xCELLigence gerçek zamanlı hücre analizi, etiketsiz koşullar altında ve birden fazla gün boyunca bağışıklık hücreleri tarafından kanser hücrelerinin öldürülmesini kantitatif olarak izlemenizi sağlar. Bu sistem, hedef oranları düşük etkili de çok sayıda yapı, efektör hücre tipleri veya kombinasyon tedavileri eşzamanlı tarama sağlayan hedef kanser hücresi öldürme tam bir zaman ders sağlar. 37 santigrat derece ve nem ile% 5 karbondioksit bir gecede kuluçka için 150 mililitrelik hücre kültürü çanak DMEM kültür orta yedi HEK293FT hücreleri 1,5 kez 10 tohumlama ile başlayın.
Ertesi sabah, transfeksiyon seyreltme çözeltisi beş mikrogram lentiviral vektör plazmid DNA ve 22,5 mikrogram lentiviral ambalaj karışımı ile 2,5 mililitre transfeksiyon seyreltme çözeltisi transfeksiyon reaktif82,5 mikrolitre ile takviye transfeksiyon seyreltme çözeltisi 2.5 mililitre karıştırın. Oda sıcaklığında 15 dakikalık bir kuluçkadan sonra, reaksiyon damlasını HEK293FT hücrelerinin kabına akıllıca aktarın ve hücreleri ikinci bir gece kuluçka için kuvöze geri döndürün. Ertesi sabah, supernatant taze DMEM kültür orta 19 mililitre ile değiştirin ve gece kuvöz hücreleri geri dönün.
Çözeltiden herhangi bir hücre veya enkaz kaldırmak için ikinci sabah santrifüj ile lentivirus sedimenting önce dört derece Santigrat depolama için tek bir 50 mililitrekonik tüp içine supernatant toplamak. Ultra centrifugation için ultra net bir santrifüj tüp supernatant içeren lentivirus yaklaşık bir mililitre hariç tüm aktarın. Ultracentrifugation sonra, dikkatle supernatant içeren artık virüs aspire, yavaşça pelet dMEM 100 mikrolitre ekleyin ve 15 dakika buz üzerinde tüp yerleştirin.
Kuluçka sonunda, çözeltiyi hafifçe karıştırın ve lentivirus çözeltisini eksi 80 santigrat derecede depolamak için önceden soğutulmuş steril tüplere yerleştirin. Daha sonra üreticinin talimatlarına göre kantitatif RT-PCR ile lentivirus titresini belirleyin. CAR-T hücre üretimi ve genişlemesi için, hücre kültürü kuvözdeki 24 kuyulu bir plakanın bir kuyuda 24 saat boyunca eşit sayıda CD3/CD28 kaplı mikroboncuk içeren bir mililitre CAR-T hücre ortasında altı periferik kan mononükleer hücresine 1-2 kez 10'u etkinleştirin.
Takip eden iki sabah, bir mikrolitre transdüksiyon arttırıcı ajanı hücrelerle karıştırın ve ardından beşe bir enfeksiyon adedinde lentivirus ilavesi ilave edin. T hücresi büyümesini her iki ila üç günde bir, hücreleri mililitre konsantrasyonu başına altı hücreye 1-2 kat 10 oranında tutmak için gerekli olduğu kadar taze CAR-T hücre ortamı ekleyerek izleyin. Akış sitometrisi ile T hücre CAR ifadesini tespit etmek için, üç kez 10 beşinci CAR ve non-transduced T hücreleri bireysel 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüpler içine aktarın.
Santrifüj ile hücreleri toplamak ve FACS tampon 200 mikrolitre içinde pelet resuspend 1% insan serumu ile takviye. Her hücre örneğini buz üzerinde tek tek beş mililitre likit polistiren FACS tüplerinde 100 mikrolitrelik aliquot'a bölün. Beş dakika sonra, her hücre tipinde bir tüpe biyotinylated FAB2 fab2 parçaları nın bir mikrolitresini ve her hücre tipinin diğer tüpüne iki mikrolitre PE etiketli anti-tag antikor ekleyin.
Buz üzerinde 30 dakika sonra, taze FACS tampon üç mililitre ile hücreleri yıkayın ve supernatants decant santrifüj sonra. Kalan supernatant pelet resuspend ve Her tüp için APC anti-CD3 ve 7-AAD iki mikrolitre iki mikrolitre ekleyin. Anti-FAB2 antikor ile boyanmış tüp kısa karıştırma ile PE etiketli Streptavidin bir mikrolitre ekleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde tüm tüpler inkübed.
Kuluçka sonunda, t hücrelerini ileri dağılıma karşı yan dağılım ve CD3'e karşı 7-AAD ekspresyonuna göre gating standart protokollere göre akış sitometrisi ile hücreleri analiz edin. Gerçek zamanlı sitoksis potens analizi için, bir e-plakanın her kuyusuna 50 ila 100 mikrolitre hedef hücre kültürü ortamı ekleyin ve bir hücre analiz cihazındaki arka plan empedansını ölçün. Trippsin kullanarak kültür plakahedef kanser hücrelerini tespit edin.
Taze kültür orta ve santrifüj 15 mililitre hücreleri yıkayın. Saymak için beş mililitre taze ortamda kanser hücresi pelet resuspend ve uygun hedef hücre konsantrasyonu için hücre yoğunluğunu ayarlayın. Kuyuların uygun sayıda hücreleri ekleyin ve hücrelerin kuyuların altına eşit yerleşmek için izin oda sıcaklığında 30 dakika e-plaka bırakın.
Equilibasyon süresinin sonunda, plakayı gerçek zamanlı hücre analizörüne yerleştirin ve gece boyunca her 15 dakikada bir otomatik olarak empedans ölçümlerini başlatın. Hedef hücrelerin yapışmave çoğalması gerçek zamanlı olarak izlenebilir. Ertesi sabah, efektör CAR seyreltmek ve tek tek tüplerde uygun konsantrasyona T hücreleri kontrol ve her kuyuda son hacmi 100 mikrolitre olacak şekilde e-plaka her kuyudan 50 ila 100 mikrolitre çıkarın.
Daha sonra, efektör tohum ve uygun kuyularda kontrol T hücreleri uygun efektör de orta 100 mikrolitre de oranları iyi başına. Daha sonra hücre analiz sistemi için plaka dönmeden önce oda sıcaklığında 30 dakika e-plaka dengeleyin. Hedef kanser hücrelerinin T hücresi aracılı öldürme etkinliğini ölçmek için, 96 saat boyunca CAR-T aracılı öldürme izlemek.
CAR-T hücrelerinin yaklaşık %50'si, T hücrelerinin yaklaşık %50'sinde CAR ekspresyonunu gösteren anti-tek zincirli değişken parça antikor için pozitif boyanmıştır. Bu temsili deneyde, tüm gruplar için 10'a bir efektör hedef oranı kullanılmıştır. Sadece Raji hücreleri ve CD22-CAR T hücresi raji hücrelerini tedavi eden sadece kontrol T hücresi ve Mock CAR-T hücre gruplarına göre önemli miktarda öldürme gösterdi.
Bu deneyde, sadece CD47-CAR-T hücreleri pankreas kanseri hücrelerinin öldürülmesinde etkili oldu. Ayrıca, CD47-CAR-T hücrelerinden gelen empedans sinyali tek başına orta tek başına kuyularda ölçülen hücre indeksi sinyalinin sadece biraz üzerindeydi ve CAR-T hücreleri gibi süspansiyon hücrelerinden kaynaklanan empedans sinyalinin minimal olduğunu ve CAR-T hücreleri hedef kanser hücrelerine eklendiğinde genel empedans sinyaline katkıda bulunmadığını gösteriyordu. Özellikle, GITR co-uyarıcı etki daha epitel büyüme faktörü reseptör pozitif hedef hücreleri gitr etki alanı olmadan orijinal CAR yapıları ile karşılaştırıldığında CAR-T hücre öldürme artırılmasında etkili olduğu gözlenmiştir.
E-plaka kuyularından orta alan, deney sırasında veya sonrasında sitokin profilini deney sırasında veya sonrasında zaman noktalarında analiz etmek için toplanabilir. Genel olarak, xCELLigence kombinasyon tedavileri immün kontrol noktası inhibitörleri için iki-spesifik T hücre meşgulve onkolitik virüsler arasında değişen çeşitli immünoterapilerin potens değerlendirme verimliliğini artırmıştır.
