Name: laser-guided neuronal tracing in brain explants
Uploaded: 2015-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants at JoVE.com

NIH tarafından desteklenen / NIDCD R01 DC 011582. Görüntüleme deneyleri Colorado Anschutz Tıp Kampüsü Gelişmiş Işık Mikroskopi Çekirdek Üniversitesi yapılmıştır NIH / NCRR Colorado CTSI Hibe Numarası UL1 RR025780 ve Rocky Mountain Neurlogical Bozuklukları Çekirdek Merkezi Grant NIH P30NS048154 kısmen desteklenmiştir. Salk Enstitüsü&#39;nden Dr. Sascha du Lac GlyT2-GFP farelerde ile sağladı.

1. Optik Genotiplemesi Fare Pups 1. Optik Genotiplemesi <ol><li> Uygun uyarım dalga boyunda bir lazer işaretleyici kullanılarak ilgili floresan markör ekspresyon için kontrol (burada tarif edilen deneylerde 405 nm) ve dalgaboyu bloke filtre gözlük karşılık gelen, ancak emisyon dalga boyu geçen (450 - Burada tarif edilen deneylerde 700 nm) . Baş ya da fare yavru omurilik arka lazer imlecini (bakınız Şekil 1). Gözleri ve lazer ışığına cildin uzun pozlama içine lazer parlayan kaçının. </li></ol> Yaşlı Hayvanları 2. Optik Genotiplemesi <ol><li> Derin bir intraperitoneal enjeksiyon (120 mg / kg vücut ağırlığı) ile yüksek dozda pentobarbital (burada tarif edilen deneylerde p138 yaş arasındaki p14) fare anestezi. Hayvanın refleksleri kontrol ederek uygun anestezi onaylayın (kısaca th ucu çimdike kulak veya arka ayakları bir kulak veya bacak) geri çekilme refleksi ortaya çıkarmak için. </li><li> Not: Hayvan hala ideal (yani onun kalbi hala atıyor) hayatta olduğu için pentobarbital (120 mg / kg vücut ağırlığı) aşırı dozda kullanılmasına rağmen biz, yerine ötenazi &quot;derin anestezi&quot; olarak enjeksiyon prosedürü bakın ne zaman cerrahi ve perfüzyon başlar. Bu beyin de dahil olmak üzere, iç organlar, daha etkili bir perfüzyon sağlamaktadır. </li><li> Hayvan herhangi refleksleri görünmüyor kez dikkatlice başın arkasını kaplayan deride bir kesi yapmak ve kafatasının Midsection keserek kafatası (Şekil 2A) örten cilt kaldırmak. Lazer ışığına çıkarılan kafatası maruz ve yukarıda açıklandığı gibi filtre gözlüğü ile floresan gözlemleyin. Olumlu bir GFP sinyali görülürse, aşağıdaki ötenazi formu sağlanması / kesilerek yoluyla hayvan kurban değilse ikinci (2. adıma geçin bizimIACUC düzenlemeler). </li></ol> Not: floresan hayvan gözüyle görülebilir (&gt; 1 ay) hatta eski Farelerde. 2. Transcardial Perfüzyon ve Beyin Hazırlık <ol><li> Buz soğukluğunda fosfat tamponlu tuzlu su ile transkardiyal serpmek, büyük ölçüde kan ayrılması için bir 30 G iğne kullanılarak şırınga (PBS NaCl: 10 mM 137 mM, KCl: 2.7 mM, KH 2 PO 4: 1,76 mM, Na 2 HPO 4) hayvan. <ol><li> İlk olarak, dikkatli bir şekilde keskin bir makas ile göğüs kafesi açmak ve ardından kalbin sol ventrikül içine iğne itin. Kalp ve aort içine PBS pompalama ve hemen bu adımı vücudu çıkmak için kan izin makas ile kalbin sağ atrium açmak için aşağıdaki başlayın. Not: Perfüzyon 5 sürüyor - hayvanın büyüklüğüne bağlı olarak 10 dk. </li></ol></li><li> Perfüzyon yoluyla kan kaybından sonra, hayvan başını kesmek pin n başını sabitlemekeedles (veya 30 G şırınga iğneleri) hazırlık tabağına göz çukurları aracılığıyla piercing ve kafatası beyin kaldırmak tarafından. <ol><li> İlk olarak, kafatası kaplanacağı cilt kesmek için keskin bir makas kullanın: Başın arka tarafında küçük bir kesi yapmak, o zaman sadece kaudal hayvanın gözlerinin kenarlarına kesilmiş, kafa sırt tarafında orta hat boyunca kesilir ve kaudal yönde son olarak kesim tamamen başın arka kısmında derinin kapaklarını kaldırın. </li><li> Bu anlamlı sonunda beyin sapının kaldırılmasını kolaylaştırmak çünkü Ardından, kafatası kendisi için aynı kesme desen tekrarlamak, süreç içinde hem cochleas kaldırmak için emin olun. Bu işlemden sonra beyindeki kaudal yarısı tamamen açığa yalan gerekir. </li><li> Bir sonraki adımda, beyincik ila yaklaşık 45 ° ve yaklaşık 2 mm rostral bir açıyla bütün ön beyin kesmek için keskin bir tıraş bıçağı veya neşter kullanmak. Ab ile beynin ayrılmış ön yarısını oymakent spatula. </li><li> Onun rostral sonunda beynin kuyruk yarısını yükseltmek ve daha sonra hala ventral tarafta beyin sapına bağlı kranial sinirlerin kesmek için spatula kullanın. Bir sonuç olarak, beyin sapı da dahil olmak üzere beynin kaudal yarısı hayvanlar için hazırlanmış kafasının geri kalanı kapalı özgürce düşmek gerekir. </li><li> Ventral tarafı ortaya çıkarmak için beynin kaldırıldı kuyruk yarısını çevirin ve yamuk gövdesini içeren ventral bulunan &quot;ampuller&quot; nin (anterograd enjeksiyon için) sadece rostral koronal düzlem boyunca kesme veya (retrograd enjeksiyon için) sadece kaudal (bkz adım 2.3). <ol><li> Daima doku üzerinde aşırı mekanik strese bağlı hücre ölümü en aza indirmek için kesme işlemi için keskin bir jilet veya neşter kullanın. Bir uç Sonuç olarak, uzunluk olarak yaklaşık 1 cm kapsayan ve diğer beyin bölgeleri boyunca tam bir üstün bir bağlantı nipeli kompleksi içeren bir beyin eksplant elde edilmiş olmalıdır. </li></ol></li></ol> &lt;/ li&gt; </ol> Not: Bu protokol işitsel beyin sapı bulunan yamuk vücuda bir izleyici enjeksiyon için prosedürü gösterir. Gerektiği gibi kesme düzlemleri ve enjeksiyon siteleri yerini ve yönünü uyarlayın. Onlar tespit ve beyin kesmeden enjekte edilebilir ve böylece beyin yüzeyine yakın ilgi yalan, bir floresan beyin bölgelerinin (Şekil 2B bakınız), daha sonra koronal kesim aşaması atlanabilir. <ol start="3"><li> Yamuk gövdesinin (VNTB) ventral çekirdeğini içeren iki ventral tanınmış &quot;ampuller&quot; olarak yamuk gövdesini tanımlayın. </li></ol> Not: Bu kesim uçakların yaklaşık stereotaktik konumu ile ilgili ayrıntılı anatomik başvuru için mm Tz &quot;olarak etiketlenmiş yamuk vücudun (= MNTB) medial çekirdeğini gösterir Bregma ~ -5,7 atlas Franklin &amp; Paxinos, 2008. Panel 78 bkz &quot;. Panel 69 Yamuk bo ventral çekirdeğini göstermektedir&quot;MVPO&quot; (medioventral periolivary çekirdek) 19 olarak adlandırılan dy (VNTB). 3. İleriye / Retrograd Takip Not: RT (25 ° C) aşağıdaki prosedürleri uygulayın. <ol><li> 125 mM, KCI: 2.5 mM, MgCI2: 1 mM, CaCl2 0.1 mM, glukoz kesilmesinden sonra, (% 95 O2,% 5 CO2) kesme çözeltisi (NaCl oksijenli içeren bir preparat çanak beyin sapı eksplant yer : 25 mM NaH 2 PO 4: 1,25 mM, NaHCO 3: 25 mM, askorbik asit; 0,4 mM, miyo-inositol: 3 mM, piruvik asit: 2 mM), 30 G şırınga iğneleri ile güvence altına alınmıştır. Enjeksiyon alanı yukarı baktığından emin olun. </li><li> Borosilikat cam enjeksiyon pipetler çekin ve aşağıdaki üç çözümlerden biri onları doldurmak: choleratoxin altbirim-b PBS 12-13 bir Alexa florofora 555 konjuge (özellikle retrograd taşınması için kullanılan), b a) 1.0 mg / ml solüsyon ) bir% 1 -d10,000 MA dekstran-TRITC 555% 0.9 tuzlu su içinde dekstran (esas olarak geriye doğru taşınması için kullanılan 3000 MW) tetrametilrodamin 555 ya da c) bir% 1 -dilution% 0.9 tuzlu su içinde ilution (esas olarak) ileriye taşıma için de kullanılır. <ol><li> 4 çekerek döngüsü - 2.5 ila 3.5 MOhm ve onlar 3 üretilmektedir o enjeksiyon pipet dirençleri aralığı olun. Burada tarif edilen deneyler için, pipet çektirmesi üzerine önceden programlanmış çekerek algoritması seçerek bunu başarmak. </li></ol></li><li> Uygun dalga boyunda bir statik monte lazer pointer kullanarak beyin eksplant Aydınlatmak (Şekil 3A öğe No 2, burada açıklanan deneylerde 405 nm dalga boyu). Enjeksiyonlar için bir rehber olarak lazer pointer kullanın ve floresan etiketli beyin çekirdeğinde veya enjekte edilecek faiz hücreleri lazer ışınını hedefliyoruz. </li><li> 70 - uyumlu filtre gözlük (450 giyerek bulun ve binoküler mikroskop aracılığıyla aydınlatılmış hedef alan gözlemlemekBurada tarif edilen deneyler) &#39;de 0 nm bant-geçiş filtresi. Ilgi alanına mikromanipülatör yoluyla enjeksiyon elektrodu yerleştirin. </li><li> Izleyici madde enjekte edilir. Beyin bölümünde faiz (ROI) bölgeye dik yönlendirilmiş bir basınçlı enjeksiyon cihazı kullanarak, 50 milisaniye her 15 psi basınç darbeleri 10 - enjeksiyonları 2 oluşur. Boya yaymak için izin vermek için 15 sn - 10 aralıklarla her basınç darbesi yönetin. </li><li> Tetrametilrodamin (TRITC) enjeksiyonları halinde, ilave olarak (burada tarif edilen deneylerde MNTB ve VNTB) ilgi beyin bölgesine yerleştirilmiş elektrot ile elektroporasyon yoluyla boya alımı arttırmak için elektriksel olarak teşvik eder. <ol><li> Bir stimülasyon yalıtım birimi (Şekil 3B&#39;de ürün No 7 ve 9), 55 V bir uyarıcısı tarafından tahrik edilir ve amplifiye aralıklarla strok arası 50 ms, 50 milisaniye boyunca 8 volt 8 TTL palslarının kullanın. Bu protokol, 20 olan idari tekrarlar - 10 kullanınBirkaç dakika 7,8 üzerinde Gürler. Düzgün elektrot toprağa emin olun - topraklama kablosu banyo solüsyonu bağlı olmalıdır! </li></ol></li><li> Enjeksiyon başarısı için kontrol edin. Uzun bir emisyon dalga boyu floresan izleyici de kısa dalga boylarına sahip lazer uyarma üzerine bir floresan sinyal yayan olduğundan, görsel lazerle bölgeyi aydınlatan ve filtre gözlük aracılığıyla gözlemlerken enjekte hedef alan yayılmış boya alımı / kontrol edin. </li></ol> 4. Kuluçka <ol><li> Enjeksiyondan sonra, oksijenli yapay beyin omurilik sıvısında (ACSF brainstems inkübe; NaCI: 125 mM KCI: 2.5 mM, MgCI2: 1 mM CaCl2: 2 mM, glikoz: 25 mM NaH 2 PO 4: 1,25 mM, NaHCO 3: 25 mM, askorbik asit; 0,4 mM, miyo-inositol: 3 mM, piruvik asit: 2 mM, 95% O 2 ile kabarmış - Oda sıcaklığında,% 5 CO2), 1 (RT, 25 ° C) - 4 saat ikenboya taşınan ediliyor. Kabarcık tüm kuluçka döneminde çözüm. </li><li> Gece boyunca (O / N) sonrası sabitleşmesi için 4 ° C sıcaklıkta tekrar ve inkübe (PFA / PBS karışımı pH 7. Yaklaşık 100 mi) daha sonra, PBS içinde çözülmüş% 4 paraformaldehit (PFA) brainstems aktarın. </li></ol> 5. Doku Dilimleme ve Montaj <ol><li> Ertesi gün, PBS Beyin Sapı (her yıkama basamağı için 5 dakika) üç defa yıkamak,% 4 agar kapsayacak ve daha sonra 50 oyulmuş - bir vibratome üzerinde 80 mikron kalınlığında dilimler. Bir bardak slayt ve lamel bir montaj orta kullanarak Dağı dilimleri. </li><li> İsteğe bağlı olarak, (: AB medyada 100 seyreltme 1 örneğin mavi Nissl) 25 dakika floresan Nissl ile bölümleri etiket. <ol><li> AB ortamı hazırlamak 0,2 M fosfat tamponu 250 ml karıştırın (PB, 51 mM KH 2 PO 4, 150 mM Na 2 HPO 4), 15 ml 5 M NaCI, 15 ml% 10&#39;luk Triton-X 220 mi GKD 2 O ve 5 g sığır serum albümin. </li><li> Precede PBS içinde 3 yıkama adımlarla Nissl etiketleme adım (10 dakika her) başarılı ve. </li></ol></li></ol> Not: kalın bölümler monte analiz edilmesi gerektiği durumlarda (örneğin dilim Burada tarif edilen deneylerde 100 idi - büyük mesafelerde aksonal bağlantıları korumak için kalınlıkta 500 mikron), doku temizleme tekniği ile kombine edilebilir. Biz ClearT2 12 20 başarılı bulundu. Bir doku temizleme aşaması dahil edildiğinde, bölümleri monte etmeden önce bunu gerçekleştirmek.

<ol>
	<li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+sections+of+glossopharyngeal+and+hypoglossal+nerves+of+the+frog+and+observations+of+the+alterations+produced+thereby+in+the+structure+of+their+primitive+fibers.">Experiments on the sections of glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. 140, 423-429 (1850).</li><li>Fink, R. P., Heimer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+methods+for+selective+silver+impregnation+of+degenerating+axons+and+their+synaptic+endings+in+the+central+nervous+system.">Two methods for selective silver impregnation of degenerating axons and their synaptic endings in the central nervous system.</a> Brain Res. 4, 369-374 (1967).</li><li>Nauta, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+silver+impregnation+of+degenerating+axons+in+the+central+nervous+system.">Selective silver impregnation of degenerating axons in the central nervous system.</a> Stain Technol. 27, 175-179 (1952).</li><li>Ram&#243;n y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologie+du+syst&#232;me+nerveux+de+l'Homme+et+des+vert&#233;br&#233;s.">Histologie du syst&#232;me nerveux de l'Homme et des vert&#233;br&#233;s.</a> , (1911).</li><li>Kristensson, K., Olsson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+retrograde+transport+of+peroxidase+in+hypoglossal+neurons.+Electron+microscopical+localization+in+the+neuronal+perikaryon.">Uptake and retrograde transport of peroxidase in hypoglossal neurons. Electron microscopical localization in the neuronal perikaryon.</a> Acta Neuropathol. 19, 1-9 (1971).</li><li>Kristensson, K., Olsson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+axonal+transport+of+protein.">Retrograde axonal transport of protein.</a> Brain Res. 29, 363-365 (1971).</li><li>Burger, R. M., Cramer, K. S., Pfeiffer, J. D., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+superior+olivary+nucleus+provides+divergent+inhibitory+input+to+parallel+auditory+pathways.">Avian superior olivary nucleus provides divergent inhibitory input to parallel auditory pathways.</a> J. Comp. Neurol. 481, 6-18 (2005).</li><li>Ford, M. C., Grothe, B., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fenestration+of+the+calyx+of+Held+occurs+sequentially+along+the+tonotopic+axis,+is+influenced+by+afferent+activity,+and+facilitates+glutamate+clearance.">Fenestration of the calyx of Held occurs sequentially along the tonotopic axis, is influenced by afferent activity, and facilitates glutamate clearance.</a> J. Comp. Neurol. 514, 92-106 (2009).</li><li>Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+dextran+amines+used+as+axonal+tracers+in+the+nervous+system+of+chicken+embryo.">Fluorescent dextran amines used as axonal tracers in the nervous system of chicken embryo.</a> J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).</li><li>Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Gonatas, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugates+of+horseradish+peroxidase+(HRP)+with+cholera+toxin+and+wheat+germ+agglutinin+are+superior+to+free+HRP+as+orthograde+transported+markers.">Conjugates of horseradish peroxidase (HRP) with cholera toxin and wheat germ agglutinin are superior to free HRP as orthograde transported markers.</a> Brain Res. 223, 381-385 (1981).</li><li>Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Steiber, A., Gonatas, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horseradish+peroxsidase+(HRP)+conjugates+of+cholera+toxin+and+lectins+are+more+sensitive+retrograde+transported+markers+than+free+HRP.">Horseradish peroxsidase (HRP) conjugates of cholera toxin and lectins are more sensitive retrograde transported markers than free HRP.</a> Brain Res. 231, 33-50 (1982).</li><li>Conte, W. L., Kamishina, H., Corvin, J. V., Reep, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+in+the+projections+of+lateral+posterior+thalamus+with+cingulate+and+medial+agranular+cortex+in+relation+to+circuitry+for+directed+attention+and+neglect.">Topography in the projections of lateral posterior thalamus with cingulate and medial agranular cortex in relation to circuitry for directed attention and neglect.</a> Brain Res. 1240, 87-95 (2008).</li><li>Conte, W. L., Kamishina, H., Reep, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+neuroanatomical+tract-tracing+using+fluorescent+Alexa+Fluor+conjugates+of+cholera+toxin+subunit+B+in+rats.">Multiple neuroanatomical tract-tracing using fluorescent Alexa Fluor conjugates of cholera toxin subunit B in rats.</a> Nat. Protoc. 4, 1157-1166 (2009).</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo-+from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo- from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li><li>Zeilhofer, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycinergic+neurons+expressing+enhanced+green+fluorescent+protein+in+bacterial+artificial+chromosome+transgenic+mice.">Glycinergic neurons expressing enhanced green fluorescent protein in bacterial artificial chromosome transgenic mice.</a> J. Comp. Neurol. 482, 123-141 (2005).</li><li>Poyatos, I., Ponce, J., Arag&#246;n, C., Gim&#233;nez, C., Zafra, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glycine+transporter+GLYT2+is+a+reliable+marker+for+glycine-immunoreactive+neurons.">The glycine transporter GLYT2 is a reliable marker for glycine-immunoreactive neurons.</a> Brain. Res. Mol. Brain Res. 49, 63-67 (1997).</li><li>Gong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes.">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li><li>Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bac+to+the+future:+the+use+of+BAC+transgenic+mice+for+neuroscience+research.">Bac to the future: the use of BAC transgenic mice for neuroscience research.</a> Nat. Rev. Neurosci. 2, 861-870 (2001).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).</li><li>Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140, 1364-1368 (2013).</li><li>Wouterlood, F. G., Jorritsma-Byham, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anterograde+neuroanatomical+tracer+biotinylated+dextran+amine:+comparison+with+the+tracer+PHA-L+in+preparations+for+electron+microscopy.">The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine: comparison with the tracer PHA-L in preparations for electron microscopy.</a> J. Neurosci. Methods. 48, 75-87 (1993).</li><li>Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+half+century+of+experimental+neuroanatomical+tracing.">A half century of experimental neuroanatomical tracing.</a> J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).</li><li>Rodriguez-Contreras, A., Silvio, J., van Hoeve, S., Habets, L. P., Locher, H., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+development+of+the+calyx+of+Held+synapse.">Dynamic development of the calyx of Held synapse.</a> PNAS. 105 (14), 5603-5608 (2008).</li><li>Albrecht, O., Dondzillo, A., Mayer, F., Thompson, J. A., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+projections+from+the+ventral+nucleus+of+the+trapezoid+body+to+the+medial+nucleus+of+the+trapezoid+body+in+the+mouse.">Inhibitory projections from the ventral nucleus of the trapezoid body to the medial nucleus of the trapezoid body in the mouse.</a> Front. Neural Circuits. 8, 83 (2014).</li><li>Benson, D. A., Teas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+unit+of+binaural+interaction+in+the+auditory+cortex+of+the+chinchilla.">Single unit of binaural interaction in the auditory cortex of the chinchilla.</a> Brain Res. 103, 313-338 (1976).</li><li>Koka, K., Jones, H. G., Thornton, J. L., Lupo, J. E., Tollin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sound+pressure+transformations+by+the+head+and+pinnae+of+the+adult+Chinchilla+(Chinchilla+lanigera).">Sound pressure transformations by the head and pinnae of the adult Chinchilla (Chinchilla lanigera).</a> Hear Res. 272 (1-2), 135-147 (2011).</li><li>Ryan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+sensitivity+of+the+mongolian+gerbil,+Meriones+unguiculatus.">Hearing sensitivity of the mongolian gerbil, Meriones unguiculatus.</a> J. Acoust. Soc. Am. 59 (5), 1222-1226 (1976).</li><li>Zwicker, E., Fastl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Psychoacoustics Facts and Models. , (1990).</li><li>Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+for+the+efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+DNA.">Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA.</a> Nucleic Acids Res. 15 (3), 1311-1326 (1987).</li><li>Klenchin, V. A., Sukharev, S. I., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrically+induced+DNA+uptake+by+cells+is+a+fast+process+involving+DNA+electrophoresis.">Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis.</a> Biophys J. 60 (4), 804-811 (1991).</li><li>Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+Slice+Culture+of+E18+Rat+Brains.">Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains.</a> J. Vis. Exp. (6), e235 (2007).</li><li>G&#228;hwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue.">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li><li>Tallini, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+transgenic+mice+express+enhanced+green+fluorescent+protein+in+central+and+peripheral+cholinergic+neurons.">BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons.</a> Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

In vivo izleme çalışmaları aksine in vitro izleyici elektroporasyon genel gücü, pahalı stereotaktik (ve genellikle elektrofizyolojik) ekipmanı içermeyen, bu araştırmacılara dolayısıyla faiz ve beyin alanına daha iyi erişim sağlamasıdır. Dekstran aminler ve diğer izleyiciler kullanımı ile ilgili ayrıntılı bir inceleme (bkz in vivo izleyici enjeksiyonları halinde yerine günler veya haftalar - Buna ek olarak, beyin eksplant için gerekli yaşam süresi sadece birkaç sa...

Belirli bir nöronal (mikro) devreyi tanımlamak için, dedi biri devre ve bunların bağlantı desen çeşitli katılımcıları bularak başlamalıdır. Hiç hasarının 1 ile nöroanatomik izleme tekniklerinin büyük bir çeşitlilik izleme neurofiber hakkında Waller&#39;ın yayın kurulduktan bu yana. 1971 5-6 keşfedilen Bu tekniklerden bazıları, sabit bir doku otopsi 2-4 uygulanabilir, diğerleri, canlı nöronlar boyanın aktif taşıma dayanır. İkincisi daha (belirli bir projeksiyon kaynağına, yani enjekte alandan. Alan bahsedilen çıkıntılı olan nöronların somata) Aktif retrograd yararlanarak yöntemleri arasındaki ayrım iki gruba ayrılabilir ve aktif anterograde (enjekte itibaren Belirli bir projeksiyon hedefinin, yani. akson projeksiyonları ve etiketli nöronlar) ulaşım aksonal terminallerine alanı. Ayrıca, bazı durumlarda, tracer malzemesi daha sonra, diğer durumlarda eksplante beyinleri enjekte edilir ise, (in vivo tracer enjeksiyonları) birçok gün veya hafta enjeksiyon hayatta kalmak ve yapay serebrospinal akışkan içinde enjeksiyondan sonra birkaç saat süreyle inkübe canlı hayvan içine enjekte edilir (in vitro iz enjeksiyonları) . Bu protokolde vitro elektroporasyon tekniği 7-8 mevcut bir izleme maddeler olarak choleratoxin alt birimi-b ve tetrametilrodamin dekstran kullanarak anterograd ve retrograd izleme deneylerinde nöronal somata ve süreçleri etiketlemek için güncellenmiştir. Bu protokolün genel amacı izli enjeksiyonlar sırasında hedefleme hassasiyetini artırmak amacıyla mevcut transgenik fare hatları ve temel optik cihazlar yararlanarak, farklı beyin çekirdekleri arasındaki nöronal bağlantı desenleri iz etkin bir araç ile sinirbilimcileri sağlamaktır. Anterograd ve retrograd izleme yöntemi kullanılarak rağmencholeratoxin dekstran amin ve ilgili floresan etiketli eşlenikler 9-13 yeni değildir (örneğin. Haas ve arkadaşları elektroporasyon gibi bir yöntem olduğu için. 14), beyin dokusu bloklarını ihtiva eden bir in vitro hazırlama elektroporasyon tracer enjeksiyonu kombinasyonunun Daha yeni bir gelişme 7&#39;dir. Canlı hayvanların tracer boyalar aynı tip kullanılarak nöronal izleme teknikleri esas avantajı, çünkü elektropore boya nöronlar tarafından alınır olarak hangi daha yüksek verimlilik, artmış etiketleme yoğunluğudur. Deneyci enjeksiyon ilgili hedef alanı üzerinde bir görsel kontrol, çünkü ek bir avantajı, izleyici enjeksiyon sırasında (boya nakil için gerekli) kısaltılmış inkübasyon süresi ve artan hedef doğruluğudur. İkincisi de pahalı stereotaktik ekipman ilgi çekirdeği veya beyin alanı bulmak için gerekli olduğu anlamına gelir. Addin içinduğunda biz 405 nm dalga boyu ve eşleştirme band geçiren filtre gözlük bir el lazer pointer (450 oluşan nöronlar 15 ve temel optik donanımın glycinergic alt popülasyonunda GFP ifade transgenik fare hattı, yararlandı, doğruluk hedefleme artış - 700 nm). Böylece, onun floresan sinyali ile enjeksiyon alanını belirleyerek doğruluğu hedef ve yerli GFP sinyal ve izleyici arasındaki etkileşimin gözlem yoluyla enjeksiyon alanı içinde boya yayılması kontrol etmek için daha ince bir yol sağlayarak önemli bir başka artış elde ışık vermiştir. Bizim teknik aynı zamanda izleyici ile doldurulmuştur (diğer fare hatları ya da eksitatör) onun GFP pozitif inhibitör nöronları belirleyerek bağlantısı ile birlikte devrenin işlevselliğini ortaya çıkarmak için izin verir. Özetle, biz daha omurgalı beynin connectome incelemek ve değerlendirmek için t güçlü nörobilimsel araç gelişmişO belirli bir neurocircuit farklı nöroanatomik özellikleri. Ucuz ve yaygın olarak kullanılan optik cihazlar ile birlikte transgenik fareler kullanarak önemli ölçüde bizim enjeksiyonları hedef doğruluğunu artırmak için başardık. Ayrıca, transgenik fareler işitsel beyinsapı bir inhibitör mikrodevre işlevselliğini ortaya çıkarılması yardımcı takip bağlantıları, tipini belirlemek için bize izin verdi.

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise.</td></tr><tr><td>Potassium chloride&amp;nbsp;</td><td></td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td></td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate di-basic</td><td></td><td>S907</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td></td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td></td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td></td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td></td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td></td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Myo-inositol</td><td></td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td></td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumine</td><td></td><td>A2153</td><td>optional, for additional (immuno)histochemistry</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td></td><td>X100</td><td>optional, for additional (immuno)histochemistry</td></tr><tr><td>Poly(ethylene glycol), 8000 MW</td><td></td><td>P2139</td><td>optional, for brain clearing</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>F84</td><td>optional, for brain clearing</td></tr><tr><td>Choleratoxin subunit-b</td><td>Molecular Probes</td><td>C-34776 (Alexa 555)&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dextrane tetramethyl-rhodamine</td><td>Molecular Probes</td><td>D-7162 (Alexa 555)</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Nissl</td><td>Invitrogen</td><td>N-21479 (blue)</td><td>optional</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF93</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbi-tal</td><td>Vortech Pharmaceuticals</td><td>Fatal-Plus&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass filaments</td><td>Harvard Apparatus</td><td>G150F-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipette puller</td><td>Zeitz Instruments, Germany</td><td>DMZ Universal Puller</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion setup</td><td>Custom-made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser pointer&amp;nbsp;</td><td>laserpointerpro.com, Hong Kong</td><td>HK-88007294 (405 nm)</td><td></td></tr><tr><td>Filter/safety goggles</td><td>Dragon Lasers, China</td><td>LSG09 (band-pass 450-700 nm)</td><td></td></tr><tr><td>Bionocular microscope&amp;nbsp;</td><td>Wild Heerbrugg, Switzerland</td><td>Wild M3</td><td>Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Instruments</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>PC with installed MC Stimulus software</td><td>Multi Channel Sys-tems, Germany (software)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-channel stimulator</td><td>Multi Channel Sys-tems, Germany</td><td>STG-1002</td><td></td></tr><tr><td>Stimulation isolation unit</td><td>A.M.P.I., Israel</td><td>Iso-Flex</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige, Japan</td><td>YOU-1</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica, Germany</td><td>VT1000S</td><td></td></tr></tbody></table>

laser-guided neuronal tracing in brain explants

Biz işlem sırasında hedeflenen lazer aydınlatma ve uygun filtre gözlük ile beyin eksplantlarında elektroporasyon yoluyla boya alımını artırmak için elektrikli ve basınç darbeleri bir dizi kullanan bir in vitro izleyici enjeksiyon protokolü, birleştiren bir teknik sunuyoruz. Kendisi ile in vitro elektroporasyon tarif edilen teknik Beynin belirli bölgeleri, hedefleme için nispeten iyi bir görsel kontrol elde edilir. Lazer floresan genetik belirteçlerin uyarma ve onların okuma-out bant-geçen filtre gözlüğü aracılığıyla, genetik olarak etiketlenmiş hücre / çekirdekler ve floresan izleme boya emisyonlarını pick up hangi bir araştırmacı ölçüde enjeksiyon doğruluğunu artırabilir ile birleştirerek ilgi alanı bulma ve çok daha verimli enjeksiyon alanında boya yayılmış / alımı için kontrol ederek. Buna ek olarak, lazer aydınlatma tekniği ata, belirli bir neurocircuit işlevselliğini çalışma sağlarGFP tanımı, nöron bir alt tarafından ifade edilen verici tipine bağlı olduğu durumlarda, belirli bir alana uzanan nöronların türü hakkında bilgi iding.

Lazer pointer ve lazer gözlüğü hızlı ve ucuz bir çöp GFP pozitif hayvanlar genotiplemesi için nasıl kullanılabileceğini 1 ve 2 gösteri rakamlar. Genç yavrular fare durumlarda, tekniğin invaziv olmayan kafatası ve üstteki derinin (- D Şekil 1A) boyunca hayvanın beyninde GFP etiketi tanımlamak için kullanılabilir. Yayılan floresan en azından yukarı doğum sonrası 3. günde (Şekil 1C) ile deri ve fare yavrular kafatası yoluyla g...

Watch this Scientific Journal Video about Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants at JoVE.com

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Biz bir in vitro hazırlık kullanarak beyin çekirdekleri içine anterograd veya retrograd tracer enjeksiyonları yoluyla nöronlar ve süreçlerini etiketlemek için bir teknik açıklar. Biz i n markalama doğruluğunu artırmak amacıyla bir avantaj floresan işaretli fare mutantları ve temel optik donanım alarak izleyici elektroporasyon vitro varolan yöntemi değiştirilebilir.

Lazer güdümlü Nöronal İzleme Beyin Eksplantlarındaki

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

laser-guided-neuronal-tracing-in-brain-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K Görüntüleme.  University of Colorado School of Medicine.  Biz bir in vitro hazırlık kullanarak beyin çekirdekleri içine anterograd veya retrograd tracer enjeksiyonları yoluyla nöronlar ve süreçlerini etiketlemek için bir teknik açıklar. Biz i n markalama doğruluğunu artırmak amacıyla bir avantaj floresan işaretli fare mutantları ve temel optik donanım alarak izleyici elektroporasyon vitro varolan yöntemi değiştirilebilir. 

Video: Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in vivo gene control of neocortical projection neuron morphology. This method is based on (1) in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors as "test" and "control" cells, (2) their co-transplantation into wild-type brains, and (3) paired morphometric evaluation of their neuronal derivatives. Specifically, E12.5 pallial precursors from panneuronal, genetically labeled donors, are employed for this purpose. They are engineered to take advantage of selected promoters and tetON/OFF technology, and they are free-hand transplanted into neonatal lateral ventricles. Later, upon immunofluorescence profiling of recipient brains, silhouettes of transplanted neurons are fed into NeurphologyJ open source software, their morphometric parameters are extracted, and average length and branching index are calculated. Compared to other methods, this one offers three main advantages: it permits achieving of fine control of transgene expression at affordable costs, it only requires basic surgical skills, and it provides statistically reliable results upon analysis of a limited number of animals. Because of its design, however, it is not adequate to address non cell-autonomous control of neuroarchitecture. Moreover, it should be preferably used to investigate neurite morphology control after completion of neuronal migration. In its present formulation, this method is exquisitely tuned to investigate gene control of glutamatergic neocortical neuron architecture. Taking advantage of transgenic lines expressing EGFP in other specific neural cell types, it can be re-purposed to address gene control of their architecture.

Based on in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors, their co-transplantation into wild-type brains and paired morphometric evaluation of "test" and "control" derivatives, this method allows accurate modeling of in vivo gene control of neocortical neuron morphology in a simple and affordable way.

In vivo Nöromimarlık çalışmaları için tasarlanan nöronal öncülerin intraventriküler nakli

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

Genetik

Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult retinal neurons in vitro. Procedures for preparing retinal cell cultures start with the dissection, digestion and trituration of the retina, and end with the plating of isolated retinal cells on dishes made especially for use with laser tweezers. These dishes are divided into a cell adhesive half and a cell repellant half. The cell adhesive side is coated with a layer of Sal-1 antibodies, which provide a substrate upon which our cells grow. Other adhesive substrates could be used for other cell types. The cell repellant side is coated with a thin layer of poly-HEMA. The cells plated on the poly-HEMA side of the dish are trapped with the laser tweezers, transported and then placed adjacent to a cell on the Sal-1 side to create a pair. Formation of cell groups of any size should be possible with this technique. "Laser-tweezers-controlled micromanipulation" means that the investigator can choose which cells to move, and the desired distance between the cells can be standardized. Because the laser beam goes through transparent surfaces of the culture dish, cell selection and placement are done in an enclosed, sterile environment. Cells can be monitored by video time-lapse and used with any cell biological technique required. This technique may help investigations of cell-cell interactions.

This video describes the manipulation of cultured neurons using laser tweezers in vitro.

In Vitro İzole Nöronlar kurgulama için Lazer Cımbız

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult ...

Biyoloji

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

Dan Sinir Eksplantasyon Kültürleri<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Nörobilim

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Travmatik Beyin Hasarı Sonrası Nöronlar veya gen ekspresyon analizi için Tek Nöron zenginleştirilmiştir Populasyonlarının Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

Optogenetically Hedeflenen Önbeyin Devreler Lazer tarama photostimulation

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain in adulthood and during development. Although most in vivo approaches use a craniotomy to study brain regions located on the dorsal side, brainstem regions such as the pons, located on the ventral side remain relatively understudied. The main goal of this protocol is to facilitate access to ventral brainstem structures so that they can be studied in vivo using electrophysiological and imaging methods. This approach allows study of structural changes in long-range axons, patterns of electrical activity in single and ensembles of cells, and changes in blood brain barrier permeability in neonate animals. Although this protocol has been used mostly to study the auditory brainstem in neonate rats, it can easily be adapted for studies in other rodent species such as neonate mice, adult rodents and other brainstem regions.

A surgical method is described to expose the ventral skull in neonate rats. Using this approach it is possible to open a craniotomy to perform acute electrophysiology and two-photon microscopy experiments in the brainstem of anesthetized pups.

Yenidoğan Kemirgenlerin Ventral Kafatası kranyotomi olun Bir Yöntem

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Serebellar Aksonlar Lazer Nanosurgery<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

Fare Beyin Dilimlerinde Uzun Menzilli Girdilerin Optogenetik Stimülasyonu için Vivo İntraserebral Stereotaksik Enjeksiyonlarda

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones -the sensory structures located at the distal tips of developing axons- execute this process. Studying the structure and dynamics of the growth cone is crucial to understanding axonal development and the interactions with the surrounding central nervous system (CNS) that enable it to form neural circuits. This is essential when devising methods to reintegrate axons into neural circuits following injury in fundamental research and pre-clinical contexts. Thus far, the general understanding of growth cone dynamics is primarily founded on studies of neurons cultured in two dimensions (2D). Although undoubtedly fundamental to the current knowledge of growth cone structural dynamics and response to stimuli, 2D studies misrepresent the physiological three-dimensional (3D) environment encountered by neuronal growth cones in intact CNS tissue. More recently, collagen gels were employed to overcome some of these limitations, enabling the investigation of neuronal development in 3D. However, both synthetic 2D and 3D environments lack signaling cues within CNS tissue, which direct the extension and pathfinding of developing axons. This protocol provides a method for studying axons and growth cones using organotypic brain slices, where developing axons encounter physiologically relevant physical and chemical cues. By combining fine-tuned in utero and ex utero electroporation to sparsely deliver fluorescent reporters along with super-resolution microscopy, this protocol presents a methodological pipeline for the visualization of axon and growth cone dynamics in situ. Furthermore, a detailed toolkit description of the analysis of long-term and live-cell imaging data is included.

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

This protocol demonstrates a straightforward and robust method to study in situ axon growth and growth cone dynamics. It describes how to prepare ex vivo physiologically relevant acute brain slices and provides a user-friendly analysis pipeline.

Yerinde Akut Ex Vivo Embriyonik Beyin Dilimi Kültürlerinde Akson Büyümesi ve Büyüme Koni Dinamiğinin Görselleştirilmesi

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain

Cell therapy has long been an emerging treatment paradigm in experimental neurobiology. However, cell transplantation studies often rely on end-point measurements and can therefore only evaluate longitudinal changes of cell migration and survival to a limited extent. This paper provides a reliable, minimally invasive protocol to transplant and longitudinally track neural progenitor cells (NPCs) in the adult mouse brain. Before transplantation, cells are transduced with a lentiviral vector comprising a bioluminescent (firefly-luciferase) and fluorescent (green fluorescent protein [GFP]) reporter. The NPCs are transplanted into the right cortical hemisphere using stereotaxic injections in the sensorimotor cortex. Following transplantation, grafted cells were detected through the intact skull for up to five weeks (at days 0, 3, 14, 21, 35) with a resolution limit of 6,000 cells using in vivo bioluminescence imaging. Subsequently, the transplanted cells are identified in histological brain sections and further characterized with immunofluorescence. Thus, this protocol provides a valuable tool to transplant, track, quantify, and characterize cells in the mouse brain.

Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain

We describe the intraparenchymal transplantation of human neural progenitor cells transduced with a dual reporter vector expressing luciferase-green fluorescent protein (GFP) in the mouse brain. After transplantation, the luciferase signal is repeatedly measured using in vivo bioluminescence and GFP-expressing grafted cells identified in brain sections using fluorescence microscopy.

İntraserebral Transplantasyon ve Fare Beynindeki İnsan Nöral Progenitör Hücrelerinin İnVivo Biyolüminesans İzlenmesi

Cell therapy has long been an emerging treatment paradigm in experimental neurobiology. However, cell transplantation studies often rely on end-point ...

Lazer güdümlü Nöronal İzleme Beyin Eksplantlarındaki

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler