Şekil 5A gösterilen dendritler izlemek için Grace Dion;; Bu eser Biz de cerrahi işlemler için yardım Matthew Petrella teşekkür Ulusal Göz Enstitüsü R01EY017925 ve R21EY020985 ve Dana &amp; Whitehall Kuruluşlar PK fonlarından hibe tarafından desteklenen ve Pratik Chhatbar için yazması üzerine yorumlar.

1. Cerrahi Hazırlık <ol><li> Anestezi øndükle ve sürekli kalp atışlarının izlenmesi, tidal CO 2, EEG, ve sıcaklık bitirmek. Tüm prosedürler Güney Carolina Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve biz daha önce 9,15 yayınlanan bu esas alındı. </li><li> Bistüri ile cilt keserek kafatasının dorsal yüzeyi Açığa. Bir Brudon küret kullanarak kemiği örten bağ dokuları diseke. Pamuk uçlu aplikatörler ve pamuklu gazlı bez kullanılarak kemik temizleyin. Küçük elçisi damarlar yoluyla zaman zaman kanamayı durdurmak için, kafatası kemik balmumu (gerektiği gibi) uygulayın. </li><li> Siyah boya (Malzeme bakınız) ile karıştırılır diş çimento kullanılarak kafatası (kraniotomi yapılacağı ilgi bölge üzerinde) bir titanyum veya paslanmaz çelik kafa plakası takın. Kafa plakasının merkezinde bir dikdörtgen açılması kranyotomi için erişim sağlar ve optik görüntüleme. Baş levha üstüne bir metal haznesi takın. Bu haznesi suya daldırma objektif lens ile görüntüleme için bir sıvı rezervuar olarak hizmet verecek. </li><li> Metal mesajları kullanarak bir xy aşamasına Baş levha sabitleyin. </li><li> Bir diş matkap kullanılarak headplate dikdörtgen şeklindeki açılış içinde kemik geniş bir alanda ince. Inceltilmesi alan iyi planlanmış kraniotomi sınırlarının ötesine genişletmek gerekir. Kraniotomi yerinde, kemik kalınlığı coverglass ve neokortikal yüzeyi arasındaki agaroz kalınlığı dikte edecek, çünkü yüksek çözünürlüklü görüntüler neokorteks elde edilmesi halinde kemirgen olmayan memeli kalın kafatası (aşağıya bakınız) inceltilmiş olmalıdır . </li><li> Kraniotomi için kemik bir 2 x 2 mm kare anahat delin. Kemik kırıkları kaldırmak ve altta yatan kortekse ısı dağılımını en aza indirmek için yeni yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) ile periyodik odası durulayın. Gerektiği gibi zaman zaman kanamayı durdurmak için, kemik mum uygulayın. </li><li> Lift # 3 forseps ile kemik flep. </li><li> Tüm ama bir ince forseps (# 5CO) ve Vannas yay makas kullanılarak dura alt katmanı kaldırın. Kemirgen olmayan memelilerde, dura kalın, opak, fakat ayrı tabakalar halinde çıkarılabilir. Kanama nadir, ancak Gelfoam ile durdurulabilir ve her kan kalıntı yavaşça dura forseps kullanılarak ve ACSF ile durulama kalan tabaka kaldırılması gerekir. Dura son kat şeffaf ve pial damarları aracılığıyla açıkça görünür olmalıdır. Intrinsik sinyal görüntüleme sırasında dura bu son tabaka intakt bırakılması (Tartışma bakın) deney sonraki iki-foton görüntüleme aşaması için floresan kalsiyum göstergelerin toplu yükleme başarı oranını artıracaktır. </li><li> Sıcak% 2&#39;lik agaroz (ACSF çözünmüş) bir damla uygulayın ve hemen kraniotomi üzerinde coverglass yerleştirin. Solunum ve kardiyovasküler pulsasyonu cerrahi bir mikroskop veya bir oküler ile en az olmasını sağlamak için kontrol kranyotomi ikiAydınlık-alan modu foton mikroskop. </li></ol> 2. İçsel Sinyal Optik Görüntüleme <ol><li> Intrinsik sinyal görüntüleme sırasında kurumasını önlemek için agaroz coverglass dış çevresinde ACSF ile ıslatılmış jel köpüğü ekleyin. </li><li> Iki foton mikroskobu (Şekil 1) üstüne standart C-mount noktasına intrinsik sinyal görüntüleme CCD kamera takın. Xy aşamada (Şekil 1A) yakınındaki hava masaya aydınlatıcı ışık kaynağı yerleştirin. Konumu ve kraniotomi ve headplate / odası (Şekil 1B) üzerinde ışık kılavuzları sabitleyin. Içsel sinyalleri için gerekli olan yansıyan kırmızı ışık, CCD kamera (Şekil 1 C-D) göre kranyotomi doğrudan geçecek şekilde ana renk değişikliği ve C montaj noktası aşağıda ayna çekin. 4x hava nesnel (0.13 NA, 17 mm WD), Görüş 2 x 2 mm alanını kullanarak intrinsik sinyal görüntüleme için kullanılabilir. </li><li> L&#39;de bir ısı filtre eklemeısıtma korteks önlemek için kilo yolu. Yeşil ışık (546 nm merkezi λ) ve kortikal yüzey kan damarlarının bir dijital referans görüntü kaydetmek geçer bir filtre kullanın. </li><li> Kortikal yüzey altında 500 um z odağı taşıyın. Içsel sinyalleri ölçmek için korteks aydınlatmak için kırmızı bir filtre (630 nm merkezi λ) kullanın. Kortikal yüzey düzgün yandığını tür ışık kılavuzları yerleştirin. Görsel görüntüleme uyarıcı tarafından üretilen ışık kranyotomi koruyun. Görsel uyaranlara ve kayıt yansıma verileri görüntüler bir dizi sunun. 10 dakika içinde bir oryantasyon haritası oluşturmak için, 8 uyaranlara (Her yön için 4 yönelimleri ve iki yönde) bir dizi 4 tekrarlar karşılık gelen veri toplamak. </li><li> Yanlış bir renk yönelim haritasını oluşturmak için intrinsik sinyal verilerini analiz edin. Nöronların iki foton etiketleme, örneğin, oryantasyon fırıldak tekilliklerin için potansiyel hedef bölge seçin - harita noktaları neredeTüm tercih yönelimleri (Şekil 2A) birleşir. Yönelim harita ve kortikal yüzey damar (Şekil 2B-C) görüntü bindirmesi. Büyük kan damarları ve arteriyoller 15 olan yerlerde kaçınarak, bir hedef seçmek için fonksiyonel alanları ve geniş yüzey damarlarının konumu düzenini kullanın. </li></ol> 3. Floresan Kalsiyum Göstergeler Toplu Yükleme <ol><li> 5 ul DMSO içinde 1 g Pluronic eklenmesi ile% 20 Pluronic / DMSO çözeltisi hazırlayın. Pluronic tamamen çözünmesi için 10 dakika boyunca 60 ° C&#39;de karışım ısıtılır. Karışım, oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Floresan kalsiyum gösterge Oregon Green 488 Bapta-1:00 (AM OGB-1), 50 ug şişeye Pluronic / DMSO karışımına 4 ul ekle. Sonra bir kırmızı boya (Alexa Fluor 594, 2 mM stok çözeltisi) ve 1 ul OGB-01:00 1 mM nihai konsantrasyon için pipet çözelti 35 ul (Malzeme bakın). ½ saat için çözelti sonikasyonsoğutulmuş bir su banyosu ve ardından kirleri çıkarmak için filtreyi bir 0.45 mikron ile santrifüjlenir. </li><li> 2.0-2.5 mikron dış uç çapı ile uzun konik pipet çekin. Pipet içine boya karışımı 5 ul yerleştirin. </li><li> Pipet ekleme kolaylaştırmak ve yüksek kalitede iki foton görüntü elde etmek için dura son katmanı kaldırın. </li><li> Pipet kortikal katman 2/3 &#39;hedefine ulaşmak amacıyla oturtulması gerektiği kortikal yüzey üzerinde yerini belirleyin. Bizim önceden kortikal hedef yönlendirmesi harita (Şekil 2) bir fırıldak tekillik olduğunu. Pipet odasının duvar ve nesnel arasındaki geçmek için bir 30 ° açıyla korteksin içine yönlendirilmesi gerekir. Böylece, 200 mikron kortikal yüzeyin altında hedef bölge etiketlemek için, kortikal yüzey üzerinde pipet giriş pozisyonuna hedef pozisyon (Şekil 3 AB) yanal yaklaşık 350 mikron olacaktır. </li><li> (Xy sahne üzerinde hareket ettirin hayvan ve pipette mikromanipülatör merkezi objektif (Şekil 3C) altında kortikal yüzey giriş pozisyonuna) yerleştirilir. Pipet kolayca kraniotomi duvar boyunca nesnel veya kemik dokunmadan korteks girecek olmasını sağlamak için en az 3 mm (Malzeme bakınız) bir çalışma mesafesi (WD) ile 20x veya 40x objektif kullanın. Giriş pozisyonuna hedefi altında ortalanmış sonra, 2 mm (Şekil 3B) tarafından objektif Z konumunu yükseltmek. Yeşil epi-floresan ışık pipet içinde kırmızı Alexa boya görselleştirmek açıkken, (ucu merkezli kadar doğrudan kortikal yüzey giriş pozisyonuna yukarıda hedefi altında (ve odaklanmış) pipet hareket mikromanipülatör ve çapraz eksen kullanın Şekil 3E). </li><li> Sürekli ocu aracılığıyla pipet izlerken pipet, kortikal yüzey (Şekil 3F) ulaşana kadar pipet dikey (z ekseni boyunca) indirinmikroskop lars. Aydınlık alan aydınlatma kullanarak, kortikal yüzey kan damarları ve kalan meningeal membran (pia ve araknoid) pipet kortikal yüzey yaklaşırken kolayca görülebilir. Pipet istenilen giriş pozisyonuna ulaşamazsa, pipet yükseltmek ve kortikal yüzeyde vasküler görülecek dayalı hedefleme recalibrate. </li><li> Nesnel çıkarın, kraniotomi gelen aşırı beyin omurilik sıvısı fitil ve tiftiksiz emilim spears kullanarak komşu kemikte kurulayın. Kraniotomi (Şekil 3G) aracılığıyla görünür korteks dengelemek için ılık% 3 agaroz (ACSF çözünmüş) bir damla uygulayın. Kemirgen olmayan,% 3 agaroz nöronlar tarafından floresan boyalar başarılı bir şekilde alımı için pulsasyonu kırmak için gereklidir. % 2 agaroz ve coverglass kombinasyonu gerekli stabilite sağladığından intrinsik sinyal optik görüntüleme için sadece% 2&#39;lik agaroz gereklidir. Burada, herhangi bir coverglass% 3 agaroz böylece boya yükleme adımı için, malzemenin,gereklidir. Agaroz katılaşmış sonra ACSF ile odası, 40x objektif takın (0.8 NA, 3,3 mm WD) ve yeniden doldurun. </li><li> Parlak alanında iki foton görüntüleme geçin ve pipet bulun. Ucu korteks (Şekil 3H), istenen derinliğe ulaşıncaya kadar mikromanipülatör bir çapraz eksen kullanarak, pipet hareket eder. Boya karışımı (bir kaç psi her darbenin 0.1 sn) Arasıra basınçlı ejeksiyon ponponları tıkanmasını pipet önlemeye yardımcı olacaktır. KGB-1 yalnızca hücre girdikten sonra görünür hale AM ​​Çünkü, kırmızı Alexa boya korteks içindeki pipet ucu görselleştirme için kritik öneme sahiptir. </li><li> Pipet derinliği onaylamak için kortikal yüzey üzerinde yeniden odaklanmak, boyanın tam doz ile objektif kortikal katman 2/3 nöronların yüklemek ve ucu düzeni esas hedef konumda olduğundan emin olmak için çalışmadan önce yüzey kan damarları. Pipet katman 2/3 &#39;de ise, boya karışımının küçük Puffs yanmalıdırekstrasellüler boşluğa ve koyu gölgeler gibi dairesel hücre gövdeleri yoğun bir derleme ortaya koymaktadır. </li><li> Korteks 300-600 mikron çaplı bir küre nöronal hücre gövdeleri yüklenmesi için, 30-90 bakliyat, her nabız 1.0 sn, 2-10 psi kullanarak ekstrasellüler boşluğa boya karışımı enjekte. Basınç sinyalleri doku taşınacak şekilde güçlü olmamalıdır. Enjeksiyon işlemi tamamlandıktan sonra, bir kaç dakika bekleyin, daha sonra, pipet ve objektif çıkarın. KGB-1 nöronlar tarafından tamamen alınan-up yapılacak AM izin 1 saat bekleyin. </li><li> Boya yükleme için kullanılan agaroz çıkarın ve kayıt oda durulama. Yüzey üzerinde% 2-3 agaroz küçük bir damla koyun ve hızlı bir kranyotomi üzerinde bir coverglass yerleştirin. Floresan boyalar ışığa duyarlı olduğundan, parlak alan veya epi-floresan ışık korteks fazla maruz bırakmaktan kaçının. Xy sahne kullanarak hedefi altında objektif sahibi ve yeniden merkezi etiketli kortikal bölgeye yüksek NA (1.0) 20x objektif yerleştirin. Eski En kraniotomi koruyuntraneous ışık kaynakları, örneğin, görsel uyaran ekran karartma malzemenin çoklu katmanlar kullanarak. </li></ol> 4. Floresan Boyalar Tek hücreli Elektroporasyon <ol><li> Dendritik morfoloji eğitim için 100 mcM Alexa Fluor 594 (2 mM Alexa Fluor 594 stoklar ACSF olarak 01:20 seyreltme) bir solüsyon hazırlanır. Dendritlerin işlevsel görüntüleme için bir OGB tuz 16,17 kullanılabilir. </li><li> 1 mikron bir ipucu boyutu ile uzun konik pipet çekin ve pipet içine boya 5 ul yükleyin. Fonksiyonel bir etki hedefleyen diğer tüm adımları toplu yükleme yöntemi (Şekil 1-3) ile aynıdır. Bir nöron hücre gövdesi zarı bitişik pipet yerleştirmek için, empedans artışı izlemek ve ekstrasellüler alanı aydınlatmak ve iki-foton görüntüleme sırasında gölgeler gibi hücre gövdeleri görmek için boya basınç ponponları uygulayın. </li><li> Pipet, bir nöronal hücre gövdesi zarı bitişik olduğunda, uygulamak için Axoporator 800A kullanın1-3 bakliyat (-8 -10 V, 10 msn nabız). Boya ile nöronun hemen dolgu iki foton mikroskopi ile kolayca görüntülenmiştir. Pipet çıkarın ve in vivo olarak dendrit ve akson yüksek çözünürlüklü görüntüler toplamak. </li></ol>

<ol>
	<li>Blasdel, G. G., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+dyes+reveal+a+modular+organization+in+monkey+striate+cortex.">Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex.</a> Nature. 321, 579-585 (1986).</li><li>Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+cortex+revealed+by+optical+imaging+of+intrinsic+signals.">Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals.</a> Nature. 324, 361-364 (1986).</li><li>Bonhoeffer, T., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iso-orientation+domains+in+cat+visual+cortex+are+arranged+in+pinwheel-like+patterns.">Iso-orientation domains in cat visual cortex are arranged in pinwheel-like patterns.</a> Nature. 353, 429-431 (1991).</li><li>Ohki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+ordered+arrangement+of+single+neurons+in+orientation+pinwheels.">Highly ordered arrangement of single neurons in orientation pinwheels.</a> Nature. 442, 925-928 (2006).</li><li>Shmuel, A., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+for+direction+of+motion+and+its+relationship+to+orientation+maps+in+cat+area+18.">Functional organization for direction of motion and its relationship to orientation maps in cat area 18.</a> J. Neurosci. 16, 6945-6964 (1996).</li><li>Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+with+cellular+resolution+reveals+precise+micro-architecture+in+visual+cortex.">Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex.</a> Nature. 433, 597-603 (2005).</li><li>Li, Y., Van Hooser, S. D., Mazurek, M., White, L. E., Fitzpatrick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience+with+moving+visual+stimuli+drives+the+early+development+of+cortical+direction+selectivity.">Experience with moving visual stimuli drives the early development of cortical direction selectivity.</a> Nature. 456, 952-956 (2008).</li><li>Bonhoeffer, T., Kim, D. S., Malonek, D., Shoham, D., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+the+layout+of+functional+domains+in+area+17+and+across+the+area+17/18+border+in+cat+visual+cortex.">Optical imaging of the layout of functional domains in area 17 and across the area 17/18 border in cat visual cortex.</a> Eur. J. Neurosci. 7, 1973-1988 (1995).</li><li>Kara, P., Boyd, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+micro-architecture+for+binocular+disparity+and+ocular+dominance+in+visual+cortex.">A micro-architecture for binocular disparity and ocular dominance in visual cortex.</a> Nature. 458, 627-631 (2009).</li><li>da Costa, N. M., Martin, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whose+Cortical+Column+Would+that+Be.">Whose Cortical Column Would that Be.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 4, 16 (2010).</li><li>Kaschube, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universality+in+the+evolution+of+orientation+columns+in+the+visual+cortex.">Universality in the evolution of orientation columns in the visual cortex.</a> Science. 330, 1113-1116 (2010).</li><li>Villeneuve, M. Y., Vanni, M. P., Casanova, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+organization+in+area+21a+of+the+cat+revealed+by+optical+imaging:+comparison+with+the+primary+visual+cortex.">Modular organization in area 21a of the cat revealed by optical imaging: comparison with the primary visual cortex.</a> Neuroscience. 164, 1320-1333 (2009).</li><li>Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+mapping+of+single+spines+in+cortical+neurons+in+vivo.">Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo.</a> Nature. 475, 501-505 (2011).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).</li><li>Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+artery-specific+fluorescent+dye+for+studying+neurovascular+coupling.">An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling.</a> Nat. Methods. 9, 273-276 (2012).</li><li>Nevian, T., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+indicator+loading+of+neurons+using+single-cell+electroporation.">Calcium indicator loading of neurons using single-cell electroporation.</a> Pflugers Archiv. 454, 675-688 (2007).</li><li>Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+patch-clamp+recordings+and+single-cell+electroporation+of+unlabeled+neurons+in+vivo.">Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 5, 61-67 (2008).</li><li>Pohl-Guimaraes, F., Krahe, T. E., Medina, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+valproic+acid+exposure+alters+functional+organization+in+the+primary+visual+cortex.">Early valproic acid exposure alters functional organization in the primary visual cortex.</a> Exp. Neurol. 228, 138-148 (2011).</li><li>Bock, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+anatomy+and+in+vivo+physiology+of+visual+cortical+neurons.">Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons.</a> Nature. 471, 177-182 (2011).</li><li>Rochefort, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+direction+selectivity+in+mouse+cortical+neurons.">Development of direction selectivity in mouse cortical neurons.</a> Neuron. 71, 425-432 (2011).</li><li>Mrsic-Flogel, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+regulation+of+eye-specific+responses+in+visual+cortex+during+ocular+dominance+plasticity.">Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity.</a> Neuron. 54, 961-972 (2007).</li><li>Bonhoeffer, T., Grinvald, A., Toga, A. W., Mazziotta, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Imaging+Based+on+Intrinsic+Signals.">Optical Imaging Based on Intrinsic Signals.</a> Brain mapping: The Methods. , 55-97 (1996).</li><li>Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+input+and+output+of+neocortical+networks+in+vivo.">Imaging input and output of neocortical networks in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).</li><li>Hofer, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+connectivity+and+response+dynamics+of+excitatory+and+inhibitory+neurons+in+visual+cortex.">Differential connectivity and response dynamics of excitatory and inhibitory neurons in visual cortex.</a> Nat. Neurosci. 14, 1045-1052 (2011).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz neokorteks önceden belirlenmiş fonksiyonel mikro alanlarda nöronal hücre gövdeleri (ya da dendrit ve akson) ve etiketleme hedeflemek için bir yöntem mevcut. Iki foton mikroskopi ile intrinsik sinyal optik görüntüleme birleştirme sinapslar ve hücrelerin herhangi bir fonksiyonel haritanın mikro-etki katkıda belirleme imkanı sunuyor, ister işlevsel haritası nöronun konumu ve nöronal devre ile nöronal seçicilik korele bileşenleri görsel deneyim 7 veya klinik tedavi edici ilaçlar 1...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 1. Yaşam destek / deney hazırlık </td></tr><tr><td> İzofluran </td><td> Webster Vet </td><td> NDC 57319-474-05 </td><td></td></tr><tr><td> İzofluran buharlaştırıcı </td><td> Midmark </td><td> VIP 3000 </td><td></td></tr><tr><td> Görüşleri düzenlenmiş ısıtma battaniyesi </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 50-7079F </td><td></td></tr><tr><td> EKG monitörü </td><td> Digicare Biyomedikal </td><td> LifeWindow Lite </td><td></td></tr><tr><td> EEG amplifikatör </td><td> AM Sistemleri </td><td> 1800 </td><td></td></tr><tr><td> EEG ekran monitör </td&gt; <td> Hewlett Packard </td><td> 78304A </td><td></td></tr><tr><td> Tidal CO 2 monitör End </td><td> Respironics </td><td> Novametrix Capnoguard 1265 </td><td> Havalandırma optimize </td></tr><tr><td> Kemik sondaj için Karbür matkap çapaklar </td><td> Henry Schein </td><td> ince (0.5 mm uç) ve iri (1.25 mm uç) </td><td></td></tr><tr><td> Headplate / odası için çimento </td><td> Dentsply </td><td> 675.571, 675.572 </td><td></td></tr><tr><td> Siyah Pudra Tempera Boya </td><td> Sargent Sanat A.Ş. </td><td> 22-7185 </td><td> Işık koruyucu geliştirmek için çimento ve yansımaları azaltmak için ekle </td></tr><tr><td> Agaroz - Tip III-A </td><td> Sigma </td><td> A9793 </td><td> Intrinsik sinyal ve iki-foton görüntüleme sırasında titreşimler en aza indirgemek için </td></tr><tr><td> Coverglass: 5 veya 8 mm çapında, 0.17 mm kalınlık </td><td> Yılında Dünya Precisionstruments </td><td> 502.040, 502.041 </td><td> Görüntüleme sırasında titreşimler en aza indirmek için, coverglass gerektiği gibi kesilebilir </td></tr><tr><td> Brudon küretler </td><td> George Tiemann </td><td> 105-715-0, 105-715-3 </td><td> Kafatası yüzeyi temizleme </td></tr><tr><td> Kemik balmumu </td><td> Ethicon </td><td> W31G </td><td> Hızla kanamayı durdurmak </td></tr><tr><td> Pamuk Aplikatör Yatırılan </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimleri </td><td> 72308-05 </td><td> Temiz ve kuru kemik yüzeyi </td></tr><tr><td> Dumont # 5CO Forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11295-20 </td><td> Dura ya pia bulunan bireysel katmanların tut </td></tr><tr><td> Vannas Bahar Makas </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 15000-03 </td><td> Kesim dura </td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Pfizer </td><td> 09-0396-05 </td><td> Dura üzerine kanamayı durdurmak için </td></tr><tr><td> Emilim mızraklar</td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 18105-01 </td><td> BOS Ultra-hızlı ve lifsiz esneklik </td></tr><tr><td> Blackout malzemesi </td><td> Thorlabs </td><td> BK5 </td><td> Kalkanı kraniotomi </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2. Hazırlık / enjeksiyon Boya </td></tr><tr><td> DMSO (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Yeşil 488 Bapta-01:00 </td><td> Invitrogen </td><td> O6807 </td><td> Kalsiyum göstergesi </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A10438 </td><td></td></tr><tr><td> Santrifüj filtre (0.45 mikron gözenek boyutu) </td><td> Millipore </td><td> UFC30HV00 </td><td> Enjeksiyondan önce kirleri çıkarmak için </td></tr><tr><td> Cam pipet çektirmesi </td><td> Sutter Aletleri </td><td> P97 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilikat cam (1.5 mm dış çapı) kılcal filamented </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 1B150F-4 </td><td> Boya ejeksiyon pipet </td></tr><tr><td> Microloader </td><td> Eppendorf </td><td> 5242 956 003 </td><td> Pipeti içine boya yükleme için </td></tr><tr><td> Mikromanipülatör </td><td> Sutter Aletleri </td><td> MP-285 </td><td> Pipet konumlandırmak için </td></tr><tr><td> Basınç darbe kontrolörü </td><td> Parker Hannifin </td><td> PicoSpritzer III </td><td> Boya basınçlı enjeksiyon için </td></tr><tr><td> Tek hücre Elektroporatör </td><td> Molecular Devices </td><td> Axoporator 800A </td><td> Boya elektroporasyon için </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 3. İçsel imaging </td></tr><tr><td> 4x Amaç (0.13 NA, 17 mm WD) </td><td> Olimpos </td><td> UPLFLN4X </td><td></td></tr><tr><td> İçsel donanım / yazılım </td><td> Optik Imaging Inc </td><td> Imager 3001 / VDAQ </td><td> VDAQ yazılım epizodik görüntüleme için kullanılır </td></tr><tr><td> CCD Kamera </td><td> Adimec </td><td> Adimec-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Işık kaynağı güç kaynağı </td><td> KEPCO </td><td> 15-15M ATE </td><td></td></tr><tr><td> Işık kaynağı </td><td> Optik Imaging Inc </td><td> HAL 100 </td><td> Kortikal yüzeyde Işık yoğunluğu 3-5 mW </td></tr><tr><td> Yeşil filtre (vasküler görüntü için) </td><td> Optik Imaging Inc </td><td> λ = 546 nm (bant geçiren 30 nm) </td><td> Yüzey vaskülatürün referans görüntü için </td></tr><tr><td> Kırmızı filtre (intrinsik sinyal için) </td><td> Optik Hayaling A.Ş. </td><td> λ = 630 nm (bant geçiren 30 nm) </td><td> Içsel sinyalleri toplamak için </td></tr><tr><td> Isı filtresi </td><td> Optik Imaging Inc </td><td> KG-1 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 4. İki foton kulesi / görüntüleme </td></tr><tr><td> İki foton mikroskop ve yazılım </td><td> Prairie Teknolojileri </td><td></td><td> Işık yolu, filtreler ve lazer güç için Shen ve ark. 2012 bakın </td></tr><tr><td> Ti: Safir Lazer </td><td> Spectra-Fizik </td><td> Mai Tai XF </td><td></td></tr><tr><td> 20x (0.5 NA; 3,5 mm WD) </td><td> Olimpos </td><td> UMPLFLN20X </td><td> 0.5 NA objektif (değil iki foton görüntüleme için) kraniotomi üzerinde pipet hizalamak için yalnızca kullanılır </td></tr><tr><td> 20x (1.0 NA; 2,0 mm WD) </td><td> Olimpos </td><td> XLUMPLFLN20X </td><td></td></tr><tr><td> 40x (0.8 NA; 3,3 mm WD) </td><td> Olimpos </td><td> LUMPLFLN40X/IR </td><td></td></tr><tr><td> Hava tablosu </td><td> Newport </td><td> ST-200 </td><td> Dış titreşimlerden hazırlık tecridi </td></tr><tr><td> xy sahne </td><td> Mike&#39;ın Machine Co (Attleboro, MA) </td><td></td><td> Xy sahnede konumlandırılmış Deneysel konu ve Sutter mikromanipülatör </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Tarifler </td></tr><tr><td> Yapay beyin omurilik sıvısına </td><td> NaCl (135 mM), KCI (5.4 mM), MgCl2 (1.0 mM), CaCl2 (1.8 mM), HEPES (5 mM), pH 7.4 </td></tr><tr><td> Pipet Çözümü 14 </td><td> NaCl (150 mM), KCI (2.5 mM), HEPES (10 mM), pH 7.4 </td></tr></tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted labeling of neurons in a specific functional micro-domain of the neocortex by combining intrinsic signal and two-photon imaging

Kemirgen olmayan memeli primer görsel korteks, nöronların böyle bir yönelim 1-4, yön 5-7, baskın göz 8,9 ve binoküler eşitsizlik 9 olarak uyarıcı özellikler için kendi tercihinize göre kümelenmiş. Oryantasyon seçiciliği en çok çalışılan bir özelliktir ve tercihli yönelim için bir yarı-periyodik düzeni ile sürekli bir harita tüm primer görsel korteks 10,11 genelinde mevcuttur. Bu işlevsel haritaları uyarıcı seçici yanıtları yol, sinaptik hücresel ve ağ katkıları entegre milimetre mekansal ölçekler için alt-mikron yayılan görüntüleme tekniklerinin hibridizasyon gerektirir. Konvansiyonel intrinsik sinyal optik görüntüleme ile, görsel korteksin tüm yüzeyi boyunca işlevsel haritaların genel düzenini 12 tespit edilebilir. Kalsiyuma duyarlı boyalar kullanılarak in vivo olarak iki-fotonlu mikroskobu gelişme synapt belirlemek için bir olanakic giriş bireysel nöronal hücre gövdeleri 6,14 yüzlerce aynı anda bireysel dendritik dikenler az 13 veya kayıt aktivite gelen. Sonuç olarak, iki foton mikroskopi mikronaltı uzaysal çözünürlüğü ile intrinsik sinyal görüntüleme birleştirerek dendritik segmentleri ve hücrelerin neokorteks herhangi bir fonksiyonel haritanın mikro-etki katkıda bulunduğunu tam olarak belirleme olanağı sunuyor. Burada hızlı bir kortikal yönelim haritasını elde etmek ve bir kemirgen olmayan memeli floresan boyalar ile nöronlar etiketlenmesi için bu işlevsel harita belirli bir mikro-etki hedefleme için yüksek verim yöntemi göstermektedir. Iki foton görüntüleme için kullanılan aynı mikroskop ile önce intrinsik sinyal optik görüntüleme kullanarak bir yönelim haritasını oluşturur. Sonra da etikete boya ile yüklü bir mikropipet kullanarak ilgi bir mikro-etki hedef göstermek nöronal hücre gövdeleri veya etiket dendrit dikenleri ve aksonlar görülebilir böyle bir nöronun bir nüfusavivo. Önceki yöntemler üzerinde Bizim ayrıntılandırmaları neokortikal fonksiyonel mimarisi çerçevesinde alt-hücresel çözünürlük ile nöronal yapı-işlev ilişkilerinin incelenmesi kolaylaştıracaktır.

Bizim boya etiketleme yöntemleri hassasiyeti göstermek için, biz kemirgen olmayan neokorteks bilinen herhangi bir fonksiyonel haritanın küçük mikro-etki hedeflenmiş. Seyrek tekilliklerin olan birincil görsel korteks yönelim harita boyunca noktaladı. Bunların hepsi tercih yönelimleri gibi yakınsama noktalarda meydana geldiğini tercihli yönelim, &quot;fırıldak&quot; (Şekil 2A-B) gibi tekillik göz çevresindeki bölgelerin sahte renk haritalarında. Kraniotomi başına bir fırıldak ö...

Watch this Scientific Journal Video about Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging at JoVE.com

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

Bir yöntem olup, önceden belirlenmiş neokorteks fonksiyonel mikro etki floresan boyalar ile nöronlar etiketleme için açıklanmıştır. İlk olarak, iç sinyal optik görüntüleme fonksiyonel bir harita elde etmek için kullanılır. Sonra iki foton mikroskopi haritanın bir mikro-etki alanı içindeki etiket ve resim nöronlar için kullanılır.

Belirli Fonksiyonel İçsel Sinyal birleştiren tarafından neokorteks Mikro-etki ve İki foton Görüntüleme nöronlar Hedefli Etiketleme

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

targeted-labeling-neurons-specific-functional-micro-domain-neocortex

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K Görüntüleme.  Medical University of South Carolina. Bir yöntem olup, önceden belirlenmiş neokorteks fonksiyonel mikro etki floresan boyalar ile nöronlar etiketleme için açıklanmıştır. İlk olarak, iç sinyal optik görüntüleme fonksiyonel bir harita elde etmek için kullanılır. Sonra iki foton mikroskopi haritanın bir mikro-etki alanı içindeki etiket ve resim nöronlar için kullanılır.

Video: Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Fare Omurilik İki foton Mikroskop kullanarak in vivo Görüntüleme

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Nörobilim

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

Endojen NADH Floresans iki-foton Imaging tarafından Fare Serebral Korteks olarak Microregional Hipoksi Algılama

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograd Floresan Etiketleme Belirlenen Nöronlar gelen Hedefli Hücre dışı Tek ünitesi Kayıt izin verir<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Fare Omurilik Hücresel Dynamics İki foton Görüntüleme

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

Ablasyon nöronal nüfusunun iki fotonlu lazer ve kalsiyum görüntüleme ve davranış kayıt zebra balığı larva kullanarak kendi değerlendirme kullanma

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Vivo Yenidoğan farelerde kortikal nöronların iki fotonlu görüntüleme

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous variability and heterogeneity (age, gender, type of trauma, other possible pathologies, etc.), animal models play a key role in unraveling factors that are limitations in clinical research. They provide a standardized and controlled setting to investigate the biological mechanisms of injury and repair following TBI. However, not all animal models mimic the diffuse and subtle nature of mTBI effectively. For example, the commonly used controlled cortical impact (CCI) and lateral fluid percussion injury (LFPI) models make use of a craniotomy to expose the brain and induce widespread focal trauma, which are not commonly seen in mTBI. Therefore, these experimental models are not valid to mimic mTBI. Thus, an appropriate model should be used to investigate mTBI. The Marmarou weight drop model for rats induces similar microstructural alterations and cognitive impairments as seen in patients who sustain mild trauma; therefore, this model was selected for this protocol. Conventional computed tomography and magnetic resonance imaging (MRI) scans commonly show no damage following a mild injury, because mTBI induces often only subtle and diffuse injuries. With diffusion weighted MRI, it is possible to investigate microstructural properties of brain tissue, which can provide more insight into the microscopic alterations following mild trauma. Therefore, the goal of this study is to obtain quantitative information of a selected region-of-interest (i.e., hippocampus) to follow up disease progression after obtaining a mild and diffuse brain injury.

The overall goal of this procedure is to obtain quantitative microstructural information of the hippocampus in a rat with mild traumatic brain injury. This is done using an advanced diffusion-weighted magnetic resonance imaging protocol and region-of-interest based analysis of parametric diffusion maps.