Antikora bağımlı hücresel sitotoksisite veya kısaca ADCC, NK hücreleri, granülositler ve makrofajlar olarak adlandırdığımız doğal öldürücü hücreler tarafından aracılık edilebilir. Bunlar ADCC'nin efektör hücreleridir. Epidermal büyüme faktörü reseptörü HER2'yi hedef alan trastuzumab gibi bir antikor tümör hücrelerine bağlanırsa, bu efektör hücreler antikorların sabit FC bölgesini bağlamak için FcyR reseptörlerini kullanırlar.
Antikor, tümör hücrelerini ve FcyR reseptör taşıyan efektör hücrelerini birbirine bağlar ve sitotoksik granüllerinin salınımını tetikler. Bu, kanser hücrelerinin apoptozuna yol açar. ADCC, trastuzumabın anti-proliferatif etkilerine yanıt vermeyen tümörlere karşı etkili olabilir.
ADCC sistemini kurmak için, anti-HER2 pozitif JIMT-1 meme karsinomu hücrelerini, anti-HER2 antikoru trastuzumab varlığında NK-92 hücre hattı ile birlikte inkübe etmemiz gerekir. Tahlil için kullandığımız JIMT-1 hücre hattı, yeşil floresan proteinini istikrarlı bir şekilde ifade eder. İlk olarak, 96 kuyucuklu yüksek içerikli eleme plakasını JIMT ortamıyla kodlayın.
Plakanın her bir kuyucuğuna 50 mikrolitre ortam pipetleyin. Plakayı bir saat boyunca bir CO2 inkübatörüne yerleştirin. Kaplama, JIMT-1 hücrelerinin plakanın cam yüzeyine tutturulması için çok önemlidir.
Kaplama adımı sırasında, JIMT-1 hücrelerini deneyin. Hücreleri iki mililitre steril PBS ile yıkayın. Ardından, şişeye bir mililitre Tripsin-EDTA ekleyin.
Şişeyi 10 dakika boyunca bir CO2 inkübatörüne geri koyun. Kuluçkadan sonra, JIMT-1 hücrelerinin ayrılıp ayrılmadığını kontrol etmek için şişeye dokunun. İki mililitre JIMT-1 ortamı ile sindirimi durdurun ve hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe toplayın.
Ardından, mavi bir döküm odasında tripan mavisi ile JIMT-1 hücrelerini sayın. Hücre numarasını ml başına 133.000 hücreye ayarlayın. Kaplama ortamını aspire edin ve ardından her bir kuyucuğa 75 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin.
Hücrelerin bir CO2 inkübatöründe 37 santigrat derecede bir gece inkübasyonu sırasında bağlanmasına izin verin. Ertesi gün, ortamı aspire edin ve kuyucuklara 50 mikrolitre taze JIMT-1 ortamı ekleyin ve plakayı yüksek verimli tarama laboratuvarına aktarın. Robot, test bileşiklerini yüksek içerikli tarama mikroplakalarına aktarmak için kullanılır.
Robot kolu ile robot, 25 nanolitre aktarmak için kalibre edilmiş pim alet ünitesini yakalar. Dört adımda toplam 100 nanolitre test bileşiğini bileşik kütüphane plakasından tahlil plakasına aktarın. Test bileşiklerinin nihai konsantrasyonunun 20 mikromolar olduğundan emin olun.
Her adım arasında, önce pim aletini% 50 DMSO ve daha sonra% 70 etanol içinde yıkayın. Plakayı bir saat boyunca bir CO2 inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin. T25 doku kültürü şişelerindeki kültür NK hücreleri.
JIMT-1 hücrelerinin ilaç tedavisi devam ederken, NK hücrelerini bir T25 şişesinden 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne toplayın. NK-92 hücrelerini mavi bir sayım odasında tripan mavisi ile sayın. Hücre numarasını ml başına 400.000 hücreye ayarlayın.
Oda sıcaklığında üç dakika boyunca 150 g'da ml başına 400.000 hücre içeren NK hücre süspansiyonunun hacmini santrifüjleyin. JIMT-1 ortamına ml başına 20 mikrogram anti-HER2 antikor trastuzumab ekleyerek ADCC ortamını hazırlayın. Hedef JIMT-1 GFP hücrelerine 50 mikrolitre ADCC ortamında pipet 20.000 NK hücre.
Son hacim 100 mikrolitredir ve nihai trastuzumab konsantrasyonu ml başına 10 mikrogramdır. Tahlil plakasını, 37 santigrat derece ayarlanmış yerleşik bir inkübatöre sahip yüksek içerikli analiz ekipmanına yerleştirin. Plakalar iki zaman noktasında görüntülenir.
İlk olarak, efektör hücrelerin hedef hücrelere eklenmesinden hemen sonra görüntüler elde ederiz ve ikinci görüntü kümesi NK hücrelerinin eklenmesinden üç saat sonra alınır. İlk olarak, mikroplakanın türünü seçin. 96 kuyucuklu yüksek içerikli eleme plakaları kullanın.
Odağı seçmek için seçin, çünkü tahlil konfokal olmayan modda 10x objektife sahip plakalarda gerçekleştirilir. Sinyal-gürültü oranını iki katına çıkarmak için iki bölmeyi seçin. Uygun kanalları, pozlama süresini, lazer gücünü, odak düzlemini ve dalga boyunu seçin.
Parlak alan görüntülerini 650-760 nanometrede alın ve 488 nanometre uyarma ve 500-550 nanometre emisyon dalga boyu ile EGFP dönüştürülmüş JIMT-1 hücrelerini tespit edin. Ölçüme başlamadan önce, doğru ayarları kontrol etmek için anlık görüntü işleviyle örnek görüntüler çekin. Son olarak, görüntüleme için alan sayısını ve zaman noktası sayısını ayarlayın.
Örneğin, dokuz alan ve iki zaman noktası seçin. ADCC verimliliğini analiz etmek için, kontrol ADCC'deki uygulanabilir JIMT-1 hücrelerini iyi sayın. Görüntüdeki hücrelere karşılık gelen bölgeleri algılamak için ince hücreler modülünü kullanın.
Her hücreyi, görüntüde, çevresinden daha yüksek floresan yoğunluğuna sahip bir bölge olarak algılayın. Çapı 80 mikrometre olan yerleşik M algoritmasını kullanarak hücreleri seçin. Büyük bir nesneyi daha küçük nesnelere ayıran bölme duyarlılığı ayarını 0,5 değerine ayarlayın.
En düşük piksel yoğunluğu düzeyi olan ortak eşiği sıfıra ayarlayın. Yüksek EGFP floresan yoğunluğuna sahip arka plan alanının algılanmasını iki adımda hariç tutun. İlk olarak, daha önce seçilen hücreler bölgesindeki EGFP floresan yoğunluğunu belirlemek için yoğunluk özelliklerini hesapla işlevini uygulayın.
Daha sonra, popülasyon seç seçeneğini kullanarak minimum ve maksimum yoğunluk eşiği ayarlayın, böylece ADCC'nin sonunda uygulanabilir JIMT-1 GFP hedef hücrelerinin sayısını elde ederiz. Üç saat sonra algılanan hücre numarasını, sıfır zamanında algılanan hücre numarasına bölerek ADCC verimliliğini hesaplayın. Yöntemimizin pratik uygulamasını temsili sonuçlarla göstermek istiyoruz.
Raflardan rastgele çıkarılan 16 bileşiğin bulunduğu bir test plakası kurduk. Ayrıca, beklenen ADCC inhibitör etkisine sahip üç bileşik, kolşisin, vinkristin, ve podofillotoksin dahil ettik. DMSO negatif kontrol olarak kullanıldı.
Her ilaç plakada dört tekrarda kullanıldı. Şekil test ekranının sonucunu göstermektedir. Eksi NK grubunda, ilaçların JIMT-1 hücreleri üzerindeki toksisitesi test edildi.
Artı NK grubunda, yaklaşık% 50 sitotoksisiteye neden olan NK hücreleri ve trastuzumab eklendi. Üç test bileşiğinin beklenen ADCC inhibitörü etkisi, tahlil ile tespit edilebilir. Meme kanseri hücreleri, NK hücreleri ve terapötik monoklonal antikor trastuzumab arasındaki klinik olarak ilgili etkileşimi modelleyen bir ko-kültür tahlil sistemi kurduk.
Tahlil, görüntü analizi ile birleştirilmiş otomatik mikroskopiye dayanmaktadır ve ADCC modifiye edici ilaçları tanımlamak için kimyasal bileşik kütüphanelerini taramak için uygundur. Prosedür potansiyel olarak bir antitümör yanıtını güçlendiren adjuvan molekülleri tanımlamak veya olumsuz etkisi olan kimyasalları tanımlamak için kullanılabilir.
