Yazarlar faydalı tartışmalar için Priyanka Subrahmanyam teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar hiçbir maddi çıkar rakip var. Bu çalışma Amerikan Kanser Derneği, NIH / NCI K01 CA131487, R21 CA162273, R21 CA162277 ve P30 Tümör İmmünolojisi ve TJ Webb&#39;e İmmünoterapi Programı hibe ile desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Kanser Enstitüsü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

1. AAPC Üretimi <ol><li> Boncuk proteinler eklemeden önce tüm reaktifler ve tamponlar hazırlamak: 0.1M Borat tampon; 1X D-PBS (hiçbir Ca 2 + ve Mg 2 +); Boncuk Yıkama Tamponu (1X PBS +5% İnsan AB serumu +% 0.02 sodyum azid) , tam bir ortam (RPMI medyumu ile +100 mM sodyum piruvat, 10 mM gerekli olmayan vitamin çözeltisi, 100 mM MEM vitamini çözeltisi,% 1 2-merkaptoetanol, 10 uM siprofloksasin,% 5 insan AB serumu); MACS tampon (1 L serbest PBS Ca 2 + ve Mg + 2, 5 g BSA, 2 mmol EDTA). </li><li> 5 ml&#39;lik şeffaf borosilikat cam şişe içinde dişli steril 3 ml 0.1 M borat tamponu (borik asit ve su, pH 7.0-7.4) ile 1 ml Dynabeads M-450 epoksi boncuklar yıkayın. </li><li> 1 ml PBS w / o Ca 2 + ve Mg + 2: ayrı bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, 100 mg hCD1d-Ig dimer ve 20 ug birlikte uyaran moleküller (örneğin anti-CD28mAb) ekleyin. </li> &lt;li&gt; Sıra boncuk gelen mıknatıs ve aspirat borat tamponu üzerine cam flakon içeren. Adım 1.2 cam şişeye protein karışımı ekleyin ve kapağını kapatın. Ters flakon hemen karıştırın, bir rotator üzerinde parafilm ile kapak ve yeri kapsayacak ve 4 ° C&#39;de bir gece inkübe </li><li> Dikkatle boncuk kaçınarak Ertesi gün, bir yerde cam mıknatıs üzerine flakon ve protein karışımı çıkarın. 3 ml boncuk yıkama tampon maddesi (PBS,% 5 AB serumu +0.02% sodyum azid) eklenmesi, ve 5 dakika için bir döndürücü üzerine, 4 ° C sıcaklıkta inkübe ederek boncuk yıkayın. Iki kez tekrarlayın. </li><li> Boncuklar bu boncuk yıkama karışım içinde saklanabilir. Fonksiyonel AAPC yapmak için, küçük bir kısım çıkarın ve bir hemasitometre boncuk saymak. Proteinler stably antikorlar (örn. PE-konjuge anti-fare IgG1) ile boyanarak ve flow sitometri analizleri yaparak boncuk üzerine yüklendiğini kontrol edin. </li><li> Antijen ile boncuk yüklemek için, 5 x 10 7 boncuk kaldırmak, ve küçük bir 1.5 ml bir cam şişeye ekleyin, 1 ml steril PBS ile boncuk yıkayın. Resuspend 1 ml steril PBS ile boncuk yıkandı ve antijen ekleyin; örneğin: α-GalCer/KRN7000 (5mg/ml) ile yükleyin. * Not: biz lipid çözünürlüğün ya misel oluşumu ile herhangi bir sorunları tespit etmemiş olsak bile, lipidler üretici tavsiyelerine göre ele alınmalıdır. Özellikle, KRN7000 bu çalışmalar için DMSO (1mg/ml) içinde yeniden oluşturuldu. KRN7000 glikolipid ve başka antijenler de 0.2 mg / ml PBS içeren% 0.5 içinde çözülebilir Tween-20 (2 saat sonikasyon. 37 ° C&#39;de). ÖNEMLİ-AAPC kullanımdan önce en az 48-72 saat boyunca yüklü olması gerekir. </li></ol> 2. CD161 + CD3 + Hücre İzolasyonu <ol><li> Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) toplayın. Bir buffy coat veya lökoferez paketi lenfositlerin Ficoll yoğunluk gradyan santrifüj ayırma için, ilk olarak oda sıcaklığında 1X PBS eşit bir hacmi ile heparinize kan seyreltin. </li><li> 15 ml Ficoll (oda sıcaklığına ısıtıldı) 50 ml konik tüpe ekleyin. Yavaşça bindirme25 Ficoll üstüne seyreltilmiş kan karışımı ml. Freni ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 2000 rpm&#39;de santrifüj yapılır. </li><li> Dikkatlice Pasteur pipeti ile lenfosit arabirimi (medya ve Ficoll arasındaki beyaz halka) kaldırmak ve yeni bir 50 ml konik tüp aktarabilirsiniz. </li><li> PBS ile 50 ml&#39;ye tüp doldurma ve 5 dakika boyunca 1500 rpm&#39;de santrifüj yoluyla hücreler yıkanır. Süpernatantı atın ve tek bir tüp, tek bir bireyden tüpler birleştirmek ve 20 ml PBS ile tekrar periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) yıkayın. Daha sonra PBMC saymak ve 5 x 10 7 hücre / MACS tampon içinde ml &#39;lik bir konsantrasyonda tekrar süspansiyon (Ca 2 1 L serbest PBS + ve Mg + 2, 5 g BSA, 2 mmol EDTA). </li><li> T hücre fraksiyonunun izole edilmesi için, PBMC (10 8 hücreleri) 2 ml ile başlar ve EasySep insan T hücresi Zenginleştirme Kit Pan T hücre zenginleştirme çözeltisinden 100 ul ilave edin. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li&gt; <li> Başka bir 10 dakika boyunca oda sıcaklığında ve çözelti inkübe manyetik parçacıkların 100 ul ekle. 2.5 ila çözücü ml nihai hacim getirin ve 5 dk için mor mıknatıs olarak yerleştirilir. Hızlı bir 15 ml konik tüp içine CD3 + fraksiyonu kapalı dökün. </li><li> 5 ml soğuk tampon MACS eklenmesi ile yıkayın hücrelerini, yaşayabilir hücrelerin sayısını saymak ve FACS boyanması için bir tablet çıkarmak. </li><li> 980 ul buz soğuk MACS tampon CD161 + hücreler, ilk tekrar süspansiyon zenginleştirilmiş T hücreleri seçmek için, 10 mikrogram anti-CD161 mAb ekleyin ve 10 dakika buzdolabında beklettikten sonra kullanın. </li><li> 5 dk için 4 ° C sıcaklıkta 1500 rpm&#39;de hücreler santrifüj yapılır. MACS tamponu 800 ul Sonra sulandırmak hücre pelletini. Anti-fare IgG1 mikroboncuk 200 ul ekle ve 4. 10 dakika için çözelti inkübe ° C </li><li> İnkübasyon bu adım sırasında, 3 ml MACS tampon eklenerek bir LS kolon dengelenmeye. </li><li> Daha sonra, 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 1,500 rpm&#39;de santrifüj ile hücreler yıkanır. Resu3 ml MACS tampon içinde hücreler geçirirler. Sonra, LS MACS ayıran sütun içine pipetle hücreler. Yavaş pipetleme kabarcıklar üreten önlemek için emin olun. MACS tampon, 3 ml ilave edilerek sütun yıkayın. Iki kez tekrarlayın. </li><li> 3 ml taze MACS tamponu ekleyin ve mıknatıstan sütun kaldırmak. 15 ml konik tüp içine yerleştirin sütun. Piston takın ve saflaştırılmış CD161 + CD3 + hücreler elde etmek içeriğini dışarı itin. Kont NKT hücre fraksiyonu zenginleştirilmiştir. Sen 2-4 milyon hücre olmalıdır. </li></ol> 3. AAPC aracılı NKT Hücre Genişletme <ol><li> 16 ml tam bir ortam (tam bir ortam + IL-2, 100 U / ml) içinde 10 6 zenginleştirilmiş CD161 + CD3 + T hücreleri ve 10 6 AAPC eklenmesi ile ko-kültür ayarlayın. , 96 iyi doku kültürü tedavi polistiren için düşük buharlaşma kapaklı U-alt plaka 160 sıra nihai / ul hacim ekleyerek Plate bu karışımı. Taze orta 80 ul ekleyerek her 7 inci günü orta değişimi gerçekleştirin. </li><li> Hasathücreler, saymak ve günde 12-14 FACS boyaması gerçekleştirin. </li><li> Genişletilmiş NKT hücreleri, özellikle 16 ml tam bir ortam içinde 10 6 genişletilmiş T-hücreleri ve 10 6 AAPC tekrar süspansiyon, yukarıda adım 3.1 &#39;de tarif edildiği gibi replated edilebilir. Ul / kuyu bir 96 U-alt plaka 160 ekleyerek Levha bu karışım. Taze orta 80 ul ekleyerek her 7 inci günü kokültürü orta yenilemek için devam edin. </li><li> Bu genişleme ikinci turu sonrasında ekstra NKT hücreleri dondurmak için en iyi (1 ml% 5 DMSO / 95% FBS 1 x10 6 / cryovial.) </li></ol> 4. İşlevsel Test: NKT Hücre AAPC aracılı Uyarım <ol><li> 5x10 4 NKT hücreleri kurma / de 96 U-alt plaka 200 ul son hacim (tam orta) olarak 5x10 5 AAPC ile. </li><li> 24-48 saat sonra ELISA Hasat hücre kültür süpernatant. </li></ol>

<ol>
	<li>Fowlkes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+population+of+T-cell+receptor+&#945;&#946;-bearing+thymocytes+which+predominantly+expresses+a+single+V&#946;+gene+family.">A novel population of T-cell receptor &#945;&#946;-bearing thymocytes which predominantly expresses a single V&#946; gene family.</a> Nature. 329, 251-254 (1987).</li><li>Prigozy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolipid+antigen+presentation+by+CD1d+molecules.">Glycolipid antigen presentation by CD1d molecules.</a> Science. 291, 664-667 (2001).</li><li>Davodeau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Close+phenotypic+and+functional+similarities+between+human+and+murine+&#945;&#946;+T+cells+expressing+invariant+TCR+&#945;-chains.">Close phenotypic and functional similarities between human and murine &#945;&#946; T cells expressing invariant TCR &#945;-chains.</a> J. Immunol. 158, 5603-5611 (1997).</li><li>Exley, M., Garcia, J., Balk, S. P., Porcelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+CD1d+recognition+by+human+invariant+V&#945;24++CD4-CD8-+T+cells.">Requirements for CD1d recognition by human invariant V&#945;24+ CD4-CD8- T cells.</a> J. Exp. Med. 186, 109-120 (1997).</li><li>Koseki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+expression+of+a+distinctive+V14++T-cell+antigen+receptor+&#945;+chain+in+mice.">Dominant expression of a distinctive V14+ T-cell antigen receptor &#945; chain in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 7518-7522 (1991).</li><li>Dellabona, P., Padovan, E., Casorati, G., Brockhaus, M., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+invariant+V&#945;24-J&#945;Q/V&#946;11+T+cell+receptor+is+expressed+in+all+individuals+by+clonally+expanded+CD4-8-+T+cells.">An invariant V&#945;24-J&#945;Q/V&#946;11 T cell receptor is expressed in all individuals by clonally expanded CD4-8- T cells.</a> J. Exp. Med. 180, 1171-1176 (1994).</li><li>Porcelli, S. A., Modlin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD1+System:+Antigen-presenting+molecules+for+T+cell+recognition+of+lipids+and+glycolipids.">The CD1 System: Antigen-presenting molecules for T cell recognition of lipids and glycolipids.</a> Annu. Rev. Immunol. 17, 297-329 (1999).</li><li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+alpha-galactosylceramide-stimulated+Valpha24++NKT+cells+cultured+in+the+absence+of+animal+materials.">Expansion of alpha-galactosylceramide-stimulated Valpha24+ NKT cells cultured in the absence of animal materials.</a> J. Immunother. 28, 314-321 (2005).</li><li>Bella, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+maturation+of+peripheral+blood+dendritic+cells+in+patients+with+breast+cancer.">Altered maturation of peripheral blood dendritic cells in patients with breast cancer.</a> Br. J. Cancer. 89, 1463-1472 (2003).</li><li>Onishi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+and+Short-Lived+Subsets+in+Monocyte-Derived+Dendritic+Cells+from+Patients+with+Advanced+Cancer.">Dysfunctional and Short-Lived Subsets in Monocyte-Derived Dendritic Cells from Patients with Advanced Cancer.</a> Clinical Immunology. 105, 286-295 (2002).</li><li>Shimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+function+of+human+invariant+NKT+cells+from+cancer+patients+using+alpha-galactosylceramide-loaded+murine+dendritic+cells.">Evaluation of the function of human invariant NKT cells from cancer patients using alpha-galactosylceramide-loaded murine dendritic cells.</a> J. Immunol. 177, 3484-3492 (2006).</li><li>Shiratsuchi, T., Schneck, J., Kawamura, A., Tsuji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD1+dimeric+proteins+as+indispensable+tools+for+research+on+CD1-binding+lipids+and+CD1-restricted+T+cells.">Human CD1 dimeric proteins as indispensable tools for research on CD1-binding lipids and CD1-restricted T cells.</a> Journal of immunological. 345, 49-59 (2009).</li><li>Webb, T. J., Bieler, J. G., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+natural+killer+T+cells+by+CD1d1-Ig+coated+artificial+antigen+presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of natural killer T cells by CD1d1-Ig coated artificial antigen presenting cells.</a> J. Immunol. Methods. 346, 38-44 (2009).</li><li>Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+antigen-specific+T+cells+by+artificial+cell+constructs+having+immobilized+multimeric+peptide-class+I+complexes+and+recombinant+B7-Fc+proteins.">Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins.</a> J. Immunol. Methods. 249, 111-119 (2001).</li><li>Goldberg, J., Shrikant, P., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+augmentation+of+tumor-specific+CTL+responses+by+class+I/peptide+antigen+complexes+on+microspheres+(large+multivalent+immunogen).">In vivo augmentation of tumor-specific CTL responses by class I/peptide antigen complexes on microspheres (large multivalent immunogen).</a> J. Immunol. 170, 228-235 (2003).</li><li>Dal Porto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+soluble+divalent+class+I+major+histocompatibility+complex+molecule+inhibits+alloreactive+T+cells+at+nanomolar+concentrations.">A soluble divalent class I major histocompatibility complex molecule inhibits alloreactive T cells at nanomolar concentrations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6671-6675 (1993).</li><li>Greten, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+antigen-specific+T+cells:+HTLV-1+Tax11-19-specific+CD8++T+cells+are+activated+in+peripheral+blood+and+accumulate+in+cerebrospinal+fluid+from+HAM/TSP+patients.">Direct visualization of antigen-specific T cells: HTLV-1 Tax11-19-specific CD8+ T cells are activated in peripheral blood and accumulate in cerebrospinal fluid from HAM/TSP patients.</a> PNAS. 95, 7568-7573 (1998).</li><li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nat. Med. 9, 619-625 (2003).</li><li>Huang, M. M. S., Borszcz, P., Sidobre, S., Kronenberg, M., Kane, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1d1+Displayed+on+Cell+Size+Beads+Identifies+and+Enriches+an+NK+Cell+Population+Negatively+Regulated+by+CD1d1.">CD1d1 Displayed on Cell Size Beads Identifies and Enriches an NK Cell Population Negatively Regulated by CD1d1.</a> J. Immunol. 172, 5304-5312 (2004).</li><li>Bourgeois, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pro-Th2+cytokine+IL-33+directly+interacts+with+invariant+NKT+and+NK+cells+to+induce+IFN-gamma+production.">The pro-Th2 cytokine IL-33 directly interacts with invariant NKT and NK cells to induce IFN-gamma production.</a> Eur. J. Immunol. 39, 1046-1055 (2009).</li><li>Ugel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+administration+of+artificial+antigen-presenting+cells+activates+low-avidity+T+cells+for+treatment+of+cancer.">In vivo administration of artificial antigen-presenting cells activates low-avidity T cells for treatment of cancer.</a> Cancer Res. 69, 9376-9384 (2009).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

AAPC NKT hücre aktivasyonu için temel gereklilikleri incelemek için kullanılır ve adoptif immünoterapi için NK T hücrelerinin ex vivo olarak genişleme için potansiyel klinik bir değere sahip olabilir. Mescher ve ark. Lateks mikro kürecikler 14, 15 yüzeyine biyotinile birlikte uyaran moleküller streptavidin üzerinden B7.1 ve B7.2 ile kombine edilmiştir birinci boncuk esaslı sistemlerinden biri, biyotinile murin MHC sınıf I-peptid-tek zincirli yapıları tanımlanmıştır. Bu yaklaşımın başarılı bir şekilde transgenik farelerden alınan antijen-spesifik T hücreleri stimüle etmek için kullanılmıştır. Bu yaklaşım MHC moleküllerinin homojen bir yükleme sağlamak için bir tek zincir MHC-peptid kompleksi kullanan bu yana Buna ek olarak, her bir hedef peptid antijen böylece yoluyla sunulan tüm, istenilen tek zincir MHC-peptid kompleksi ifade etmek için bir yeni transfeksiyon gerektirir yaklaşım. Önemlisi, Dr Schneck grubunun başka bir hücresel olmayan boncuk tabanlı AAPC geliştirerek, boncuk tabanlı-AAPC öncülük, Manyetik boncuklar üzerine HLA-Ig, sinyal 1, ve anti-CD28, sinyal 2, kuplaj yapılır. HLA-Ig, bir immunglobulin moleküler iskele 16, 17 için erimiş HLA eşsiz multimerik formu kendi grubu tarafından geliştirilmiştir. Daha sonra, onlar etkili CMV ve MART-1 spesifik CTL 18 genişletmeye gösterilmiştir MHC-Ig tabanlı AAPC geliştirdi. Burada, CD1d-Ig bazlı AAPC fonksiyonel NKT hücrelerinin genişletmek için kullanılabileceğini göstermiştir. Bir çalışmada, CD1d 19 ile NK hücrelerinin fiziksel etkileşimini incelemek için benzer bir sistem kullandı. Özellikle, biz en uygun NKT hücre çoğalması için gerekli bulduğunuz herhangi gereksinimlerine uyarlanabilir yapay bir antijen sunan hücre tasarladık. AAPC genişleme yöntemi, insan NKT hücreleri genişletilmesi ve zenginleştirilmesi için basit ve güvenilir bir yöntem sağlar. Bizim AAPC sistematik potansiyeli kostimülatör moleküllerin bir panel rolünü değerlendirmek ve NKT hücre proliferasyonunda kendi rolünü değerlendirmek için modifiye edilebilirtion ve fonksiyonu. Böylece, AAPC NKT hücreleri indükleyen ve genişletilmesi için kullanışlı sağlam çok yönlü bir teknoloji sunmaktadır. AAPCs bir kuşak en az bir hafta sürer ve boncuk büyük miktarlarda üretim için uygundur. Bununla birlikte, AAPC oluşturulmasında önemli bir adım CD1d-Ig stabil olarak boncuklar üzerinde hareketsiz tutulan yüzey olduğunu doğrulamak için ve partiden partiye tutarlılık sağlamak için kendi işlevselliğini değerlendirilmesidir. Sistemin bir potansiyel kısıtlama boncuk mekanik olarak temizlenmesi dışında, stimülasyon kapatmak için bir mekanizma yok olmasıdır. Spesifik olarak, antijen ile T hücre reseptörü (TCR) iç içe geçme: CD1d/MHC kompleks tipik olarak T hücresi ve her ikisi üzerinde inhibitör ya da baskılayıcı faktörlerin indüksiyonu ile sonuçlanabilir aksesuar / yapışma molekülleri ile uyum içinde immünolojik sinaps oluşturmak antijen hücre sunulması. AAPC sistem, bu faktörler T hücresi tarafından upregulated olabilir, ama boncuk ortak kökenli ligand ifade etmedikleribu reseptörler için. Buna ek olarak, CD4 + NKT hücreleri, farelerde ve insanlarda anti-tümör tepkileri bastırmak için gösterilmiştir, bundan dolayı da bütün NKT hücreleri (α-GalCer yani, küresel stimülasyonu) ya da yanlış bir alt kümesi aktivasyonu seçici aktivasyon istenmeyen immünolojik neden olması mümkündür sonuçları. Sonuç olarak, bir fenotipik olarak ve işlevsel olarak AAPC-genişletilmiş NKT hücre popülasyonu göstermek zorundadır. Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi, anti-CD28 eksprese eden α-GalCer yüklemeli AAPC ile stimülasyon Th2 Th1 üreten NKT hücreleri, ve Th17 tipi sitokinlerin neden olabileceğini bulduk. Mürin çalışmalarda, IL-33, yeni tanımlanmış bir sitokin olan meydan IL-5 ve IL-13 gibi inflamatuar sitokinlerin dolaşımdaki düzeylerinde artış sağladığını bildirdi. IL-33 ile NKT hücrelerinin tedavisi onların sitokin üretimini 20 artırmıştır. IL-33 ST2 için bir spesifik ligand olup, bu çözünür ST2 ca görülmüştürn blok IL-33 sinyal. Böylece, gelecekteki bir uygulama örneği olarak, AAPC ifade ST2 oluşturulur ve NKT hücreleri tarafından Th1 sitokin salgılanmasını uyaran ise bir seçici olarak Th2 sitokinlerin üretimini inhibe edebilir olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. Aynı zamanda rapor edilmiştir ki iv enjeksiyon Kb-eksprese eden içine AAPC C57BL / 6 fareleri tümör 21 azalmıştır akciğer metastazı ile sonuçlanmıştır. Önemlisi, bu veriler akciğer o AAPC trafiği göstermek ve efektör T hücre alt aktive edebiliyoruz. Bu nedenle, bir AAPC birden fazla türde oluşturmak ve antijen spesifik T hücre alt grupları arasındaki etkileşimi incelemek olabilir. Özetlemek gerekirse, bu çalışmalar CD1d-Ig tabanlı AAPC normal hücresel APC yerine kullanılabileceğini göstermek ve NKT hücre bazlı evlatlık immünoterapi için güncel klinik yaklaşımlar geliştirmek için potansiyel var.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque PLUS </td><td> GE Yaşam Bilimleri </td><td> 17-1440 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep İnsan T Hücre Zenginleştirme Takımı </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 19051 </td><td></td></tr><tr><td> Allophycocyanin CD161 insan mAb </td><td> Pharmingen </td><td> 550968 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep Mıknatıs </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 18002 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-fare IgG1 mikro-küreler </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-047-101 </td><td></td></tr><tr><td> Dimer XI Rekombinant Çözünür Dimerik Fare CD1d: IG Fusion Protein </td><td> BD Biosciences </td><td> 557599 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Anti-CD28 mAb </td><td> Biolegend </td><td> 302914 </td><td></td></tr><tr><td> M-450 epoksi boncuk </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 150-11 </td><td></td></tr><tr><td> Alpha-galactosylceramide (KRN7000) </td><td> Axxora, LLC </td><td> BML-SL232-0100 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 Orta </td><td> Sigma Aldrich </td><td> R 0883 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum piruvat </td><td> Gibco </td><td> 11360-070 </td><td></td></tr><tr><td> Non-esansiyel amino asitler </td><td> Gibco </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> Vitamin Çözüm </td><td> Gibco </td><td> 11120-052 </td><td></td></tr><tr><td> 2-merkaptoetanol </td><td> Gibco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Siprofloksasin </td><td> Alexis Biyokimyasallar </td><td> 380-288-G025 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24Jα18 </td><td> Biolegend </td><td> 342904 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24 (klon C15) </td><td> Beckman Coulter </td><td> A66907 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-Vβ11 (Klon C21) </td><td> Beckman Coulter </td><td> A66905 </td><td></td></tr><tr><td> PE-CD1d </td><td> Biolegend </td><td> 123510 </td><td></td></tr><tr><td> PE anti-fare IgG1 </td><td> BD Biosciences </td><td> 556650 </td><td></td></tr><tr><td> FITC anti-fare IgG2a </td><td> Biolegend </td><td> 407105 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS, hiçbir kalsiyum, magnezyum yok </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 14190250 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum Azid </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> Bovine Albumin Serum </td><td> Biyoanalitik Amerikan </td><td> AB00440-00100 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 431788 </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 (Proleukin) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354043 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan AB Serum </td><td> Atlanta Biyolojik </td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td> Labquake Tüp Rotator </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-687-10Q </td><td></td></tr><tr><td> BD Falcon 5 ml polistiren yuvarlak tabanlı tüpler </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-1A </td><td></td></tr><tr><td> Cap ile Wheaton Cam örnek Flakon </td><td> Fisher Scientific </td><td> (03-343-6E) Büyük (03-343-6A) Küçük </td><td></td></tr></tbody></table>

artificial antigen presenting cell (aapc) mediated activation and expansion of natural killer t cells

Doğal katil T (NKT) hücreleri, doğal katil (NK) hücreleri, T hücrelerinin her ikisi de 1 ve karakteristik belirteçleri göstermek T hücrelerinin özel bir alt kümesidir. Klasik T hücrelerinin aksine, NKT hücrelerinin CD1 molekülleri 2 bağlamında, lipid antijeni tanır. Farelerde Vα14Jα18 ve sınırlı çeşitlilik 3-6 Vβ zincirleri ile ilişkili olan, insanlarda Vα24Jα18, kurallı ve değişmeyen NKT (i NKT) hücreler olarak ifade edilir: NKT hücreleri, değişmeyen bir TCRα zincir düzenlenmesi ifade eder. Geleneksel T-hücreleri ile benzer şekilde, NKT hücrelerinin CD1d 7 ile uygun olan sinyal ardından, CD4-CD8-timus T öncü hücrelerinden gelişir. Tedavi amaçlı NKT hücreleri kullanmak için potansiyel anlamlı α-galactosylceramide (α-GalCer) ve sitokinlerin 8 çeşitli insan NKT hücreleri canlandırmak ve genişletmek için yeteneği ile artmıştır. Önemlisi, bu hücreler kendi özgün phenotyp koruduE, salgılanan sitokinler ve tümör hücre hatlarına karşı gösterilen sitotoksik fonksiyonu. Bu nedenle, ex vivo genişletilmiş NKT hücrelerinin işlevsel kalır ve adoptif immünoterapi için de kullanılabilir. Bununla birlikte, NKT hücre bazlı immünoterapi otolog antijen sunan hücrelerin kullanımı ile sınırlı olup, bu stimülatör hücrelerin miktarı ve kalitesi önemli ölçüde değişebilir. Kanser hastalarının monosit türevli DC birlikte uyaran moleküllerin düşük seviyelerde ifade etmek ve 9,10 az enflamatuvar sitokinler üretmek için rapor edilmiştir. Aslında, daha ziyade otolog APC murin DC KML hastalar 11 NKT hücrelerinin fonksiyon test etmek için kullanılmıştır. NKT hücrelerinin mürin DC tarafından genişletilmiş ve daha sonra adoptif immünoterapi için kullanılamaz Bununla beraber, bu sistem, sadece in vitro test için kullanılabilir. Böylece yapay antijen sunan hücreler (AAPC) dayanan standart bir sistem allo-ya Ksenogenik ce tuzaklar olmadan DC uyarıcı etkileri olabilirlls 12, 13. Burada, CD1d bazlı AAPC üretmek için bir yöntem açıklanmaktadır. CD1d-Ig kompleksleri güvenilir bir yöntem, izole etkinleştirmek ve efektör NKT hücre popülasyonlarının genişletmek sağlar: CD1d-antijen kompleksleri ile T hücre reseptör (TCR) katılımını NKT hücre aktivasyonu, antijen temel bir ihtiyacı olduğu için.

Bu olgu, NKT hücreleri (Şekil 1) yayılması için standart yöntem olarak NKT hücreleri, uyarmak için manyetik boncuklara CD1d-Ig, anti-CD28 mAb kovalent bağlanması ile yapılmış CD1d-Ig bazlı AAPC, üretmek için bir yöntem açıklanmaktadır. İlk olarak, bir CD1d-Ig füzyon proteinleri stabil olarak manyetik boncuk yüzey üzerinde hareketsiz olduğundan göstermek zorundadır. Şekil 2A, CD1d-Ig ve anti-CD28 antikor gösterilen manyetik boncuk yüzeyinde eksprese edilen, her ikisi de. AAPC olan uyarıcı kapasitesini incelemek için AAPC gecede, hasat kültür yüzer ve ELISA ile ölçülen IL-2 üretimi ile biz co-kültürlü NKT hücre hibridomlar. Biz CD1d-Ig tabanlı AAPC (Şekil 3, veriler gösterilmemiştir) eşit ya da hücresel muadillerine göre daha yüksek seviyelerde NKT hücre hibridomlar teşvik başardık bulundu. İlginçtir, bizim fare NKT hücre hibridomlar insan CD1d tabanlı AAPC (Fi tarafından uyarılır bulunduAAPC her parti test edilmesi için basit bir yöntem sağlar Şayet 2B). Sonra biz AAPC yayılma potansiyelini göstermek için çalıştı, böylece insan T hücreleri periferik kandan izole edildi. İlk CD161 + CD3 + T hücre fraksiyonu manyetik boncuk ayırma ile zenginleşti. Daha sonra T hücreleri α-GalCer yüklemeli AAPC ile haftada iki kez uyarıldı. Önemlisi, biz bile nispeten düşük bir başlangıç ​​NKT hücre nüfus (% 0.03) ile, biz ~ 67% Vα24 + Vβ11 + (Şekil 3) hücreleri genişletmek mümkün olduğunu bulmuşlardır. Biz çok sağlıklı gönüllüler ve kanser hastalarının PBMC NKT hücreleri genişlettik ve α-GalCer yüklenen AAPC iki grupta NKT hücreleri nüfus genişletmek mümkün olduğunu bulduk. Özellikle, genleşme oranı yüksek donör bağımlı oldu. Beklendiği gibi Vα24 + hücrelerin daha yüksek bir başlangıç ​​nüfusu, genişleme daha büyük yüzdesi. Buna ek olarak,2 milyon hücre, bir başlangıç ​​popülasyonu kullanıldığında CD161 + CD3 + T-hücreleri, tek genişlemelere (Tablo 1) sonra&gt; 10 7 hücreleri elde edebilir. Genişletilmiş NKT hücrelerinin yaklaşık% 80-90 +, ~% 5 CD8 + ve geri kalan muhtemelen CD4-negatif CD8-çift NKT hücreleri CD4 vardır. Şekil 4A-C &#39;de gösterildiği gibi Bu genişletilmiş NKT hücrelerinin fonksiyonel çalışmalar için de kullanılabilir. Biz ex vivo NKT hücreleri α-GalCer uyarım ile duyarlı kalmasını ve IL-17A, TNF-α, ve IFN-γ potent üreticileri genişletilmiş olduğunu bulduk. Bu, ilk T-hücresi zenginleştirme nüfus düşük olması ve bir ikinci CD161 zenginleştirme adımı gerçekleştirmek mümkün ise, AAPC-aracılı genleşme beklenen sonuçlar (Şekil 4D, Donör 1&#39;e bakınız) elde olmayabilir not edilmelidir. Dolaşımdaki NKT hücrelerinin yüzdesi% 0.1 &#39;den daha yüksek olan, ancak, yine de önemli bir büyüme elde etmek mümkün olmalıdıri NKT hücrelerinin. Toplu olarak, bu veri CD1d bazlı AAPC genişletmek ve etkili bir primer insan NKT hücreleri, uyarmak için kullanılabileceğini göstermektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig1.jpg" /> Şekil 1. CD1d şematik: Ig-tabanlı aAPCs CD1d molekülünün hücre dışı bölümleri, kısa amino asit bağlayıcısı ile ayrılan bir immünoglobülin ağır zincir protein sabit bölgesi ile birleştirilir. Bu moleküller, kolayca sadece ilgi lipid fazlalığı ile inkübe ederek, bu gibi α-GalCer gibi lipid antijenleri ile yüklenebilir. AAPC manyetik boncuklara CD1d-Ig, anti-CD Abs birleştirilmesi ile gerçekleştirilmiştir. Bu sistemde, CD1d-Ig mAb kaynaklı birlikte uyaran sinyalin içerir TCR ve anti-CD28 ile aynı soydan gelen antijen-spesifik sinyal sağlamak için kullanılır. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="4.25in" fo: src = src = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2.jpg&quot; / &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2highres.jpg&quot;&gt; Şekil 2. . IgG dimer (PE-bağlı anti-fare IgG1 ile boyama yoluyla) ve anti-CD28 antikoru (FITC-konjuge anti-fare IgG2a kullanılarak): aAPCs yüzey proteinleri FACS boyama A) aAPCs CD1d varlığı açısından test edildi . Aç histogramlar izotip kontrol gösterir; dolu histogramlar Belirtilen antikorlar temsil eder. CD1d-Ig ifade AAPC NKT hücreleri IL-2 üretimi teşvik edebilir. B) Vα14 + fare hibridoma hücre NKT, DN32.D3, ya da orta, suda çözünür antijen (α-GalCer), AAPC ya da α-GalCer yüklemeli AAPC boşaltılması ile kültüre edildi. Yüzen kültürler hasat edildi ve standart bir sandviç ELISA, IL-2 üretimini ölçmek için kullanılmıştır. <img alt="Şekil 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3.jpg" /> Şekil 3,. CD1d-Ig kaplama suni antijen sunan hücreler tarafından NKT hücrelerinin genişlemesi. (A) Birincil CD3 + CD161 + çift pozitif hücreler manyetik ayırma kullanarak PBMC&#39;ler izole edilmiştir. Kriteri hücreleri α-GalCer yüklü, 14 gün boyunca CD1d-Ig kaplamalı AAPC ile uyarıldı. Hücreler Vα24 ve Vβ11 aşağıdaki AAPC uyarılması için boyandı. (B) Birincil insan NKT hücre bir B hücreli lenfoma hattı lizis aracılık. Antijeninin varlığı ya da yokluğu, 20-24 saat için 96 oyuklu U tabanlı bir plaka-GalCer (100 ng / ml) olarak belirtilen oranlarda NKT hücreleri ile inkübe C1R-CD1d hücreler. NKT hücre aracılı hücre parçalama standart 51Cr-salınım testi ile değerlendirildi. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4.jpg" /> Şekil 4. AAPC-genişletilmiş NKT hücrelerinin sitokin profilleri. </strong&gt; iki hafta α GalCer yüklenen AAPC, genişletilmiş NKT hücreleri (1 × 10 5 / kuyu) çözünür α-GalCer, PMA / Ionomycin, anti-CD3/28 mikroboncukları veya α-GalCer yüklü AAPC ile kültüre edildi ile stimülasyon sonra (2 × 10 5 kuyu /) 48 saat boyunca. (A), IL-17A, (B), TNF-α, ve (C), IFN-γ standart sitokin üretimi ELISA ile ölçülmüştür. Gösterilen veriler negatif kontroller (medya ve boş boncuk) düşüldükten sonra net sitokin üretimi vardır. (D) Birincil T hücreleri PBMC manyetik boncuk ayırma kullanılarak izole edilmiştir. Kriteri hücreler-GalCer yüklü-AAPC göstergesi ile iki hafta için uyarıldı. Hücreler Vα24 için belirli Abs kullanılarak boyandı + ve Vβ11 + ve flow sitometri ile analiz.

Watch this Scientific Journal Video about Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells at JoVE.com

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Burada yapay antijen sunan hücreler (AAPC) kullanarak toplu T hücre popülasyonlarının insan NKT hücreleri aktive ve genişletilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. CD1d bazlı AAPC kullanılması, fonksiyonel NKT hücrelerinin yüksek sayılar için bir standart bir yöntem sağlar.

Yapay Antijen Hücre (AAPC) Aracılı Aktivasyon ve Doğal Öldürücü T hücreleri genişletilmesi Presenting

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

artificial-antigen-presenting-cell-aapc-mediated-activation-expansion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

17.9K Görüntüleme.  University of Maryland. Burada yapay antijen sunan hücreler (AAPC) kullanarak toplu T hücre popülasyonlarının insan NKT hücreleri aktive ve genişletilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. CD1d bazlı AAPC kullanılması, fonksiyonel NKT hücrelerinin yüksek sayılar için bir standart bir yöntem sağlar.

Video: Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Hazırlanması ve kullanımı, HIV-1 Enfekte İlköğretim CD4 + T-Hücreleri Hedef Hücreler olarak Natural Killer Hücre Sitotoksik Tahliller

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals may exhibit suppressive immune microenvironment and, in contrast to activating CTL, their autologous antigen presenting cells may tend to tolerize or anergize antigen specific CTL. As a result, although still in the experimental phase, CTL-based adoptive immunotherapy has evolved to become a promising treatment for various diseases such as cancer and virus infections. In initial experiments ex vivo expanded CMV (cytomegalovirus) specific CTL have been used for treatment of CMV infection in immunocompromised allogeneic bone marrow transplant patients. While it is common to have life-threatening CMV viremia in these patients, none of the patients receiving expanded CTL develop CMV related illness, implying the anti-CMV immunity is established by the adoptively transferred CTL1. Promising results have also been observed for melanoma and may be extended to other types of cancer2. 
While there are many ways to ex vivo stimulate and expand human CTL, current approaches are restricted by the cost and technical limitations. For example, the current gold standard is based on the use of autologous DC. This requires each patient to donate a significant number of leukocytes and is also very expensive and laborious. Moreover, detailed in vitro characterization of DC expanded CTL has revealed that these have only suboptimal effector function 3. 
Here we present a highly efficient aAPC based system for ex vivo expansion of human CMV specific CTL for adoptive immunotherapy (Figure 1). The aAPC were made by coupling cell sized magnetic beads with human HLA-A2-Ig dimer and anti-CD28mAb4. Once aAPC are made, they can be loaded with various peptides of interest, and remain functional for months. In this report, aAPC were loaded with a dominant peptide from CMV, pp65 (NLVPMVATV). After culturing purified human CD8+ CTL from a healthy donor with aAPC for one week, CMV specific CTL can be increased dramatically in specificity up to 98% (Figure 2) and amplified more than 10,000 fold. If more CMV-specific CTL are required, further expansion can be easily achieved by repetitive stimulation with aAPC. Phenotypic and functional characterization shows these expanded cells have an effector-memory phenotype and make significant amounts of both TNF&alpha; and IFN&gamma; (Figure 3).

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

A new DC independent method for induction and expansion of antigen-specific T cells is described. HLA A2-Ig based artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) are loaded with HLA-A2 restricted peptides to efficiently expand CTL of diverse antigen specificity. This technology holds great potential for CTL-based adoptive immunotherapy.

Verimli HLA-Ig Tabanlı Yapay antijen sunan hücrelerin Ex vivo</emİnsan CTL> Genleşme

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Klinik Uygulama<em&gt; Sleeping Beauty</emGenetiği Periferik ve Göbek Kordon Kanı alınan T hücreleri Değiştir Sunan Hücreler&gt; ve Yapay Antijen

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

Etkin Killer yapay antijen sunan hücreler (KaAPC)<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Antijen-spesifik T hücrelerinin tükenmesi

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells are therefore characterized as an innate T cell population capable of activating and steering adaptive immune responses. The development of improved techniques for the culture and expansion of murine iNKT cells facilitates the study of iNKT cell biology in in vitro and in vivo model systems. Here we describe an optimized procedure for the isolation and expansion of murine splenic iNKT cells.
Spleens from C57Bl/6 mice are removed, dissected and strained and the resulting cellular suspension is layered over density gradient media. Following centrifugation, splenic mononuclear cells (MNCs) are collected and CD5-positive (CD5+) lymphocytes are enriched for using magnetic beads. iNKT cells within the CD5+ fraction are subsequently stained with &#945;GalCer-loaded CD1d tetramer and purified by fluorescence activated cell sorting (FACS). FACS sorted iNKT cells are then initially cultured in vitro using a combination of recombinant murine cytokines and plate-bound T cell receptor (TCR) stimuli before being expanded in the presence of murine recombinant IL-7. Using this technique, approximately 108 iNKT cells can be generated within 18-20 days of culture, after which they can be used for functional assays in vitro, or for in vivo transfer experiments in mice.

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

Fare Dalak Değişmeyen Doğal Öldürücü T Hücreleri İzolasyon ve Yaygınlaştırılması için optimize Yöntemi

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

Bir Antijen odaklı Kolit Modelinin Geliştirilmesi Antijen T hücreleri için Hücreler sunulması ile Antijen Sunumu Eğitim için

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Otoimmünite karşı Kök Hücre türetilmiş antijen-özgü düzenleyici T hücrelerinin gelişimini

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Roman besleyici-Alerjik sistemi fare doğal katil hücreler Vitro seri üretim için

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that antigen-presenting dendritic cells (DCs) can sense elevated extracellular sodium leading to the activation of the NADPH oxidase and formation of isolevuglandin (IsoLG)-protein adducts. These IsoLG-protein adducts react with self-proteins and promote an autoimmune-like state and hypertension. We have developed and optimized state-of-the-art methods to study DC function in hypertension. Here, we provide a detailed protocol for isolation, in vitro treatment with elevated sodium, and adoptive transfer of murine splenic CD11c+ cells into recipient mice to study their role in hypertension.

Here, we present a protocol to isolate dendritic cells from murine spleens by magnetic cell sorting and subsequent adoptive transfer into na&#239;ve mice. The model of high-salt activated dendritic cells was chosen to explain the step-by-step procedures of adoptive transfer and flow cytometry.