Yazarlar yardım SB sistemi ile yardım için AAPC klon # 4 ve Dr Perry Hackett (Minnesota Üniversitesi) üretme ve sağlama Dr Carl Haziran (Pennsylvania Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum. Hibe desteği: Kanser Merkezi Çekirdek Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); SPORE (CA136411); Albert J Ward Vakfı; Burroughs Wellcome Fonu; Gillson Longenbaugh Vakfı; Kanser Önleme ve Texas Araştırma Enstitüsü; KLL Küresel Araştırma Vakfı; Savunma Bakanlığı; Noelan L. Bibler Estate; Harry T. Mangurian, Jr, Lösemi İmmünoterapi Fonu; Kişiselleştirilmiş Kanser Tedavi Enstitüsü, Lösemi ve Lenfoma Derneği; Lenfoma Araştırma Vakfı; MDACC Kardeş Kurum Ağı Fonu; Miller Vakfı; Sayın Herb Simons, Bay ve Bayan Joe H. Ölçekler; Bay Thomas Scott; Kanser Araştırma Ulusal Vakfı; Pediatrik Kanser Araştırma Vakfı; Üretim assistancWilliam Lawrence ve Blanche Hughes Çocuk Vakfı; Hücresel Tedaviler (PACT) e.

<html> Gün 0 veya önce 1. PB ve UCB gelen Mononükleer Hücreleri İzolasyon (ÇUŞ) <ol><li> Eşit hacimde PB ve PBS-EDTA dört ciltlik UCB seyreltin. </li><li> 40 dk (hiç fren) - 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne (ler) ve 30 için 400 x g&#39;da santrifüj Ficoll üzerine yavaşça tabakası, seyreltik kan (25 mi) (12 ml) eklenmiştir. </li><li> Taze bir 50 ml santrifüj tüpüne bir transfer pipet kullanarak mononükleer hücre fraksiyonu (arayüz) toplayın ve aktarmak. </li><li> PBS-EDTA ile 50 ml hacim getirin ve 10 dakika için 450 xg santrifüj. </li><li> Komple Kültür ortamı (CCM) ile, 10 dakika için 400 x g&#39;da santrifüj 50 ml süpernatant, nazikçe tekrar askıya hücre peleti (ler) aspire. </li><li> Nazikçe yeniden askıya ve havuz CCM hücre pelet ve Tripan mavi dışlama yöntemi (Cellometer, PBMC programı) kullanarak hücre sayımı gerçekleştirmek. </li><li> MNC şimdi elektroporasyon (Nucleofection) için kullanılan veya ileride kullanılmak üzere kriyoprezerve edilebilir. </li></ol>Gün 0 üzerine Elektroporasyon için T hücreleri başlığı &quot;&gt; 2. Hazırlık <ol><li> Kriyoprezerve MNC kullanıyorsanız, hızlı bir şekilde tam ölçekli elektroporasyon (2 x 10 8 santrifüj ve 2 saat inkübasyon esnasında hücre kaybı hesaba ~% 20 ekleyerek) 37 ° C su banyosu için yeterli hücre eritin. Taze izole kullanıyorsanız MNC 2.3 adıma geçin. </li><li> Nazikçe yeniden askıya ve önceden ısıtılmış Komple Fenol-Alerjik RPMI kültür ortamı (PF-RPMI) ve 10 dakika (hiçbir fren), aspirat süpernatant için 200 xg&#39;de santrifüj bulunan uygun boyutta bir santrifüj tüpüne (ler) için hücreleri aktarmak. </li><li> PF-RPMI içinde tekrar askıya MNC, bir hücre sayımı (Cellometer) gerçekleştirmek ve 10 6 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyonda uygun boyutlu bir hücre kültür kap (lar) ile hücre transfer edin. </li><li> Nemli 37 içinde inkübe ° 2 saat süreyle C /% 5 CO2 kuluçka makinesi ± 30 dak. </li><li> Steril bir santrifüj tüpüne (ler) i, 5 dak (hiçbir fren) için 200 x g&#39;da spin MNC aktarın yavaşça süpernatan ve r aspireE-askıya ve PF-RPMI hücre pelet (ler) birleştirir. </li><li> Bir hücre sayımı (Cellometer) gerçekleştirin ve (2 x 10 8 MNC) gerekli hücre süspansiyonu hacmi hesaplamak. </li><li> Steril bir 50 ml santrifüj tüp ve 10 dakika (hiçbir fren) için 200 xg&#39;de spin hesaplanan hacim aktarın. </li><li> Kalıntı medya kalır ve hafifçe tüpün yan dokunarak yeniden askıya böylece süpernatant aspire. </li></ol> 3. Gün 0 üzerine MNC (10 Küvetleri kullanma Tam Ölçekli Süreç) arasında Elektroporasyon (Nucleofection) <ol><li> Nemli 37 ° C /% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde sıcak PF-RPMI 4 ml içeren 10 kuyucuklu bir steril 12 oyuklu plaka ön-inkübe edilir. </li><li> Hazırlayın ve önceden sıcak Lonza Nucleofector Çözüm İnsan T hücre kiti (, üreticinin talimatlarına göre kurulur <a href="http://www.lonza.com" target="_blank">www.lonza.com</a> ) Biyogüvenlik Kabini (BSC) ortam sıcaklığına. </li><li> Eklenti tarafından Nucleofector çözüm / DNA ana karışımı hazırlayınilave Nucleofector çözelti g 100 ul, transposon 15 mg (CD19RCD28/pSBSO olarak belirlenmiş, süper plazmid DNA) ve tepkime / küvet başına transposase 5 mikrogram (pCMV-SB11 olarak tanımlanan plazmid DNA, süper). </li><li> Hafifçe santrifüj tüpünün yan dokunarak hücre pelet (adım 2.8 &#39;dan itibaren) Dispers ve Nucleofection çözüm / DNA master miks (Final hücre konsantrasyonu: 2 x 10 7 cells/100 ul) yeniden askıya. </li><li> Dikkatle kabarcıkları önlemek için dikkatli olmak, on (10) Lonza Nucleofection küvetlerin her hücre süspansiyonu (adım 3.4 &#39;dan itibaren) 100 ul aktarın. </li><li> Kez küvet dokunun ve program U-014 (uyarılmamış T hücreleri için) kullanarak elektroporasyonu. </li><li> BSC küvetler ve 12-plaka (Adım 3.1) aktarın. </li><li> Iyi, karşılık gelen ikinci önceden ısıtılmış kültür ortamı ~ 500 ul ekleme (Ste içinde hazırlanmış 12-kuyu plakası ile bir Amaxa ince uç transfer pipeti kullanarak, her bir küvet dan electroporated hücreler hasatp 3.1) ile nemlendirilmiş 37 ° plaka dönüş 2 saat süreyle C /% 5 CO2 kuluçka makinesi ± 30 dak. </li><li> 2-hr inkübasyon, hasat sonrasında ve tüm kuyulardan steril bir santrifüj tüpüne hücreleri aktarmak. </li><li> 8 dakika, çevre sıcaklığı, herhangi bir fren ve kalıntı orta hücre peleti kaplayacak şekilde süpernatan aspire ve atmak için 140 x g&#39;de santrifüj ile hücreler yıkanır. </li><li> Nazikçe santrifüj tüpünün yan dokunarak hücre peleti Disperse ve yavaşça tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için CCM yeniden askıya. </li><li> Hücre sayımı gerçekleştirin ve 10 6 hücre / CCM ml hücre konsantrasyonu ayarlayın. </li><li> Gecede kuluçka hücre kültürü şişesi (lar) ve yere hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> EGFP transfekte hücreler (Amaxa kontrolü EGFP plazmid, süper 5 mikrogram ile 5 x 10 6 hücre / küvet, pmaxGFP): Süreç adımları 2,1-3,8 kontrolü için tekrarlandı. </li></ol> 1. Gün 1 st ve SonrakiUyarım Çevrimleri 4. Gün 1 Flow Sitometri CAR İfade Analizi <ol><li> Electroporated hücreleri Harvest ve Tripan mavi dışlama yöntemi (hemasitometre) kullanarak hücre sayımı gerçekleştirmek. </li><li> CD3, CD4, CD8, ve insan IgG Fcγ (CAR ifade ölçümü olarak) için spesifik antikor ile Leke hücreleri (1-2 x 10 6). </li><li> FACS Calibur hücreler Edinme ve CAR ifade hesaplamak için FCS Express yazılımını kullanarak verileri analiz. <ol><li> Formülü ile kültür CAR + hücreleri hesaplayın: (Toplam canlı hücre sayısı) x (% CAR + hücreler) CAR = Hayır + hücrelerin </li></ol></li></ol> 5. 1. Gününde AAPC hazırlanması (klon # 4). AAPC (klon # 4) Eş-express İstenilen T Hücre Co-uyarıcı Molekülü için K562 hücreleri (Amerikan Tip Kültür Koleksiyonundan Elde Edilen Ebeveyn Hattı) türetilen edildi <ol><li> 37 dondurulmuş 100 Gy ışınlanmış AAPC bir kısım çözülme °; C su banyosu. </li><li> Hücreleri 400 xg, CCM 10 dk santrifüj ile iki kez yıkanmış ve Cellometer (Tripan mavi dışlama) kullanılarak sayılır. </li><li> Uyarılması için gerekli canlı AAPC sayısı hesaplayın: (CAR + hücre sayısı) x 2 ışınlanmış AAPC arasında = No gerekli </li></ol> 6. CAR AAPC-aracılı Stimülasyon + Gündüz T Hücreleri 1 1. başlangıcı ve sonraki Uyarım Çevrimleri <ol><li> CCM: 1:2 oranında (canlı AAPC CAR + hücre) steril bir kap içinde electroporated hücreleri (SYR ifade) ve γ-ışınlanmış AAPC (klon # 4) karıştırın. <ol><li> AAPC oranı flow sitometri elektroporasyon gün sonra esas CAR ifadesi için ayarlanır unutmayın. </li></ol></li><li> Hücre süspansiyonu ile IL-21 (30 ng / ml) ilave edilir. </li><li> Tablet içinde T-75 cm2 şişeye (ler) ve / veya 10 6 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyonda Vue kültür torbaları ve incubat dönmekya da. </li></ol> Gün 3, 5 7. CAR Devamı Kültür + T hücreleri <ol><li> Bir yarı-ortam değiştirme işlemini, IL-21, doldur ve 10 6 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyonda T hücreleri korumak. </li></ol> 7. Gün 8. İlk AAPC aracılı Uyarım Çevrim sonu <ol><li> Hasat hücreleri saymak ve leke CD3, CD4, CD8, ve Fcγ (SYR) ve 10.1 adıma geçin. </li></ol> 9. CD56 + hücreler (Genellikle 7 ile 14 gün arasında elektroporasyon sonra) tükenmesi <ol><li> Paramanyetik boncuklar kullanarak CD56 tükenmesi gerçekleştirin eğer CD56 + CD3 neg lenfositler ≥ 10%. </li></ol> Uyarım döngüleri # 2, # 3, Gün 8 → 14 &amp; # 4. Sorumlu, gün 15 → 21, &amp; Gün 22 → 28 10. Klinik olarak yeterli Numaraları T hücreleri yayma için AAPC özyinelemeli eklenmesi <ol><li> Stimulatio tekrarlayınn süreci (4 kez) gibi adımlar 4,3-8,1 tarif. </li><li> Ve sonra her ortam değişimi (haftada üç kez, Pazartesi-Çarşamba-Cuma zamanlama) at Gün 7, 14 ve 21. sayfada başlayan kültürleri, IL-2 (50U/ml) ekleyin. </li><li> Cryopreserve (arşiv) aşırı T hücreleri gerektiği gibi. <ol><li> T hücreleri kontrollü oranı dondurucu kullanılarak dondurulduğu. </li></ol></li></ol> Gün 28 11. Son AAPC aracılı Uyarım Döngüsünün Sonu: Hasat T hücreleri <ol><li> Sürümü test ve infüzyon için T hücreleri Cryopreserve. </li></ol>

<ol>
	<li>Jena, B., Dotti, G., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redirecting+T-cell+specificity+by+introducing+a+tumor-specific+chimeric+antigen+receptor.">Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor.</a> Blood. 116, 1035-1044 (2010).</li><li>Ertl, H. C., Zaia, J., Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+clinical+application+of+chimeric+antigen+receptor+T+cells:+observations+from+a+recombinant+DNA+Advisory+Committee+Symposium+held.">Considerations for the clinical application of chimeric antigen receptor T cells: observations from a recombinant DNA Advisory Committee Symposium held.</a> Cancer Res. 71, 3175-3181 (2010).</li><li>Kohn, D. B., Dotti, G., Brentjens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CARs+on+track+in+the+clinic.">CARs on track in the clinic.</a> Mol. Ther. 19, 432-438 (2011).</li><li>Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sleeping+Beauty+transposon+system:+a+non-viral+vector+for+gene+therapy.">The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy.</a> Hum. Mol Genet. 20, R14-R20 (2011).</li><li>Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon+and+transposase+system+for+human+application.">A transposon and transposase system for human application.</a> Mol. Ther. 18, 674-683 (2010).</li><li>Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+Sleeping+Beauty+transposition+into+cellular+therapies:+victories+and+challenges.">Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges.</a> Bioessays. 32, 756-767 (2010).</li><li>Kebriaei, P., Huls, H., Bipulendu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infusing+CD19-directed+T+cells+to+augment+disease+control+in+patients+undergoing+autologous+hematopoietic+stem-cell+transplantation+for+advanced+B-lymphoid+malignancies.">Infusing CD19-directed T cells to augment disease control in patients undergoing autologous hematopoietic stem-cell transplantation for advanced B-lymphoid malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 23 (5), 444-450 (2012).</li><li>Williams, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+beauty+vector+system+moves+toward+human+trials+in+the+United+States.">Sleeping beauty vector system moves toward human trials in the United States.</a> Mol. Ther. 16, 1515-1516 (2008).</li><li>Geurts, A. M., Hackett, C. S., Bell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+prediction+of+insertion-site+preferences+of+transposons+into+chromosomes.">Structure-based prediction of insertion-site preferences of transposons into chromosomes.</a> Nucleic Acids Res. 34, 2803-2811 (2006).</li><li>Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+reconstruction+of+Sleeping+Beauty,+a+Tc1-like+transposon+from+fish,+and+its+transposition+in+human+cells.">Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells.</a> Cell. 91, 501-510 (1997).</li><li>Izsvak, Z., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+beauty+transposition:+biology+and+applications+for+molecular+therapy.">Sleeping beauty transposition: biology and applications for molecular therapy.</a> Mol Ther. 9, 147-156 (2004).</li><li>Manuri, P. V., Wilson, M. H., Maiti, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposon/transposase+system+to+generate+CD19-specific+T+cells+for+the+treatment+of+B-lineage+malignancies.">piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for the treatment of B-lineage malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 21, 427-437 (2010).</li><li>Singh, H., Figliola, M. J., Dawson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+CD19-specific+T+cells+with+IL-21+signaling+can+improve+adoptive+immunotherapy+of+B-lineage+malignancies.">Reprogramming CD19-specific T cells with IL-21 signaling can improve adoptive immunotherapy of B-lineage malignancies.</a> Cancer Res. 71, 3516-3527 (2011).</li><li>Kowolik, C. M., Topp, M. S., Gonzalez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+costimulation+provided+through+a+CD19-specific+chimeric+antigen+receptor+enhances+in+vivo+persistence+and+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+T+cells.">CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells.</a> Cancer Res. 66, 10995-11004 (2006).</li><li>Jin, Z., Maiti, S., Huls, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+SB100X+improves+the+genetic+modification+of+T+cells+to+express+a+chimeric+antigen+receptor.">The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor.</a> Gene Ther. 18, 849-856 (2011).</li><li>Davies, J. K., Singh, H., Huls, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+CD19+redirection+and+alloanergization+to+generate+tumor-specific+human+T+cells+for+allogeneic+cell+therapy+of+B-cell+malignancies.">Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies.</a> Cancer Res. 70, 3915-3924 (2010).</li><li>Kebriaei, P., Kelly, S. S., Manuri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CARs:+driving+T-cell+specificity+to+enhance+anti-tumor+immunity.">CARs: driving T-cell specificity to enhance anti-tumor immunity.</a> Front. Biosci. (Schol. Ed). 4, 520-531 (2012).</li><li>Singh, H., Manuri, P. R., Olivares, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redirecting+specificity+of+T-cell+populations+for+CD19+using+the+Sleeping+Beauty+system.">Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system.</a> Cancer Res. 68, 2961-2971 (2008).</li><li>Nakazawa, Y., Huye, L. E., Salsman, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PiggyBac-mediated+cancer+immunotherapy+using+EBV-specific+cytotoxic+T-cells+expressing+HER2-specific+chimeric+antigen+receptor.">PiggyBac-mediated cancer immunotherapy using EBV-specific cytotoxic T-cells expressing HER2-specific chimeric antigen receptor.</a> Mol. Ther. 19, 2133-2143 (2011).</li><li>Huang, G., Yu, L., Cooper, L. J., Hollomon, M., Huls, H., Kleinerman, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+T+cells+targeting+interleukin-11+receptor+alpha-chain+kill+human+osteosarcoma+cells+and+induce+the+regression+of+established+osteosarcoma+lung+metastases.">Genetically modified T cells targeting interleukin-11 receptor alpha-chain kill human osteosarcoma cells and induce the regression of established osteosarcoma lung metastases.</a> Cancer Res. 72, 271-281 (2012).</li><li>Huang, X., Guo, H., Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+Beauty+transposon-mediated+engineering+of+human+primary+T+cells+for+therapy+of+CD19++lymphoid+malignancies.">Sleeping Beauty transposon-mediated engineering of human primary T cells for therapy of CD19+ lymphoid malignancies.</a> Mol. Ther. 16, 580-589 (2008).</li><li>Huang, X., Wilber, A., McIvor, R. S., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transposons+for+modification+of+human+primary+T+lymphocytes.">DNA transposons for modification of human primary T lymphocytes.</a> Methods Mol. Biol. 506, 115-126 (2009).</li><li>Hackett, P. B., Aronovich, E. L., Hunter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+Sleeping+Beauty+transposon-mediated+gene+transfer+in+preclinical+animal+studies.">Efficacy and safety of Sleeping Beauty transposon-mediated gene transfer in preclinical animal studies.</a> Curr. Gene Ther. 11, 341-349 (2011).</li><li>Suhoski, M. M., Golovina, T. N., Aqui, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+artificial+antigen-presenting+cells+to+express+a+diverse+array+of+co-stimulatory+molecules.">Engineering artificial antigen-presenting cells to express a diverse array of co-stimulatory molecules.</a> Mol. Ther. 15, 981-988 (2007).</li><li>Numbenjapon, T., Serrano, L. M., Singh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+artificial+antigen-presenting+cell+to+propagate+cytolytic+CD19-specific+T+cells.">Characterization of an artificial antigen-presenting cell to propagate cytolytic CD19-specific T cells.</a> Leukemia. 20, 1889-1892 (2006).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Transposon ve böyle piggyBac 12,19 ve SB 18,20-22 itibaren transposase sistemleri, klinik grade CAR viral-aracılı transdüksiyon + T hücreleri için bir alternatif olan gen tedavisi olmayan viral yaklaşımlardır. SB insan gen terapisi için potansiyel 1,6,23 dayalı gen aktarım sistemi olarak seçilmiştir. Biz, SB transpozisyon (bir araç tanıtmak için) ve uygun bir TAA-spesifik T hücrelerinin üretiminde platform teknolojileri olarak hizmet etmek için γ-ışınlanmış AAPC arasında yinelemeli eklenmesi (stabil bir şekilde eksprese eden bir ARAÇ genetik olarak modifiye edilmiş T hücreleri almak için) bir çift teknolojiler geliştikçe Faz I / II çalışmaları için cGMP (Şekil 4). Γ-ışınlanmış AAPC üzerine ko-kültür 28 gün (dört adet 7 günlük stimülasyon siklus) sonra, genellikle insan uygulamaları için en az ~ 10 10 genetiği değiştirilmiş T hücrelerinin uygun oluşturmak edebiliyoruz. Gerektiğinde, yeni stimülasyon çevrimleri t yapılabiliro genetiği değiştirilmiş T hücrelerinin büyük sayılar üretmek. Daha az CAR + T hücreleri ihtiyaç vardır Bundan başka, eğer, elektroporasyon ve yayılma için geri yaklaşım daha az sayıda ve her bir küvet kullanılarak başlangıcında ileri AAPC üzerinde proliferasyon sonraki tur için sayısal olarak genişletilmiş T hücrelerinin sadece bir alt grubu taşıyan ölçeklendirilebilir Uyarım çevrimi. Çoğunluğu electroporated ve infüzyon stabil CAR ifade için hasat T hücreleri yayılır. CD4 + akıbet ve 2. nesil CAR ifade CD8 + T hücreleri, bellek / naif fenotipe sahip hücreleri içerir ve yeniden yönlendirilen özgüllük üç diğerlerinden ayıran sergilerler. Öncelikle, genetiği değiştirilmiş T hücrelerinin özellikle ikincisi, CD19 + hedefler lyse CD19 + stimülatör hücreleri yanıt olarak IFN-γ üreten ve üçüncüsü, CD19 yanıt olarak prolifere + besleyici hücreler, bir CAR-bağımlı bir şekilde 13,18 tüm. Integr yaklaşımımızSB sistemi non-viral DNA plazmit elektro transferi ile bir ARAÇ transgen yedi PB ve UCB elde edilen hareketsiz birincil T-hücrelerinde de yapılabilir. Biz ve diğerleri genetik AAPC verimli infüzyon 24,25 T hücrelerinin klinik-yeterli sayıda yayılmasına olarak hizmet K562 hücrelerinde değiştirdiniz. AAPC ve doku kültürü ortamında (örneğin IL-21 ilave) üretmek için modifiye edilmiştir oylandı hasta ve hematopoetik kök hücre nakli sonrası infüzyon için CD19-spesifik T hücreleri (Tablo 1) 13,18 donör kaynaklı. Biz CAR üretebilir + PB alınan T hücreleri sadece maliyet, rahatsızlık, ve aferez ile PB adlı MNC elde rahatsızlıktan önler hangi Damara elde. CAR sayıda + MNC az sayıda alınan T hücreleri türetmek yeteneği özellikle allojenik UCB nakli sonrası T hücreleri kaynaştırmak için itiraz ediyor. Yenidoğan vericinin küçük boyutu ve anonimlik yeniden engeller-Erişen daha sonraki bir zaman noktasında bu bireysel ve hasat MNC sadece sınırlı sayıda hematopoez engellemesini önlemek için, T-hücresi üretimi için başlangıç ​​maddesi olarak kullanılabilir. Üretim sürecine daha fazla gelişmeler de henüz işlemeyi en aza indirmek için tamamen kapalı DALGA biyoreaktör ile birleştiğinde yüksek verimlilik elektroporasyon cihazı yönelik çalışmalara devam edilmektedir. Toplamda, SB ve AAPC platformlar CD19-özgü CAR + cGMP ile uygun olarak alternatif bir hücre-yüzey TAAS tanıyabilir genetik olarak modifiye edilmiş T hücrelerinin büyük bir sayı üretmek için adapte edilebilir T-hücreleri oluşturmak hitap etmektedir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifler </td><td> Satıcı </td><td> Katalog numarası </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reaktifler </td></tr><tr><td> DNA plazmid anlatımla GFP (pmaxGFP) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 (kit) </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS PBS-EDTA </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 70026 </td><td></td></tr><tr><td> HyQ RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30096.01 </td><td></td></tr><tr><td> Fenol Ücretsiz RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30605.01 </td><td></td></tr><tr><td> Hyclone Fetal Bovine Serum </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH3007003HI </td><td></td></tr><tr><td> GlutaMAX(100x) </td><td> Gibco </td><td> 3505-061 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll-Paque </td><td> GE Healthcare Biosciences </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> Rekombinant insan IL-21 </td><td> PeproTech </td><td> AF-200-21 </td><td></td></tr><tr><td> Rekombinan insan IL-2 (Proleukin) </td><td> Novartis </td><td> NDC 65483-116-07 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan T-hücresi Takımı (Nucleofector Çözümü) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS CD56 Reaktif </td><td> Miltenyi </td><td> 70206 </td><td></td></tr><tr><td> Insan CD3 için fare mAb için belirli FITC-konjuge </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td></td></tr><tr><td> Insan CD4 için fare mAb spesifik APC-konjuge </td><td> BD Biosciences </td><td> 340443 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5-konjugeİnsan CD8 için fare mAb spesifik </td><td> BD Biosciences </td><td> 341051 </td><td></td></tr><tr><td> F (ab &#39;) için spesifik keçi insan antikor 2 fragmanı için PE-konjuge Fcγ </td><td> Invitrogen </td><td> H10104 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum Azid </td><td> Sigma </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Sarf </td></tr><tr><td> 12-plaka </td><td> Corning </td><td> 3513 </td><td></td></tr><tr><td> T-75 cm2 şişeye </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Kültür çanta </td><td> Vue Yaşam </td><td> 290C; 750C </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne </td><td> BD Biosciences </td><td> 352098 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><sTrong&gt; Ekipman </td></tr><tr><td> Amaxa Nuceleofector II </td><td> Lonza </td><td> AAB-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Cellometer </td><td> Bioscience Nexcelom </td><td> Cellometer Vizyon </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall Legend RT Santrifüj </td><td> Sorvall </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Calibur </td><td> BD Biosciences </td><td> 342975 </td><td></td></tr><tr><td> Kontrollü oranı dondurucu </td><td> Planya </td><td> Kryo 750 </td><td></td></tr><tr><td> Işınlayıcının </td><td> BDT biyo Uluslararası </td><td> IBL-437 C # 09433 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Moleküllerin Anlatım (Endojen ve tanıtılan) </td></tr><tr><td> Hücre Hattı </td> &lt;td&gt; Ortak Ad </td><td> Hücre Tipi </td><td> Moleküller ifade </td></tr><tr><td> CJKT64.86.41BBL.GFP-IL15.CD19 </td><td> Clone 4 </td><td> K562 </td><td> CD86, CD64, CD137L, CD19, GFP zar ile birlikte ifade edilen IL-15 bağlı </td></tr></tbody></table> Komple Kültür Medya (CCM) (30 güne kadar 4 ° C&#39;de saklanır) HyQ RPMI-1640/Phenol-free RPMI-1640 % 10 FBS % 1 GlutaMAX Akım Sitometri Buffer (30 güne kadar 4 ° C&#39;de saklanır) PBS % 2 FBS % 0.1 Sodyum Azid </td></tr></tbody></table>

clinical application of sleeping beauty and artificial antigen presenting cells to genetically modify t cells from peripheral and umbilical cord blood

Klinik düzeyde T hücrelerinin potens tümör ilişkili antijenler üstün (i) tanıma (TAAS), infüzyon sonrası (ii) sebat, (iii) için potansiyele sahip bir biyolojik ürün mühendisi immünoterapi ile gen tedavisi birleştirerek geliştirilebilir tümör alanlarına göç ve tümör mikro içinde efektör fonksiyonları geri dönüşüm (iv) yeteneği için potansiyel. İnsan uygulama için tasarlanmış T hücrelerinin genetik manipülasyonu En yaklaşımlar CAR 1-3 istikrarlı ifade retrovirüs ve lentivirüs kullandık. Bu üretim tesislerinin sınırlı sayıda klinik düzeyde rekombinant virüs üretimi ve salınımı üzerine dayanır Bu yaklaşım, ancak güncel iyi üretim uygulamaları (GMP) ile uyumlu, pahalı olabilir. DNA türün 1/10 th recombin maliyeti yaklaşık klinik grade üretilebilir beri viral olmayan plazmid elektro-transfer transdüksiyon için cazip bir alternatif olduğunukarınca GMP dereceli virüs. Biz insan uygulama 4-8 Güzellik (SB) transpozon ve transposase Sleeping adapte entegrasyon verimliliği artırmak için. Bizim SB sistemi ilgi bir gen (CD19RCD28 belirlenmiş örneğin 2. nesil CD19-spesifik CAR transgen,) ve TA dinükleotid içine transgen 9-11 tekrarlar ekler transposase (örn. SB11) kodlayan bir transpozon oluşan iki DNA plazmit kullanır . Bir TAA (örneğin, CD19) ve T-hücresi kostimülatör moleküller CD86, CD137L, ifade etmek için modifiye K562-türevli suni antijen sunan hücreler (AAPC) (klon # 4) kullanmak genetik olarak modifiye edilmiş T-hücrelerinde, klinik olarak yeterli bir sayı üretmek için bir Monoklonal antikorların yüklenmesi için interlökin (IL) -15 (peptid modifiye IgG4 Fc bölgesi ile birleşir) ve CD64 (FC-γ reseptör 1) zar bağlı versiyon (mAb) 12. Bu yazıda, complia üstlendiği edilebilir prosedürleri göstermeknce ile CD19-özgü CAR + insan uygulaması için uygun T-hücreleri üretmek için cGMP. Bu γ-ışınlanmış AAPC arasında her-7-günlük eklemeler (stimülasyon döngüsü) ile stabil integrants alınmasını takiben iki DNA plazmit, bir SB transpozon (CD19RCD28) ve SB transposase (SB11) elektro-transferi senkron sağlandı (klon # 4) çözünür rekombinant insan IL-2 ve IL-21 13 varlığında. Genellikle 4 kür (sürekli kültürün 28 gün) stabil CAR ifade T hücrelerinin klinik-çekici sayılar üretmek için yapılmaktadır. Imalat klinik düzeyde CD19-spesifik T hücrelerinin Bu metodoloji, periferik kan (PK) ve göbek kordonu kanı (KK) elde edilen T hücreleri için de uygulanabilir. Ayrıca, bu yaklaşım AAPC üzerinde SYR tarafından tanınan TAA, ifadesi ile tanıttı CAR özgüllüğü eşleştirme tarafından farklı tümör tiplerine T hücreleri oluşturmak için harnessed olabilir.

Bu plazmid DNA ve γ-ışınlanmış AAPC T hücrelerinin çoğalma elektro-transferi insan uygulamalar için PB ve UCB elde edilen T-hücrelerinde, klinik olarak-çekici sayı üretmek için kullanılabilir olduğunu bildirmektedir. Bu genetiği değiştirilmiş T hücrelerinin MHC kompleksi bağımsız TAA CD19, tanıdığı bir tanıttı CAR ifade. SB-kaynaklı DNA plazmid CD28 ve CD3-ε 14 üzerinden sinyalleri, ve (ii) transposase, SB11 15, 13 önceden tarif edilmiştir ki, (i) transpozon, bir 2. kuşak CAR (CD19RCD28), 16,17 ifade etmek için . Mevcut çalışmada kullanılan plasmidlerin Waisman Klinik Biomanufacturing Tesis (Madison, WI) tarafından ticari olarak üretilen edildi. K562 hücreleri (Amerikan Tip Kültür Koleksiyonundan elde edilen parental çizgi), co-ekspres arzu edilen T-hücresi birlikte-uyarıcı moleküller (AAPC bir hücre yüzeyi üzerinde 3% 90 her bir molekül ortaya elde edilmiştir) AAPC (klon # 4),daha önce 12 tarif. Burada, CD19-spesifik T hücrelerinin PB veya UCB sayısal bir araba-bağımlı bir şekilde T-hücrelerinde (Şekiller 1 genişletmek için AAPC eklenmesi ile takiben araç tanıtmak için SB aktarılması ile elde edilen mononükleer hücreleri (MNC) elde edilebileceğini göstermek , 4) 13,18. On küvetler (2x10 7 MNC / küvet) transpozon (SYR) için kodlama plazmid DNA 15 mikrogram (CD19RCD28/pSBSO) ve transposase (SB11) için kodlama plazmid DNA 5 mikrogram (pCMV-SB11) kullanarak her alıcı için electroporated edilir. MNC sınırlayıcı veya laboratuvar çalışmaları için geri ölçekli eğer küvetlerin sayısı azaltılabilir. Elektroporasyonun gün uyarılması döngüsü 1. &quot;Gün 0&quot; olarak tanımlanır. Flow sitometri ve kültür koşulları için denetimleri gibi, otolog T hücreleri sahte electroporated vardır (DNA plazmid olmadan) ve sayısal çapraz bağlantı CD3&#39;e T hücre sürdürmek OKT3 yüklenmi olmuştu γ-ışınlanmış AAPC (klon # 4) genişletilmiş çoğalması. Biz routinely electrotransfer ve elektroporasyon gün sonra T-hücrelerinde (Şekil 2B) canlılığı etkinliğini değerlendirmek. Bu ilk kez noktada kontrol DNA plazmid (pmaxGFP belirlenmiş) ve CAR&#39;dan EGFP ifadesi entegre ve episomal plazmid protein ekspresyonu yansıtır. Genellikle, günlük elektroporasyon sonra biz% 40-50 arasında T hücre canlılığı ile ~% 40 (Şekil 2A) az ~ 60% ve ARAÇ ifadeye EGFP ifade ölçün. Çözünür rekombinant insan IL-2 ve IL-21 varlığında γ-ışınlanmış AAPC Yinelemeli ilave stabil bir şekilde CAR (CD19RCD28) eksprese eden T hücreleri alır. CD3 neg CD56 + NK hücrelerinin bu NK hücre yüzdesi T hücreleri üzerinde eksprese CAR yüzdesi düşük, özellikle ≥% 10 ise ve CD56-spesifik paramanyetik boncuklar kullanarak kültürü tükenmiş. Bu tükenmesi proliferatio sürdürmek için AAPC yeteneğini engelleyen NK hücrelerinin hızlı büyümesi engellerARAÇ n + T hücreleridir. Vesilesiyle, CAR + T hücreleri NK hücrelerinin tükenmesi son iki stimülasyon döngüleri sırasında üstlenilen, ama bu bazı CAR + T hücreleri CD56 arasında ortak ifadesi nedeniyle istenen hücre kaybı tanıtmaktadır. T-hücreleri 14. gün geçmiş Vue kültür torba kullanılarak, bir işlevsel olarak kapalı bir sistem içinde büyütülmüştür. Genetiği değiştirilmiş ve yayılan T hücrelerinin bir alt kümesi genellikle gelecekteki analizler için arşiv malzemesi kaynağı olarak hizmet etmek ve olmak AAPC üzerine ko-kültür Günü 14 veya 21. Gün (Uyarım döngülerinin sonuna # 2 veya # 3) kriyoprezerve edilir beklenmeyen problemler sonradan üretim süreci sırasında oluşursa çözülmüş. T hücreleri tipik olarak (Şekil 3) veya kültür Günü yaklaşık 28 hasat olduğunu rutin ekspres&gt;% 90 CAR ve vardır&gt;% 80 uygulanabilir (Şekil 2C, D). Biz daha önce AAPC üzerine ko-kültür dört hafta sonra CD3 ortalama kat genişleme + T hücreleri 19.800 olduğunu göstermiştir ± CA ile 11.313<html> R + ifadesi% 90 olmak ± 7.5 13. Bu T hücreleri dondurulan ve in-proses ve güvenlik ve üretilen ürünün terapötik potansiyeli üzerine bilgilendirir serbest bırakma testi geçmiştir. Film test öncesinde klinik çalışmalara alıcılara içine infüzyon için analiz sertifikası oluşturmak için klinik laboratuvar iyileşme değişiklikler (CLIA) uygun olarak yapılmaktadır. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1.jpg" /> Şekil 1. CAR + PB ve UCB alınan T hücreleri elektroporasyonu ve yaymak için süreci özetleyen Adımlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig1large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . upload/50070/50070fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50070/50070fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. PB gelen genetik olarak değiştirilmiş T-hücreleri karakterizasyonu. Gen transferi verimini değerlendirmek için ilk uyarım döngüsünün 0. günde EGFP (A) ifade. CD19-spesifik CAR Expression (CD19RCD28) gibi +, CD8 + ve CD4 + elektroporasyon sonra (B) yaklaşık 24 saat ve (C) 28 gün AAPC üzerine ko-kültür sonra T hücreleri CD3 flow sitometri ile değerlendirildi. ARAÇ Benzer ifade UCB alınan T-hücrelerinde gözlenmiştir. (D) CAR ifade kinetiği. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3.jpg" /> Şekil 3,. PB-türetilmiş CAR YayılmasıCD3 + ve CAR + rekombinant insan IL-2 ve IL-çözünür 21. varlığında, γ-ışınlanmış AAPC üzerinde tekrarlanan ko-kültür tarafından PB elde edilen T-hücrelerinde, sayısal genleşme + T hücreleridir. Oranı. Yukarı okları her Uyarım döngüsünün başlangıcı olduğunu γ-ışınlanmış AAPC ve eklemeler göstermektedir. UCB-türetilmiş CAR + T hücreleri sayısal genişleme benzer oranları sergilerler. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4.jpg" /> Şekil 4. Genetik olarak ARAÇ değiştirmek ve yaymak için SB ve AAPC sistemleri kullanılarak üretim sürecinin şematik + Pb ve UCB alınan T-hücreleri. CD19-spesifik CAR + T hücreleri SB-türetilmiş plazmit DNA, süper ve ko-kültür sonraki elektro-transfer tarafından oluşturulan varlığında o içinde K562-türevli AAPC (klon # 4)f rekombinant insan çözünür IL-2 ve IL-21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig4large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <table border="1"><tbody><tr><td width="5"> T hücre kaynağı </td><td width="9"> Transposon * </td><td width="9"> Transposase </td><td width="26"> T hücre infüzyonu </td><td width="1"> IRB # </td><td width="1"> NIH-OBA # </td><td width="1"> IND # </td></tr><tr><td> Otolog (hastanın türetilen) ** </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Otolog hematopoetik kök hücre nakli sonrası </td><td> 2007-0635 </td><td> 0804-922 </td><td> 14193 </td></tr><tr><td> Allojenik (donör kaynaklı) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Allojenik hematopoetik kök hücre nakli sonrası </td><td> 2009-0525 </td><td> 0910-1003 </td><td&gt; 14577 </td></tr><tr><td> Allojenik (donör kaynaklı) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Allojenik göbek kordon kanı nakli sonra </td><td> 2010-0835 </td><td> 1001-1022 </td><td> 14739 </td></tr></tbody></table> * Tablo 1. MDACC de FDA himayesinde Klinik çalışmalarda CD19-spesifik CAR demlenmeye + T hücreleri AAPC üzerine yayılır. T hücreleri SB transpozon bir 2. nesil CAR için kodlama zorlanan ifadesi, belirlenen CD19RCD28, CD28 ve CD3-ε yoluyla sinyalleri aracılığıyla CD19 için belirli işlenir. ** Deneme referans 5&#39;te açıklanan.

Watch this Scientific Journal Video about Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood at JoVE

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Bir CD19 özgü kimerik antijen reseptör (SYR) eksprese eden T hücrelerinin ilk-in-insan gen tedavi denemelerinde B-hücreli kanserlerin araştırılan tedavi olarak infüze edilir. Bu kullanılarak T hücre genetik modifikasyonu tanımlamak<em&gt; Sleeping Beauty</emTasarımcı CD19 + suni antijen sunan hücreler üzerinde CD19-spesifik CAR ve seçici yayılım tanıtmak&gt; (SB) sistemi.

Klinik Uygulama<em&gt; Sleeping Beauty</emGenetiği Periferik ve Göbek Kordon Kanı alınan T hücreleri Değiştir Sunan Hücreler&gt; ve Yapay Antijen

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

clinical-application-sleeping-beauty-artificial-antigen-presenting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

18.2K Görüntüleme.  U.T. MD Anderson Cancer Center. Bir CD19 özgü kimerik antijen reseptör (SYR) eksprese eden T hücrelerinin ilk-in-insan gen tedavi denemelerinde B-hücreli kanserlerin araştırılan tedavi olarak infüze edilir. Bu kullanılarak T hücre genetik modifikasyonu tanımlamak Sleeping Beauty (SB) sistemi.

Video: Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals may exhibit suppressive immune microenvironment and, in contrast to activating CTL, their autologous antigen presenting cells may tend to tolerize or anergize antigen specific CTL. As a result, although still in the experimental phase, CTL-based adoptive immunotherapy has evolved to become a promising treatment for various diseases such as cancer and virus infections. In initial experiments ex vivo expanded CMV (cytomegalovirus) specific CTL have been used for treatment of CMV infection in immunocompromised allogeneic bone marrow transplant patients. While it is common to have life-threatening CMV viremia in these patients, none of the patients receiving expanded CTL develop CMV related illness, implying the anti-CMV immunity is established by the adoptively transferred CTL1. Promising results have also been observed for melanoma and may be extended to other types of cancer2. 
While there are many ways to ex vivo stimulate and expand human CTL, current approaches are restricted by the cost and technical limitations. For example, the current gold standard is based on the use of autologous DC. This requires each patient to donate a significant number of leukocytes and is also very expensive and laborious. Moreover, detailed in vitro characterization of DC expanded CTL has revealed that these have only suboptimal effector function 3. 
Here we present a highly efficient aAPC based system for ex vivo expansion of human CMV specific CTL for adoptive immunotherapy (Figure 1). The aAPC were made by coupling cell sized magnetic beads with human HLA-A2-Ig dimer and anti-CD28mAb4. Once aAPC are made, they can be loaded with various peptides of interest, and remain functional for months. In this report, aAPC were loaded with a dominant peptide from CMV, pp65 (NLVPMVATV). After culturing purified human CD8+ CTL from a healthy donor with aAPC for one week, CMV specific CTL can be increased dramatically in specificity up to 98% (Figure 2) and amplified more than 10,000 fold. If more CMV-specific CTL are required, further expansion can be easily achieved by repetitive stimulation with aAPC. Phenotypic and functional characterization shows these expanded cells have an effector-memory phenotype and make significant amounts of both TNF&alpha; and IFN&gamma; (Figure 3).

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

A new DC independent method for induction and expansion of antigen-specific T cells is described. HLA A2-Ig based artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) are loaded with HLA-A2 restricted peptides to efficiently expand CTL of diverse antigen specificity. This technology holds great potential for CTL-based adoptive immunotherapy.

Verimli HLA-Ig Tabanlı Yapay antijen sunan hücrelerin Ex vivo</emİnsan CTL> Genleşme

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and anti-infective activity.1 The majority of &gamma;&delta; T cells in peripheral blood have the V&gamma;9V&delta;2 T cell receptor. These cells recognize antigen in a major histocompatibility complex-independent manner and develop strong cytolytic and Th1-like effector functions.1Therefore, &gamma;&delta; T cells are attractive candidate effector cells for cancer immunotherapy. V&gamma;9V&#x03B4;2 T cells respond to phosphoantigens such as (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), which is synthesized in bacteria via isoprenoid biosynthesis;2 and isopentenyl pyrophosphate (IPP), which is produced in eukaryotic cells through the mevalonate pathway.3 In physiological condition, the generation of IPP in nontransformed cell is not sufficient for the activation of &gamma;&delta; T cells. Dysregulation of mevalonate pathway in tumor cells leads to accumulation of IPP and &gamma;&delta; T cells activation.3 Because aminobisphosphonates (such as pamidronate or zoledronate) inhibit farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS), the enzyme acting downstream of IPP in the mevalonate pathway, intracellular levels of IPP and sensitibity to &gamma;&delta; T cells recognition can be therapeutically increased by aminobisphosphonates. IPP accumulation is less efficient in nontransfomred cells than tumor cells with a pharmacologically relevant concentration of aminobisphosphonates, that allow us immunotherapy for cancer by activating &gamma;&delta; T cells with aminobisphosphonates. 4 Interestingly, IPP accumulates in monocytes when PBMC are treated with aminobisphosphonates, because of efficient drug uptake by these cells. 5 Monocytes that accumulate IPP become antigen-presenting cells and stimulate V&gamma;9V&delta;2 T cells in the peripheral blood.6 Based on these mechanisms, we developed a technique for large-scale expansion of &gamma;&delta; T cell cultures using zoledronate and interleukin-2 (IL-2).7 Other methods for expansion of &gamma;&delta; T cells utilize the synthetic phosphoantigens bromohydrin pyrophosphate (BrHPP)8 or 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP).9 All of these methods allow ex vivo expansion, resulting in large numbers of &gamma;&delta; T cells for use in adoptive immunotherapy. However, only zoledronate is an FDA-approved commercially available reagent. Zoledronate-expanded &gamma;&delta; T cells display CD27-CD45RA- effector memory phenotype and thier function can be evaluated by IFN-&gamma; production assay. 7

Expansion of Human Peripheral Blood  &amp;#947;&amp;#948; T Cells using Zoledronate

A method to expand &gamma;&delta; T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is described. PBMC-derived &gamma;&delta; T cells are stimulated and expanded using zoledronate and interleukin-2 (IL-2). Large scale expansion of &gamma;&delta; T cells can be applied to autologous cellular immunotherapy of cancer.

Zoledronate İnsan Periferik Kan Genişleme γδ T Hücreler

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

Kordon Kanı adlı Sitotoksik T lenfositler genişletilmesi olduğunu Hedef Sitomegalovirüs, Epstein-Barr Virus ve Adenovirüs

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

Yapay Antijen Hücre (AAPC) Aracılı Aktivasyon ve Doğal Öldürücü T hücreleri genişletilmesi Presenting

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

Kordon Kanı gelen Prekürsör B-hücreli altkümeleri İzolasyonu

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

Etkin Killer yapay antijen sunan hücreler (KaAPC)<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Antijen-spesifik T hücrelerinin tükenmesi

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Periferik Kan İnsan alloantijen-özgü T hücrelerinin üretilmesi

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

Bir Antijen odaklı Kolit Modelinin Geliştirilmesi Antijen T hücreleri için Hücreler sunulması ile Antijen Sunumu Eğitim için

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells differentiate to form platelet precursors called megakaryocytes, which terminally differentiate to release platelets from long cytoplasmic processes termed proplatelets. Megakaryocytes are rare cells confined to the bone marrow and are therefore difficult to harvest in sufficient numbers for laboratory use. Efficient production of human megakaryocytes can be achieved in vitro by culturing CD34+ cells under suitable conditions. The protocol detailed here describes isolation of CD34+ cells by magnetic cell sorting from umbilical cord blood samples. The necessary steps to produce highly pure, mature megakaryocytes under serum-free conditions are described. Details of phenotypic analysis of megakaryocyte differentiation and determination of proplatelet formation and platelet production are also provided. Effectors that influence megakaryocyte differentiation and/or proplatelet formation, such as anti-platelet antibodies or thrombopoietin mimetics, can be added to cultured cells to examine biological function.

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

A highly pure population of megakaryocytes can be obtained from cord blood-derived CD34+ cells. A method for CD34+ cell isolation and megakaryocyte differentiation is described here.

Kordon kan kaynaklı CD34 megakaryocyte farklılaşma ve trombosit oluşumu insan+ hücreleri

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

Kanda dolaşan nadir antijen spesifik B hücreleri Discriminative insan monoklonal antikorların üretimi

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...