Yazarlar bizim veri analizi için kendi bilgisayar kümelerinin kullanımı için Çocuk Merhamet Hastaneler ve Klinikler Dr Stephen Kingsmore ve Pediatrik Genom Tıp Merkezi teşekkür etmek istiyorum, Illumina saha servis ekibi (Elizabeth Boyer, Scott Cook ve Mark Cook) ve teknik Onların hızlı tepkiler ve yeni nesil DNA dizileme enstrüman, HiScanSQ ve veri kalitesi analizi çalışmasını yararlı öneriler için danışman ekibi. Bu çalışma Sağlık Hibe HL080042 (SQY için) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından kısmen desteklenen ve Çocuk Merhamet Hastaneler ve Klinikler start-up fon ve bağış, Kansas City Missouri Üniversitesi (SQY için). Edildi

<html> Bu protokol özetleyen bir akış şeması Şekil 1 &#39;de gösterilir. 1. Trombin, RNA İzolasyonu, RNA Kalitesi Değerlendirme ve Ölçülmesi ile Hücre Tedavisi <ol><li> % 5 FBS, büyüme faktörleri ve antibiyotik ile EGM-2 orta boy 6-kuyucuğu yılında% 90-100 izdiham Kültür İnsan Akciğer Mikrovasküler Endotel Hücreleri (HMVEC-LBL) (Lonza, cat # CC-3202). </li><li> Açlık medya (0% FBS) öncesinde trombin ile tedaviye 30 dakika ortam değiştirin. </li><li> 0.05 U / ml trombin ile hücrelerin tedavi ya da ° C ve% 5 CO2 37, 6 saat süreyle, bir kontrol olarak tedavi bırakın. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak Ambion mir Vana kiti kullanılarak tedavi edilen ve kontrol hücrelerinden toplam RNA izole edin. </li><li> Experion Otomatik Elektroforez İstasyonu (ilgili standart protokole göre bir Experion StdSense Ökaryotik RNA çip ile RNA kalitesini değerlendirmek= &quot;_blank&quot;&gt; Www.bio-rad.com). </li><li> Bir standart spektrofotometrik yöntem kullanılarak RNA ölçülmesine imkan verirler. </li></ol> 2. Kütüphane İnşaat ve Dizileme <ol><li> Başlangıç ​​maddesi olarak örnek için yüksek kalitede toplam RNA&#39;nın 1 mg kullanımı. </li><li> Kütüphane oluşturmak için, Illumina (protokol # 15008136 Rev A) &#39;dan standart prosedürü izleyin. Bu protokolde, poli iki tur (A) içeren mRNA seçimleri rRNA dizi minimize etmek rRNA kaldırmak için yapılır. </li><li> Experion Otomatik Elektroforez İstasyonu (ilgili standart protokole göre bir Experion DNA 1K çip kullanan kütüphanelerin kalitesini değerlendiriniz <a href="http://www.bio-rad.com" target="_blank">www.bio-rad.com</a> ). </li><li> QPCR kullanarak kütüphane sayısal: önce bir standart eğri ve bağlanan bağdaştırıcıları için spesifik primerler olarak dizisi edilmiş bir kütüphane kullanın. Bilinmeyen kütüphaneleri (yani 1:100, 1:500 ve 1:1,000) dilüsyonlarının bir dizi kullanın. QPCR ACCO çalıştırınSyberGreen MM protokol rding ve her kütüphanenin orijinal stok miktarını hesaplamak. </li><li> Küme bir akış hücresi hazır olana kadar -20 ° C&#39;de 10 nM ve saklamak için kütüphane stok sulandırınız. </li><li> Ne zaman küme bir akış hücresi hazır, bir su banyosunda CBOT reaktif plaka eritin. CBOT küme oluşturma sürecini hızlandırmak için kullanılan bir Illumina araçtır. </li><li> CBOT enstrüman yıkayın. </li><li> Kütüphaneleri denatüre:, tüpün yönünde 13 ul TE 1x ve 6 ul 10 uM ve kütüphane, Kombine 1 ul 1 N NaOH (Illumina tarafından sağlanan) ekleyin. Vorteks, aşağı dönüş 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir ve buz üzerinde denatüre kütüphaneleri yerleştirin. </li><li> Kütüphaneleri inceltilir 12:00 arasında bir nihai konsantrasyon için 996 ul HT1 ve 4 ul denatüre kütüphane birleştirilmesi ile önceden soğutulmuş bir hibridizasyon tampon ile denatüre kütüphaneleri (HT1, Illumina tarafından sağlanmaktadır) seyreltilir. Buz üzerinde denatüre ve seyreltilmiş kütüphaneler yerleştirin. </li><li> , CBOT levha tüplerin her sıra InvertTüm reaktifler çözülmüş olmasının sağlanması. Plaka aşağı Spin, / delinmeye folyo mühürler kaldırmak ve CBOT üzerine yerleştirin. </li><li> Bir şerit tüp seyreltilmiş, denatüre kütüphanelerin kısım 120 ul, 1-8 etiketli. Bir kontrol başak-gibi her tüpe 1,2 ul seyreltilmiş, denatüre phix kontrol kitaplığı (Illumina dan itibaren) ekleyin. Vortex ve tüpler aşağı spin ve doğru yönde CBOT (sağ tüp # 1) yükleyin. </li><li> CBOT üzerine bir akış hücresi ve manifoldu yükleyin. </li><li> Akışını kontrol ve kümelenme çalışma başlar tamamlayın. </li><li> Çalışma tamamlandıktan sonra, tüm kulvarları arasında reaktif teslim edin. Herhangi bir anormallik not edin. Ya 4 ° C&#39;de hemen dizi çalışma başlatmak veya sağlanan tüp içinde akış hücresi depolamak </li><li> Sıralama-by-sentez (SBS, Illumina) reaktifler çözülme. </li><li> Dilinim karışımı dokunduktan sonra diğer reaktifler dokunmamaya dikkat ederek, reaktif tepsileri uygun noktalar reaktifleri yerleştirin. </li><li> Bir hayır kullanman-sıralama akış hücresi (yani önceden sıralandı biri), asal reaktif çizgiler iki kez. </li><li> İyice% 70 EtOH ve lens kağıt ardından% 70 EtOH ve Kimwipes ile sıralama akış hücresi, temizleyin. Herhangi çizgiler akış hücresi inceleyin. Gerekirse yeniden temizleyin. </li><li> Sequencer üzerine akış hücresi yükleyin ve manifoldlar ve akış hücresi arasındaki mühür sıkı olduğundan emin olmak için kontrol akışı gerçekleştirin. </li><li> Sıralama çalışma başlatın. </li><li> Onlar çalıştırması sırasında kullanılabilir hale kalite ölçütleri (küme yoğunluğu, örneğin filtre geçen kümeleri, S30, yoğunluk) değerlendirin. </li><li> Çalışma süresince yoğunluğunu izleyin. </li><li> 101 döngüleri tamamlandıktan sonra, ikinci okumak tamamlamak için dönüş kimya gerçekleştirin: Eşleştirilmiş sonuna reaktifler ve ikinci okuma Ortaklığımız Buffer (ICB, SBS reaktiflerin bir bileşeni, Illumina) çözülme ve reaktifler yükleyin. </li><li> 2. yoğunluğu, S30 bir okuma değerlendirirken, sıralama çalışma devamçalışma ilerledikçe nd diğer kalite ölçütleri. </li></ol> 3. Veri Analizi <ol><li> Her numune için tek fastq dosyasının oluşturulmasını sağlamak için 0 fastq-küme sayısı ayarı. Fastq dosyaları tabanı çağrı dosyaları (. Bcl) dosyalarını dönüştürmek için casava (Illumina, şu anda 1.8.2) en son sürümünü kullanın . Aşağı analiz için fastq dosyaları açın. </li><li> RNA-seq ultra high-throughput kısa okuma hizalama (Papyon, 0.12.7) 6 ve SAMtools (0.1 kullanarak memeli ölçekli genom okur hizalar Tophat (1.4.1) 5, en son sürümlerini kullanarak eşleştirilmiş sonuna hizalama gerçekleştirin. 17) 7. SAMtools SAM biçiminde sonrası işleme hizalanmalar için çeşitli araçlar uygular. Referans insan transcriptome iGenomes (indirilebilir <a href="http://www.illumina.com" target="_blank">www.illumina.com</a> ). Tophat çalıştıran, biz fr-unstranded (varsayılan) olarak kütüphane türü seçeneği dahil olmak üzere tüm varsayılan parametre ayarları kullanılır. </li><li> Bize8. yazılım paketi programı CuffDiff, kol düğmesi parçası (1.3.0) &#39;a ing insan referans transcriptome esas olarak önceki farklı olarak ifade edilen gen transkript dışarıda bırakmak için, kontrol hücreleri ile trombin ile tedavi edilen hücreler karşılaştırın. Bu karşılaştırma bilinen transkript diferansiyel ifadesi algılar. Tablo şeklinde sonuç görselleştirmek için Microsoft Excel kullanın. Kol Düğmeleri program çalışırken, biz tüm varsayılan parametre ayarları kullanılır. FPKM &lt;0.05 ve p&gt; olanlar gen transkript 0.05 filtrelenir. </li><li> Roman izoformları algılamak için, bir referans transcriptome olmadan Kol Düğmeleri çalıştırın. Cuffcompare kullanılarak referans genomuna örnek transkript dosyaları karşılaştırın ve bir analiz için referans genomu ve bir ikinci analiz için referans genom olarak birleştirilmiş kontrol transkript dosyaları olarak birleştirilmiş trombin transkript dosyaları kullanılarak Cuffdiff ile diferansiyel ifade test edin. Tablo biçiminde sonuç görselleştirmek için Microsoft Excel kullanın. Yine, ThosFPKM &lt;0.05 ve p&gt; E gen transkript 0.05 filtrelenir. Bu adımdan sonra, araştırmacılar UCSC Genom Tarayıcı web sitesi (için yeni rapor transkript bir listesini yüklemeyi tercih edebilirler <a href="http://genome.ucsc.edu/" target="_blank">http://genome.ucsc.edu/</a> bir elle muayene ederek geçerliliğini doğrulamak için). </li><li> Yaratıcılık Pathway Analizi (IPA, değişik şekillerde ifade genlerin listeleri gönderin <a href="www.ingenuity.com" target="_blank">www.ingenuity.com</a> trombin tedavi etkilenen genlerin ve yolların karakterizasyonu için). Bu adımda, müfettişler kuşak (kullanmayı tercih edebilir <a href="http://compbio.mit.edu/cummeRbund/" target="_blank">http://compbio.mit.edu/cummeRbund/</a> görselleştirmek, yönetmenize yardımcı olmak için), Kol Düğmeleri RNA-seq çıkış irdeleme görevini yardım ve kolaylaştırmak için tasarlanmış bir R paketi, ve bir analiz Cuffdiff tarafından üretilen verinin her entegre. </li></ol> 4. Kantitatif Gerçek-zamanlı-Po tarafından RNA-seq Sonuçlar Validasyonulymerase Zincir Reaksiyonu (qRT-PCR) <ol><li> Kontrol ve trombin-işlenmiş HMVEC-LBL hücreleri, RNA kalite değerlendirmesi ve 1.6 Adımlar 1,4 açıklanan RNA miktarının toplam RNA izolasyonu gerçekleştirin. </li><li> Üreticinin talimatlarına (Invitrogen, 18080-051) takip Üst Simge III Üretim-Strand Sentez Sistemi RT Kitleri ile her bir örnek 1 mg total RNA, gelen tamamlayıcı DNA oluşturun. </li><li> CUGBP, Elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor tespiti için Taqman Assay-on-Demand tasarlanmış oligonükleotidler kullanılarak Uygulamalı Biyosistem VIIa 7 Real-Time PCR Sistemi qRT-PCR analizi gerçekleştirin ilişkili faktör 1 (TRAF1, Hs01090170_m1) ve β-aktin (ACTB, Hs99999903_m1). Her numune toplam RNA 5 ng eşdeğer bir şablon vardı. DDCt yöntemiyle kantitatif ölçün ve β-aktin normalleştirmeniz. Her bir tahlil çoğaltır, en az üç biyolojik karşısında gerçekleştirildi. </li></ol>

<ol>
	<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li><li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+DNA+sequencing.">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li><li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays.">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).</li><li>Zhang, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+Reveals+Novel+Transcriptome+of+Genes+and+Their+Isoforms+in+Human+Pulmonary+Microvascular+Endothelial+Cells+Treated+with+Thrombin.">RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin.</a> PLoS One. 7, e31229 (2012).</li><li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat:+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq.">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10, R25 (2009).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation.">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).</li><li>Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+pathway+analysis:+current+approaches+and+outstanding+challenges.">Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002375 (2012).</li><li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+RNA.">Working with RNA.</a> Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+assembly+and+analysis+of+RNA-seq+data.">De novo assembly and analysis of RNA-seq data.</a> Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).</li><li>Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+methods+for+transcriptome+annotation+and+quantification+using+RNA-seq.">Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq.</a> Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).</li><li>Martin, J. A., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+transcriptome+assembly.">Next-generation transcriptome assembly.</a> Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Anahtar adımlar RNA Elleçleme: RNaz, hatta en yüksek kalitede RNA düşer dolayısıyla bakım RNA 10 izolasyonu, depolanması ve kullanılması sırasında alınmalıdır. Eldiven her zaman insan elinde bulunan RNaz tarafından kirlenmesini önlemek için giyilir. Eldiven, özellikle dokunma deri, kapı kolu ya da başka ortak yüzeyleri sonra, sık sık değiştirilmesi gerekir. Pipetler bir dizi çalışma RNA sadece adanmıştır edilmeli ve tüm ipuçları ve...

<table border="1"><tbody><tr><td width="183"> Reaktifler ve Ekipmanları </td><td width="85"> Şirket </td><td width="185"> Katalog numarası </td><td width="359"> Yorumlar </td></tr><tr><td> İnsan Akciğer mikrovasküler endotel hücrelerinde </td><td> Lonza </td><td> CC-2815 </td><td></td></tr><tr><td> Lonza, Bullet Takımı </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td> EGM-2, FBS, büyüme faktörleri ve antibiyotik içerir </td></tr><tr><td> Trombin </td><td> Sigma </td><td> T4393 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion mir Vana Kiti </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> AM 1560 </td><td></td></tr><tr><td> RNaz-Zap </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> AM9782 </td><td></td></tr><tr><td> Experion StdSens RNA </td><td> Bio-Rad </td><td> 700-7103 </td><td></td></tr><tr><td> TruSeq RNA HazırlıkTakımı </td><td> Illumina </td><td> FC-122-1001 </td><td></td></tr><tr><td> AMPureXP Boncuk </td><td> Beckman Coulter </td><td> A63881 </td><td></td></tr><tr><td> Üstsimge Ters transkriptaz II </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 18064-014 </td><td></td></tr><tr><td> Experion DNA 1K </td><td> Bio-Rad </td><td> 700-7107 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiTect SyberGreen </td><td> Qiagen </td><td> 204163 </td><td></td></tr><tr><td> PE Küme Nesil Takımı </td><td> Illumina </td><td> PE-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> Phix Kontrol Kiti </td><td> Illumina </td><td> FC110-301 </td><td></td></tr><tr><td> 200 Döngü SBS Takımı </td><td> Illumina </td><td> FC-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> * HiScanSQ </td><td> Illumina </td><td> SY-103-2001 </td><td></td></tr><tr><td> CBOT </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td></td></tr><tr><td> qPCR makinesi - Viia7 </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> Model # VIIA7 / Ekipman # 10631261 </td><td> Veya eşdeğeri </td></tr><tr><td> Experion Sistemi </td><td> Bio Rad </td><td> 7007001 </td><td> Bioanalyzer alternatif bir sistemi </td></tr><tr><td> Spektrofotometre </td><td> Bio-Tek </td><td> Epoch Mikroplaka Spektrofotometre </td><td> Veya eşdeğeri </td></tr><tr><td> Santrıfüj - Sorvall Legend XTR </td><td> Thermo Scientific </td><td> 75004521 </td><td> Veya eşdeğeri </td></tr><tr><td> Manyetik standı </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> AM10027 </td><td></td></tr><tr><td> PCR 96- </td><td> Genel Lab Tedarikçi </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Anahtar Reaktifler ve Binbaşı E Tablo 3. Listequipment. *, Video, yerine HiScanSQ arasında HiSeq1000 gösterilmiştir. </td></tr></tbody></table>

rna-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells

MRNA seviyelerinin ölçümü yoluyla hücrelerinde gen ekspresyonu karakterizasyonu hücrenin transkripsiyonel makine harici sinyaller (örneğin uyuşturucu tedavisi), veya nasıl hücreler sağlıklı bir devlet ve bir hastalıklı durum arasındaki farklılıklar nasıl etkilendiğini belirlemede yararlı bir araçtır. Nesil DNA dizileme teknolojinin gelişi ve sürekli arıtma ile, RNA-sıralama (RNA-seq), transkript bütün türlerin kataloğa tüm ifade genlerin transkripsiyonel yapısını belirlemek ve ölçmek için transcriptome analiz giderek daha popüler bir yöntem haline gelmiştir belirli bir hücre, doku veya organizma 1,2 transkript toplam grubu değişen ifade seviyeleri. RNA-seq kademeli olarak tam bir profil transcriptome avantajlara sahiptir çünkü, transcriptome analiz için tercih edilen bir yöntem olarak DNA mikroarrayleri yerine bir tür dijital veri (herhangi bir transkript kopya sayısı) sağlayan ve bilinen herhangi bir genomik istif güvenmek içince 3. Burada, biz veya trombin tedavi olmadan insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde profili transcriptomes RNA-seq uygulamak için tam ve ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu protokol başlıklı bizim son yayınlanan araştırmaya dayanmaktadır başarılı insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinin ilk tam transcriptome analizi icra ettiği 4 &quot;RNA-seq Trombin ile Tedavi İnsan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde Genlerin ve Bunların İzoformlar, Romanı transcriptome ortaya çıkarır&quot; trombin RNA-seq kullanarak tedavi. Bu inflamatuvar koşulları, kanser, diyabet ve koroner kalp hastalığı patogenezinde trombin aracılı endotel disfonksiyonu moleküler mekanizmaları içgörüler kazanmak için daha sonraki denemeler için görülmemiş kaynaklar vermiştir ve bu hastalıklar için tedavi hedefleri için potansiyel yeni müşteriler sağlar. Bu protokolün açıklayıcı metindört bölüme ayrılmıştır. Birinci bölüm trombin ve RNA izolasyonu, kalite ve miktar ile analiz insan akciğer mikrovasküler endotel hücrelerinin tedavisi açıklanmaktadır. İkinci bölümde kütüphane oluşturma ve sıralama açıklar. Üçüncü kısım veri analizi açıklanmıştır. Dördüncü bölüm, bir RT-PCR testi doğrulama açıklanmaktadır. Birkaç kilit adımlar Temsilcisi sonuçları görüntülenir. Önemli adımlar başarı artırmak için Yararlı ipuçları veya önlem Tartışma bölümünde verilmiştir. Bu protokol trombin ile tedavi insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde kullanmasına rağmen, memeli ve non-memeli hücrelerinde hem de farklı uyaranlara veya inhibitörleri, ya da sağlıklı bir devlet arasındaki hücre veya dokularda transcriptomes karşılaştırmak ile tedavi dokularda profili transcriptomes jeneralize olabilir ve bir hastalık durumu.

Adım 1 için: 28s: 18s oranı geleneksel RNA bozulmanın bir göstergesi olarak kullanılmaktadır. İdeal olarak, 28s tepe 18s bant (2 oranında) yaklaşık iki katı alan olmalıdır, ancak bu ideal oran genellikle uygulamada görülmemektedir. Ayrıca, 28s: spektrofotometrik yöntem ile elde edilen 18s oranları RNA bozulma miktarı göz ardı edebilir. Daha doğru bir şekilde parçalanması ve bu nedenle RNA örnek kalitesini ölçmek için, Experion sistem, bir RNA kalite göstergesi (RQI) sayıs...

Watch this Scientific Journal Video about RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

Bu protokol ile veya trombin tedavi olmadan insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde profili transcriptomes RNA-seq, güçlü bir nesil DNA dizileme teknolojisi, uygulamak için tam ve ayrıntılı prosedür sunar. Bu protokol, farklı reaktifler veya hastalık durumlarında etkilenen çeşitli hücreleri veya dokulara genellenebilir olduğunu.

RNA-seq Trombin-tedavi içinde Transcriptomes Analizi ve Kontrol İnsan Pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

rna-seq-analysis-transcriptomes-thrombin-treated-control-human

Research

JoVE Journal

Biology

21.8K Görüntüleme.  Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City. Bu protokol ile veya trombin tedavi olmadan insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde profili transcriptomes RNA-seq, güçlü bir nesil DNA dizileme teknolojisi, uygulamak için tam ve ayrıntılı prosedür sunar. Bu protokol, farklı reaktifler veya hastalık durumlarında etkilenen çeşitli hücreleri veya dokulara genellenebilir olduğunu.

Video: RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

İnsan umbilikal ven endotel hücreleri İzolasyon (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Biyoloji

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Yenidoğan Fareler Pulmoner Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks in vivo. In this regard, the search for experimental models to build blood vessel networks in vivo is of utmost importance 1. The feasibility of bioengineering microvascular networks in vivo was first shown using human tissue-derived mature endothelial cells (ECs) 2-4; however, such autologous endothelial cells present problems for wide clinical use, because they are difficult to obtain in sufficient quantities and require harvesting from existing vasculature. These limitations have instigated the search for other sources of ECs. The identification of endothelial colony-forming cells (ECFCs) in blood presented an opportunity to non-invasively obtain ECs 5-7. We and other authors have shown that adult and cord blood-derived ECFCs have the capacity to form functional vascular networks in vivo 7-11. Importantly, these studies have also shown that to obtain stable and durable vascular networks, ECFCs require co-implantation with perivascular cells. The assay we describe here illustrates this concept: we show how human cord blood-derived ECFCs can be combined with bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) as a single cell suspension in a collagen/fibronectin/fibrinogen gel to form a functional human vascular network within 7 days after implantation into an immunodeficient mouse. The presence of human ECFC-lined lumens containing host erythrocytes can be seen throughout the implants indicating not only the formation (de novo) of a vascular network, but also the development of functional anastomoses with the host circulatory system. This murine model of bioengineered human vascular network is ideally suited for studies on the cellular and molecular mechanisms of human vascular network formation and for the development of strategies to vascularize engineered tissues.

Here, we describe a methodology to deliver human cord blood-derived endothelial colony-forming cells (ECFCs) and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs), embedded in a collagen/fibronectin gel, subcutaneously into immunodeficient mice. This cell/gel combination generates a human vascular network that connects with the mouse vasculature.

Bağışık yetmezliği olan farelere Biyomühendislik İnsan Mikrovasküler Ağları

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

Hava Sıvı Arayüz İnsan Burun Epitel Hücrelerinin ekimi

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

Fare Direnç arterlerden mikrovasküler endotel Tüpler İzolasyonu

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Zebra balığı Embriyolar Oksidatif Stres Analizi

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Murin Vana Endotel Hücreleri İzolasyon

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

Bozulmamış Arterlerin endotel katmanı Nitrik Oksit ve Süperoksit En Yüz Algılama

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.