Bu çalışma kısmen, Ulusal Sağlık Enstitüsü, hibe K99EB009096-01A1 tarafından desteklenen JM-M.

1. Hazırlık <ol><li> EGM-2 orta boy (500 ml) <ul><li> Fetal sığır serumu (FBS) 100 mL, 395 mL (EBM-2) Endotelyal Bazal Orta ekleyin. </li><li> 100x Glutamin-penisilin-streptomisin çözüm (GPS) 5 ml ekleyin. </li><li> Hidrokortizon (yani, VEGF, hFGF-B, R-IGF-1, hEGF, heparin, askorbik asit ve GA-1000) dışında tüm EGM-2 SingleQuots takviyeleri ekleyin. </li><li> Filtre 0.2 mikron gözenek boyutu vakum filtre ile sterilize edilmiş. </li></ul></li><li> MSCGM orta (500 ml) <ul><li> 100x GPS Mezenkimal Kök Hücre Bazal Orta (MSCBM) 440 ml 5 ml ekleyin. </li><li> MSCGM SingleQuots kiti tüm içerik ekleyin. </li><li> EGM-2 SingleQuots takviyeleri hFGF-B kısım ekleyin. </li><li> Filtre 0.2 mikron gözenek boyutu vakum filtre ile sterilize edilmiş. </li></ul></li><li> DMEM orta (500 ml) <ul><li> Fetal sığır serumu (FBS) 50 ml, 440 ml 1x yüksek glukoz Dulbecco&#39;nun Modifiye Kartal Medium (DMEM) ekleyin. </li><li> 100x GPS 5 ml ekleyin. </li><li> Gerekli olmayan amino asit çözeltisi 5 ml ekleyin. </li><li> Filtre 0.2 mikron gözenek boyutu vakum filtre ile sterilize edilmiş. </li></ul></li><li> Kollajen / fibronektin solüsyonu (enjeksiyon yapılan aynı gün 3.6 mL) <ul><li> 10x DMEM 0.4 mL distile H 2 O. 150 mcL ekleyin </li><li> 1M Hepes 100 mcL (son 25 mM) ekleyin. </li><li> Dikkatle, sığır kollajen 2.4 ml (5 mg / ml stok, 3 mg / ml son) ekleyin ve buz üzerinde hafifçe karıştırın. </li><li> (Yaklaşık 30 mcL) 1N NaOH çözeltisi ekleyerek nötr pH ayarlayın. </li><li> Nötr pH değerlendirmek için fenol kırmızı gösterge kullanın; alternatif pH izlemek için pH test kağıdı kullanabilirsiniz. </li><li> (30 mg / ml son 1 mg / ml stok) insan fibronektin 120 mcL ekle </li><li> FBS 0.4 mL (% 10 final) </li><li> kullanana kadar buz üzerinde çözüm tutmak. </li></ul></li><li> Fibrinojen solüsyonu (enjeksiyon yapılan aynı gün 1 ml) <ul><li> Toz fibrinojen 30 mg 1 ml 0.9N NaCl (pH 7.4) solüsyonu (30 mg / ml nihai) ekleyin. </li><li> Kullanmadan önce, 37 fibrinojen solüsyonu inkübe ° C 30 dakika boyunca. </li><li> Önce kollajen / fibronektin jel Ayrıca, vorteks, hafifçe karıştırın. </li></ul></li><li> Trombin solüsyonu (200 ml) <ul><li> % 0.9 NaCl normal tuzlu su (50 U / ml) 200 ml toz trombin 1 KU ekleyin. </li><li> Kullanana kadar -20 ° C&#39;de 0.2 mikron gözenek boyutu şırınga filtresi ve mağaza ile sterilize Filtresi. </li><li> Önce 10 U / ml bir final konsantrasyon% 0.9 NaCl normal tuzlu su ile seyreltilmiş kullanabilirsiniz. </li></ul></li><li> % 1 jelatin solüsyonu (500 ml) <ul><li> Dulbecco&#39;nun fosfat 500 ml için 5 gr toz jelatin ekleyin tamponlu salin (PBS). </li><li> 121 ° C&#39;de 30 dakika için otoklavlı. </li><li> Filtre 0.2 mikron gözenek boyutu vakum filtre ile sterilize edilmiş. </li></ul></li><li> % 1 jelatin kaplama çözümü ile Coat 100 mm doku kültürü plakaları <ul><li> Her 100 mm doku kültürü plakası% 1 jelatin solüsyonu 10 ml ekleyin. </li><li> 37 ° plakaları ° C&#39;de 60 dakika. </li><li> Kullanmadan önce, jelatin çözüm kaldırmak ve plakalar PBS ile bir kez yıkayın. </li></ul></li></ol> 2. İnsan Kablosu Kültür Koloni Şekillendirme Endotel Hücreleri (ECFCs) Kan Türetilmiş Bu protokol ECFC dondurulmuş şişeleri, bu deneyde önce laboratuvarda mevcuttur varsayar. ECFC, göbek kordon kanı veya daha önce 7 açıklandığı gibi yetişkin periferik kan ya mononükleer hücre fraksiyonu izole edilebilir . <ol><li> ECFCs Çözülme bir flakon (genellikle 0.5-1x10 6 hücre dondurma medya 1 ml) sıvı azot depolama tankı alınan ve içeriği, 10 ml DMEM orta içeren bir 15 ml konik tüp hemen sulandırmak . 1200 rpm&#39;de 5 dakika boyunca dönerler. Süpernatantı ve 10 ml sıcak EGM-2 orta boy hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Jelatin kaplı 100 mm doku kültürü plakası% 1, ECFC süspansiyon 10 ml ekleyin. 37 ° C ve% 5 CO 2 nemlendirilmiş bir inkübatör plaka koyun. Ertesi gün hafifçe bağlanmamış hücreleri ve orta aspirat ve taze EGM-2 orta boy 10 ml ile bağlı hücreleri beslemek. </li><li> EGM-2 orta boy ile her 2-3 günde bir plaka besleyin. Hücreleri plaka konfluent hücresel bir tek tabaka ile kaplı olduğu gibi genişletmek için izin ver. Izdiham, aşağıdaki gibi hücreler altkültürü: </li><li> Aspire kültür ortamı ve hücreleri 10 ml PBS ile yıkayın. </li><li> PBS çıkarın ve her biri 100 mm plaka için 2 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Tripsin-EDTA çözeltisi eşit dağıtmak için plakalar yavaşça sallayın. 37 ° ° C&#39;de ve% 5 CO 2 3-5 dakika. Süspansiyon müstakil hücreler yavaşça ters bir mikroskop altında görmek için plaka dokunun. </li><li> Hücreler tamamen ayırmak, 8 mL EGM-2 orta boy eklemek ve toplamak hücreli çözüm15 ml konik bir tüp içine TION. Bir haemocytometer hücrelerin sayısı ve hasat hücrelerinin toplam sayısını 10 mcL alın. </li><li> Plaka EGM-2 orta boy kullanılarak, 5.000 hücre / cm ekim yoğunluğu% 1, jelatin kaplı doku kültürü plakalar hücrelerin 2. Inkübatör tabak yerleştirin ve her 2-3 günde bir EGM-2 orta boy ile onları beslemek. </li></ol> Sonraki pasajlar için bu yordamı yineleyin. Hücre popülasyonu genişletilmiş olarak geçiş sayısının takip edin. ECFCs pasajlar 4-8 arasında kullanılacaktır. 3. Kültür İnsan Kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreler (MKH) Bu protokol, bu deneyde önce laboratuvarda insan MSC dondurulmuş şişeleri mevcuttur varsayar. Kemik iliği gibi daha önce 11 olarak açıklanan aspiratlarda MSC izole edilebilir . <ol><li> MKH Çözülme bir flakon (genellikle 1 ml dondurma medya 0.50-1x10 6 hücre), sıvı azot depolama tankı alınan ve içeriği, 10 ml DMEM orta içeren bir 15 ml konik tüp hemen sulandırmak. 1200 rpm&#39;de 5 dakika boyunca dönerler. Süpernatantı ve 10 ml sıcak MSCGM ortamın hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> MSC süspansiyon bir kaplanmamış 100 mm doku kültürü tabak içine 10 ml ekleyin. 37 ° C ve% 5 CO 2 nemlendirilmiş bir inkübatör plaka koyun. Ertesi gün hafifçe bağlanmamış hücreleri ve orta aspirat ve 10 ml taze MSCGM orta ile bağlı hücreleri beslemek. </li><li> MSCGM ortamı ile her 2-3 günde bir plaka besleyin. Hücreleri plaka konfluent hücresel tek tabaka% 80 ulaştığı gibi genişletmek için izin ver. % 80 izdiham, aşağıdaki gibi hücreler altkültürü: </li><li> Aspire kültür ortamı ve hücreleri 10 ml PBS ile yıkayın. </li><li> PBS çıkarın ve her biri 100 mm plaka için 2 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Tripsin-EDTA çözeltisi eşit dağıtmak için plakalar yavaşça sallayın. 37 ° ° C&#39;de ve% 5 CO2 3-5 dakika. Süspansiyon müstakil hücreler yavaşça ters bir mikroskop altında görmek için plaka dokunun. </li><li> Hücreler tamamen ayırmak, MSCGM orta 8 mL ve 15 mL konik bir tüp içine hücre çözümü toplamak. Bir haemocytometer hücrelerin sayısı ve hasat hücrelerinin toplam sayısını 10 mcL alın. </li><li> Plaka kaplanmamış doku kültürü plakaları hücreleri 10.000 hücre / cm 2 MSCGM orta kullanarak bir tohumlama yoğunlukta. Inkübatör tabak yerleştirin ve her 2-3 günde bir MSCGM orta ile onları beslemek. </li></ol> Sonraki pasajlar için bu yordamı yineleyin. Hücre popülasyonu genişletilmiş olarak geçiş sayısının takip edin. MKH pasajlar 4-8 arasında kullanılır. 4. Kollajen / Fibronektin / Fibrinojen Çözüm hücreler tabanda (Gün 0) 0.8x10 6 ECFCs ve 1.2x10 6 MKH her implant ve fare için gerekli olacak; deney öncesinde, kültürün yeterince ECFCs ve MKH olmadığından emin olun. <ol><li> Her kültürün plaka orta aspire hücreler ve 10 ml PBS ile yıkayın. PBS çıkarın ve her biri 100 mm plaka için 2 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Tripsin-EDTA çözeltisi eşit dağıtmak için plakalar yavaşça sallayın. 3-5 dakika inkübe edin. Süspansiyon müstakil hücreler yavaşça ters bir mikroskop altında görmek için plaka dokunun. </li><li> Hücreler tamamen ayırmak, DMEM orta 8 mL ve 15 mL konik bir tüp içine hücre çözümü toplamak. Bir haemocytometer hücrelerin sayısı ve ECFCs ve MKH hasat toplam sayısı 10 mcL alın. </li><li> Transfer 4x10 6 ECFCs (5x 0.8x10 6 hücre) ve tek bir 50 mL konik tüp halinde bir araya 6x10 6 MPCs (5x 1.2x10 6 hücre). Bu beş ayrı implantlar ve fareler için gerekli hücrelerin toplam miktar. 1200 rpm&#39;de santrifüj ve süpernatantı kaldırmak. </li><li> Yavaşça, kollajen / fibronektin çözüm (3 mg / ml son fibrinojen) 0.9 mL 100 uL Fibrinojen çözüm eklemek; karışımı buz üzerinde tutmak. </li><li> Buz gibi kolajen / fibronektin / fibrinojen solüsyonu 1 ml hücre pelletini tekrar; kabarcıkları önlemek için hücrelerin karışımı çok nazikçe. 1 ml steril enjektör içine karışımı yerleştirin ve 26-gauge iğne, şırınga ucundaki kapağı ile bir yerde. Enjeksiyona kadar buz üzerinde yüklü şırınga tutun. </li></ol> 5. Immünyetmezligi Nude Fare içine enjeksiyon (Gün 0) Tüm hayvan deneyleri 6 haftalık atimik nude (nu / nu) fareler ile yapılacaktır. <ol><li> Enjeksiyon öncesinde, bir gaz odasına izofluran teslim yerleştirerek bağışık yetmezliği olan farelere uyutmak. (Muayene ile kalp atım monitörü), anestezi ve ayak tutam tepkisiz kadar yaklaşık 2 dakika boyunca farelerin izofluran teneffüs izin verin. </li><li> Her fare için 50 mcL trombin solüsyonu (10 U / ml), 26-gauge iğne kullanılarak üst dorsal bölge subkutan enjekte edilir. </li><li&gt; Aynı yerde trombin enjekte edildi, 200 mcL 26-gauge iğne kullanılarak hücre karışımı enjekte edilir. Kollajen jel 37 ° C ve fibrinojen trombin varlığı fibrin jel formu olacak. Sonuç olarak, implant, küçük, ama kayda değer oluşturmalıdır cilt altında tutabilirim. </li><li> Enjeksiyondan sonra, rahatlık ve sıcaklık için bir katman üzerine gazlı bez farelerin yeri ve ayaktan olana kadar onları gözlemlemek. Sonra sonra, ilk üç gün için günlük farelerin gözlemliyoruz. </li></ol> 6. Hasat (7. Gün) <ol><li> Bir hafta enjeksiyondan sonra fareler, bir gaz odasına sıkıştırılmış CO 2 gaz teslim yerleştirerek euthanize. </li><li> Bir kez ötenazi, enjeksiyon alanında yakın deri kesilerek açılır ve cerrahi jel fişi çekin. Bir ölçekte alınan jel fişlerinin dijital fotoğraf tavsiye edilir. </li><li> Hasat jel fişler histolojik kaset içine yerleştirin ve derin onları% 10 nötr gece oda sıcaklığında formalin solüsyonu. </li><li> Fiksasyon sonra, nötr distile H 2 O ile formalin solüsyonu% 10 yıkayın ve histolojik kasetleri yerde 4 ° C kadar histolojik değerlendirme PBS. </li></ol> 7. Değerlendirme: Histoloji (H &amp; E) ve (hCD31 İmmünohistokimya) <ol><li> Histolojik değerlendirme için, implantlar, parafin ve standart histolojik prosedürlerini kullanarak (7 mikron kalınlığında kesitler) kesitli gömülür. </li><li> Implantlar orta kesiminde alınan Hematoxilin ve Eosin (H &amp; E) boyanan kesitler değerlendirilmesi ile mikrovasküler dansite sayısal olmalıdır. H &amp; E boyama için standart protokoller başka bir yerde bulunabilir. Mikrodamarlar kırmızı kan hücreleri içeren lumenal yapılar olarak tespit edilebilir. Ortalama sayısı, kırmızı kan hücre dolu damarlarının / mm 2 olarak analiz ve ifade edilen alanlardan mikrodamarlar mikrodamarlar yoğunluğu Raporu . </li><li> Mikrovasküler gemileri, alınan implant bölümleri insan doğası immünohistokimyasal göstermek için özel bir insan CD31 (hCD31) standart boyama protokollerini kullanarak antikor ile boyanmış olmalıdır. 1:100 dilüsyon; DakoCytomation (kedi # M0823 Clone JC70A) monoklonal fare anti-insan CD31 antikoru kullanmanızı öneririz. Bu antikor insan özgüllük paralel 7,11 boyandı fare doku kesitlerinde bir çeşitlilik ile elde edilen negatif reaksiyon tarafından teyit edilmiştir. Notu, fare kan damarları genellikle (özellikle sınır civarında) implantlar içinde görülür, ancak fare gemiler, bu antikor ile pozitif leke yapmaz. Buna ek olarak, CD90 veya α-düz kas aktin (α-SMA) karşı insan-spesifik antikorların varlığı insan MSC ile immünohistokimyasal boyama ile tespit edilebilir. İnsan MSC, yeni oluşan kan damarlarının perivasküler bölgede ve interstisyel implant 11 boyunca bulunan iki bulunur . </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig1.jpg" /> Şekil 1. ECFC ve MSC kültürlerinin Tipik bir görünüm . Faz kontrast mikrograflar kültür ECFCs ve MKH tipik bir görünüm gösterir. (A) endotel hücreleri karakteristik parke taşı morfolojisi gösteren kordon kanı türevi ECFCs konfluent tek tabaka. (B) İnsan kemik iliği MKH bir mil şekli morfolojisi gösteren türetilmiştir. Ölçekleyici barlar, 200 um. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig2.jpg" /> Şekil 2. 7 gün eksplante fişlerinin Görünüm. İnsan kordon kanı türevi iliği kaynaklı MKH ECFCs ve kemik kollajen / fibronektin / fibrin jel gömülü ve metinde açıklandığı gibi çıplak farelere subkutan implante edildi. (A) 7 gün sonra, fare ötenazi edildikten sonra cilt enjeksiyon alanı yakınında açmak, kesmek ve cilt saygısız hücre / jel fiş maruz. (B) fişi Görünüm fare ve formalin fiksasyonu önce ameliyatla çıkarıldı. Implantın kırmızı renk vaskülarizasyonun bir göstergesidir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig3.jpg" /> Şekil 3. Eksplante fişler vasküler ağ histolojik tanımlama. Eksplante fişlerinin orta kesiminde alınan Hematoxilin ve Eosin (H &amp; E) boyanan kesitler. (A) çevreleyen ana dokuların bağlamda (yani, yağ dokusu ve iskelet kası) implant (sarı kesikli çizgi ile işaretlenmiş) Düşük büyütme (10x) mikrografı. (B) Yüksek büyütme (40x) mikrografı fişi içinde görüntüleyerek birden fazla mikrodamarlar (sarı ok ucu bazıları işaret); mikrodamarlar kırmızı kan hücreleri içeren lumenal yapılar olarak tespit edilebilir. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig4.jpg" /> Şekil 4. Insan İmmünohistokimyasal kimlikeksplante fişler orta kısmından lümen. İmmünohistokimyasal boyanan kesitler alınmıştır. 1:100 dilüsyon; Boyama DakoCytomation (kedi # M0823 Clone JC70A); bir monoklonal fare anti-insan CD31 (hCD31) antikoru kullanılarak gerçekleştirilen hücre çekirdekleri hematoxilin ile zıt. (A) konak dokuları çevreleyen bağlamında implant (siyah bir kesik çizgi ile tasvir) Düşük büyütme (10x) mikrografı. İnsan özgü, CD31 pozitif mikrodamarlar kahverengi lekeli (peroksidaz boyama). (B) Yüksek büyütme (40x) mikrografı fişi içinde birden fazla insan mikrodamarlar (siyah ok ucu bazı hCD31 olumlu lümen işaret).

<ol>
	<li>Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13.+An+in+vivo+experimental+model+for+postnatal+vasculogenesis.">Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis.</a> Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).</li><li>Koike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering:+creation+of+long-lasting+blood+vessels.">Tissue engineering: creation of long-lasting blood vessels.</a> Nature. 428, 138-139 (2004).</li><li>Schechner, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+formation+of+complex+microvessels+lined+by+human+endothelial+cells+in+an+immunodeficient+mouse.">In vivo formation of complex microvessels lined by human endothelial cells in an immunodeficient mouse.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97, 9191-9196 (2000).</li><li>N&amp;ouml, r., E, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+functional+human+microvessels+in+immunodeficient+mice.">Engineering and characterization of functional human microvessels in immunodeficient mice.</a> Lab Invest. 81, 453-463 (2001).</li><li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood.">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> J Clin Invest. 105, 71-77 (2000).</li><li>Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood.">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104, 2752-2760 (2004).</li><li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+vasculogenic+potential+of+human+blood-derived+endothelial+progenitor+cells.">In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Blood. 109, 4761-4768 (2007).</li><li>Au, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+in+vivo+potential+of+endothelial+progenitor+cells+from+human+umbilical+cord+blood+and+adult+peripheral+blood+to+form+functional+long-lasting+vessels.">Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels.</a> Blood. 111, 1302-1305 (2008).</li><li>Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem/progenitor+cell+principals.">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li><li>Traktuev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Functional+Vascular+Network+Formation+In+Vivo+by+Cooperation+of+Adipose+Progenitor+and+Endothelial+Cells.">Robust Functional Vascular Network Formation In Vivo by Cooperation of Adipose Progenitor and Endothelial Cells.</a> Circ Res. 104, 1410-1420 (2009).</li><li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+robust+and+functional+vascular+networks+in+vivo+with+human+adult+and+cord+blood-derived+progenitor+cells.">Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells.</a> Circ Res. 103, 194-202 (2008).</li><li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Myeloid+Cells+Are+Necessary+for+Creating+Bioengineered+Human+Vascular+Networks+In+Vivo.">Host Myeloid Cells Are Necessary for Creating Bioengineered Human Vascular Networks In Vivo.</a> Tissue Eng Part A. 16, 2457-2466 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu biyomühendislik insan damar ağları deneysel bir model. Bu modelin ana özellikleri şunlardır: 1) mikrodamarlar doğum sonrası dokular (örneğin, kan ve kemik iliği) izole insan hücrelerden oluşur; 2) mikrodamarlar yetişkin bir hayvanın oluşan ve 3) mikrodamarlar öncesi ortaya çıkmaz varolan tek hücrelerin uygun bir jel askıya de novo (ana bilgisayar) damarların, ancak bunun yerine oluşur, . Anjiyogenez Bu testte, fare damarsal bağlantıları, kırmızı kan hücresi dolu kaplar, bu testte fonksiyonel okuma biri elde etmek için gerekli, çünkü önemli bir rol oynar. Buna ek olarak, ana bilgisayar miyeloid hücrelerin gün erken transplantasyon sonrası implant işe ve onlar yeni damar yatağı 12 oluşumu için gereklidir. Bu deneysel model, in vivo insan damar ağları post-natal oluşumunu incelemek için çok yönlü, ölçülebilir ve nispeten daha basit bir model sistem sunmaktadır. Ayrıca, bu testte gerçekleştirmek için basit ve bir kesi veya cerrahi işlem gerektirmez. Bu model, insan endotel ve perivasküler hücreleri farklı kaynaklardan vaskülojenik potansiyelini incelemek için kullanılabilir. Anti-ve / veya pro-vaskülojenik bileşikler için ekran için model olabilir. Son olarak, model insan endotel oluşan damar ağının oluşumu ve işlev olarak belirli genlerin rolü (ler) çalışma için kullanılabilir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Endotel Bazal Orta, EBM-2 </td><td> Lonza </td><td> CC-3156 </td><td></td></tr><tr><td> EGM-2 SingleQuot takviyeleri </td><td> Lonza </td><td> CC-3162 </td><td></td></tr><tr><td> Streptomisin çözüm, 100x GPS Glutamin-penisilin- </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 30-009-CI </td><td></td></tr><tr><td> Mezenkimal Kök Hücre Büyüme Orta BulletKit MSCBM / MSCGM </td><td> Lonza </td><td> PT-3001 </td><td></td></tr><tr><td> Yüksek glukoz Dulbecco&#39;nun Modifiye Eagle Orta, 1x DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-073 </td><td></td></tr><tr><td> MEM Sigara esansiyel amino asit çözeltisi, 100x NEAA </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> Yüksek glikoz Dulbecco&#39;nun Modifiye Kartal, toz DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100-046 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes Tampon çözümü </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Cultrex Sığır Kollajen I çözüm </td><td> Trevigen </td><td> 3442-050-01 </td><td></td></tr><tr><td> Cultrex İnsan Fibronektin </td><td> Trevigen </td><td> 3420-001-01 </td><td></td></tr><tr><td> Fibrinojen gelen sığır plazma </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F8630-1G </td><td></td></tr><tr><td> Jelâtin </td><td> Balıkçı </td><td> DF0143-17-9 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;nun fosfat tamponlu tuzlu su, PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin-EDTA çözeltisi, 1x </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Inhalasyon izofluran, sıvı </td><td> Buxter Sağlık Corporation </td><td> NDC 10019-360-40 </td><td></td></tr><tr><td> Sığır plazma gelen Trombin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T4648-1KU </td><td></td></tr><tr><td> Formalin Çözüm Nötr Tamponlu </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> Monoklonal Fare İnsan Anti-CD31 antikor </td><td> DakoCytomation </td><td> M0823 </td><td> Klon JC70A </td></tr></tbody></table>

bioengineering human microvascular networks in immunodeficient mice

, Doku mühendisliği ve doku rejenerasyonu için hücre tabanlı tedaviler gelecekte muhtemelen in vivo fonksiyonel damar ağları oluşturmak için yeteneği üzerinde de durulacaktır. Bu bağlamda, deneysel modeller için arama in vivo kan damarı ağı oluşturmak için, büyük önem 1 taşımaktadır . Insan doku türetilen olgun endotel hücreleri (EC) 2-4 kullanarak in vivo biyomühendislik mikrovasküler ağlarının fizibilitesi ilk gösterildi; Ancak, bu geniş klinik kullanım için otolog endotel hücreleri mevcut sorunlar, elde etmek ve yeterli miktarda gerektirir zor çünkü Mevcut damarsal hasat. Bu sınırlamalar, EC diğer kaynaklar için arama öngörüyordu. Kimlik koloni oluşturan endotel kan hücreleri (ECFCs), non-invaziv elde etmek için bir fırsat sundu 5-7 EC . Biz ve diğer yazarlar, yetişkin ve kordon kanı türevi ECFCs in vivo 7-11 fonksiyonel damar ağları oluşturmak için kapasiteye sahip olduğunu göstermiştir . Daha da önemlisi, bu çalışmalar aynı zamanda istikrarlı ve dayanıklı damar ağları elde göstermiştir ki, ECFCs perivasküler hücreleri ile co-implantasyon gerektirir. Biz burada açıklamak testi bu kavramı gösterir: fonksiyonel bir insan formuna kollajen / fibronektin / fibrinojen jel tek bir hücre süspansiyonu, kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreler (MKH) ile kombine edilebilir nasıl insan kordon kanı türevi ECFCs immünyetmezligi bir fare içine implantasyon sonrası 7 gün içinde damar ağı. Ev sahibi eritrositler içeren insan ECFC çizgili lümen varlığı sadece bir damar ağı oluşumunu (de novo), aynı zamanda ana dolaşım sistemi ile fonksiyonel anastomozlar gelişme gösteren implantlar boyunca görülebilir. Bu fare kaldırılmıs insan vasküler ağ modeli, ideal insan damar ağı oluşumunu, hücresel ve moleküler mekanizmaları üzerinde çalışmalar ve mühendislik dokular vascularize için stratejiler geliştirilmesi için uygundur.

Watch this Scientific Journal Video about Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice at JoVE.com

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

Burada, biz insan kordon kanı endotel koloni oluşturan hücrelerin (ECFCs -) ve kemik iliğinden elde edilen bağışık yetmezliği olan farelere subkutan kollajen / fibronektin jel gömülü mezenkimal kök hücreler (MKH), teslim etmek için bir metodoloji tarif Bu hücre / jel kombinasyonu, fare damarsal ile bağlayan bir insan bir damar ağı oluşturur.

Bağışık yetmezliği olan farelere Biyomühendislik İnsan Mikrovasküler Ağları

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

bioengineering-human-microvascular-networks-in-immunodeficient-mice

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K Görüntüleme.  Harvard Medical School. Burada, biz insan kordon kanı endotel koloni oluşturan hücrelerin (ECFCs -) ve kemik iliğinden elde edilen bağışık yetmezliği olan farelere subkutan kollajen / fibronektin jel gömülü mezenkimal kök hücreler (MKH), teslim etmek için bir metodoloji tarif Bu hücre / jel kombinasyonu, fare damarsal ile bağlayan bir insan bir damar ağı oluşturur.

Video: Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Teşhis Araçları Geliştirmek İçin Mikro-Elektro-Mekanik Sistemler (MEMS)

Biyoloji

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-Lenfosit Yakalama HIV için Disposable mikroakışkan Chip

Title Cell Encapsulation by Droplets

Droplets tarafından Başlığı Hücre Kapsülleme

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development of constructs for tissue engineering. This environment better mimics what cells observe in vivo, compared to standard tissue culture, due to the tissue-like properties and 3D environment. Synthetic polymeric hydrogels are water-swollen networks that can be designed to be stable or to degrade through hydrolysis or proteolysis as new tissue is deposited by encapsulated cells. A wide variety of polymers have been explored for these applications, such as poly(ethylene glycol) and hyaluronic acid. Most commonly, the polymer is functionalized with reactive groups such as methacrylates or acrylates capable of undergoing crosslinking through various mechanisms. In the past decade, much progress has been made in engineering these microenvironments - e.g., via the physical or pendant covalent incorporation of biochemical cues - to improve viability and direct cellular phenotype, including the differentiation of encapsulated stem cells (Burdick et al.).
The following methods for the 3D encapsulation of cells have been optimized in our and other laboratories to maximize cytocompatibility and minimize the number of hydrogel processing steps. In the following protocols (see Figure 1 for an illustration of the procedure), it is assumed that functionalized polymers capable of undergoing crosslinking are already in hand; excellent reviews of polymer chemistry as applied to the field of tissue engineering may be found elsewhere (Burdick et al.) and these methods are compatible with a range of polymer types. Further, the Michael-type addition (see Lutolf et al.) and light-initiated free radical (see Elisseeff et al.) mechanisms focused on here constitute only a small portion of the reported crosslinking techniques. Mixed mode crosslinking, in which a portion of reactive groups is first consumed by addition crosslinking and followed by a radical mechanism, is another commonly used and powerful paradigm for directing the phenotype of encapsulated cells (Khetan et al., Salinas et al.).

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

We present protocols for the 3-dimensional (3D) encapsulation of cells within synthetic hydrogels. The encapsulation procedure is outlined for two commonly used methods of crosslinking (michael-type addition and light-initiated free radical mechanisms), as well as a number of techniques for assessing encapsulated cell behavior.

Doku Mühendisliği 3D Hidrojeller Hücresel Kapsülleme

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves required for peristalsis and mediate neuronal input from the enteric nervous system1. Different subtypes of ICC form distinct networks in the muscularis of the GI tract 2,3. Loss or injury to these networks is associated with a number of motility disorders4. ICC cells express the KIT receptor tyrosine kinase on the plasma membrane and KIT immunostaining has been used for the past 15 years to label the ICC network5,6. Importantly, normal KIT activity is required for ICC development5,6. Neoplastic transformation of ICC cells results in gastrointestinal stromal tumor (GIST), that frequently harbor gain-of-function KIT mutations7,8. We recently showed that ETV1 is a lineage-specific survival factor expressed in the ICC/GIST lineage and is a master transcriptional regulator required for both normal ICC network formation and for of GIST tumorigenesis9. We further demonstrate that it cooperates with activating KIT mutations in tumorigenesis. Here, we describe methods for visualization of ICC networks in mice, largely based on previously published protocols10,11. More recently, the chloride channel anoctamin 1 (ANO1) has also been characterized as a specific membrane marker of ICC11,12. Because of their plasma membrane localization, immunofluorescence of both proteins can be used to visualize the ICC networks. Here, we describe visualization of the ICC networks by fixed-frozen cyrosections and whole mount preparations.

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are the pacemaker cells of the gastrointestinal (GI) tract. They form complex networks between smooth muscle cells and post-ganglionic neuronal fibers to regulate GI contractility. Here, we present immunofluorescence methods cross-sectional and whole-mount visualization of murine ICC networks.

Farelerde Cajal (ICC) Ağ İnterstisyel Hücreler Görselleştirme

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are pluripotent, thus having the potential to differentiate into multiple lineages. Such properties make ESCs extremely attractive for cell based therapy and regenerative treatment applications 1. However for its full potential to be realized the cells have to be differentiated into mature and functional phenotypes, which is a daunting task. A promising approach in inducing cellular differentiation is to closely mimic the path of organogenesis in the in vitro setting. Pancreatic development is known to occur in specific stages 2, starting with endoderm, which can develop into several organs, including liver and pancreas. Endoderm induction can be achieved by modulation of the nodal pathway through addition of Activin A 3 in combination with several growth factors 4-7. Definitive endoderm cells then undergo pancreatic commitment by inhibition of sonic hedgehog inhibition, which can be achieved in vitro by addition of cyclopamine 8. Pancreatic maturation is mediated by several parallel events including inhibition of notch signaling; aggregation of pancreatic progenitors into 3-dimentional clusters; induction of vascularization; to name a few. By far the most successful in vitro maturation of ESC derived pancreatic progenitor cells have been achieved through inhibition of notch signaling by DAPT supplementation 9. Although successful, this results in low yield of the mature phenotype with reduced functionality. A less studied area is the effect of endothelial cell signaling in pancreatic maturation, which is increasingly being appreciated as an important contributing factor in in-vivo pancreatic islet maturation 10,11.
The current study explores such effect of endothelial cell signaling in maturation of human ESC derived pancreatic progenitor cells into insulin producing islet-like cells. We report a multi-stage directed differentiation protocol where the human ESCs are first induced towards endoderm by Activin A along with inhibition of PI3K pathway. Pancreatic specification of endoderm cells is achieved by inhibition of sonic hedgehog signaling by Cyclopamine along with retinoid induction by addition of Retinoic Acid. The final stage of maturation is induced by endothelial cell signaling achieved by a co-culture configuration. While several endothelial cells have been tested in the co-culture, herein we present our data with rat heart microvascular endothelial Cells (RHMVEC), primarily for the ease of analysis.

The current study describes a directed differentiation approach in inducing pancreatic differentiation of human embryonic stem cells. Of great significance is the finding that endothelial cell co-culture mediates maturation of human embryonic stem cell derived pancreatic progenitors into insulin expressing cells.

İnsan Embriyonik endotel hücre Co-kültür aracılık Olgunlaşma Bir Yönetmen Farklılaşma Yaklaşım Pankreas insülin üreten hücreler için Kök Hücre

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are ...

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the cell is affected by external signals (e.g. drug treatment), or how cells differ between a healthy state and a diseased state. With the advent and continuous refinement of next-generation DNA sequencing technology, RNA-sequencing (RNA-seq) has become an increasingly popular method of transcriptome analysis to catalog all species of transcripts, to determine the transcriptional structure of all expressed genes and to quantify the changing expression levels of the total set of transcripts in a given cell, tissue or organism1,2 . RNA-seq is gradually replacing DNA microarrays as a preferred method for transcriptome analysis because it has the advantages of profiling a complete transcriptome, providing a digital type datum (copy number of any transcript) and not relying on any known genomic sequence3.
Here, we present a complete and detailed protocol to apply RNA-seq to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is based on our recent published study entitled "RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin,"4 in which we successfully performed the first complete transcriptome analysis of human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin using RNA-seq. It yielded unprecedented resources for further experimentation to gain insights into molecular mechanisms underlying thrombin-mediated endothelial dysfunction in the pathogenesis of inflammatory conditions, cancer, diabetes, and coronary heart disease, and provides potential new leads for therapeutic targets to those diseases.
The descriptive text of this protocol is divided into four parts. The first part describes the treatment of human pulmonary microvascular endothelial cells with thrombin and RNA isolation, quality analysis and quantification. The second part describes library construction and sequencing. The third part describes the data analysis. The fourth part describes an RT-PCR validation assay. Representative results of several key steps are displayed. Useful tips or precautions to boost success in key steps are provided in the Discussion section. Although this protocol uses human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin, it can be generalized to profile transcriptomes in both mammalian and non-mammalian cells and in tissues treated with different stimuli or inhibitors, or to compare transcriptomes in cells or tissues between a healthy state and a disease state.

This protocol presents a complete and detailed procedure to apply RNA-seq, a powerful next-generation DNA sequencing technology, to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is generalizable to various cells or tissues affected by different reagents or disease states.

RNA-seq Trombin-tedavi içinde Transcriptomes Analizi ve Kontrol İnsan Pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Mutlak Protein Niceleme Kütle Spektrometresi İzleme Seçilen Tepki

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in mammals. However, humans cannot oxidize cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid to cytidine monophosphate-N-glycolylneuraminic acid due to a primary exon deletion of the CMAH gene. To understand the effects and implications of the lack of CMAH activity in more detail, a Cmah knock-out model in mice is of keen interest in basic and applied research. The analysis method to determine the phenotype of this mouse model is herein described in detail, and is based on the detection of both N-acetylneuraminic acid and N-glycolylenuraminic acid in the liver and milk of wild-type and Cmah knock-out mice. Endogenous sialic acids are released and derivatized with o-phenylenediamine to generate fluorogenic derivatives, which can be subsequently analyzed by HPLC. The presented protocol can be also applied for the analysis of milk and tissue samples from various other origins, and may be of use to investigate the nutritional and health effects of N-glycolylneuraminic acid.

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

We describe a HPLC-based method for the determination of N-acetylneuraminic acid and N-glycolylenuraminic acid in mouse liver and milk.

Karaciğer ve Süt örneklerinde vahşi tipli ve sialik asitler tayini ve<em&gt; CMAH</em&gt; Knock-out Fare.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in ...