Support in Massimo Santoro lab come from HFSP, Marie Curie Action, Telethon and AIRC. We thank Dafne Gays and Emiliano Panieri for critical reading of the manuscript.

Araçların ve Çalışma Çözümleri 1. Hazırlanması <ol><li> Balık su çözeltisi hazırlayın. Damıtılmış su, 50 ml deniz tuzları &quot;Instant Ocean&quot; 2 g eriterek bir stok çözeltisi yapın. Balık suyu (60 ug / ml nihai konsantrasyon deniz tuzu) kullanıma hazır hazırlamak için 1 L damıtılmış su stok balık su 1.5 ml ilave edilir. Kullanımdan önce balık suyu kullanmaya hazır otoklavlayın. Bu çözüm, zebra balığı, embriyo ortamı olarak kullanılır. </li><li> Embriyo montaj için metilselüloz hazırlayın. Balık steril 50 ml su içinde 1.5 g metilselüloz çözülür. Bir karıştırıcı plaka üzerinde bir mıknatıs kullanılarak erimesini kolaylaştırmak. Tozun tam çözünme birkaç saat gerekebilir. Küçük tüpler içine netlik ve kısım için çözüm kontrol edin. Ay boyunca -20 ° C&#39;de saklayın ve kullanımda alikotları çözülme. Kullanmadan önce, 5 dakika boyunca 950 x g&#39;de santrifüje metilselüloz. Alikotların donma-erime döngülerinden kaçınmak. </li><li> Tricaine / etil 3-aminobenzoat m, 50 ml hazırlamak100 ml su içinde, 200 mg tricaine eritilmesi ve Tris-HCl, 1 M (pH 9) ile pH 7.0 &#39;ye ayarlanması ile etansülfonat tuzu (stok çözelti). En fazla 30 gün boyunca 4 ° C&#39;de, bu stok saklayın. DİKKAT: tricaine toksiktir. Uygun kullanım talimatlarına uygun olarak kullanın. </li><li> Zebra balığı embriyolar oksidatif stres yaratmadan <ol><li> Genel oksidatif stres oluşumu için bir oksitleyici çözelti hazırlayın: H 2 O 2 stok çözeltisi (hidrojen peroksit, 100 mM) eklenmesi ile oksidan, çözelti 50 ml olun balık su. 2 mM ile 100 uM arasında bir nihai konsantrasyon 2 H O 2 kullanın. Kısa bir süre kullanımdan önce bu çözüm hazırlayın. Oksidan, çözelti, bütün montaj ROS-algılama ve tek hücreli ROS-algılama yöntemlerinin her ikisine de uygulanabilir. Bu çözüm saklamayın. DİKKAT: H 2 O 2, tehlikeli ve solunduğunda zararlıdır ve yutulduğunda. Yanıcı maddelerle temasında yangına neden olabilir. Davlumbaz altında işlemek ve uygun pers giymekÖnal koruyucu ekipman. </li><li> Mitokondri türevi oksidatif stres oluşumu için bir oksitleyici çözelti hazırlayın: dimetil sülfoksit (DMSO) içinde bir 2 ml rotenone 3.9 mg çözülmesiyle bir oksidan stok çözeltisi (5 mM) olun. Karanlıkta, oda sıcaklığında, bu çözüm tutun. <ol><li> Çözümü kullanmak için hazır hale getirmek için balık suda 10 ml rotenone stok solüsyonu çözülür. 5-50 uM arasında bir konsantrasyonda rotenon kullanın. 100 uM daha yüksek konsantrasyonlarda rotenon kullanmayın. Uygun konsantrasyonlarda, bu oksidan, çözelti, bütün montaj ROS-algılama ve tek hücreli ROS-algılama yöntemlerinin her ikisine de uygulanabilir. DİKKAT: Rotenone zehirli ve tehlikelidir. Uygun önlem ifadeleri göre tutun. </li></ol></li><li> Gen tarafından oksidatif strese neden knock-down: Knock-down nrf2a gen ifadesini Zebra balığı embriyolarının morfolinodur mikroenjeksiyon tarafından önceden Timme-Laragy A. ve diğerleri, 2012 38 tarafından bildirilen.. </li><li> Oxid Inducedoku hasarı sonrası stres Ative:. önceden Niethammer ve ark, 2009 39 tarafından açıklandığı gibi 72 hpf Zebra balığı embriyolarının kuyruk yüzgecinin bir yara marjı oluşturur. </li></ol></li><li> Tek hücre ROS-saptama yöntemi için ROS-algılama çözeltisi 5 ml hazırlanması: <ol><li> Bir çalışma çözeltisi (: 2.5-10 uM konsantrasyon aralığı) hazırlamak amacıyla, HBSS (Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi) &#39;de genel ROS-duyarlı molekül prob eritin: Genel ROS tespiti için çözümü. Bu çözüm, kısa bir süre kullanımdan önce hazırlanmış olmalıdır. </li><li> Mitokondri tarafından uyarılan özgü saptama ROS Çözüm: kullanımdan hemen önce, DMSO, 5 mM stok çözelti yapma ile bir mitokondriyal ROS duyarlı probu çözülür. Bir çalışma çözeltisi (: 2.5-10 uM konsantrasyon aralığı) hazırlamak amacıyla HBSS içinde stok çözeltisi çözülür. NOT: ROS-algılama çalışma çözümleri ışık ve oksijen maruz kalma ve kendi stok çözümleri kaçının. Kullanılarak ışık tüpü korumakbir alüminyum folyo. Saklamak veya HBSS&#39;de çözülmüş yeniden kullanımı sondalar etmeyin. Bir ay boyunca -20 ° C &#39;de stok çözelti saklayın. DİKKAT: Uygun kurallarına uygun bir davlumbaz altında moleküler problar ve DMSO&#39;yu tutun. </li></ol></li><li> Bütün montaj ROS-saptama yöntemi için ROS-algılama çözeltisi 5 ml hazırlayın: bir çalışma çözeltisi (: 2,5-5 uM konsantrasyon aralığı) hazırlamak amacıyla, HBSS (DMSO içinde stabilize edilmiş) genel ROS duyarlı probu stok çözeltisi içinde çözündürülür. Işık ve oksijen maruz kalmaktan kaçınınız. Işıktan tüp koruyun. Kullanmadan önce bu çözüm hazırlayın. Bu çözümü saklamak veya yeniden kullanmayın. DİKKAT: Uygun kurallarına uygun bir davlumbaz altında moleküler problar taşıyınız. </li><li> PBS 1x 15 ml cenin sığır serumu 10 mi eklenerek Durdurma Solüsyonu 25 ml olun. Steril çözüm tutun. 4 ° C &#39;de, bu çözüm Mağaza ROS algılama yöntemi - Bu çözüm sadece tek bir hücre için gereklidir. </li><li> 28 ve at Zebrafish hava inkübatör ayarlayın# 176; C. </li><li> Tek hücre ROS-saptama yöntemi boyunca 4 ° C&#39;de santrifüj ayarlayın. </li></ol> 2.. Yetişkin Balıkların Çiftleşme ve Zebra balığı Embriyolar Seçimi <ol><li> Set-up yetişkin zebrabalıkları çifti standart protokollere göre 40 haçlar. Spesifik deneysel ihtiyaçlarına uygun olarak, uygun transjenik çizgi seçin. </li><li> Yumurta toplamak ve balık su / embriyo orta ile 90 mm çanak içine koyun. Embriyolar geliştirmek ve istenilen gelişimsel aşamada büyüyecek kadar 28 ° C&#39;de yumurta tutmak (örneğin, 48 hpf, 72 hpf; hpf: saat sonra döllenme). </li><li> Embriyoların geliştirilmesi için ekran. Tüm döllenmemiş yumurta veya az gelişmiş embriyolar dışlamak. </li><li> 50 ml su içinde balık tricaine (stok çözelti) içinde 1 ml ilave etmek suretiyle embriyolar anestezisi. </li><li> Stereomicroscope altında Tg floresan embriyolar seçin. </li></ol> Oksidan Agent ile Embriyoların 3. Tedavisi <ol><li> 48 saat arasında en az 30 embriyolar kullanınpf ve 72 farklı durum başına HPF. Tricaine çıkarmak için taze balık iki kere su ile embriyolar yıkayın. </li><li> Üç yemeklerin içine floresan embriyolar Split. En fazla 30 embriyo / çanak koymak. </li><li> Yıkama çözeltisini çıkarın ve oksidan, çözelti 10 ml ya da kontrol çözeltisi gibi balık su 10 ml ekleyin. </li><li> 28 ° C&#39;de 1 saat 10 dakika boyunca inkübe embriyolar Kuluçka süresi, belirli dokularda indüklendiği oksidatif stres düzeyine göre değişir. Oksidatif stres etkilenen hücreleri ilerleyici hücre ölümünü geçmesi gibi kısa dönemler iyisidir. </li><li> Dönen tarafından HBSS ve yıkama embriyoları içeren yeni bir çanak içine embriyolar transfer. 28 ° C&#39;de önceden sıcak HBSS </li></ol> 4.. Tüm Dağı ROS Algılama Yöntemi <ol><li> Oksidan tedaviden sonra embriyolar toplayın ve küçük bir tüp içinde en fazla 10 embriyolar koydu. HBSS ile mümkün olduğu kadar yıkayın. Alüminyum folyo kullanarak ışık tüpü koruyun. </li><li> ROS için algılama çözeltisi 1 ml ilave edilirHer bir tüp. </li><li> Işık maruz kalmasını önlemek için 28 ° C&#39;de 15 dakika boyunca karanlıkta inkübe embriyolar. </li><li> Inkübasyon süresi boyunca bütün embriyo analizi için bir cam slayt hazırlar. Bir &quot;depresyon&quot; cam slayt metilselüloz 300 ul koyun ve bir pipet ile cam yüzeye yayılır. Metilselüloz bırakırken kabarcıkları kaçının. </li><li> İnkübasyon süresi sonunda, hemen ROS algılama çözüm kaldırmak ve 2 ml HBSS ile iki kez yıkayın. Tüpü birkaç kez baş aşağı çevirerek embriyolar yıkayın. Pipet veya vorteks etmeyin. </li><li> Kadar cam Pasteur pipet içine aspire embriyolar. Pipet açılışına yakın ve yavaşça pozisyon embriyolar metilselüloz içine bunları çıkarın. Ince naylon hattı ile uygun embriyolar yönlendirmek. </li><li> Tedavi edilen embriyolar ile embriyo kontrol floresan karşılaştırın. Tüm embriyolar aynı kullanarak görüntülü böylece Alternatif olarak, flöresanlı bir stereomikroskop veya konfokal mikroskop parametrelerini saptamakgörüntüleme ayarları. </li></ol> 5.. Tek Hücre ROS-algılama Yöntemi <ol><li> 3.5: aşama başlatın. Her durum için en az 35 embriyo var emin olun. </li><li> Yeni bir çanak içine embriyolar aktarın. Balık suya mümkün olduğunca kaldırın. Buz soğukluğunda PBS 1x 10 ml ve Proteaz İnhibitörleri Kokteyl 400 ul ekleyin. Elle forseps ile embriyolar dechorionate ve ince bir iğne ile yumurta sarısı çuval çıkarın. Not: sarısı çuval Çıkarma aşağıdaki FACS analizi için temiz örnekleri sağlar. Bu adım, FACS alet uygun bir biçimde yok edilebilir. </li><li> Aktarım de-yolked, 24 oyuklu çoklu gözenekli plakanın içine embriyolar (15 embriyo / çukur) ve tüm balık suyu çıkarmak. </li><li> HBSS 300 ul, 30 ul kolajenaz P, her bir oyuğa 50 ul tripsin-EDTA ekleyin. </li><li> Sıkı bir pipet (1.000 ul) ile hafifçe yukarı pipetleme ve aşağı embriyolar homojenize. </li><li> 20 dakika boyunca 28 ° C&#39;de inkübe edilir ve her 5 dakikada pipetleme örnekleri homojenize edilmiştir. </li><li> Doku DISR edinbileşik mikroskobunda homojenat bir kısım gözlemleyerek uption. Pipetleme tek hücre süspansiyonu kolaylaştıracak. Fazla 30 dakika boyunca embriyolar inkübe etmeyin. </li><li> Durdurma Solüsyonu 200 ul ilave ederek reaksiyonu durdurun. Hafifçe pipetleme karıştırın. </li><li> Dar bir tabana sahip önceden soğutulmuş bir tüp içine hücre süspansiyonu aktarın. Buz üzerinde tüp tutun ve ışık maruz kalmaktan kaçının. </li><li> 4 ° C&#39;de 250 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj </li><li> Hafifçe pipetleme buz HBSS ile üst faz ve yeniden askıya hücreleri çıkarmak. </li><li> Hücrelerin sayısı ve sizin tüm örneklerde hücrelerin aynı numara olduğundan emin olun. Az 2 x 10 6 hücre kullanmayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 250 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj hücreleri </li><li> Süpernatantı ve ROS duyarlı probu içeren buz gibi soğutulmuş HBSS 1 ml pelet askıya. </li><li> Karanlıkta 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin tüpü. Oksidatif stres seviyesine göre inkübasyon süresi değişebilir ve tProbun o hassasiyeti. </li><li> Bir FACS tüpü hücreleri aktarın. Buz üzerinde tüpler tutmak ve FACS analizden önce ışık maruz kalmaktan kaçının. </li><li> Bir floresan-aktive edilmiş hücre ayırıcı (FACS) hücreleri sıralar. Tg doku floresan (örneğin, GFP) ve ROS tespiti (örneğin, belirli mitokondriyal ROS-duyarlı sondalar, genel ROS-duyarlı problar) için kullanılan moleküler prob uyarma / emisyon spektrumları uygun set dalga boyları. </li><li> Her bir durum için, aynı FACS ayarlarını uygulayarak, aynı deneysel oturumdaki tüm örneklerini ölçmek. Farklı biyolojik kez tekrarlanan deneyin ortalaması olarak floresan hücrelerin yüzdesini hesaplayın. Her bir durum için en az iki analiz çoğaltır. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Kritik Adımlar Burada tarif zebra balığı embriyolar oksidatif stres saptanması için prosedür, iki farklı yöntem ihtiva eder. Tek hücre ROS-saptama yöntemi (Şekil 1), daha özel niceliksel ölçümlerini sağlar iken bütün montaj ROS-saptama yöntemi, esas olarak ROS-nitel olarak saptanması için bir deneydir. Her iki yöntem de Zebra balığı embriyolarının üzerinde in vivo ROS-algılama değerlendirmek için hızlı ve kolay bir yol sunar. Ancak, h...

Oksidatif stres özellikle dengesiz hücresel redoks durumundan kaynaklanan bir durum olarak tanımlanır. Rutin hücrelerin içinde meydana kompleksinin redoks reaksiyonları hücresel redoks-durumunu belirlemek. Redoks reaksiyonları azaltma ve molekül (yani redoks reaksiyonları) oksidasyonunu üreten biyolojik moleküllerin atomları arasında elektron transferinde oluşan, kimyasal reaksiyonlar oluşur. Bu reaksiyonlar, bir uç yapı kararsızlık ve komşu biyomoleküllerle alışverişi dengesiz elektron kendiliğinden aktivasyonu ile karakterize edilir elektronik aktif bir tür (örneğin pro-oksidatif türleri) ile katalize edilir. Bu düzensiz reaksiyonlar DNA hasarı, protein karboksilasyon ve lipid oksidasyon haline neden ve sonuçta hücre ölümüne 1. yol açar. Oksidatif stres seviyelerinin artması yaşlanma ve farklı patolojik durumların 2&#39;nin ilerlemesi ile ilişkilendirilmiştir. Oksidatif stres vardiyabet, kalp-damar hastalıkları 3,4 vasküler değişikliklerden sorumlu olduğu bildirilmiştir. Ayrıca, Alzheimer hastalığı nöronal dejenerasyon önemli bir rol oynar ve Parkinson hastalığı 5. Ayrıca, oksidatif stres kanser ilerlemesini ve metastatik olayları 6,7 yöneten kritik bir faktör olarak kanıtlanmıştır. Buna ek olarak, enflamasyon ve immün yanıtları ortaya ve diğer destek oksidatif stres 8 olabilir. Veya nitrojen (RNS; reaktif nitrojen türleri); canlı hücreler olarak, pro-oksidatif oksijen türleri (ROS reaktif oksijen türleri) türetilir. (H 2 O 2) ve hidrojen peroksit - (O 2) ROS superoksit anyon (. OH) hidroksil radikali içerir. Birincil RNS nitröz oksit (NO). Olduğunu. İkinci reaktif türlerin bir dizi betwee kendiliğinden etkileşimleri ile üretilebilirn ROS ve RNS veya ücretsiz metaller 9 iyonların. H 2 O 2 Fe2 + hidroksil radikalleri meydana ile reaksiyona sokulması sırasında, - örneğin, süperoksit anyon peroxynitrate (ONOO) oluşturmak için azot oksit ile reaksiyona girer. ROS ve RNS nedeniyle çok biyomoleküller ile tepkimeye yetenekleri için, fizyolojik redoks durumuna 10 bakımı için tehlikeli bir tehdit olarak kabul edilir. Korumak için redoks durumu hücreleri, anti-oksidan moleküllerini ve detoksifiye edici enzimler, bir dizi ile donatılmıştır. . 11 - süperoksit dismutaz (SOD), katalaz, glütatyon peroksidaz ve Peroxiredoxins esas H2O 2, OH ve Oono de dahil olmak üzere pro-oksidatif türlerden hücresel koruma sağlayan, anti-oksidan enzimatik-cephanelik oluşturmaktadır. Ayrıca C vitamini ve E, polifenoller ve CoEnzymeQ10 (CoQ10) gibi anti-oksidan moleküller ROS ve tehlikeli DE gidermek için kritik öneme sahip12,13 türevleri üzerinde. Bununla birlikte, ROS ve RNS, ya da anti-oksidan sisteminde bir fonksiyon bozukluğu, aşırı üretimi oksidatif stres 14 doğru hücresel redoks durumunu değiştirir. Onların olumsuz çağrışım yanı sıra, ROS farklı kökenli hücrelerde çeşitli fizyolojik roller oynayabilir. Hücreler normalde böyle konak savunma ve yara onarımı 15-17 gibi normal biyolojik olaylara aracılık için sinyal molekülleri olarak ROS üretir. Reaktif türlerin normal sinyalizasyon faktörleri, büyüme faktörleri, ve kalsiyum seviyeleri 18,19 hücre içi dalgalanmalara tepki olarak bu NOx (NADPH oksidaz) ve XO (ksantin oksidaz) gibi hücre içi enzimlerin hücrelerinde üretilir. Bu ROS diferansiyel örneğin p53 ya da ATM-kinaz, DNA hasarı 20 için cevabın bir ana regülatör olarak, hücresel bileşenler olarak önemli bir nükleer faktör aktivitesini modüle edebilir olduğu bildirilmiştir. Benzer ROS kuvvetle inci aracılık ederek hücresel sinyalizasyonu etkileyebilire oksidasyon ve sinyal iletimi 21 arasında önemli bir düzenleyici olarak oluşturulan protein tirozin fosfatazlar (PTP), inaktivasyonu. Ayrıca, proteomik göre yöntemler RNS aynı zamanda spesifik protein modifikasyonları ve moleküler sinyallemesinin değişikliklerden sorumlu olduğunu göstermektedir. S-RNS nitrothiols (SNO) içine değiştirerek ve bu enflamatuar ve otoimmün hastalıklarda 22,23 gibi patolojik durumları ile birlikte moleküler yolları tetikleme sistein tiyol grupları ile reaksiyona girmektedir. Hücre kültürü deneyleri sadece kısmen in vivo etkili faktörlerin sayıda yeniden beri, hayvan modellerinde 24,25 redoks çalışmalar gerçekleştirmek için büyük ilgi olduğunu. Bunu başarmak için, zebra balığı oksidatif stres dinamiklerini 26 incelemek için uygun bir omurgalı hayvan modeli olarak kabul edilmiştir. Zebra balığı çeşitli avantajları omurgalı dev sırasında hücresel ve genetik olayları incelemek için izin veren yeni bir model sistemelopment ve hastalık. Embriyolarının büyük kümeler deneysel ihtiyaçları için haftalık oluşturulur ve mevcut olabilir. Ayrıca Zebra balığı embriyolarının olağanüstü optik netlik, hem de kendi küçük boyutu, bütün organizmalar 27 tek hücre görüntüleme ve dinamik bir izleme sağlar. Son on yılda, zebra balığı mutantlar önemli sayıda kanser ve genetik hastalıklar 28-31 gibi insan patolojik durumları modellemek için oluşturulan edilmiştir. En önemlisi, transjenik soylarda çok sayıda genetik ve biyolojik manipülasyonlar 32 arasında geniş olanaklar sağlamak için hazırlanmıştır. Örneğin, transgenik dokuya özgü zebra balığı hatları düzenli olarak in vivo çalışmalar için kullanılmaktadır. Bu hatlar, in vivo olarak, tek hücreleri tanımlamak için yeteneği, hem de bu ihtiva anatomik yapısını sunan seçilen bir promoterin kontrolü altında bir floresan proteini ifade eder. Çeşitli toksikolojik çalışmalar zaten t kullanmışo ilaç keşfi ve oksidatif stres 33-35 alanında için bir hayvan modeli olarak, bu omurgalının uygunluğunu gösteren, redoks homeostazı ile ilgili kimyasalların in vivo etkisini değerlendirmek için zebra balığı. Bazı floresan probları Zebra balığı larvaları 36,37 oksidatif stresi izlemek için test edilmiş olsa da, Zebra balığı dokulardaki oksidatif stres düzeyleri ve yaşam hücreleri algılamak ve ölçmek için hiçbir kurulmuş tahliller vardır. Burada zebrafish embriyoların canlı hücreler oksidatif stres in vivo ölçümü için bir prosedür tarif eder. Görüntüleme araçları, FACS, flüoresan probları ve pro-oksidatif koşullar her zebra balığı embriyolar ve dokularda oksidatif türlerinin saptanması ve miktarının belirlenmesi için basit bir deney oluşturmak için birleştirilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1261">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:285px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:528px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hydrogen peroxide solution</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">516813</td>
			<td>DO NOT STORE DILUITIONS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution 1X</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Methyl cellulose</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">M0387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture</td>
			<td style="width:147px;">INSTANT OCEAN</td>
			<td style="width:285px;">SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tricaine</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Cgeneric ROS-sensitive probe:&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; CellROX Deep Red Reagent</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">C10422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX&#160;</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">M36008</td>
			<td>dissolve one vial with 13&#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hydroethidine</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">D23107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Rotenone</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">R8875</td>
			<td>Prepare 5mM stock solution in DMSO.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine</td>
			<td style="width:147px;">EnzoLifeScience</td>
			<td>BML-EI395</td>
			<td>dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Propidium Iodide&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Molecular probes&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (Life Technologies)&#160;</td>
			<td>P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">7-aminoactinomycin D (7-AAD)&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Molecular probes&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (Life Technologies)&#160;</td>
			<td>A1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Nrf2a Morpholino</td>
			<td style="width:147px;">GeneTools</td>
			<td style="width:285px;">5&#39;-CATTTCAATCTCCATCATGTCTCAG-3&#39;</td>
			<td>Ref: Timme-LaLaragy et al; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al; 2002(PMID:12167159 )</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase P</td>
			<td style="width:147px;">ROCHE</td>
			<td>11213857001</td>
			<td>Dissolve the powder at 100mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">10010-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:147px;">ROCHE</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td>Dissolve one tablet in 1ml of water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">15400-054</td>
			<td>Prepare 1X working solution before usage</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Compound microscope&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stereo microscope with fluorescent illumination</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:285px;">AZ100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">camera&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;">AxioCamMRm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">software for fluorescence image acquisition</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;">ZEN 2011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescence-activated cell sorter</td>
			<td style="width:147px;">BD FACSCalibur</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:285px;">5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FACS tubes&#160;</td>
			<td style="width:147px;">BD</td>
			<td>342065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiwell Plate&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Sterilized, non treated Petri dishes 90mm</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:285px;">391-1915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:147px;">Leica</td>
			<td style="width:285px;">Leica SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of oxidative stress in zebrafish embryos

Reaktif oksijen türlerinin (ROS) yüksek düzeyde oksidatif stres durumuna karşı hücresel redoks durumunda bir değişikliğe neden olabilir. Bu durum, moleküllerin (yağ, DNA, protein) oksidasyonuna neden olur ve hücre ölümüne yol açar. Oksidatif stres de etkiler, diyabet, retinopati, nörodejenerasyon ve kanser gibi çeşitli patolojik koşulların ilerlemesi. Bu nedenle, tek hücre düzeyinde değil, aynı zamanda bütün organizmaların bağlamında sadece oksidatif stres koşulları araştırmak için araçlar tanımlamak önemlidir. Burada, bu tür çalışmalar gerçekleştirmek ve in vivo oksidatif stresi ölçmek için bir protokol mevcut in vivo sisteminde yararlı olarak Zebra balığı embriyo düşünün. &quot;I) oksidatif stres nitel ölçümü için&quot; bütün embriyo ROS-algılama yöntemi &quot;ve ii): floresan ROS prob ve zebra balığı transgenik floresan hatlarının yararlanarak, in vivo oksidatif stresi ölçmek için iki farklı yöntem geliştirmekoksidatif stres kantitatif ölçümleri için, tek hücreli bir ROS algılama yöntemi &quot;. Burada, oksitleyici maddeler ve fizyolojik ya da genetik yöntemlerle dokularda oksidatif stresi artırarak bu işlemlerin etkinliğini göstermektedir. Bu protokol, ileri genetik ekranlar için müsait olan ve bu tür nörolojik bozukluklar ve kanser gibi oksidatif stresle ilgili patolojiler hayvan modellerinde ROS adresi neden-sonuç ilişkilerini yardımcı olacaktır.

Burada anlatılan yöntemi uygulayarak, kolayca ölçebilir ve zebra balığı embriyonik dokularda oksidatif stres (ve ROS seviyelerini) algılar. Yetişkin zebrafish geçtikten sonra, yumurta toplandı ve 72 saat sonrası fertilizasyon (hpf) 28 ° C&#39;de gelişmeye bırakıldı. Güçlü pro-oksidan reaktifleri ile embriyoların 1) tedavi veya doku yaralanma sonrası 2) teşvik ROS oluşumu: oksidatif strese neden amacıyla, iki farklı yaklaşımı öneriyoruz. Hidrojen peroksit (2...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos at JoVE.com

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Zebra balığı Embriyolar Oksidatif Stres Analizi

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

analysis-of-oxidative-stress-in-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

37.0K Görüntüleme.  University of Torino. Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses. 

Video: Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biyoloji

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Gen Fonksiyon Analiz Zebra balığı Embriyolar Mikroenjeksiyon

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Transplantasyon Kimerik Zebra balığı Embriyolar Yaratma

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Canlı Zebra balığı Embriyolar iki-Foton-Tabanlı fotoaktivasyon

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Zebra balığı Embriyolar Metabolik Profil Analizi

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Aktif Kaspaz 3 Algılama Tüm montaj immünofloresans tarafından Zebra balığı Embriyolar Apaptozun Analizi

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Zebra balığı Embriyolar Doku spesifik Floresans yarı otomatik Görüntüleme

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Haploit Zebra balığı Embriyolar üretimi ile<em&gt; In Vitro</em&gt; Gübreleme

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Oksidatif Stres Direnci Ölçüm<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 96 oyuklu mikrotiter plakalarında

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively inert because it has two unpaired electrons located in different pi * anti-bonding orbitals. These two electrons have parallel spins, meaning they rotate in the same direction about their own axes. This is why the oxygen molecule is not very reactive. Activation of oxygen may occur by two different mechanisms; either through reduction via one electron at a time (monovalent reduction), or through the absorption of sufficient energy to reverse the spin of one of the unpaired electrons. This results in the production of reactive oxidative species (ROS). There are a number of ways in which the human body eliminates ROS in its physiological state. If ROS production exceeds the repair capacity, oxidative stress results and damages different molecules. There are many different methods by which oxidative stress can be measured. This manuscript focuses on one of the methods named cell gel electrophoresis, also known as &#8220;comet assay&#8221; which allows measurement of DNA breaks. If all factors known to cause DNA damage, other than oxidative stress are kept constant, the amount of DNA damage measured by comet assay is a good parameter of oxidative stress. The principle is simple and relies upon the fact that DNA molecules are negatively charged. An intact DNA molecule has such a large size that it does not migrate during electrophoresis. DNA breaks, however, if present result in smaller fragments which move in the electrical field towards the anode. Smaller fragments migrate faster. As the fragments have different sizes the final result of the electrophoresis is not a distinct line but rather a continuum with the shape of a comet. The system allows a quantification of the resulting &#8220;comet&#8221; and thus of the DNA breaks in the cell.

Comet assay measures DNA breaks, induced by different factors. If all factors (except oxidative stress) causing DNA damage are kept constant, the amount of DNA damage is a good indirect parameter of oxidative stress. The goal of this protocol is to use comet assay for indirect measurement of oxidative stress.

Sistemik Oksidatif Stresin bir Dolaylı Tedbir olarak Comet Assay

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...