such as water may have low quality and quantities of DNA as well as contaminants that co-precipitate with DNA. The mechanical and enzymatic processes involved in extraction and library preparation may further damage the DNA. Gel size selection enables purification and recovery of DNA fragments of a defined size for sequencing applications. Nevertheless, this task is one of the most time-consuming steps in the DNA library preparation workflow. The protocol described here enables complete automation of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments. 
In this study, we describe a high-throughput approach to prepare high quality DNA libraries from freshwater samples that can be applied also to other environmental samples. We used an indirect approach to concentrate bacterial cells from environmental freshwater samples; DNA was extracted using a commercially available DNA extraction kit, and DNA libraries were prepared using a commercial transposon-based protocol. DNA fragments of 500 to 800 bp were gel size selected using Ranger Technology, an automated electrophoresis workstation. Sequencing of the size-selected DNA libraries demonstrated significant improvements to read length and quality of the sequencing reads.

This manuscript describes an automated gel size selection approach for purifying DNA fragments for next-generation sequencing. The Ranger Technology provides complete automation of the entire process of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments allowing for high-throughput and high quality next-generation sequencing libraries.

Otomatik Jel Boyut Seçimi Çevre Su Örneklerinden hazırlanmıştır nesil Sıralama Kütüphaneler Kalitesi Geliştirmek için

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated HF183 marker. The EntHF183 duplex dPCR (referred as EntHF183 dPCR hereon) assay uses the same primer and probe sequences as its published individual quantitative PCR (qPCR) counterparts. Likewise, the same water filtration and DNA extraction procedures as performed prior to qPCR are followed prior to running dPCR. However, the duplex dPCR assay has several advantages over the qPCR assays. Most important, the dPCR assay eliminates the need for running a standard curve and hence, the associated bias and variability, by direct quantification of its targets. In addition, while duplexing (i.e. simultaneous quantification) Enterococcus and HF183 in qPCR often leads to severe underestimation of the less abundant target in a sample, dPCR provides consistent quantification of both targets, whether quantified individually or simultaneously in the same reaction. The dPCR assay is also able to tolerate PCR inhibitor concentrations that are one to two orders of magnitude higher than those tolerated by qPCR. These advantages make the EntHF183 dPCR assay particularly attractive because it simultaneously provides accurate and repeatable information on both general and human-associated fecal contamination in environmental waters without the need to run two separate qPCR assays. Despite its advantages over qPCR, the upper quantification limit of the dPCR assay with currently available instrumentation is approximately four orders of magnitude lower than that achievable by qPCR. Consequently, dilution is needed for measurement of high concentrations of target organisms such as those typically observed following sewage spills.

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay that can be used to simultaneously quantify Enterococcus spp. and the HF183 genetic markers as indicators of general and human-associated fecal contamination in recreational waters.

Eşzamanlı Niceleme için Dubleks Dijital PCR Testi<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Ve Waters İnsan Fekal ilişkili HF183 Marker

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Clean Sampling and Analysis of River and Estuarine Waters for Trace Metal Studies

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination control. Developments of some techniques aiming to reduce trace metal contamination in the last couple of decades have resulted in concentrations reported now being orders of magnitude lower than those in the past. These low concentrations often necessitate preconcentration of water samples prior to instrumental analysis of samples. Since contamination can appear in all phases of trace metal analyses, including sample collection (and during preparation of sampling containers), storage and handling, pretreatments, and instrumental analysis, specific care needs to be taken in order to reduce contamination levels at all steps. The effort to develop and utilize "clean techniques" in trace metal studies allows scientists to investigate trace metal distributions and chemical and biological behavior in greater details. This advancement also provides the required accuracy and precision of trace metal data allowing for environmental conditions to be related to trace metal concentrations in aquatic environments.
This protocol that is presented here details needed materials for sample preparation, sample collection, sample pretreatment including preconcentration, and instrumental analysis. By reducing contamination throughout all phases mentioned above for trace metal analysis, much lower detection limits and thus accuracy can be achieved. The effectiveness of "clean techniques" is further demonstrated using low field blanks and good recoveries for standard reference material. The data quality that can be obtained thus enables the assessment of trace metal distributions and their relationships to environmental parameters.

Special care using "clean techniques" is required to properly collect and process water samples for trace metal studies in aquatic environments. A protocol for sampling, processing, and analytical procedures with the aim of obtaining reliable environmental monitoring data and results with high sensitivity for detailed trace metal studies is presented.

Temiz Örnekleme ve Eser Metal Çalışmaları Nehri ve haliç Waters Analizi

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination ...

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

VacuSIP, bir Geliştirilmiş INEX Yöntemi için<em&gt; In Situ</em&gt; Partikül Ölçümü ve Çözünmüş bileşikler Aktif Süspansiyon besleme üniteleri İşlenmiş

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and ...

Protocol for Microplastics Sampling on the Sea Surface and Sample Analysis

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of scientific publications address microplastic pollution of the sea surface. The protocol below describes the methodology for sampling, sample preparation, separation and chemical identification of microplastic particles. A manta net fixed on an &#187;A frame&#171; attached to the side of the vessel was used for sampling. Microplastic particles caught in the cod end of the net were separated from samples by visual identification and use of stereomicroscopes. Particles were analyzed for their size using an image analysis program and for their chemical structure using ATR-FTIR and micro FTIR spectroscopy. The described protocol is in line with recommendations for microplastics monitoring published by the Marine Strategy Framework Directive (MSFD) Technical Subgroup on Marine Litter. This written protocol with video guide will support the work of researchers that deal with microplastics monitoring all over the world.

The protocol below describes the methodology for: microplastics sampling on the sea surface, separation of microplastic and chemical identification of particles. This protocol is in line with the recommendations for microplastics monitoring published by the MSFD Technical Subgroup on Marine Litter.

Deniz Yüzey ve Numune Analizi Microplastics Örnekleme Protokolü

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of ...

Controlled-release of Chlorine Dioxide in a Perforated Packaging System to Extend the Storage Life and Improve the Safety of Grape Tomatoes

A controlled-release chlorine dioxide (ClO2) pouch was developed by sealing a slurry form of ClO2 into semipermeable polymer film; the release properties of the pouch were monitored in containers with or without fruit. The pouch was affixed to the inside of a perforated clamshell containing grape tomatoes, and the effect on microbial population, firmness, and weight loss was evaluated during a 14 day storage period at 20 &#176;C. Within 3 days, the ClO2 concentration in the clamshells reached 3.5 ppm and remained constant until day 10. Thereafter, it decreased to 2 ppm by day 14. The ClO2 pouch exhibited strong antimicrobial activity, reducing Escherichia coli populations by 3.08 log CFU/g and Alternaria alternata populations by 2.85 log CFU/g after 14 days of storage. The ClO2 treatment also reduced softening and weight loss and extended the overall shelf life of the tomatoes. Our results suggest that ClO2 treatment is useful for extending the shelf life and improving the microbial safety of tomatoes during storage without impairing their quality.

Here, we describe a protocol for the application of a novel, slow-release ClO2 product that reduces spoilage and extends the shelf life of fresh fruit. The slow-release ClO2 product was added to standard commercial grape tomato packaging and tested against Escherichia coli and Alternaria alternata.

Bir Delikli Ambalaj Sistemde Klor Dioksit Kontrollü salım Depolama ömrünü uzatmak ve Üzüm Domates Güvenliğini Artırmak İçin

A controlled-release chlorine dioxide (ClO2) pouch was developed by sealing a slurry form of ClO2 into semipermeable polymer film; the release properties ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment during manufacturing and transport. Because of their environmental persistence, they are widely distributed in the oceans and on beaches all over the world. They can act as a vector of potentially toxic organic compounds (e.g., polychlorinated biphenyls) and might consequently negatively affect marine organisms. Their possible impacts along the food chain are not yet well understood. In order to assess the hazards associated with the occurrence of plastic pellets in the marine environment, it is necessary to develop methodologies that allow for rapid determination of associated organic contaminant levels. The present protocol describes the different steps required for sampling resin pellets, analyzing adsorbed organochlorine pesticides (OCPs) and identifying the plastic type. The focus is on the extraction of OCPs from plastic pellets by means of a pressurized fluid extractor (PFE) and on the polymer chemical analysis applying Fourier Transform-InfraRed (FT-IR) spectroscopy. The developed methodology focuses on 11 OCPs and related compounds, including dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT) and its two main metabolites, lindane and two production isomers, as well as the two biologically active isomers of technical endosulfan. This protocol constitutes a simple and rapid alternative to existing methodology for evaluating the concentration of organic contaminants adsorbed on plastic pieces.

Microplastics act as vector of potentially toxic organic contaminants with unpredictable effects. This protocol describes an alternative methodology for assessing the levels of organochlorine pesticides adsorbed on plastic pellets and identifying the polymer chemical structure. The focus is on pressurized fluid extraction and attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy.

Plastik Peletlerden Organochlorine Pestisitlerin Çıkarılması ve Plastik Tipi Analizi

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly relevant as a model for the studies of osmoregulatory mechanisms because of its extreme tolerance to low salinity. It is also widely used as a model of settling biology, in particular in relation to antifouling research. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae for studies. A protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus has been developed and a detailed description of all steps in the production line is outlined (i.e., the establishment of adult cultures on panels, the collection and rearing of barnacle larvae, and the administration of feed for adults and larvae). The description also provides guidance on troubleshooting and discusses critical parameters (e.g., the removal of contamination, the production of high-quality feed, the manpower needed, and the importance of high-quality seawater). Each batch from the culturing system maximally yields roughly 12,000 nauplii and can deliver four batches in a week, so up to almost 50,000 larvae per week can be produced. The method used to culture B. improvisus is, probably, to a large extent also applicable to other marine invertebrates with free-swimminglarvae. Protocols are presented for the dissection of various tissues from adults as well as the production of high-quality RNA for studies on gene expression. It is also described how cultured adults and reared cyprids can be utilized in a wide array of experimental designs for examining gene expression in relation to external factors. The use of cultured barnacles in gene expression is illustrated with studies of possible osmoregulatory roles of Na+/K+ ATPase and aquaporins.

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is a model for studying osmoregulation and antifouling. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae. Here, a protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus is described, including the production of larvae. The use of cultured barnacles in gene expression studies is illustrated.

Deniz bir Model - olarak Barnacle Balanus improvisus kültür ve gen ekspresyonu

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...