Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı (DFG) SCHU-2681 / 1-1 (CS) ve KFO 146 (MF) tarafından desteklenmiştir, Savunma hibe PC DOD Bölümü 040972 (MO) ve Sağlık Ulusal Enstitüsü RO1&#39;e CA108835 verir , RO1 Ai44129 (Jps)

HLA-A2-lg Tabanlı KaAPC 1. Üretimi <ol><li> Steril borat tamponu hazırlayın. Su içinde borik asit içindeki bir 0.1 M bir solüsyon yapmak ve 7.0 pH değerinin ayarlanması. Steril filtre (0.22 um) tamponu ve 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Steril boncuk yıkama tamponu hazırlayın. Magnezyum ve kalsiyum içermeyen fosfat tamponlu serum fizyolojik (PBS) kullanılır. % 3 nihai konsantrasyon, insan AB serumu ekleyin. 2 mM nihai konsantrasyon için etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ilave edin. % 0.01 nihai konsantrasyona sodyum azid (NaN3) ekleyin. Steril filtre (0.22 um) tamponu ve 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Steril içine stoktan epoksi boncuklar (yaklaşık 100 x 10 6 boncuk) 250 ul aktarın, cam tüpe vida. </li><li> Borat tampon 250 ul ilave edin. </li><li> Bir mıknatıs cam şişeyi koyun ve boncuk 2 dakika uymak edelim; aspirat tampon ve mıknatıstan cam şişeyi çıkarın. </li><li> 1 ml borat tamponu ile bir kez boncuk yıkayın. </li><li> 0.018 mcg 550 ul içine süspanse boncuklar/ Ml HLA-A2-lg ve 3.64 ug / ml anti-insan CD95 mAb (klon CH11) ve hafifçe sallanarak karıştırılır. (Ek bilgi için tartışma bölümüne bakınız.) </li><li> 24 saat boyunca 4 ° C &#39;de, ucuna bir döndürücü ucunda cam tüpe inkübe edin. </li><li> 2 dakika boyunca 300 xg&#39;de boncuk aşağı doğru döndürün. </li><li> 2 dakika için bir mıknatıs üzerine cam şişe yerleştirin ve &quot;KaAPC yükleme çözüm&quot; aspire; , mıknatıs cam flakonun çıkarılması boncuk yıkama tamponu 1 ml ekleyin ve sallayarak dikkatle tekrar süspansiyon. </li><li> Adımı yineleyin 1.10 iki kez. </li><li> 1 mi boncuk yıkama tampon maddesi içinde, 24 saat boyunca 4 ° C &#39;de, bir döndürücü üzerinde cam tüpe inkübe edin. Bu noktada, tüm bağlanma yerleri artan protein boncuk yıkama tamponu içinde bulunan insan AB serumu ile bloke edilir. </li><li> 2 dakika boyunca 300 xg&#39;de boncuk aşağı doğru döndürün. </li><li> Yer cam 2 dakika ve aspire boncuk yıkama tamponu için bir mıknatıs üzerine flakon; mıknatıstan cam tüpe çıkarın ve 1 ml PBS ile bir çözüm yerine. </li></ol> 2. Kalite Kontrol, Peptide Yükleme, Wkülleme, Depolama ve KaAPC Kararlılık <ol><li> Bir FACS tüpü içine, 1.5 x 10 5 KaAPC aktarın ve FACS yıkama tamponu 1 ml ile yıkayın. </li><li> Tampon ve tespiti için, ve anti-fare IgM FITC (klon R6-60.2 1 ul (HLA-A2-Ig Fc bölümü tespiti için), anti-fare IgG1 PE 1 ul yıkama 100 ul FACS içinde süspanse boncuk anti-insan CD95 mAb). </li><li> Tampon ve akış sitometrisi ile lekeleme yıkama oku 250 ul FACS 1 ml FACS yıkama tamponu ve tekrar süspansiyon ile yıkayınız, 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca inkübe edin. </li></ol><img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" width="500" /> Protokol bölümünde belirtildiği gibi yapılan bir KaAPC toplu Şekil 1. QC lekesi. Lekelenmesi anti-insan CD95 ise, 2. HLA-A2-lg bir anti-fare-PE IgG1 mAb protokolü kullanılarak tespit edilmiştir bölümünde tarif edildiği gibi gerçekleştirildi (anti-Fas) (se protokolüne bir anti-fare-FITC ile IgM mAb ile saptandıavranış 2.2) (mavi çizgi). Dolgulu siyah grafikler, sırasıyla anti-fare-PE IgG1 mAb ya da anti-fare FITC-lgM mAb ile lekelenmiş, boş boncuklar temsil eder. Sağ üst köşedeki sayılar ortalama floresan yoğunluğu (MFI) gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="4"><li> Yeni bir steril cam şişenin içine peptid yükleme devri 20 x 10 6 KaAPC için, 2 dakika boyunca bir mıknatıs üzerine yerleştirin, 5 ug peptit ile 500 ul taze PBS içine aspire PBS ve tekrar süspansiyon boncuk (Unutmayın, sadece HLA-A2 kısıtlı peptidler olacak dimer üzerine bağlanan!). </li><li> Mağaza HLA-A2-lg dimer üzerine yeterli bir peptit yüklenmesine olanak sağlamak üzere, en az 3 gün süre ile, kullanılana kadar 4 ° C &#39;de KaAPC yüklendi. </li><li> Kullanımdan hemen önce, 1,14 belirtildiği gibi KaAPC yüklenen peptidi yıkama; Bu adımı en az 6x tekrarlayın. NOT: Bu ücretsiz peptid t sahip olmasını sağlamak için önemli bir adımdıro yalancı pozitif öldürme sonuçları önlemek için tamamen çıkarılmalıdır; artık serbest peptid antijene özgü T hücre kültürlerinin 9 apoptosisi teşvik ettiği gösterilmiştir. Çözünebilir peptid etkisini ortadan kaldırabilmek için, yüklenen peptid süpernatant kontrol örnekleri çalıştırmak ve KaAPC (3.8 bakınız) yıkandı. </li><li> Hemasitometre kullanarak boncuk saymak ve peptit ve konsantrasyon tarih, adı ile etiketleyin. NOT: Yüklü KaAPC en az bir ay boyunca 4 ° C &#39;de işlevsel kalır. Bir ay sonra, aynı peptid ile yeniden yükleme KaAPC bir yıla kadar kullanılmasını sağlar. </li></ol> 3. KaAPC İn Vitro Öldürme Deneyi <ol><li> Ko-kültür ortamı hazırlayın. Ve% 3 otolog plazma verici (laboratuarda yapılan 6) 3% T hücre büyüme faktörü ile desteklenmiş tam RPMI ortamı hazırlayın. Donör otolog plazma mevcut değilse, ısı ile inaktive edilmiş insan AB serumu kullanın. </li><li> AnnexinV bağlama tamponu hazırlanmasını hazırlayın. 8.12 g sodyum klorür (NaCI) ve 0.12 g kireci çözündürün990 mi ile kombine edilmiştir 2&#39;ye amonyum klorür (CaCl2), 10 ml 1 M HEPES tamponu O.Add. </li><li> Insan antijen-spesifik T hücrelerini oluşturur. (Ayrıntılı bir protokol için yapay antijen sunan hücreler (aAPC) kullanan bir önceki yayını 7 bakınız). Bu peptid özgünlüğü tetramer boyama ile saptandığı haliyle en azından&gt;% 75 olduğundan emin olun. </li><li> Nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 48 saat boyunca KaAPC 1 oranında, 37 ° C de Her numune için, 2 x 10 5 antijene spesifik T hücre / göz (96 yuvarlak tabanlı plaka içindeki), 1 ortak-kültür ortamı içinde 200 ul inkübe C ve% 5 CO2. </li><li> Hasat örnekler ve bir FACS tüpü içine transferi; 1 ml bağlayıcı tampon ile AnnexinV yıkama 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de spin AnnexinV bağlayıcı tampon 100 ul supernatant ve tekrar süspansiyon atmak </li><li> 1 ul AnnexinV FITC ve oda sıcaklığında 10-15 dakika boyunca 5 ul 7-AAD ile Leke örnekleri, 1 mi AnnexinV bağlama tamponu ile yıkama; , 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de dönme üst sıvı bir atın250 ul AnnexinV bağlama tamponu içinde tekrar süspansiyon d </li><li> Akış sitometresi örnekleri hemen okuyun. </li><li> KaAPC antijen spesifik öldürmeyi belirlemek için aşağıdaki örnekleri hazırlayın: T hücrelerinin sadece; + T hücreleri, çözünür anti-CD95; T hücreleri boşaltılmış KaAPC +; T hücreleri + olmayan soydaş peptid KaAPC yüklenir; T hücreleri, ortak kökenli + peptid KaAPC yüklenir; Ortak kökenli peptitin T hücreleri + yüzer KaAPC yüklendi. </li></ol><img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" width="500" /> ., CMVpp65 spesifik T hücreleri (~% 80) 1 oranında, hasat edilmiş ve daha sonra AnnexinV ile boyanmıştır: Şekil 2. KaAPC öldürme deneyi bir Peptid 1 de 48 saat süre ile kültüre KaAPC ya da kontrol boncuk (HLA-A2-lg sadece boncuk) yüklendi edildi ve propidyum iyodür (PI). flow sitometri (bkz protokol bölüm 3.3-3.7) tarafından &quot;soydaş&quot; apopitozun olmak &quot;non-soydaş&quot; CMVpp65 ve yüklü boncuk atıfta içinMart-1 peptid ile yüklü reklamlar. Sayılar her arsa sol alt kadranda canlı T hücrelerinin yüzdesini göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="9"><li> , Çapraz-deneyler yaparak, iki farklı özelliklerin antijene-özgü T hücrelerinin üretilmesi için. </li><li> Bundan başka, T hücre popülasyonunun heterojen T hücrelerinin antijene özgü bir eleme analizi ile eşzamanlı KaAPC antijene spesifik tükenmesinin-yeteneklerini değerlendirmek. (Ayrıntılı bir protokol için Schütz ark bakınız. 10). </li></ol>

<ol>
	<li>Bizzaro, N., Tozzoli, R., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+at+a+stage+to+predict+autoimmune+rheumatic+diseases.">Are we at a stage to predict autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis and rheumatism. 56 (6), 1736-1744 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Oelke, M., Schneck, J. P., Mackensen, A., Killer Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells:+the+synthetic+embodiment+of+a+&#8220;guided+missile.">artificial antigen-presenting cells: the synthetic embodiment of a &#8220;guided missile.</a> Immunotherapy. 2 (4), 539-550 (2010).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+but+not+immature+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+human+monocyte-derived+dendritic+cells+are+protected+from+Fas-mediated+apoptosis+and+can+be+used+as+killer+APC.">Mature but not immature Fas ligand (CD95L)-transduced human monocyte-derived dendritic cells are protected from Fas-mediated apoptosis and can be used as killer APC.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 170 (11), 5406-5413 (2003).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+activated+but+not+resting+primary+human+CD4++and+CD8++T+cells+by+Fas+ligand+(FasL/CD95L)-expressing+Killer-dendritic+cells.">Elimination of activated but not resting primary human CD4+ and CD8+ T cells by Fas ligand (FasL/CD95L)-expressing Killer-dendritic cells.</a> Immunobiology. 208 (5), 463-475 (2004).</li><li>Sch&#252;tz, C., Hoves, S., Halbritter, D., Zhang, H. -. G., Mountz, J. D., Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alloantigen+specific+deletion+of+primary+human+T+cells+by+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+monocyte-derived+killer-dendritic+cells.">Alloantigen specific deletion of primary human T cells by Fas ligand (CD95L)-transduced monocyte-derived killer-dendritic cells.</a> Immunology. 133 (1), 115-122 (2011).</li><li>Oelke, M., Maus, M. V., Didiano, D., June, C. H., Mackensen, A., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Chiu, Y. -. L., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-Ig+based+artificial+antigen+presenting+cells+for+efficient+ex+vivo+expansion+of+human+CTL.">HLA-Ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human CTL.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (50), (2011).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111 (7), 3546-3552 (2008).</li><li>Snow, A. L., Pandiyan, P., Zheng, L., Krummey, S. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+and+the+promise+of+restimulation-induced+cell+death+in+human+immune+diseases.">The power and the promise of restimulation-induced cell death in human immune diseases.</a> Immunological reviews. 236 (1), 68-82 (2010).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+flow+cytometric+assay+for+the+simultaneous+analysis+of+antigen-specific+elimination+of+T+cells+in+heterogeneous+T+cell+populations.">A new flow cytometric assay for the simultaneous analysis of antigen-specific elimination of T cells in heterogeneous T cell populations.</a> Journal of immunological. 344 (2), 98-108 (2009).</li><li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells+deplete+alloantigen-specific+T+cells+in+a+murine+model+of+alloskin+transplantation.">artificial antigen-presenting cells deplete alloantigen-specific T cells in a murine model of alloskin transplantation.</a> Immunology letters. 138 (2), 144-155 (2011).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+artificial+antigen+presenting+Cells+for+T+cell+immunotherapy.">Nanoscale artificial antigen presenting Cells for T cell immunotherapy.</a> Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. 10 (1), 119-129 (2013).</li><li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2013).</li></ol>

CS ve MF ifşa hiçbir şey yok. NexImmune ve Johns Hopkins Üniversitesi, Dr arasında bir lisans anlaşması altında. Schneck ve Oelke bu makalede açıklanan aAPC ürünlerinin satışlarında Üniversitesi tarafından alınan lisanslı hisse hakkına sahiptir. Onlar da Üniversite politikası uyarınca belirli kısıtlamalara tabidir NexImmune stok sahibi. Dr Schneck şirket &quot;ler Yönetim Kurulu ve Bilimsel Danışma Kurulu üyesidir. Bu düzenlemenin koşulları faiz politikalarında ihtilafı uyarınca Johns Hopkins Üniversitesi tarafından yönetiliyor.

Protokolde en önemli nokta sinyali 1 (peptid-MHC) ve sinyal 2 (anti-Fas mAb) uygun oranının sağlamaktır. Biz sinyali 1 ve 2 için mükemmel oranını tanımlamak için yoğun titrasyon deneyleri var; nedeniyle HLA-A2 ile lg dimer ya da anti-Fas mAb konsantrasyonlarında çok az farklar varyasyonlar KaAPC işlevselliği de müdahale edebildiği de ortaya çıkmıştır. Böylece, hem sinyallerin yoğunluğunun her zaman kontrol edilmelidir ve her iki protein kalitesi genellikle bu ticari bir kaynaktan sipariş olsa bile test edilmelidir. Farklı tespit deneyleri, farklı konsantrasyonlarda neden olabilir Dahası, konsantrasyon her zaman aynı deneyi ile tespit edilir. HLA-A2-Ig işlevselliği, aynı zamanda, tam olmayan katlama ve / veya verimsiz peptit yüküne bozulabilir. Ayrıca dimer molekülleri proteinin işlevsel etkinliği üzerindeki etkisi olabilir, farklı derecelerde burada toplayabilir. Bu nedenle, actudimer ark miktarı değişebilir ve belirli fonksiyonel KaAPC üretilmesi için gerekli. Ayrıca, sinyal KaAPC anti Fas mAb indükleyici ölümü için ideal aralık son derece sıkı olduğu bulunmuştur. Bizim elimizde büyük miktarlarda 3.64 ug / ml &#39;nin altında miktarları, doza bağlı olarak, indirgenmiş öldürme aktivitesi ile sonuçlanırken mi, Fas pozitif T hücre spesifik olmayan öldürülmesine yol / 3.64 ug. Bu koşullar oldukça sıkı gibi ise de, bu ayrıntıları bir dikkat ve spesifik fonksiyonel KaAPC üretilmesiyle sonuçlanacaktır. Mevcut KaAPC fenotipi saf ya da dinlenme antijen-spesifik T hücrelerini hedefleyen antijene özel aktive edilmiş T hücreleri, ön deneylerde tükenmesi için işlevsel olduğunu da bu popülasyonlar, Fas düşürülmüş sentezlenmesine sahip antijen-özel apoptosis anlamlı endüksiyonunu gösterdi. Bu nedenle, bunları açmak yapmak Hareketsiz T hücreleri üzerinde Fas yukarı düzenlenmesini teşvik etmek için KaAPC üzerine ko-stimülatör bir sinyal ekleme olabilir tasavvurKaAPC için bir hedef haline. Bunun mümkün olduğu da her üç sinyal, dikkatli bir şekilde fonksiyonel bir KaAPC fenotip temin etmek için titre edilmesi gerekir. Bir biyo-uyumlu ya da biyo-bozunabilir matris, damak platformu ayarlanması in vivo uygulanabilirliği KaAPC arttıracaktır. Son zamanlarda, Shen ve ark. KaAPC -TRP2 11b, anti-Fas (klon Jo2) ve anti-His / H2-Kd konjüge 5 um lateks boncuklar kullanılarak in vivo kullanımı başarılı bildirmişlerdir. Bu yapay antijen sunan hücreler (aAPC) &#39;deki genel kavramı başarılı bir şekilde mil boyutlu parçacıklar 12 um büyüklükte transfer edilebilir ve bu işlevsellik parçacık geometrisine 13 etkisi olduğunu göstermek mümkün olmuştur. Bu yüzden, boyutu ve / veya gelecekteki KaAPC şekli değiştirilerek bir organa özgü otoimmün hastalıkların başarılı bir tedavisi için bir anahtar olabilir in vivo işlevselliği ve biyo-dağılımı üzerindeki etkisi mümkün olabilir tasarlar. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; KaAPC donör durumu ve ön arıtma bağımsızdır, zaman ve maliyet etkin bir yaklaşım &quot;raftan&quot; kullanımı kolay bir hücre bazlı tükenmesi stratejilerinin önemli eksikliklerin üstesinden. KaAPC kişisel ya da parakrin öldürme sinyal hedefleri ve CTL&#39;nin sitolitik efektör fonksiyonlara duyarlı değildirler. KaAPC ilgili hastalık antijenin belirlenmesini gerektirir ve spesifik HLA tipi üzerinde de durulacaktır. Tip 1 diyabet için halen çeşitli uygun HLA-A2 ile kısıtlı antijenler birlikte, GvHH skleroz ve katları 2, i daha da artırmak ve uygulanabilirliğini genişletecektir moleküllerin yanı sıra, yeni otoimmün ilgili antijenlerin tanımlanmasını eden dimer ilave HLA sınıf gelişimini tespit edilmiştir KaAPC. Ayrıca tek bir aynı anda birden fazla antijenleri hedeflemek üzere farklı epitoplarına yönelik KaAPC kullanılarak düşünülebilir. Özetle, KaAPC bir için esnek bir platformdur teknolojiyi temsilantigene-özgü T hücresi kaybı. Onların &quot;lego benzeri&quot; yapısı örneğin genişletmek ve in vitro ve in vivo uygulanabilirliği ve bunların daha sonradan arttırabildiğini gibi çeşitli matrisler üzerinde PD1 veya izleme aracı olarak ek yardımcı-uyarıcı ya da inhibitör sinyalleri, yeni sinyalleri dahil sağlar. Bu yazıda KaAPC farklı özellikteki T hücresi bunların karışımlarından antijen-spesifik T hücrelerinin ortadan kaldırılması için, birinci kordon dayalı yaklaşımı oluşturmak için adım adım protokol mevcut. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" width="500" /> Şekil 3. KaAPC antijen spesifik şekilde CTL ortadan kaldırmak veya 1 Fas + efektör-hafızalı CTL aktive PKH26-etiketlenmiş ve karıştırıldı aynı donörden alınan CMVpp65 özgü CTL PKH67 etiketli:. CMVpp65 KaAPC 1 oranında, ve ko-kültive 48 saat karıştırıldı. Kontrol kültürleri yüksüz KaAPC ya da 1 ug / ml ile muamele edildisuda çözünür, anti-Fas mAb (klon CH11). Canlı hücreler minimum kaybı muamele edilmemiş karışık CTL kültürlerinde (t karışımı) olarak tespit edilmiştir. T karışımı her CTL nüfus için orijinal FACS verileri gösterilmiştir. Önce her iki T hücre popülasyonlarının 10 ayrı yolluk tarafından yayınlanan apoptoz analizi yapıldı. Sol üst kadranda tasvir Numaraları toplam hücrelerin% temsil eder. Gösteren Şekil, üç bağımsız deneyin üzerinden, temsilci bir deneyden elde edilir. Bu araştırma aslında Blood yayınlandı. . Schütz, C. ve ark katil yapay antijen sunan hücreler: yeni bir strateji spesifik T hücreleri silmek için kan.. 2008, 111, 3546-52. Telif Amerikan Hematoloji Derneği. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Son yirmi yıl içinde çok fazla ilerleme otoimmün hastalıkların patojenik mekanizmasının anlaşılması yönünde gerçekleştirilen edilmiştir. Bununla birlikte, en yaygın tedavi yaklaşımları kortikosteroidler yanı sıra, purin analogları gibi bağışıklık bastırıcı ilaçlar, alkile edici maddeler ve kalsinörin inhibitörü 1 dayanmaktadır. Bu tür ilaçların kullanımı büyük ölçüde hastaların prognozu gelişmiş, henüz tedavi altta yatan immünolojik arıza tedavi sağlamaz. Ayrıca, hastalar enfeksiyonlara ve kanser gelişmesine karşı savunmasız hale gelir. Bu nedenle T hücresi kaynaklı otoimmün hastalıkların ve allograft reddinin tedavisi için nihai hedefi özel olarak ise, aynı zamanda, el değmemiş ve immünolojik bozuklukları mücadele için yetkili kalan bağışıklık sistemini terk ederken neden olan T hücrelerinin sadece hastalık hedef etmektir. Kullanarak antijen-sunan hücreler (APC), periferal T hücresi tepkilerini bastırmak için bir tedavi olarak birinci kadar erken olarak nitelendirildiçeşitli gruplar tarafından 1970&#39;lerde. Daha sonra pek çok hücre tabanlı yaklaşımlar geliştirilmiştir beri (Schütz&#39;ün ve ark. 2 gözden). Immunoregülatuar hücreleri otoimmünite, allogreft reddi ve kronik enfeksiyonların tedavisi için terapötik potansiyelini gösteren umut verici sonuçlar gösterdi FasL ifade katil-APC kullanarak Stratejileri. Ancak, sonuçta kendi klinik uygulanabilirliğini sınırlı FasL&#39;nin Killer-APC kullanan stratejileri ile önemli kısıtlamalar vardır; APC (i) üretimi veya izolasyonu zaman, işgücü ve maliyet yoğun olan, (ii) ikinci sitopeni bağlı bağışıklık bastırma şikayetçi olan hastalar, sınırlı miktarda ve hücrelerin kalitesi sağlar (iii) bu tür çok FasL sonuçlar olarak apoptozu teşvik edici sinyallerle yapılan kaplama ya da APC&#39;nin transdüksiyon Değişken fenotipleri ve (iv) Killer APC sonuç olarak terapötik potansiyelini azaltır T hücreleri efektör fonksiyonlarını sitotoksik duyarlıdır. Bu nedenle, belirli bir tekrarlanabilir katil APC fenoksi garanti etmek zordurin vivo T hücresi tepkilerinin, antijene özel modülasyonu için kullanılabilir türü. Katil APC 3-5 ve yapay antijen sunan hücreler (aAPC) ifade FasL ile daha önceki çalışmalara dayanarak 6,7 oto-reaktif T hücrelerinin antijen-belirgin önlenmesi ya da ortadan kaldırılması için bir tane bazlı yaklaşım (KaAPC) geliştirmiştir in vitro. KaAPC bir HLA-A2-lg dimer (sinyal 1) kovalent bir 4.5 um paramanyetik lateks boncuk bir yüzeyi üzerinde hareketsiz kılınmış bir anti-Fas mAb (apoptoz uyarıcı sinyali) oluşur. Bu antijen-spesifik şekilde birden fazla özgüllüklerinin T hücre kültürlerinden bir Fas / FasL aracılı antijen-spesifik T hücrelerinin tüketilmesi ve etkinleştirme indüklenen hücre ölümü (AICD) yolunun bağımsız olarak gerçekleştirilir. Hedeflenen T hücrelerinde doza bağlı apoptoz zaten 30 dakika 8 sonra hızla uyarılır. KaAPC kolayca kontrollü bir şekilde oluşturulabilir bir raf phenot kapalı tanımlandığı sağlanmasını gerektirmektedirype hem de hücre bazlı tükenmesi stratejilerinin eksikliklerin üstesinden en. Sonuç olarak, T hücresi KaAPC spesifik tedavi stratejilerinin alanını ilerleyen T-hücresi kaynaklı otoimmün hastalıklar ve allograft reddinin tedavisi için büyük bir potansiyel gösterir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="654">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:185px;">Name</td>
			<td style="width:157px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Cat #</td>
			<td style="width:164px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human AB serum</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S40110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium azide</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M-450 epoxybeads</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>14011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MPC-1 magnet</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>12001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">screw top glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CD95 (clone CH11)</td>
			<td>Milliore</td>
			<td>05-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HLA-A2-Ig dimer</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>551263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-tube 2ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgG1 PE</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>559320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgM FITC</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>553408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>cellgro/Mediatech</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>gibco/life technologies</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96well round bottom plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnnexinV FITC</td>
			<td>PromoKine</td>
			<td>PK-CA577-1001-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-AAD</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>51-68981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

killer artificial antigen presenting cells (kaapc) for efficient in vitro depletion of human antigen-specific t cells

T hücresi kaynaklı otoimmün hastalıkların tedavisinde yeni yaklaşımlar gibi enfeksiyonlar veya maligniteler kontrol etmek için bir azaltılmış yeteneği gibi uzun vadede yan etkiler eşlik eder, bağışıklık sisteminin bastırılması ile, stratejileri çoğunlukla dayanır. Bu nedenle, yeni yaklaşımlar sadece hastalık aracılık hücreleri hedef ve sağlam kalan bağışıklık sistemini terk etmesini geliştirilmesi gerekmektedir. Geçtiğimiz on yıl içinde hücre bazlı immunoterapi çeşitli stratejiler T hücre aracılı bağışıklık tepkileri geliştirilmiştir modüle etmek. Bu yaklaşımlardan en çok tolerans uyarıcı, antijen sunan hücreler (APC) dayanmaktadır. Bununla birlikte, teknik olarak zor ve külfetli olmanın yanı sıra, bu tür yaklaşımlar, hücre bazlı bir tedavi edici kapasitesini sınırlar ve sitotoksik T hücresi tepkilerinin, son derece duyarlıdır. Burada yeniden bırakırken, patolojik T hücrelerinin tükenmesi sağlayan hücresel olmayan killer, yapay antijen sunan hücrelerin üretimi (KaAPC) için bir protokol mevcutisti bağışıklık sistemi bakir ve fonksiyonel. KaAPC bir antijen belirli bir tarz içinde istenmeyen T hücre yanıtını düzenleyerek, otoimmün hastalıkların ve allograft reddi tedavisinde bir potansiyele sahip hücresel immünoterapiye alternatif bir çözümdür.

Bu protokolün özellikleri hücre bazlı yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında kaplama değişmez, aynı zamanda HLA-A2-Ig (1 sinyal) ve anti-Fas mAb (apoptoz sinyali) görüntüleyen bir KaAPC fenotip tanımlanmış kuşağı ya da transdüksiyon etkinliklerinin ve kolay bir üretim (Şekil 1) modüle edilebilir. Ayrıca, KaAPC, T hücrelerinin sitotoksik efektör fonksiyonlara duyarlı değildir ve bunların işlevselliği nitro manipülasyon öncesi ve sonrası otolog antijen sunan hücreler kalitesine bağlı değildir. KaAPC olmayan ortak kökenli KaAPC T hücrelerini (Şekil 2) tüketmek olmaz yüklü iken, ortak kökenli peptid ile yüklü olduğunda in vitro ortamda antijen-spesifik T hücrelerini tüketme yeteneğine sahiptir. Bu nedenle, KaAPC antijene özel bir şekilde T hücresi apoptosis. Daha sonra, farklı T hücresi SPE karışımından antijen-spesifik T hücrelerinin seçici tükenmesi için ikinci KaAPCsadece asgari sitotoksisite komşu T hücreleri sızması olduğunu gösteren cificities, (Şekil 3). Böylece, KaAPC otoimmün hastalıklar ve allograft tedavisi için potansiyel klinik uygulanabilirliği olan insan aktive antijen-spesifik T hücrelerinin in vitro antijen ile spesifik azaltımı için mükemmel bir araç temsil eder.

Watch this Scientific Journal Video about Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells at JoVE.com

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Topluluk oluşturan hücreler katil yapay antijen üretimi için sunulmuştur, KaAPC insan antijen-spesifik T hücrelerinin in vitro tüketimi ve bir antijene T hücre aracılı bağışıklık hastalıklarının tedavisi için selüler immünoterapi için alternatif bir çözüm için etkin bir araç Kalan bağışıklık sistemini ödün vermeden özel biçim.

Etkin Killer yapay antijen sunan hücreler (KaAPC)<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Antijen-spesifik T hücrelerinin tükenmesi

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

killer-artificial-antigen-presenting-cells-kaapc-for-efficient-vitro

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

9.6K Görüntüleme.  Johns Hopkins University.  Topluluk oluşturan hücreler katil yapay antijen üretimi için sunulmuştur, KaAPC insan antijen-spesifik T hücrelerinin in vitro tüketimi ve bir antijene T hücre aracılı bağışıklık hastalıklarının tedavisi için selüler immünoterapi için alternatif bir çözüm için etkin bir araç Kalan bağışıklık sistemini ödün vermeden özel biçim. 

Video: Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation. This labeling has classically been used to study proliferation and migration. In the method presented here, we have shortened the timeline after adoptive transfer to look at survival and killing of epitope specific CFSE labeled target cells4-6. The level of specific killing of a CD8 + T cell clone can indicate the quality of the response, as their quantity may be misleading. Specific CD8+ T cells can become functionally exhausted over time with a decline in cytokine production and killing7,8. Also, certain CD8 + T cell clones may not kill as well as others with differing TCR specificities9. For effective Cell Mediated Immunity (CMI), antigens must be identified that produce not only adequate numbers of responding T cells, but also functionally robust responding T cells. Here we assess the percent cell specific killing of two peptide specific T cell clones in BALB/c mice.

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Many infections elicit a strong CTL response, but occasionally, the quantity of responding cells does not correlate to control of the pathogen1. One measure of CTL quality is their ability to kill specifically2. CFSE labeling of target cells can be used to investigate this CTL response quality in vivo3,4.

Antijen Özgül In Vivo</emKAKE Etiketli Hedef Hücreler> Killing Testi

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals may exhibit suppressive immune microenvironment and, in contrast to activating CTL, their autologous antigen presenting cells may tend to tolerize or anergize antigen specific CTL. As a result, although still in the experimental phase, CTL-based adoptive immunotherapy has evolved to become a promising treatment for various diseases such as cancer and virus infections. In initial experiments ex vivo expanded CMV (cytomegalovirus) specific CTL have been used for treatment of CMV infection in immunocompromised allogeneic bone marrow transplant patients. While it is common to have life-threatening CMV viremia in these patients, none of the patients receiving expanded CTL develop CMV related illness, implying the anti-CMV immunity is established by the adoptively transferred CTL1. Promising results have also been observed for melanoma and may be extended to other types of cancer2. 
While there are many ways to ex vivo stimulate and expand human CTL, current approaches are restricted by the cost and technical limitations. For example, the current gold standard is based on the use of autologous DC. This requires each patient to donate a significant number of leukocytes and is also very expensive and laborious. Moreover, detailed in vitro characterization of DC expanded CTL has revealed that these have only suboptimal effector function 3. 
Here we present a highly efficient aAPC based system for ex vivo expansion of human CMV specific CTL for adoptive immunotherapy (Figure 1). The aAPC were made by coupling cell sized magnetic beads with human HLA-A2-Ig dimer and anti-CD28mAb4. Once aAPC are made, they can be loaded with various peptides of interest, and remain functional for months. In this report, aAPC were loaded with a dominant peptide from CMV, pp65 (NLVPMVATV). After culturing purified human CD8+ CTL from a healthy donor with aAPC for one week, CMV specific CTL can be increased dramatically in specificity up to 98% (Figure 2) and amplified more than 10,000 fold. If more CMV-specific CTL are required, further expansion can be easily achieved by repetitive stimulation with aAPC. Phenotypic and functional characterization shows these expanded cells have an effector-memory phenotype and make significant amounts of both TNF&alpha; and IFN&gamma; (Figure 3).

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

A new DC independent method for induction and expansion of antigen-specific T cells is described. HLA A2-Ig based artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) are loaded with HLA-A2 restricted peptides to efficiently expand CTL of diverse antigen specificity. This technology holds great potential for CTL-based adoptive immunotherapy.

Verimli HLA-Ig Tabanlı Yapay antijen sunan hücrelerin Ex vivo</emİnsan CTL> Genleşme

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

Yapay Antijen Hücre (AAPC) Aracılı Aktivasyon ve Doğal Öldürücü T hücreleri genişletilmesi Presenting

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Klinik Uygulama<em&gt; Sleeping Beauty</emGenetiği Periferik ve Göbek Kordon Kanı alınan T hücreleri Değiştir Sunan Hücreler&gt; ve Yapay Antijen

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

Bir Antijen odaklı Kolit Modelinin Geliştirilmesi Antijen T hücreleri için Hücreler sunulması ile Antijen Sunumu Eğitim için

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Yaratma<em&gt; De Novo</em&gt; Merkezli Hemichain retroviral transdüksiyonu ile antijen-özel insan T hücre reseptörleri

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Otoimmünite karşı Kök Hücre türetilmiş antijen-özgü düzenleyici T hücrelerinin gelişimini

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

Kanda dolaşan nadir antijen spesifik B hücreleri Discriminative insan monoklonal antikorların üretimi

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The development of stable, non-toxic, fluorescent dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) allows for rare, antigen-specific T cells to be distinguished from bystanders by diminution in fluorescent staining, as detected by flow cytometry. This method has the following advantages over alternative approaches: (i) it is very sensitive to low-frequency T cells, (ii) no knowledge of the antigen or epitope is required, (iii) the phenotype of the responding cells can be analyzed, and (iv) viable, responding cells can be sorted and used for further analysis, such as T cell cloning.

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Presented here is a protocol for measuring proliferating CD4+ T cells in response to antigenic proteins or peptides using dye dilution. This assay is particularly sensitive to rare antigen-specific T cells and can be modified to facilitate cloning of antigen-specific cells.

Proliferasyon ınsan antijeni spesifik CD4+ T hücrelerinin Karboksflorcein Succinimidyl Ester kullanarak ölçülmesini

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the spontaneous non-obese diabetes (NOD) mouse model, insulin is the primary target, and genetic manipulation of these animals to remove a single key insulin epitope prevents disease. Thus, selective elimination of professional antigen presenting cells (APCs) bearing this pathogenic epitope is an approach to inhibit the unwanted insulin-specific autoimmune responses, and likely has greater translational potential.
Chimeric antigen receptors (CARs) can redirect T cells to selectively target disease-causing antigens. This technique is fundamental to recent attempts to use cellular engineering for adoptive cell therapy to treat multiple cancers. In this protocol, we describe an optimized T-cell retrovirus (RV) transduction and in vitro expansion protocol that generates high numbers of functional antigen-specific CD8 CAR-T cells starting from a low number of naive cells. Previously multiple CAR-T cell protocols have been described, but typically with relatively low transduction efficiency and cell viability following transduction. In contrast, our protocol provides up to 90% transduction efficiency, and the cells generated can survive more than two weeks in vivo and significantly delay disease onset following a single infusion. We provide a detailed description of the cell maintenance and transduction protocol, so that the critical steps can be easily followed. The whole procedure from primary cell isolation to CAR expression can be performed within 14 days. The general method may be applied to any mouse disease model in which the target is known. Similarly, the specific application (targeting a pathogenic peptide/MHC class II complex) is applicable to any other autoimmune disease model for which a key complex has been identified.

This article describes a protocol for the generation of antigen-specific CD8 T cells, and their expansion in vitro, with the aim of yielding high numbers of functional T cells for use in vitro and in vivo.

Otoimmün Diyabet Modelinde Fonksiyonel Testler için Antijene Özgü Primer Fare Sitotoksik T Hücrelerinin Yüksek Verimli Üretimi

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...