Araştırma Ödülü sayısı R01CA174385 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenen bu yayında bildirdi. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

1. Reaktiflerin Hazırlanması <ol><li> 500 ml RPMI-1640 ve 5 ml karıştırma ile RPMI-PLGH hazırlanması Penisilin-Streptomisin, L-glutamin, HEPES ve çözelti her biri. </li><li> % 10 fetal bovin serumu (FBS) ile RPMI-PLGH karıştırma ile R10 çözeltisi hazırlayın. FBS ile ilave 30 dakika boyunca 56 ° C&#39;de önceden de ısı ile inaktive edilir. </li><li> 37 ön ısıtma ° C RPMI-PLGH, steril konik tüpler içinde R10 15 ml PBS ve 15 ml ve 50 ml. </li><li> PDMS içinde nanowells diziler İmalatı: silikon ana fotolitografi, esas olarak daha önce anlatılan 10 kullanılarak imal edilir. İyice bir plastik bıçak kullanarak Sylgard 184 elastomer kiti temel ve bir tek fincan 10:01 ağırlık oranında sertleştirici karıştırın. 1 saat boyunca bir vakum odasında Degas karışımı. , Nanowell dizi üzerine karışımı dökün bir cam slayt ile mühür ve 30 dakika bekletin. ° C de 2 saat süre ile 80 olarak ayarlanmış, bir fırın içine montaj aktarın ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında soğumaya bırakılır. Elastomer fark olacakBu dönemde ve irade cam slayt bağ sırasında e. PDMS nanowell dizi içeren cam slayt dikkatlice bant ile kaplanmış ve ileride kullanmak kadar saklanır, silikon ana kaldırdı edilir. </li></ol> 2. Hedef Hücre (T) Etiketleme <ol><li> 5 dakika boyunca 340 x g&#39;de santrifüj ile bir steril 15 ml konik bir tüp içinde bir hemasitometre ile pelet hücreleri kullanılarak hücre kültürü ile 5 milyon hedef hücreleri sayın. Hücre kültürü 5 ml toplam hacmi (yoğunluk = 1 milyon / ml) içinde bir önceki güne bölmek ve T-25 şişesi (VWR) içinde yetiştirilir. Hemasitometre kullanarak hücre sayımı için Protokoller önce 11 ayrıntılı olarak tarif edilmiştir </li><li> Ortam yaklaşık 50 ul geride bırakarak aşırı medya aspire. </li><li> (Son konsantrasyonu 2.5 mcM) 150 ul RPMI-PLGH 0.5 ul TO stok (1 mM) karıştırılarak Hücre Tracker Kırmızı (TO) bir çalışma çözeltisi hazırlayın. Hedef hücrelere çalışma solüsyonu 150 ul ekleyin ve bir P200 pipet kullanarak iyice karıştırın.Alternatif olarak, PKH 26 (2 uM nihai konsantrasyon) imalatçının talimatlarına göre etiketli hedef hücreler olarak da kullanılabilir. </li><li> 20 dk için 37 ° C /% 5 CO2 inkübe edin. </li></ol> 3. Efektör (E) Hücre Etiketleme <ol><li> 5 dakika boyunca 340 x g&#39;de santrifüj ile bir steril 15 ml konik bir tüp içinde bir hemasitometre ile pelet hücreleri kullanılarak hücre kültürü ile 5 milyon efektör hücreleri sayın. </li><li> Aşırı medya aspire </li><li> R10 medya 1 ml (5 uM nihai konsantrasyon) ile 5 mM stok Vybrant Violet 1 ul ilave edilerek Vybrant DyeCycleViolet Leke çözeltisi bir çalışma çözeltisi hazırlayın. Hücrelere çalışma çözeltisi ekleyin ve P200 pipet kullanarak tekrar süspansiyon haline getirin. Alternatif olarak, PKH 67 (2 uM nihai konsantrasyon) imalatçının talimatlarına göre etiketli hedef hücreler olarak da kullanılabilir. PKH 67 kullanılırsa, bunlar aynı flüoresan kanalı olması nedeniyle, daha sonra SYTOX Green kullanılmamalıdır. Apoptotik hedeflerin numaralandırma sadece A kullanılarak yapılırBu durumda nnexinV boyama. Not: time-lapse değil nokta ölçümler yapıyorsanız, Vybrant Violet gibi UV boyalar kaçınılmalıdır. </li><li> 20 dk için 37 ° C /% 5 CO2 inkübe edin. </li></ol> 4. Bir Yoğunluk Gradient Kullanarak Canlı ve Ölü Hücrelerin Ayrılması <ol><li> Sırasıyla, hedef ve efektör hücrelere 6.8 ml ve RPMI-PLGH 6.0 ml ekleyin ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. </li><li> Ficoll-Paque Artı hedef ve efektör hücreler içeren her konik tüp alt tabakası 3,5 ml. Katman Ficoll yavaş yavaş Ficoll ve medya arasındaki tabaka iyi oluşumunu sağlamak için. </li><li> 30 dakika boyunca 340 xg&#39;de her iki tüp santrifüjleyin. Hiçbir fren ve hızlanma ile. </li><li> Santrifüj sırasında, bir 4-iyi levhaya önceden ısıtılmış PBS 7 ml aktarın. Nanowell array (PDMS fabrikasyon) hazırlayın: etanol ile cam slayt temiz alt ve 1 dakika boyunca plazma oksitleyici kullanarak yüksek RF ayarda PDMS okside eder. Bu adım adım olacak steAyrıca hidrofilik PDMS sunarken nanowell dizi rilize. Hemen PBS içeren plaka içine nanowell dizi taşıyın. </li><li> Bir biyogüvenlik kabine plaka aktarın ve aşırı PBS aspirat. 30-45 saniye sonra, 10 ml distile su ve mikrodalga buna 100 mg agar tozu ilave edilerek 10 ml% 1 agar asil edin. Dizi hareketsiz ve katılaşmaya agar için 10 dakika beklemek zorunda nanowell dizisi içeren cam slayt üst ve alt kenarda 1% asil agar sıcak uygulayın. 3 ml PBS ve aspirat aşırı agar ekleyin. </li><li> Nanowell dizinin üst üzerine R10, 3 ml ekleyin ve yaklaşık 10 dakika için denge sağlar. </li><li> Santrifüj Ficoll takiben, her tüp üst tabakasından 5 ml medya aspire. Hücreleri içeren katmanı aspire için dikkatli olun. </li><li> P1, 000 pipet ve yeni steril konik tüpler için hamle ile Ficoll ve medya arasındaki tabakası 1-2 ml kurtarma tarafından hücreleri (beyaz tabaka) Harvest. Size maxim emin yaparken hücrelerin iki seti için bu işlemi tekrarlayıniyileşme hücreleri tanımlamak için analiz edildi. </li><li> Tam hızlanma ve fren üzerinde 5 dakika boyunca 340 x g&#39;de santrifüj ile pelet ve pipetleme ile her bir tüp, karışım için önceden ısıtılmış RPMI-PLGH 3 ml ilave edilir. </li><li> Fazla ortamı aspire, her bir tüp için önceden ısıtılmış RPMI-PLGH, 5 ml ilave edin ve 5 dakika boyunca 340 x g&#39;de santrifüj tekrarlayın. </li><li> Fazla ortamı aspire ve R10, 500 ul hücre pelet tekrar süspansiyon. </li><li> Bir hemasitometre üzerine Tripan mavi dışlama yöntemi kullanılarak canlı hücreleri saymak. </li></ol> 5. Nanowell Dizi üzerine Hücre Yükleniyor <ol><li> Nanowell diziden aşırı medya aspire ve dizi boyunca taze R10 2 ml ekleyin. Nanowell dizinin üst bu hücrelerin dağılımını etkileyecek gibi çok ıslak / kuru değil emin yaparken tekrar aspire. </li><li> Nanowell dizi yüzey üzerine R10 200 ul içinde depolama 1 x 10 5 efektör hücreler (yoğunluk = 5 x 10 5 hücre / ml). </li><li> Hücreleri 5 dakika boyunca yerleşmek ve en standart bir doku kültürü mikroskobu çek kullanarak Lethücrelerinin dağılımını arzu edilir olduğuna dikkat edin. Gerekirse daha fazla hücre ekleyin. </li><li> Depo 1 x 10 nanowell dizi yüzeyde 200 ul R10 5 hedef hücreler (yoğunluk = 5 x 10 5 hücre / ml). </li><li> Hücreler 5 dakika ve hücrelerin dağılımı tercih edilir olduğundan emin olmak için, standart bir doku kültürü mikroskop kullanılarak kontrol dinlendiriniz. Gerekirse daha fazla hücre ekleyin. </li><li> 2 ml R10 ve aspirat fazla medya ile dikkatlice nanowell dizi durulayın. </li><li> 15 ml steril konik tüp içinde 3 ml önceden ısıtılmış R10 hazırlayın. Leke 0.5mM SYTOX Green nükleik asit 3 ul (0.5 uM son konsantrasyon) ve çalışma çözeltisi hazırlamak için Annexin V-Alexa Fluor 647 60 ul ekle. Hücreleri kuyulardan yerinden değil emin yaparken dikkatli 4-plaka üzerine çalışma çözüm ekleyin. </li><li> 15 dk için 37 ° C /% 5 CO2 inkübe edin. </li></ol> 6. Görüntüleme 1 <ol><li> Bir floresan MICR kullanarak nanowell dizinin görüntüleri Edinmeoscope: Bu örnekte, bir motorlu sahne ve Lambda-DG4 sahip Z-1 mikroskop ZEISS Gözlemci kullanın. </li><li> Yazılım ve mikroskop başlatılamıyor ve iletilen ışık ve diğer floresan kanallarda sinyal yoğunluğu kontrol edin. Genel olarak, karşılık gelen beş kanal olacak: iletilen ışık, Annexin V-647 (Cy5 filtresi), TO (DsRed filtresi), SYTOX Yeşil (FITC filtresi) ve Vybrant Violet (DAPI filtre). Doyuma kaçınarak gürültü maksimum sinyal sağlamak için kurulum mikroskop emin olun. </li><li> X ve nanowell dizisi için Y konumu ayarlayın. Sıfır konumu ayarlama ve nanowell dizi damga sol üst köşesinde üzerine 7 x 7 nanowell dizinin blok merkezine odaklanmak başlatarak süreci başlar. Doğru her blok odağı yansıtmak için her bloğun merkezi ve z-değeri ile çakışacak şekilde x, y konumlarını ayarlayın. </li><li> Pozisyonu ve odak tüm set olduktan sonra, lineer modda görüntü toplama ayarlamak ve görüntüler elde etmek için emin olun. <s&gt; Not Trong: mikroskop inkübatör ve CO 2 gerekli dönüş en az 30 dakika deney öncesinde ise. </li></ol> 7. Post-görüntüleme 6 saat süreyle bir inkübatör (37 ° C /% 5 CO2) içine nanowell dizi içeren 4-plaka aktarın. 8. Görüntüleme 2 6. Adım de tarif edildiği gibi zaman noktası saniyede görüntü elde edin. 9. Görüntü Analizi <ol><li> Nanowells içindeki hücrelerin fazla uygun görüntü bölütleme programları kullanımı (örneğin ImageJ ile tespit edilir <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ), esas olarak daha önce tarif 9,12. </li><li> Mikroskop (t = 0 saat, t 0) ilk set analizi tam olarak bir hedef hücreye canlı (tanımlanır içeren bireysel nanowells bir veri tabanı oluşturmak için kullanılanRed CellTracker, kırmızı) ve ölü hücreleri (Annexin V boyası ile tanımlanır, yeşil) [T1T 0 nanowells]. </li><li> Mikroskop (t = 6 saatte, t 6) ikinci küme analizi. Bağımsız olarak 1, hedef hücre (kırmızı) [T1T 6 nanowells] nanowells ihtiva eden ikinci bir veri tabanı belirlemek için kullanılır Bir bütünlük denetimi (veritabanı sorgu) t 0 bütün canlı hedefler eşleşen hedefleri bir final seti (T1T 0 T1match olarak belirlenmiş = T1T 6, var nanowells olarak uygulanan) üretmek için t 6 hedeflere uyumlu olmasını sağlamak için uygulanan </li><li> Nanowells efektör hücrelerin sayısı t, 0 [E1 nanowells] az Vybrant mor leke kullanılarak belirlenir </li><li> Bir veritabanı sorgu (E1T1 olarak belirlenmiş E1 ve T1 maç var nanowells olarak tanımlanan), tek hedefleri ile birlikte kuluçkaya tek etkileyiciler içeren nanowells belirlemek için uygulanmaktadır </li><li> Efektör apoptosis i tarafından atılırsa<html> t 0 ve pozitif Annexin V t 4 de (t 6 Annexin V hedef boyama ile E1T1) negatif Annexin V hedefleri dentifying. </li></ol> 10. Nikon&#39;un BioStation IM kullanma Öldürme Opsiyonel Time-lapse Görüntüleme <ol><li> Lamel dipli bir Petri kabı alın ve tam olarak lamel uyacaktır nanowell dizi çipi küçük bir parça (Adım 5 hazırlanır) kesip. Kesim sırasında talaş ıslak kalır emin olun. </li><li> Karışım 1 x 10 6 hedefler ve 100 ul ortam içinde 1 x 10 6 T hücreleri ve lamel üzerine bu pipetle. </li><li> Yaklaşık 15-30 dk hücreleri yerleşmek izin ver. </li><li> Hızla küçük nanowell dizi çip ters ve lamel üzerine yerleştirin. </li><li> Çip çip üstüne görüntüleme, yer içinde bir ya da iki adet 20mm x 20mm lamelleri taşımak mümkün olmayacaktır emin olmak için. Çanak altına çip itmek usulca baskı uygulayın. </li></ol>çadır &quot;&gt; Not: nanowell dizi yongasının altına yüksek çözünürlüklü görüntüleme için çok kalın ve bu yüzden altüst edilmesi gerekir Bu işlem sırasında hücrelerin birçok yıkanır Bu Adım 9.2 &#39;de kolayca kontrollü, hücre sayıları olamayacaktır.. ve Basamak 9.3 &#39;de inkübasyon süresi optimize edilmesi gerekmektedir.

<ol>
	<li>Louis, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+and+long-term+fate+of+chimeric+antigen+receptor-positive+T+cells+in+patients+with+neuroblastoma.">Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma.</a> Blood. 118, 6050-6056 (2011).</li><li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+costimulation+improves+expansion+and+persistence+of+chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+lymphoma+patients.">CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients.</a> J. Clin. Invest. 121, 1822-1826 (2011).</li><li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+with+chimeric+antigen+receptors+have+potent+antitumor+effects+and+can+establish+memory+in+patients+with+advanced+leukemia.">T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia.</a> Sci. Transl. Med. 3, 95ra73 (2011).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor-Modified+T+Cells+in+Chronic+Lymphoid+Leukemia.">Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia.</a> N. Engl. J. Med. , (2011).</li><li>Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+immunotherapy+for+cancer:+harnessing+the+T+cell+response.">Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 269-281 (2012).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li><li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+visualizing+immunity+in+context.">Intravital microscopy: visualizing immunity in context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+cytokine+optimization+and+standard+operating+procedure.">Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure.</a> Nat. Protoc. 1, 1507-1516 (2006).</li><li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8++T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis.">A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).</li><li>Ogunniyi, A. O., Story, C. M., Papa, E., Guillen, E., Love, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+individual+hybridomas+by+microengraving+to+discover+monoclonal+antibodies.">Screening individual hybridomas by microengraving to discover monoclonal antibodies.</a> Nat. Protoc. 4, 767-782 (2009).</li><li>Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+IFN-gamma+Elispot+assay+in+HIV+vaccine+research.">The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research.</a> Nat. Protoc. 4, 461-469 (2009).</li><li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+efficient+functional+characterization+and+recovery+of+HIV-specific+human+CD8++T+cells+using+microengraving.">Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8+ T cells using microengraving.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3885-3890 (2012).</li><li>Makedonas, G., Betts, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+in+a+house+of+cards:+re-evaluating+CD8++T-cell+immune+correlates+against+HIV.">Living in a house of cards: re-evaluating CD8+ T-cell immune correlates against HIV.</a> Immunol. Rev. 239, 109-124 (2011).</li><li>Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+analysis+of+apoptosis+by+flow+and+image+cytometry.">Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 263, 141-160 (2004).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz nanowells diziler (Şekil 1) etkileyiciler ve hedefleri ko-kuluçka yoluyla etkin bir high-throughput tek hücreli sitolitik tahlil için protokol ana hatlarıyla. Verim ek olarak, tekniğin büyük bir avantaj da hedef hücreleri otolog ya da primer / eşlemeli tümör hücrelerinin kullanımına izin verir hedef hücre mühendisliği için gerek kalmadan istenen hedef hücrelerine karşı sitotoksisite efektör-aracılı izlemek için yeteneğidir. Uzaysal kapatılma tahlil 9 sonunda ge...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> RPMI-1640 w / o L-glutamin </td><td> Cellgro </td><td> 15-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin-streptomisin </td><td> Cellgro </td><td> 30-002-CI </td><td> 10.000 IU Penisilin 10.000 mg / ml streptomisin </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Cellgro </td><td> 25-005-CI </td><td> 200 mM çözelti </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma Aldrich </td><td> H3537 </td><td> 1M </td></tr><tr><td> Fetal bovin serumu (FBS) </td><td> Atlanta Biyolojik </td><td> S11150 </td><td> Lot test </td></tr><tr><td> Hücre Tracker Kırmızı Leke </td><td> Invitrogen </td><td> C34552 </td><td> 50 mikrogram </td></tr><tr><td> Vybrant DyeCycle Violet Leke </td><td> Invitrogen </td><td> V35003 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> SYTOX yeşil Nükleik Acid Stain </td><td> Invitrogen </td><td> S7020 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Annexin V-Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A23204 </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td> Dulbecco PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Noble Agar </td><td> Difco </td><td> 2M220 </td><td> 100 g </td></tr><tr><td> Tripan Mavi </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T8154 </td><td> % 0.4 sıvı steril filtre </td></tr><tr><td> Hemasitometre </td><td> Hausser Scientifics </td><td> 1492 </td><td> Parlak hattı </td></tr><tr><td> 4-plaka </td><td> Thermo Fisher </td><td> 167603 </td><td></td></tr><tr><td> Harrick Plazma Temizleyici </td><td> Harrick Plazma </td><td> PDC-32G </td><td> Temel plazma temizleyici </td></tr><tr><td> Observer.Z1 </td><td> ZEISS </td><td&gt; </td><td> Floresan mikroskobu (aşağıdaki üç bölümden ile çalışır) </td></tr><tr><td> Lambda 10-3 </td><td> Sutter Instrument </td><td></td><td> Filtre denetleyici </td></tr><tr><td> Lambda DG-4 </td><td> Sutter Instrument </td><td></td><td> Ultra Yüksek Hız Dalgaboyu anahtarlayıcı </td></tr><tr><td> Hamamatsu EM-CCD Kamera </td><td> Hamamatsu </td><td> C9100-13 </td><td> CCD-Mikroskop kamera </td></tr><tr><td> 15 ml konik tüp </td><td> BD Falcon </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml konik bir tüp </td><td> VWR </td><td> 3282-345-300 </td><td></td></tr><tr><td> Nikon Biostation </td><td> Nikon Instruments Inc </td><td> Biostation IM </td><td></td></tr><tr><td> Cam alt kültür çanak </td><td> Mattek Corporation, </td><td> P35G-0 </td><td> 35 mm petri, 10 mm kuyucuk </td></tr></tbody></table>

quantitative high-throughput single-cell cytotoxicity assay for t cells

Kanser immünoterapi tümörleri hedef ve yok etmek için bağışıklık yanıtının özgüllüğü koşum olabilir. Genetik bir kimerik antijen reseptör (SYR) ifade etmek için değiştirilmiş T hücrelerinin evlatlık transferi dayalı evlatlık hücre tedavisi (ACT) klinik çalışmalarda 1-4 önemli olacağını göstermiştir. Orada CAR kullanarak + T hücreleri olmayan MHC kısıtlı antijenleri hedeflemek ve konak içinde homing ve sebat optimum yaşam için T hücreleri, daha işlevsel yeteneği dahil olmak üzere kanser tedavisi için çeşitli avantajları vardır; ve nihayet CAR apoptoza teşvik etmek + ana toksisite 5 durumunda T hücreleridir. CAR optimum işlevlerini tasvir + klinik fayda ile ilişkili T hücrelerinin klinik çalışmaların yeni nesil tasarımı için önemlidir. Multiphoton mikroskopi gibi canlı hayvan görüntülemede son gelişmeler, immün hücre fonksiyonunun çalışma devrim var in vivo 6,7. Bu in vivo çalışmalar, klinik çalışmalarda T-hücresi bazlı ACT T-hücre fonksiyonlarının anlaşılmasını ederken de kullanarak, önceden infüzyon klinik etkinlik sonrası infüzyon ile T-hücresi preparatlar moleküler ve fonksiyonel özelliği bağlamak için ihtiyaç doğurur sitotoksisite ve sitokin salgılanması gibi T hücre fonksiyonlarının izlenmesi vitro tayinlerde. Standart akım sitometri dayalı testler tek hücre düzeyinde T hücre popülasyonları genel işleyişini belirlemek ancak bu konjugat oluşumu ve yaşam süreleri veya birden fazla hedeflere 8 öldürmek için aynı hücre yeteneği izlenmesi için uygun olmadığını geliştirilmiştir. Polidimetilsiloksan (PDMS) gibi biyouyumlu polimerler dizayn Microfabricated diziler mekansal etkileyiciler ve küçük hacimleri 9 hedeflere sınırlandırmak için özellikle çekici bir yöntemdir. Otomatik time-lapse mikroskopi, tho ile birlikteefektör-hedef etkileşimlerin usands bir nanowell dizi görüntüleme bireysel kuyular tarafından aynı anda izlenebilir. Burada genel olarak T hücrelerinin sitotoksik özelliğe incelemek için uygulanabilir ve tek hücre seviyesinde T-hücre aracılı sitotoksisite izlenmesi için bir yüksek hacimli yöntem sunulmaktadır.

Yüksek verimli sitolitik testinin uygulamasının bir örneği, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Kısaca, CD19 spesifik olarak etiketlenmiş ARAÇ + T hücreleri bir nanowell dizi bireysel haznesi (Bölüm 1-5) olarak etiketli fare hedef EL4 hücreleri ile birlikte inkübe edildi. Bir ilk görüntü dizisi (Bölüm 6) ilgili her nanowell arasında doluluk (etkileyiciler ve / veya hedefler) tanımlamak için otomatik floresan mikroskop kaydedildi. Görüntü işleme tam olarak tek bir hedef ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells at JoVE.com

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Bu tümör hedef hücreleri ile inkübe zaman T hücrelerinin sitotoksisiteye ölçmek için bir tek hücreli yüksek verim tahlil açıklanmaktadır. Bu yöntem, mekansal olarak tanımlanan oranlarda T hücreler ve hedef hücrelerin sınırlandırmak için alt nanolitre kuyular (~ 100.000 kuyu / dizi) ve bir yoğun, elastomerik dizisi kullanır ve efektör-hedef konjugasyon ve daha sonra apoptoz izlemek için flüoresan mikroskop ile birleştirilmiştir.

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

quantitative-high-throughput-single-cell-cytotoxicity-assay-for-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.9K Görüntüleme.  University of Houston. Bu tümör hedef hücreleri ile inkübe zaman T hücrelerinin sitotoksisiteye ölçmek için bir tek hücreli yüksek verim tahlil açıklanmaktadır. Bu yöntem, mekansal olarak tanımlanan oranlarda T hücreler ve hedef hücrelerin sınırlandırmak için alt nanolitre kuyular (~ 100.000 kuyu / dizi) ve bir yoğun, elastomerik dizisi kullanır ve efektör-hedef konjugasyon ve daha sonra apoptoz izlemek için flüoresan mikroskop ile birleştirilmiştir.

Video: Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular organisms towards a source of nutrients or away from unsuitable conditions, as well as in multicellular organisms for tissue development, immune surveillance and wound healing, just to mention a few roles1,2,3. Deregulation of this process can lead to serious neurological, cardiovascular and immunological diseases, as well as exacerbated tumor formation and spread4,5. Molecularly, actin polymerization and receptor recycling have been shown to play important roles in creating cellular extensions (lamellipodia), that drive the forward movement of the cell6,7,8. However, many biological questions about cell migration remain unanswered.
The central role for cellular motility in human health and disease underlines the importance of understanding the specific mechanisms involved in this process and makes accurate methods for evaluating cell motility particularly important. Microscopes are usually used to visualize the movement of cells. However, cells move rather slowly, making the quantitative measurement of cell migration a resource-consuming process requiring expensive cameras and software to create quantitative time-lapsed movies of motile cells. Therefore, the ability to perform a quantitative measurement of cell migration that is cost-effective, non-laborious, and that utilizes common laboratory equipment is a great need for many researchers.
The phagokinetic track motility assay utilizes the ability of a moving cell to clear gold particles from its path to create a measurable track on a colloidal gold-coated glass coverslip9,10. With the use of freely available software, multiple tracks can be evaluated for each treatment to accomplish statistical requirements. The assay can be utilized to assess motility of many cell types, such as cancer cells11,12, fibroblasts9, neutrophils13, skeletal muscle cells14, keratinocytes15, trophoblasts16, endothelial cells17, and monocytes10,18-22. The protocol involves the creation of slides coated with gold nanoparticles (Au&deg;) that are generated by a reduction of chloroauric acid (Au3+) by sodium citrate. This method was developed by Turkevich et al. in 195123 and then improved in the 1970s by Frens et al.24,25. As a result of this chemical reduction step, gold particles (10-20 nm in diameter) precipitate from the reaction mixture and can be applied to glass coverslips, which are then ready for use in cellular migration analyses9,26,27.
In general, the phagokinetic track motility assay is a quick, quantitative and easy measure of cellular motility. In addition, it can be utilized as a simple high-throughput assay, for use with cell types that are not amenable to time-lapsed imaging, as well as other uses depending on the needs of the researcher. Together, the ability to quantitatively measure cellular motility of multiple cell types without the need for expensive microscopes and software, along with the use of common laboratory equipment and chemicals, make the phagokinetic track motility assay a solid choice for scientists with an interest in understanding cellular motility.

The phagokinetic motility track assay is a method used to assess the movement of cells. Specifically, the assay measures chemokinesis (random cell motility) over time in a quantitative manner. The assay takes advantage of the ability of cells to create a measurable track of their movement on colloidal gold-coated coverslips.

Phagokinetic Parça Motilite Testi sayesinde Hücre Göç Kantitatif Değerlendirilmesi

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Yüksek verim Kantitatif Gerçek zamanlı RT-PCR Testi Türleri I ve III İnterferon Alttipleriyle İfadesi Profilleri belirlenmesi için

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation. 
Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

Ekstraselüler DNA Yayın Yüksek Verimli Ölçme ve İnsan Nötrofiller Kantitatif NET Oluşumu<em&gt; İn Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

Yüksek Verimli, gerçek zamanlı, Hücre içi Antimikrobiyal Aktiviteleri Çift okuma Test ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için uygun bir floresan bazlı lenfositi analizi

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. NETs have been demonstrated to serve as an important host defense mechanism that traps and kills microorganisms. On the other hand, they have been implicated in diverse systemic autoimmune diseases. NETs are immunogenic and toxic structures that contain a pool of relevant autoantigens including anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)-associated vasculitis (AAV) and systemic lupus erythematosus (SLE). Different forms of NETs can be induced depending on the stimulus. The amount of NETs can be quantified using different techniques including measuring DNA release in supernatants, measuring DNA-complexed with NET-molecules like myeloperoxidase (MPO) or neutrophil elastase (NE), measuring the presence of citrullinated histones by fluorescence microscopy, or flow cytometric detection of NET-components which all have different features regarding their specificity, sensitivity, objectivity, and quantity. Here is a protocol to quantify ex vivo NET formation in a highly-sensitive, high-throughput manner by using three-dimensional immunofluorescence confocal microscopy. This protocol can be applied to address various research questions about NET formation and degradation in health and disease.

This protocol describes a highly sensitive and high throughput neutrophil extracellular trap (NET) assay for the semi-automated quantification of ex vivo NET formation by immunofluorescence three-dimensional confocal microscopy. This protocol can be used to evaluate NET formation and degradation after different stimuli and can be used to study potential NET-targeted therapies.

Nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu ölçmek ve değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek tahlil

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Bir yüksek-den geçerek Shigella-belirli bakterisidal tahlil

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

Tek-T hücreleri veya tek parçacık Immünolojik tek hücreli kuvvet spektroskopisi ile Atomic Force mikroskop Cantilevers functionalization

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...