Kanser Önleme ve Texas Araştırma Enstitüsü (CPRIT; RP160169) ve UT Güneybatı Tıp Merkezi MHZ verilen, bu çalışma Crohn ve Amerika Kolit Vakfı, (3711 CCFA) fon tarafından desteklenmiştir

Burada açıklanan tüm deneyler Hayvan Resource Center (ARC), UT Southwestern Tıp Merkezi&#39;nde belirli bir patojen free (SPF) tesiste muhafaza 6-8 haftalık erkek vahşi tip (C57BL6 / J) fareleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Tüm çalışmalar Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve IACUC kurallarına ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi National Institutes göre yapılmıştır. 1. Toplama ve Colon hazırlanması <ol><li> Servikal dislokasyon tarafından takip CO 2 boğulma ile fareler Euthanize. </li><li> % 70 etanol ile fareler Sprey ve gemide aşağı fare dorsal yüzü tutmak iğneleme kuruluna bacaklarda pin. </li><li> önceden sterilize edilmiş kesme makasları ve forseps kullanarak, karın periton bir orta hat kesi yapmak. forseps ile periton katlanarak karın açın. </li><li> karın boşluğu wi gelen bağırsak kaldırinci forseps ve makas diseksiyon. çekum alt ve rektum diğer ucunda kesilerek ince bağırsaktan kolon ayırın. </li><li> buz soğukluğunda PBS içeren steril bir petri kolon yerleştirin. kolon lümeni içinde dışkı tamamen kaldırılması, bir 20 G iğne veya oral gavaj iğnesi tutan bir 20 ml şırınga kullanılarak buz gibi soğuk PBS ile kolonun lümen içeriği çalkalayın. </li><li> uzunlamasına makasla kolon kesin. Steril bir Petri kabındaki buz gibi soğuk PBS ile şiddetli bir şekilde çalkalayarak kolon yıkayın. </li><li> yaklaşık 1 cm uzunluğunda bir steril neşter veya makas kullanarak parçalar halinde kolon doku kesin. </li><li> Kolon parçaları ağırlığını kaydedin. Not: Bölüm 1 &#39;de tüm adımlar içinde ya da biyolojik güvenlik kabini dışındaki ya da gerçekleştirilebilir. Kolonlar kültür için hazır olduğunda, tüm adımları kısırlık korumak için bir biyolojik güvenlik kabini içinde yapılmalıdır. </li></ol> 2. Kolon Orgbir Kültür <ol><li> 6 oyuklu hücre kültürü plakasının bir hücre süzgecinden (100 um) yerleştirin. hücre süzgecinden içine bir fare toplanan kolon parçalarının hepsini aktarın. </li><li> % 5 FBS, penisilin-streptomisin (1x) ve gentamisin (20 ug / ml) ihtiva eden 5 ml DMEM / F12 ortamı ekleyin. Tamamen medya ile kolon parçaları kapsamaktadır. </li><li> % 5 CO2 ve% 95 hava içeren bir inkübatörde 37 ° C&#39;de 2 saat süreyle inkübe edin. </li><li> Hücre süzgeç kaldırın ve medya aspire. </li><li> geri çukuruna hücre süzgeç yerleştirin ve herhangi bir antibiyotik olmadan 5 ml taze medya ekleyin. Hücre süzgeç kaldırın ve medya aspire. </li><li> bakiye antibiyotikler kaldırmak için yukarıdaki yıkama adımı (adım 2.5) iki kez daha (toplam 3x) tekrar edin. </li><li> steril 12-yuvalı hücre kültürü plakasının tek kuyuya tek bir hücre süzgecinden alınan kolon parçaları aktarın. </li><li> (Antibiyotikler olmadan),% 5 FBS içeren DMEM / F12 ortamı ekleyin. Weig ile orta ses seviyesini ayarlamakKolon parçaları HT örneğin, doku, 100 mg, 1 ml aracı. % 5 CO2 ve% 95 hava enjekte bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de 12 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> steril 1.5 ml tüp içinde kültür süpernatant toplayın. </li><li> 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 12,000 x g&#39;de santrifüjleyin. deneyi ve / veya diğer bağışıklık tahlilleri öldürme bakteride kullanım için yeni bir 1.5 ml tüp içine yüzey maddesi ayrılır. Süpernatan, deneye kadar -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> RNA izolasyonu için bir tüp kolon parçaları toplamak. </li></ol> Öldürme Denemesi 3. E.coli <ol><li> 15 ml&#39;lik bir tüp içinde 5 ml Luria-Bertani (LB) sıvısında E. coli inoküle ve gece boyunca 200 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de inkübe edin. biraz gevşek kültür tüpünün kapağını tutun. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1200 x g&#39;de bakteriyel kültür tüpü santrifüjleyin. Süpernatantı ve 5 mi buz soğukluğunda PBS içine bakteriyel pelletini. </li><li> Bact Devri 1 mL600 nm &#39;de bir küvet ve ölçü OD içine eri süspansiyon. Bir boş olarak PBS kullanın. </li><li> önceden tespit edilmiş bir standart eğri kullanılarak koloni oluşturan birimi (CFU) hesaplayın. Burada, bu 1 OD = 2 x 10 9 kob / ml (yaklaşık) varsayalım. </li><li> Stok süspansiyon 1 x 10 5 cfu / ml yapmak için bakteri süspansiyonu sulandırmak. </li><li> 24-iyi hücre kültür plakası yinelenen kuyulara Bölüm 2.10 toplanan kolon organ kültür süpernatant aktarın (500 ul / oyuk). </li><li> Bir de içeren 500 uL kolon organ kültürü süpernatant içine 10 uL E.coli kültürü (1.000 cfu) ekleyin. Kolon, organ kültür süpernatanı herhangi bir bulaşmayı içermiyor onaylamak için herhangi bir E.coli aşılamadan olmadan başka kuyu bırakın. </li><li> Bir kontrol olarak bir antibiyotiksiz kültür ortamı (DMEM / F12 +% 5 FBS) içinde bakteri aynı sayıda (1.000 CFU) inkübe edin. </li><li> 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Her bir örnek açılan wi 50 uL yerleştirinMacConkey agar plaklarına se. gece boyunca 37 ° C &#39;de MacConkey agar plakaları inkübe edin. </li><li> kolonilerin sayısını ve kob / ml hesaplayın. </li></ol> 4. Kolon Antimikrobiyal Konak savunma Yanıtları üzerinde Dış ve iç Faktörlerin Etkisi NOT: Burada açıklandığı gibi antimikrobiyal öldürme tahlil organ kültürü süpernatant bakterisidal aktivitesi üzerine patojen ilişkili moleküler desenleri (PAMPS) ve sitokinler etkisini incelemek üzere kabul edilebilir. IL-1 ve IL-18 ile bu deney bir örneği, aşağıda tarif edilmektedir. <ol><li> Bölüm 1 &#39;de tarif edildiği gibi farelerden nokta üst üste toplar. </li><li> steril bir kağıt havlu üzerine kolon yerleştirin. Makas kullanarak üç bölümden (Şekil 2) içine uzunlamasına kolon kesin. </li><li> Bölüm 1 &#39;de tarif edildiği gibi bu gibi soğuk PBS kolonun her bir bölümü yıkayın. </li><li> küçük parçalar halinde kolonun her bir parçasını kesin ve aseptik tartın. her bir parçanın parçaları aktarın6-yuvalı hücre kültürü plakasının üç kuyu (Şekil 2) üzerine yerleştirilmiş üç ayrı hücre süzgeçler (100 um) olarak kolonun. </li><li> % 5 FBS, penisilin-streptomisin (1x) ve gentamisin (20 ug / ml) ihtiva eden 2 ml DMEM / F12 ortamı ekleyin. </li><li> % 5 CO2 ve% 95 hava enjekte bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de 2 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> 2.4-2.6 de tarif edildiği gibi kolon parçaları yıkayın. steril 12-yuvalı hücre kültürü plakasının tek kuyuya tek bir hücre süzgecinden kolon parçaları aktarın. Tek bir fare kolon üç parça içeren üç kuyu (Şekil 2), tedavi edilmemiş, IL-1 olarak adlandırılan, ve IL-18 olmalıdır. </li><li> (Antibiyotikler olmadan),% 5 FBS içeren DMEM / F12 ortamı ekleyin. Kolon parçaları ağırlığı, örneğin, doku 100 mg 1 ml orta ile orta ses seviyesini ayarlayın. </li><li> 12 saat, IL-1 p (20 ng / ml) ya da IL-18 (20 ng / mL) ile kolon organ kültürü teşvik. Tedavi edilmeyen kolon<html> Organ kültürü kontrol olarak hizmet vermektedir. </li><li> % 5 CO2 ve% 95 hava enjekte bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de 12 saat inkübe edildikten sonra, steril bir 1.5 ml bir tüp içinde kültür süpernatan toplamak. </li><li> 24-iyi plaka çift kuyulara 500 uL kültür süpernatant aktarın. </li><li> Her bir durum için, Bölüm 3&#39;te tarif edildiği gibi tek bir kuyuda E. coli inoküle, kolon organ kültür yüzey maddesinde E. coli (1000 CFU) inoküle. E. coli olmadan diğer iyi içeren aynı organ kültürü süpernatant bakteriyel kontaminasyon için bir kontrol olarak görev yapacak. </li><li> Bir kontrol olarak bir antibiyotiksiz kültür ortamında bakteri aynı miktarda inkübe edin. </li><li> 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> damla damla MacConkey agar plakaları üzerinde her numunenin 50 uL yerleştirin. gece boyunca 37 ° C&#39;de MacConkey agar plakaları inkübe edin. </li><li> Kolonilerin sayısını ve kob / mL (Şekil 4) hesaplayın. </li></ol>e_title &quot;&gt; 5. Antimikrobiyal Genlerin İfade ölçümü <ol><li> kolon organ kültürü bir gece inkübe (12 saat) sonra, 2 ml buz soğukluğunda PBS (2x) ile kolon parçaları yıkama Bölüm 2 ve 4&#39;te tarif edildiği gibi. </li><li> 2 ml RNaz / DNaz ücretsiz vidalı kapaklı tüp içine kolon parçaları toplamak. buz üzerinde tüpler yerleştirin. </li><li> tüp içine 1 ml ticari bir Trizol reaktif ve yokedici matris boncuk ekleyin. </li><li> Lyse otomatik bir doku homojenleştirici kullanılarak doku. </li><li> Bir yeni bir mikrosantrifüj tüpü içine doku lizatındaki toplayın. </li><li> standart protokolü kullanarak RNA izole. </li><li> RNA konsantrasyonu ölçün. </li><li> iyonu giderilmiş su ile uygun bir şekilde RNA seyreltilir ve cDNA sentezi için, 500 ng RNA kullanın. </li><li> hedeflenen antimikrobiyal gen, sitokinler, kemokinler ve diğer ilgi genleri gerçek zamanlı RT-PCR analizi için cDNA&#39;nın kullanılmasıdır. </li></ol>

<ol>
	<li>Maloy, K. J., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+homeostasis+and+its+breakdown+in+inflammatory+bowel+disease.">Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease.</a> Nature. 474, 298-306 (2011).</li><li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota.">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).</li><li>Vaishnava, S., Behrendt, C. L., Ismail, A. S., Eckmann, L., Hooper, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+directly+sense+gut+commensals+and+maintain+homeostasis+at+the+intestinal+host-microbial+interface.">Paneth cells directly sense gut commensals and maintain homeostasis at the intestinal host-microbial interface.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20858-20863 (2008).</li><li>Kamada, N., Chen, G. Y., Inohara, N., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pathogens+and+pathobionts+by+the+gut+microbiota.">Control of pathogens and pathobionts by the gut microbiota.</a> Nat Immunol. 14, 685-690 (2013).</li><li>Wu, H. J., Wu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+gut+microbiota+in+immune+homeostasis+and+autoimmunity.">The role of gut microbiota in immune homeostasis and autoimmunity.</a> Gut Microbes. 3, 4-14 (2012).</li><li>Zimmerman, N. P., Vongsa, R. A., Wendt, M. K., Dwinell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+chemokine+receptors+in+mucosal+homeostasis+at+the+intestinal+epithelial+barrier+in+inflammatory+bowel+disease.">Chemokines and chemokine receptors in mucosal homeostasis at the intestinal epithelial barrier in inflammatory bowel disease.</a> Inflamm Bowel Dis. 14, 1000-1011 (2008).</li><li>Elliott, D. E., Siddique, S. S., Weinstock, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+in+disease.">Innate immunity in disease.</a> Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 749-755 (2014).</li><li>Chopra, D. P., Dombkowski, A. A., Stemmer, P. M., Parker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+cells+in+vitro.">Intestinal epithelial cells in vitro.</a> Stem Cells Dev. 19, 131-142 (2010).</li><li>Autrup, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture+of+human+colon.">Explant culture of human colon.</a> Methods Cell Biol. 21, 385-401 (1980).</li><li>Qin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+gut+microbial+gene+catalogue+established+by+metagenomic+sequencing.">A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing.</a> Nature. 464, 59-65 (2010).</li><li>Wildenberg, M. E., vanden Brink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+advance+in+ex+vivo+intestinal+organ+culture.">A major advance in ex vivo intestinal organ culture.</a> Gut. 61, 961-962 (2012).</li><li>Leushacke, M., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culture+of+the+intestinal+epithelium:+strategies+and+applications.">Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications.</a> Gut. 63, 1345-1354 (2014).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Tsilingiri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+and+postbiotic+activity+in+health+and+disease:+comparison+on+a+novel+polarised+ex-vivo+organ+culture+model.">Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model.</a> Gut. 61, 1007-1015 (2012).</li><li>Haque, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+interactions+of+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium+with+human+small+intestinal+epithelial+explants.">Early interactions of Salmonella enterica serovar typhimurium with human small intestinal epithelial explants.</a> Gut. 53, 1424-1430 (2004).</li><li>Hicks, S., Candy, D. C., Phillips, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+enteroaggregative+Escherichia+coli+to+pediatric+intestinal+mucosa+in+vitro.">Adhesion of enteroaggregative Escherichia coli to pediatric intestinal mucosa in vitro.</a> Infect Immun. 64, 4751-4760 (1996).</li><li>Knutton, S., Lloyd, D. R., Candy, D. C., McNeish, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+adhesion+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli+to+human+intestinal+epithelial+cells+from+mucosal+biopsies.">In vitro adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli to human intestinal epithelial cells from mucosal biopsies.</a> Infect Immun. 44, 514-518 (1984).</li><li>Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt+regeneration+in+adult+human+colonic+mucosa+during+prolonged+organ+culture.">Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture.</a> J Anat. 134, 459-469 (1982).</li><li>Smollett, K., Shaw, R. K., Garmendia, J., Knutton, S., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+distribution+of+EspG2,+a+type+III+secretion+system+effector+of+enteropathogenic+Escherichia+coli.">Function and distribution of EspG2, a type III secretion system effector of enteropathogenic Escherichia coli.</a> Microbes Infect. 8, 2220-2227 (2006).</li><li>Bareiss, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypical+tissue+cultures+from+adult+murine+colon+as+an+in+vitro+model+of+intestinal+mucosa.">Organotypical tissue cultures from adult murine colon as an in vitro model of intestinal mucosa.</a> Histochem Cell Biol. 129, 795-804 (2008).</li><li>Tsilingiri, K., Sonzogni, A., Caprioli, F., Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+culture+and+polarized+stimulation+of+human+intestinal+mucosa+explants.">A novel method for the culture and polarized stimulation of human intestinal mucosa explants.</a> J Vis Exp. , e4368 (2013).</li><li>Hu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+Sensor+AIM2+Maintains+Intestinal+Homeostasis+via+Regulation+of+Epithelial+Antimicrobial+Host+Defense.">The DNA Sensor AIM2 Maintains Intestinal Homeostasis via Regulation of Epithelial Antimicrobial Host Defense.</a> Cell Rep. 13, 1922-1936 (2015).</li><li>Moorghen, M., Chapman, M., Appleton, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organ-culture+method+for+human+colorectal+mucosa+using+serum-free+medium.">An organ-culture method for human colorectal mucosa using serum-free medium.</a> J Pathol. 180, 102-105 (1996).</li><li>Dame, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colon+tissue+in+organ+culture:+preservation+of+normal+and+neoplastic+characteristics.">Human colon tissue in organ culture: preservation of normal and neoplastic characteristics.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46, 114-122 (2010).</li><li>Grant, A. J., Woodward, J., Maskell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+ex+vivo+organ+culture+model+using+human+gastro-intestinal+tissue+and+Campylobacter+jejuni.">Development of an ex vivo organ culture model using human gastro-intestinal tissue and Campylobacter jejuni.</a> FEMS Microbiol Lett. 263, 240-243 (2006).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

Bağırsak epitelial hücreler büyüme şartları açısından çok hassas ve kültür nedenle zordur. EDTA muamelesi ile izole epitel hücreler, DMEM 8 gibi geleneksel hücre kültür ortamında hayatta yoktur. Bu nedenle, izole crypt veya birincil epitel hücreleri kullanılarak konak-patojen etkileşim çalışmaları çok zorlu. Son zamanlarda, Sato ve ark. Bağırsak patofizyolojisi 13 ile ilgili çalışmalar için çok umut verici ve yararlı bir crypt organoid kü...

Bağırsak, ortakçı mikroorganizmalar için bir bariyer olarak görev yapan bir dinamik bir sistemi temsil eder, işgalci patojenlere karşı mücadele ve mikrobik bileşim 1 düzenler. bağırsak epitel hücreleri, enterositlerde, goblet hücreleri, Paneth hücreleri ve enteroendokrin hücrelerden oluşan, bağırsak mikrobıyota karşı konak savunma yanıtları sağlamak önemli hücre popülasyonları vardır. Goblet hücreleri epitel tabakası 2&#39;nin üstünde bir askerden arındırılmış bölge oluşturmak müsinleri üretirler. Paneth hücreleri ve enterositler antimikrobiyal peptidler, sitokinler ve antimikrobiyal konak savunma yanıtları oluşturan ve bağırsak mikrobiyal kompozisyon 3, 4 şekillenmesine katkı reaktif oksijen ve nitrojen türlerinin üretirler. epitel hücrelerine ek olarak, makrofajlar, dendritik hücreler, nötrofiller, doğal katil hücreler, lenfositler ve Inna gibi immün hücrelerin<html> 7 - lamina propria ve submukozada te lenfoid hücreler üreten sitokinler, kemokinler ve diğer arabulucular 5 bağırsak antimikrobiyal konak savunma yanıtları kritik bir rol oynamaktadır. mukozal bağışıklık sistemi Mikrobiyota düzenler ve mikrobik enfeksiyonlara karşı koruma sağlar anlamak amacıyla, gut heterojen hücre popülasyonu karmaşık etkileşimi dikkate alınması önemlidir. Bununla birlikte, bağırsak tüm özelliklerini kapsayan bir in vitro model için mevcut değildir. Bu nedenle, bağırsakta konak-patojen etkileşimi üzerinde moleküler çalışmalar son derece zordur. Geçtiğimiz birkaç yıl içinde, bağırsak mukozasının yönlerini taklit birkaç model sistemler enflamatuar barsak hastalıkları (IBD) ve diğer gastrointestinal bozukluklar 8 katılan patofizyolojik süreçlerin araştırılması için geliştirilmiştir -= &quot;xref&quot;&gt; 14. Ölümsüzleştirilmiş intestinal epitelyal hücre hatları genellikle epitel hücre spesifik yanıtlar incelemek için kullanılır. Bununla birlikte, farklı gen ifadesi ve ölümsüzleştirilmiş hücre fonksiyon, veriler genellikle, in vivo çalışmalarda gözlenen ile eşleşmiyorsa, bu hücreler kullanılarak elde edilen. Son zamanlarda farklı uyaranlara 13 bağırsak epiteli yanıtını değerlendirmek için potansiyel bir araç olarak ortaya çıkmıştır organoid kültür bağırsak crypt. Bu sistemde, kript kök hücrelerin büyümesine ve 3D organoid yapısını geliştirmek için izin verilir. organoid kültür sistemi, bağırsak epiteli birçok açıdan çalışmak için çok yararlı olsa da, bağışıklık hücreleri, epitel hücreleri ve mikrobiyal ürünler kompleks bir etkileşim taklit etmez. Bağırsak dokusunun ex vivo kültür içinde in vivo konukçu savurma tepkilerin daha iyi bir temsilini sunar. Bu yöntemde, bağırsağın bir bölümü, bir hücre kültür plakası wit kültürlenirbağırsakta hücre popülasyonlarının farklı sağlayan h uygun ortam en az 48 saat süreyle metabolik olarak aktif olması için. Bu nedenle, organ, bir ex vivo kültür antimikrobiyal gen ekspresyonunu ve belirli bir uyarana bağırsak konak savunma tepkilerini ölçmek için kullanılabilir. 21 - Müfettişler bağırsakta 15 mikrobiyal enfeksiyonlara karşı konak savunma yanıtları incelemek için ex-vivo organ kültürü sistemi kullanılarak edilmiştir. Biz son zamanlarda fare iki nokta üst üste 22 antimikrobiyal konak savunma yanıtları inflammasome rolünü incelemek için organ kültürü sistemini benimsemiştir. inflammasome olgunlaşmış IL-1 p ve IL-18 üretimi için gerekli olan kaspaz-1 aktivasyonu için moleküler bir platformdur. Bu, IL-1β ve IL-18, E. coli gibi etkili bir ortakçı pathobionts öldürmek antimikrobiyal peptitler neden olduğunu gösterdi </em&gt;. Bu gözlem, inflammasome kusurlu fare kolon 22 artmış, E. coli yükü ile tutarlıdır. Bu sistem, bu nedenle bu tür enflamatuvar bağırsak hastalığı (IBD) ve kolorektal kanserin (CRC) gibi, bağırsak rahatsızlıklarının bağırsak antimikrobiyal konak savunma karşılıklarında eden örüntü tanıma reseptöleri (PRR&#39;ler) ve diğer doğal bağışıklık moleküllerinin rolü ve hastalık oluşumunun incelenmesinde kullanılabilir. Bu genlerin çoğu bağırsağında değiştirilmiş mikrobiyal bileşim ile ilişkilidir 200&#39;den IBD yatkınlık genleri ve mutasyon vardır. Bu IBD-yatkınlık genleri bağırsak Mikrobiyota düzenleyen hangi aracılığıyla hassas mekanizmasını belirlemek için büyük bir klinik öneme sahiptir. Bu yöntemin genel amacı, ex vivo kolon organ kültürü temel bir protokol tanıtmak ve bu kültür yöntemi bağırsak antimikrobiyal konak savunma yanıtları incelemek için nasıl kullanılabileceğini göstermektir.

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM/ F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride &amp;amp; Magnesium chloride</td><td>Sigma</td><td>5634</td><td></td></tr><tr><td>FBS, heat inactivated</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin solution</td><td>Sigma</td><td>G1272</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-1b recombinan</td><td>Reprokine</td><td>RKP10749</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-18 recombinant</td><td>Reprokine</td><td>RKP70380</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Difco Luria-Bertani Broth&amp;nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>BD&amp;nbsp;Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0075-17-1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Uded to measure RNA concentration</td></tr><tr><td>UV/Vis Spectrophotometer</td><td>BECKMAN</td><td>DU 530</td><td>Used to determine E. coli count</td></tr><tr><td>iScript RT Supermix, 100 rxns</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Univer SYBR Green Supermix&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1725125&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lysing Matrix S (1/8&quot;), 2 ml Tube</td><td>MP Biomedicals</td><td>116925500</td><td>Used to homgenize colon organ for RNA isolation</td></tr><tr><td>FastPrep-24 5G System</td><td>Bio-Rad</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm Petri Dish</td><td>Falcon</td><td>5687</td><td></td></tr><tr><td>Plate 6 well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile</td><td>Cellstar</td><td>5085</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>5698</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST40R Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forma Scientific orbital shaker</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the ex vivo colon organ culture and its use in antimicrobial host defense studies

bağırsak epitel hücrelerinin, farklı türde lamina bağışıklık hücrelerini ihtiva eden propia ve stroma oluşan tekrarlanan kript yapılarının bir mimariyi gösterir. Bu heterojen hücrelerin tüm intestinal homeostasis katkıda bulunmak ve antimikrobiyal konak savunmasında katılmak. Bu nedenle, in vitro ortamda bir bağışıklık yanıtı ve bağırsak antimikrobiyal aktivitesini incelemek için bir vekil örneğin belirlenmesi son derece zordur. In vitro çalışmalar, normal bağırsak ve mikroçevresinin tam fizyolojisini temsil etmemektedir organoid kültür ölümsüzleştirdi bağırsak epitel hücre hatları ya da birincil crypt kullanarak. Burada, bir kültür kabı ve bunun nasıl ex vivo organ kültürü sistemi antimikrobiyal konak savunma yanıtları ile ilgili çalışmalarda uygulanabilir kültürlemenin fare kolon dokusu için bir yöntem tartışılmaktadır. Örnek deneylerde, organ kültüründe kolonlar resp antimikrobiyal peptitleri ifade olduğunu göstermiştireksojen IL-1 ve IL-18&#39;e Onse. Ayrıca, organ kültüründe kolon dokular tarafından üretilen antimikrobiyal efektör molekülleri verimli in vitro Escherichia coli öldürmek. Bu yaklaşım, bu nedenle, bağırsak doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarını ve antimikrobiyal bir ev sahibi savunma tepkilerini düzenleyen patojen ve tehlike ilişkili moleküler desen ve hücresel reseptörlerin rol incelemek için kullanılabilir.

Organ kültüründe iki nokta üst üste bir temsili resmi, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. kültürde kolon parçaları metabolik ve fizyolojik olarak aktif kalır. Bu kültür ortamına ilave ekzojen uyarıcılara etkin yanıt. Ex vivo kültür ve dış uyarılara ile uyarma, örneğin IL-1 ve IL-18 için kolon dokusunun hazırlanması şematik bir iş akışı, Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. Organ kültüründe kolonlar gibi a...

Watch this Scientific Journal Video about The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies at JoVE.com

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.

<em&gt; Ex Vivo</emAntimikrobiyal Konak savunma Çalışmaları&gt; Kolon Organ Kültür ve Kullanımı

The intestine displays an architecture of repetitive crypt structures consisting of different types of epithelial cells, lamina propia containing immune ...

the-ex-vivo-colon-organ-culture-its-use-antimicrobial-host-defense

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

14.0K Görüntüleme.  UT Southwestern Medical Center. The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine. 

Video: The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

Several human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical polarity, ability to differentiate, and anoikis are not maintained in colon cancer derived cell lines. The present study demonstrates a method for culturing primary mouse colon tumor organoids adapted from Sato T et al. 1, which retains important physiologic features of colon tumors. This method consists of mouse colon tumor tissue collection, adjacent normal colon epithelium dissociation, colon tumor cells digestion into single cells, embedding colon tumor cells into matrigel, and selective culture based on the principle that tumor cells maintain growth on limiting nutrient conditions compared to normal epithelial cells.
The primary tumor organoids if isolated from genetically modified mice provide a very useful system to assess tumor autonomous function of specific genes. Moreover, the tumor organoids are amenable to genetic manipulation by virus meditated gene delivery; therefore signaling pathways involved in the colon tumorigenesis could also be extensively investigated by overexpression or knockdown. Primary tumor organoids culture provides a physiologic relevant and feasible means to study the mechanisms and therapeutic modalities for colon tumorigenesis.

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

A simple method to establish primary murine colon tumor organoid is described. This method utilizes the feature that colon tumor cells survive and grow into organoids in media containing limited growth factors, whereas normal colon epithelial do not.

Birincil Fare Colon Tümörler in vitro organoid Kültür

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

Tıp

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of the crypt region. IESCs include active stem cells, which self-renew and differentiate into various epithelial cell types, and quiescent stem cells, which serve as the reserve stem cells in the case of injury. Regeneration of the intestinal epithelium is controlled by the self-renewing and differentiating capabilities of these active IESCs. In addition, the balance of the crypt stem cell population and maintenance of the stem cell niche are essential for intestinal regeneration. Organoid culture is an important and attractive approach to studying proteins, signaling molecules, and environmental cues that regulate stem cell survival and functions. This model is less expensive, less time-consuming, and more manipulatable than animal models. Organoids also mimic the tissue microenvironment, providing in vivo relevance. The present protocol describes the isolation of colonic crypts, embedding these isolated crypt cells into a three-dimensional gel matrix system and culturing crypt cells to form colonic organoids capable of self-organization, proliferation, self-renewal, and differentiation. This model allows one to manipulate the environment-knocking out specific proteins such as claudin-7, activating/deactivating signaling pathways, etc.-to study how these effects influence the functioning of colonic stem cells. Specifically, the role of tight junction protein claudin-7 in colonic stem cell function was examined. Claudin-7 is vital for maintaining intestinal homeostasis and barrier function and integrity. Knockout of claudin-7 in mice induces an inflammatory bowel disease-like phenotype exhibiting intestinal inflammation, epithelial hyperplasia, weight loss, mucosal ulcerations, epithelial cell sloughing, and adenomas. Previously, it was reported that claudin-7 is required for intestinal epithelial stem cell functions in the small intestine. In this protocol, a colonic organoid culture system is established to study the role of claudin-7 in the large intestine.

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The present protocol describes establishing a murine colonic organoid system to study the activity and functioning of colonic stem cells in a claudin-7 knockout model.

Bağırsak Kök Hücre Fonksiyonunu Incelemek için Murin Kolonik Kriptlerinin Üç Boyutlu Kültürü Ex Vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

Kanser Araştırmaları

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

içinde Microengineered İnsan Bağırsak Villi Oturma mikrobiyomu Co-kültür, bir Gut-on-a-Chip mikroakışkan Aygıt

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Biyomühendislik

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

<em&gt; Ex Vivo</emFare Bağırsak Organoids ve&gt; Kültür ve Desen Tanıma Reseptör Uyarım

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Patojenler, Commensals ve ana bilgisayar bağırsak epitel arasındaki etkileşimler çalışmaya insan Colonoid Monolayers

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper homeostasis directly depends on these interactions, as they shape an entire immunological response inducing tolerance against food antigens while at the same time mounting effective immune responses against pathogenic microbes accidentally ingested with food.
Intestinal homeostasis is preserved also through various complex interactions between the microbiota (including food-associated beneficial bacterial strains) and the host, that regulate the attachment/degradation of mucus, the production of antimicrobial peptides by the epithelial barrier, and the "education" of epithelial cells' that controls the tolerogenic or immunogenic phenotype of unique, gut-resident lymphoid cells' populations. These interactions have been so far very difficult to reproduce with in vitro assays using either cultured cell lines or peripheral blood mononuclear cells. In addition, mouse models differ substantially in components of the intestinal mucosa (mucus layer organization, commensal bacteria community) with respect to the human gut. Thus, studies of a variety of treatments to be brought in the clinics for important stress-related or pathological conditions such as irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease or colorectal cancer have been difficult to carry out.
To address these issues, we developed a novel system that enables us to stimulate explants of human intestinal mucosa that retain their in situ conditioning by the host microbiota and immune response, in a polarized fashion. Polarized apical stimulation is of great importance for the outcome of the elicited immune response. It has been repeatedly shown that the same stimuli can produce completely different responses when they bypass the apical face of the intestinal epithelium, stimulating epithelial cells basolaterally or coming into direct contact with lamina propria components, switching the phenotype from tolerogenic to immunogenic and causing unnecessary and excessive inflammation in the area.
We achieved polarized stimulation by gluing a cave cylinder which delimited the area of stimulation on the apical face of the mucosa as will be described in the protocol. We used this model to examine, among others, differential effects of three different Lactobacilli strains. We show that this model system is very powerful to assess the immunomodulatory properties of probiotics in healthy and disease conditions.

We introduce a novel method for the maintenance of human intestinal mucosa in culture and monitoring of the response to various types of stimuli over at least 24 hrs. With our method, the polarity of the tissue is maintained, allowing for a physiological stimulation via the apical route.

İnsan bağırsak mukozasının eksplantlar Kültür ve Polarize Uyarım için Yeni Bir Yöntem

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Biyoloji

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for maintaining local and systemic homeostasis; changes to gut microbiota composition (dysbiosis) associate with a wide array of human diseases. Methods for dissecting host-microbiota interactions encompass an inherent tradeoff among preservation of physiological tissue structure (when using in vivo animal models) and the level of control over the experiment factors (as in simple in vitro cell culture systems). To address this tradeoff, Yissachar et al. recently developed an intestinal organ culture system. The system preserves a naive colon tissue construction and cellular mechanisms and it also permits tight experimental control, facilitating experimentations that cannot be readily performed in vivo. It is optimal for dissecting short-term responses of various gut components (such as epithelial, immunological and neuronal elements) to luminal perturbations (including anaerobic or aerobic microbes, whole microbiota samples from mice or humans, drugs and metabolites). Here, we present a detailed description of an optimized protocol for organ culture of multiple gut fragments using a custom-made gut culture device. Host responses to luminal perturbations can be visualized by immunofluorescence staining of tissue sections or whole-mount tissue fragments, fluorescence in-situ hybridization (FISH), or time-lapse imaging. This system supports a wide array of readouts, including next-generation sequencing, flow cytometry, and various cellular and biochemical assays. Overall, this three-dimensional organ culture system supports the culture of large, intact intestinal tissues and has broad applications for high-resolution analysis and visualization of host-microbiota interactions in the local gut environment.

This article presents a unique method for analyzing host-microbiome interactions using a novel gut organ culture system for ex vivo experiments.

Konak-Mikrobiyota Etkileşimlerini Analiz Etmek için Bağırsak Bağırsak Organ Kültürü Sistemi

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

Bağırsak İltihabının Yerleşik Murin Kolonoidleri Üzerindeki Epitelyal Etkileri

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic cell layer provides the first line of defense between microbial and immune populations and helps to modulate the intestinal immune response. Disruption of the epithelial barrier is a hallmark of inflammatory bowel disease (IBD) and is of interest for therapeutic targeting. The 3-dimensional colonoid culture system is an extremely useful in vitro model for studying intestinal stem cell dynamics and epithelial cell physiology in IBD pathogenesis. Ideally, establishing colonoids from the inflamed epithelial tissue of animals would be most beneficial in assessing the genetic and molecular influences on disease. However, we have shown that in vivo epithelial changes are not necessarily retained in colonoids established from mice with acute inflammation. To address this limitation, we have developed a protocol to treat colonoids with a cocktail of inflammatory mediators that are typically elevated during IBD. While this system can be applied ubiquitously to various culture conditions, this protocol emphasizes treatment on both differentiated colonoids and 2-dimensional monolayers derived from established colonoids. In a traditional culture setting, colonoids are enriched with intestinal stem cells, providing an ideal environment to study the stem cell niche. However, this system does not allow for an analysis of the features of intestinal physiology, such as barrier function. Further, traditional colonoids do not offer the opportunity to study the cellular response of terminally differentiated epithelial cells to proinflammatory stimuli. The methods presented here provide an alternative experimental framework to address these limitations. The 2-dimensional monolayer culture system also offers an opportunity for therapeutic drug screening ex vivo. This polarized layer of cells can be treated with inflammatory mediators on the basal side of the cell and concomitantly with putative therapeutics apically to determine their utility in IBD treatment.

Yazar Spotlight: Bağırsak İltihabının Yerleşik Murin Kolonoidleri Üzerindeki İn Vitro Epitelyal Etkilerinin İncelenmesi  

We describe a protocol detailing the isolation of murine colonic crypts for the development of 3-dimensional colonoids. The established colonoids can then be terminally differentiated to reflect the cellular composition of the host epithelium prior to receiving an inflammatory challenge or being directed to establish an epithelial monolayer.

İntestinal İnflamasyonun Yerleşik Murin Kolonoidleri Üzerindeki İn Vitro Epitelyal Etkilerinin İncelenmesi

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Birincil Fare Colon Tümörler in vitro organoid Kültür

Bağırsak Kök Hücre Fonksiyonunu Incelemek için Murin Kolonik Kriptlerinin Üç Boyutlu Kültürü Ex Vivo

içinde Microengineered İnsan Bağırsak Villi Oturma mikrobiyomu Co-kültür, bir Gut-on-a-Chip mikroakışkan Aygıt

Patojenler, Commensals ve ana bilgisayar bağırsak epitel arasındaki etkileşimler çalışmaya insan Colonoid Monolayers

İnsan bağırsak mukozasının eksplantlar Kültür ve Polarize Uyarım için Yeni Bir Yöntem

Konak-Mikrobiyota Etkileşimlerini Analiz Etmek için Bağırsak Bağırsak Organ Kültürü Sistemi

İntestinal İnflamasyonun Yerleşik Murin Kolonoidleri Üzerindeki İn Vitro Epitelyal Etkilerinin İncelenmesi

İntestinal İnflamasyonun Yerleşik Murin Kolonoidleri Üzerindeki İn Vitro Epitelyal Etkilerinin İncelenmesi

İntestinal İnflamasyonun Yerleşik Murin Kolonoidleri Üzerindeki İn Vitro Epitelyal Etkilerinin İncelenmesi