Biz oksijen odaları sağlamak için mükemmel teknik destek ve Dr Antonio Di Sabatino için Erika Mileti teşekkür ederim. Finansman: MR ve Fondazione Cariplo ve Marie Curie uluslararası eğitim hareketlilik ağ (Çapraz-Talk, hibe anlaşması No: 21553-2) destek için: Bu çalışma, 7. AB çerçeve programı (Dendroworld IBDase, ERC) hibe tarafından desteklenmiştir KT.

1. Elde ve Doku hazırlanması <ol><li> Doku (sağlıklı veya İBH mukoza) ameliyat sırasında elde edilir. Bir kez numune 4 ° C&#39;de veya buz üzerinde Kalem / Strep ile desteklenmiş Ca + + / Mg + + ücretsiz HBSS tampon tutarak, en kısa sürede laboratuara transferi eksize edilir. </li></ol> Numunenin * boyutu doku bulunmasına bağlıdır: elde edilen doku parçası, tanı için gerekli değildir ne sıkı ve sağlıklı ve IBD konular arasında büyük ölçüde değişebilir. Sağlıklı doku kolon kanseri nedeniyle ameliyat geçiren hastalarda eksize edilir. <ol start="2"><li> Hafifçe doku yıkayın ve tüm mezenterik malzeme temizleyin. Bir Petri kabı (mutlaka immerged değil) HBSS tampon doku tutarken steril makas ve forseps kullanarak submukozadan mukoza tabakası ayırın. Mümkün olduğunca az forseps ile mukoza yüzeyine dokunmayın. </li><li> En az 1 C çizgili mukoza Kesmem genişliğinde ve mümkün olduğunca uzun süre. Eğer gıda kesim sanki çok, iki steril neşter kullanın. </li><li> HBSS hafifçe mukoza temiz ve yukarı bakacak şekilde apikal yüzü bir Petri kabı üzerine uzatmak yıkayın. </li></ol> 2. Doku Montaj <ol><li> Taze orta (tisDMEM) hazırlayın. DMEM, glutamin (2 mM) ve NaPyr (1 mM) ile desteklenmiş kullanın ve FBS-Na% 15 ekleyin (Fetal Sığır Serumu - Kuzey Amerika), 1% ITS-X ve kullanım sırasında 200 ng / ml, EGF. </li><li> FBS-Na (metal ızgaralar tamamen sular altında olacak şekilde yaklaşık 30 ml kullanın) ve batığın metal ızgaraları geri kalanı ile bir 10 cm Petri kabı doldurun. Plaka kendi musluğu plastik silindir açın ve destek tutun. </li></ol> * Metal ızgaraları demirdir. Örgü, 0.5 mm bir tarafı ile kare-şekillidir. <ol start="3"><li> 10 veya 20 ul pipet ile cerrahi yapıştırıcı 3 ul alın. Bu f tutarken plastik bir silindirin sınırları birine dikkatle uygulayınforseps ile IRM. </li><li> Yavaşça mümkün olduğu kadar yakın olan şeridin sınırları birine, mukoza apikal tarafındaki silindir yerleştirin. </li><li> Iyi merkezinde orta 850 ul-1 ml koyun ve plaka merkezi kuyunun kenarlarında metal ızgara destek: sıkıca doku üzerinde silindir takmak için tutkal zaman vermek, merkez de organ kültürü plaka hazırlamak. </li><li> Uzakta daha önce olduğu gibi iki steril neşter kullanarak silindirin sınırlarından aşırı doku kesin. </li><li> Yavaşça bağlı doku ile kaldırma silindiri ve plakanın ortasına metal ızgara üzerinde bazolateral yan. </li></ol> 3. Uyarım <ol><li> Tercih konsantrasyon seçtiğiniz uyaranlara kullanın. </li><li> Pipet ile silindir ya da mukoza yüzeyi bozmadan plastik silindirin merkezine uygun hacim uygulanır. Seçtiğiniz hacmi eşit silindir içindeki yüzeyini kaplayan emin olun. Içindeendikedir hacimleri: Büyük plastik silindir: 200 ul Orta plastik silindir: 100 ul Küçük plastik silindir: 50 ul </li><li> Kadar geleneksel bir inkübatör 3 saat için inkübe edin. </li></ol> * Daha uzun zaman noktalarında inkübe isterseniz, (3.5) Eğer uyaranlara çok daha küçük bir hacim (10-20 ul) kullandığınızdan emin olun ve doğrudan 1 Atm baskısı% 100 O 2 bir ortamda mendilini . <ol start="4"><li> Apikal yüzünde orta kalın bir tabaka gaz değişimi engelliyorsa, doku 2 O yeterli almaz, çünkü doku apikal yüzeyinden uyaranlara ile orta alın ve taze orta DEĞİŞTİR. Kapak plakası. </li><li> 1 atm basınçta% 100 O2 atmosferi içinde doku yerleştirin. </li></ol> 4. Hasat <ol><li> Toplam kültür süresi (± 2,5 saat) 24 saat sonra dikkatli bir şekilde inci silindir çıkarınE bir neşter hafifçe kazıyarak tutkal yardımı ile doku ve (RNA saflaştırma ve gen ekspresyon profili ya da protein saflaştırma ve Batı benek deneyleri için sıvı N2 içinde immünohistokimya ve / veya imünoflüoresan deneylerinde ya da ek dondurulmasını düzeltmek istenen analizine bağlı olarak depolamak .) </li><li> Sitokin salgılanması profil için bazolateral orta hasat. Pelet enkaz 7 dakika 8.000 rpm&#39;de santrifüj, bir Eppendorf tüp (alternatif kısım) olarak süpernatant aktarmak ve hemen -20 ° C&#39;de saklayın </li></ol> * Daha uzun süre süpernatanlar tutmak istiyorsanız, -80 saklayın ° C

<ol>
	<li>Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ex+vivo+response+of+human+intestinal+mucosa+to+enteropathogenic+Escherichia+coli+infection.">The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection.</a> Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).</li><li>Tsilingiri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+and+postbiotic+activity+in+health+and+disease:+comparison+on+a+novel+polarised+ex-vivo+organ+culture+model.">Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model.</a> Gut. , (2012).</li><li>Tsilingiri, K., Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Should+probiotics+be+tested+on+ex+vivo+organ+culture+models?.">Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models?.</a> Gut Microbes. , (2012).</li><li>Mileti, E., Matteoli, G., Iliev, I. D., Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+immunomodulatory+properties+of+three+probiotic+strains+of+Lactobacilli+using+complex+culture+systems:+prediction+for+in+vivo+efficacy.">Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains of Lactobacilli using complex culture systems: prediction for in vivo efficacy.</a> PLoS One. 4, e7056 (2009).</li><li>Cencic, A., Langerholc, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cell+models+of+the+gut+and+their+applications+in+food+microbiology--a+review.">Functional cell models of the gut and their applications in food microbiology--a review.</a> Int. J. Food Microbiol. 141, S4-S14 (2010).</li><li>te Velde, A. A., Verstege, M. A., Hommes, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+appraisal+of+the+current+practice+in+murine+TNBS-induced+colitis.">Critical appraisal of the current practice in murine TNBS-induced colitis.</a> Inflamm. Bowel Dis. 12, 995-999 (2006).</li><li>Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt+regeneration+in+adult+human+colonic+mucosa+during+prolonged+organ+culture.">Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture.</a> J. Anat. 134, 459-469 (1982).</li><li>Browning, T. H., Trier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+culture+of+mucosal+biopsies+of+human+small+intestine.">Organ culture of mucosal biopsies of human small intestine.</a> J. Clin. Invest. 48, 1423-1432 (1969).</li><li>Besselink, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+prophylaxis+in+predicted+severe+acute+pancreatitis:+a+randomised,+double-blind,+placebo-controlled+trial.">Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial.</a> Lancet. 371, 651-659 (2008).</li><li>Lakhdari, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+NF-kappaB+modulation+capabilities+within+human+intestinal+commensal+bacteria.">Identification of NF-kappaB modulation capabilities within human intestinal commensal bacteria.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2011, 282356 (2011).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

İnsan bağırsak mukozası için tedaviler geçerli olarak test edilebilir hangi fizyolojik ilgili modelleri olan ihtiyaç uzun vurgulanmıştır. Birçok araştırmacı bu amaçla bugüne kadar kullanılan cep 5 ve fare modellerinde 6 hem de potansiyel eserler ve kusurları belirledik. Umut verici klinik öncesi veriler genellikle elde olsa bile Gerçekten de, bu nadiren önemli klinik fayda çevirmek. Bu çalışmada açıklanan bir yöntem olup, bir kültür ve pola...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Regeant</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog No.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X HBSS</td>
			<td>Eurocalne</td>
			<td>ECM4006XL</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peni/Strepto</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE17602E</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-037</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12614</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS-Na</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X ITS-X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Tebu-bio</td>
			<td>100-15</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17605E</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non essential aminoacids 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaPyr</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-039</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloning cylinders 6x8 mm</td>
			<td>BellCo</td>
			<td>2090-00608</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloning cylinders 8x8 mm</td>
			<td>BellCo</td>
			<td>2090-0080</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloning cylinders 10x10 mm</td>
			<td>BellCo</td>
			<td>2090-01010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal grids</td>
			<td>Home made</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centre well organ culture plate</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353037</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical glue (Vetbond)</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Jars</td>
			<td>Home made</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen tanks</td>
			<td>Air Liquid Sanit&agrave;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel method for the culture and polarized stimulation of human intestinal mucosa explants

Birkaç model şu anda gerçekçi etkileşimleri çeşitli yer alan karmaşık insan bağırsak mikro-çevre, simüle etmek için var. Aynı zamanda yanlışlıkla gıda ile yutulur patojen mikroplara karşı etkili bir bağışıklık yanıtları montaj yaparken de gıda antijenlerine karşı bütün bir immünolojik tepki neden olan tolerans şekil olarak uygun dengesini doğrudan, bu etkileşimlerin bağlıdır. Bağırsak homeostasis mukus eki / bozulması düzenleyen Mikrobiyota (gıda ile ilişkili yararlı bakteri suşlar dahil) ve ev sahibi, arasında çeşitli karmaşık etkileşimler aracılığıyla da korunur, epitel bariyer tarafından antimikrobiyal peptidler üretimi, ve &quot;eğitim&quot; nüfus &#39;benzersiz, gut yerleşik lenfoid hücrelerin tolerojenik veya immünojenik fenotip kontrol&#39; epitel hücreleri. Bu etkileşimler, in vitro tahlillerde ile yeniden oluşturmak için şimdiye kadar çok zor olmuşturkültürlenmiş hücre çizgileri ya da periferal kan tek-çekirdekli hücreleri ya kullanılarak. Buna ek olarak, fare modelleri, insan bağırsak ile ilgili olarak, bağırsak mukozası (mukus tabakası organizasyon, ortakçı bakteri eden) bileşenleri önemli ölçüde farklılık gösterir. Böylece, irritabl bağırsak sendromu, enflamatuar barsak hastalığı veya kolorektal kanser gibi önemli stresle ilişkili veya patolojik durumlar için klinikte getirilmesi için çeşitli tedaviler çalışmalarını gerçekleştirmek zor olmuştur. Bu sorunları çözmek için, bize bir polarize şekilde, ev sahibi Mikrobiyota ve immün yanıt ile yerinde klima kendi korumak insan bağırsak mukozasının eksplantlarının teşvik sağlayan yeni bir sistem geliştirdi. Polarize apikal stimülasyon sonucu için büyük önem taşımaktadır immün yanıt ortaya çıkardı. Bu tekrar tekrar bağırsak epi apikal yüz atlamak zaman aynı uyaranlara tamamen farklı tepkiler üretebilir gösterilmiştirsentezlenen, basolaterally epitel hücreleri uyararak ya da lamina propria bileşenleri ile doğrudan temas, tolerojenik gelen immünojenik için fenotip geçiş ve bölgede gereksiz ve aşırı enflamasyon neden olur. Bu yapıştırma mukoza apikal yüzünde stimülasyon alanı olarak protokolde tarif edilecektir ayrılmış bir mağara silindir polarize uyarılması sağlanır. Biz diğerleri, üç farklı Laktobasillerin suşlarının diferansiyel etkileri arasında, incelemek için bu model kullanılır. Bu model sistem sağlıklı ve hastalık koşullarında probiyotiklerin bağışıklık özelliklerini değerlendirmek için çok güçlü olduğunu göstermektedir.

Bu doku sağlığını koruyan en az 24 saat boyunca kültür sağlıklı ve IBD de insan bağırsak mukozasında korumuştur. Kültür zaman çoğunluğu (toplam en az 85%) O 2 yer aldı önceki gözlemler 1 uyarınca, bu doku geleneksel kuluçka 24 saat (Şekil 2) için hayatta değildi gibi, mümkün oldu. Ayrıca eksplant farklı tepkiler uyarılması (apikal vs bazolateral) ve uyarı 2,3 immünojeniklik polaritesine bağlı olarak bu modelde gözlenebilir göstermi?...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants at JoVE.com

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

En az 24 saat boyunca çeşitli uyaranlara yanıt kültürü ve izleme insan bağırsak mukozasının korunması için yeni bir yöntem getirmektedir. Bizim yöntem ile, doku kutup apikal yolla fizyolojik bir uyarım sağlayan, korunur.

İnsan bağırsak mukozasının eksplantlar Kültür ve Polarize Uyarım için Yeni Bir Yöntem

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

a-novel-method-for-culture-polarized-stimulation-human-intestinal

Research

JoVE Journal

Biology

13.0K Görüntüleme.  European Institute of Oncology. En az 24 saat boyunca çeşitli uyaranlara yanıt kültürü ve izleme insan bağırsak mukozasının korunması için yeni bir yöntem getirmektedir. Bizim yöntem ile, doku kutup apikal yolla fizyolojik bir uyarım sağlayan, korunur.