Odaklanmış iyon ışını litografisi veya FIB kullanımı, araştırmacıların biyouyumluluk ve doğal doku ile entegrasyon artmış malzeme yüzeyleri tasarlayarak hücre yüzeyi etkileşimini artırmak için izin verir. FIB ile, özellikler silikon, metaller ve polimerler gibi çeşitli malzemelere kazınabilir. Düzlemsel olmayan yüzeyler de kullanılabilir ve tek tek cihazlarda işleme sonrası yapılabilir.
Genel olarak bu yöntem diğer mikroskoplarda kullanılabilir. Ancak, farklı mikroskop üreticileri her sistem için optimize edilmelidir desenleme yazılımı, benzersiz sürümleri var. Prosedürü gösteren, Bayan Shreya Mahajan, benim laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olacak.
Montaja hazırlanmak için, silikon probların temiz şeridini dikkatlice almak için ince uçlu delikli vakum forsepsleri kullanın. Elektron mikroskobu FIB görüntüleme ve gravür tarama için kullanılan temiz bir alüminyum saplama üzerine yerleştirin. Sondayı çevreleyen silikon substrat kenarına gümüş boya küçük bir damla yerleştirmek için bir kürdan kullanın.
Sondayı çevreleyen silikon substrat kenarlarına gümüş boya yayarak şerit güvenli. Sem FIB içine alüminyum saplama yerleştirmeden önce gümüş boya tamamen kurumasını bekleyin. Ardından, SEM FIB odasını havalandırmak için Işın Denetimi sekmesindeki Vent düğmesine tıklayın.
Ana sahnegerçekleştirmek için Shift F3 tuşuna basın. Açılan penceredeki Ana Sahne düğmesini seçerek seçimi onaylayın. Ana Aşama tamamlandıktan sonra, sahneyi X=70 milimetre, Y=70 milimetre, Z=0 milimetre, T=0 derece, R=0 derece koordinatlarına taşıyın.
Oda boşaltıldıktan sonra temiz nitril eldivenleri giyin ve oda nın kapısını açın. Probları tutan alüminyum sapı sahne adaptörünün üstüne yerleştirin. Sahne adaptörünün yan tarafındaki set vidasını sıkarak alüminyum sapı sabitle.
Yüksekliğin uygun şekilde ayarlandığından emin olun. Bu görev için 1,5 milimetrelik hex anahtarını kullanın. Navigasyon kamerası kolunu durana kadar dikkatlice açın.
Mikroskop aşaması otomatik olarak kameranın altındaki bir konuma taşınır. Mikroskop kullanıcı arabiriminin Çeyreğinde gösterilen canlı görüntüyü izleyin. Parlaklık düzeyi uygun bir düzeye otomatik olarak ayarlandıktan sonra, kamera braketi üzerindeki düğmeye basarak görüntüyü elde edin.
Bu işlem yaklaşık 10 saniye sürer. Kamera kolunu kapalı konuma geri salın. Sahne orijinal konumuna geri dönecektir.
Mikroskop odası nın kapısını dikkatlice kapatın. Kapıyı kapatırken Quadrant Four'daki CCD kamera görüntüsünü izleyin. Numunelerin ve sahnenin mikroskop odasındaki herhangi bir kritik bileşenden güvenli bir mesafede olduğundan emin olun.
Oda vakum pompasını ve dahili plazma temizleyicisini başlatmak için kullanıcı arabirimi yazılımında Örnek Temizleme düğmesini seçin. Mikroskop haznesinin pompalama süresi ve plazma temizleme döngüsünün tamamlanması için yaklaşık sekiz dakika bekleyin. Kullanıcı arabiriminin sağ alt köşesindeki simge yeşile döndüğünde, elektron ve iyon demetlerini açan ışın kontrol sekmesindeki Uyandırma düğmesine basın.
Quadrant One'ı seçin ve ışın sinyalini Elektron ışınına ayarlayın. Sonra Çeyrek 2'yi Ion Beam'e ayarla. Şimdi, SEM voltajını beş kilovolta, SEM ışını akımını 0,20 nanoamp'a, SEM Dedektörünü ETD'ye ve Dedektör Modunu İkincil Elektronlara ayarlayın.
FIB Voltajını 30 kilovolta, FIB ışınını 24 pikoama, FIB Dedektörünü ICE Dedektörüne ve Dedektör Modunu İkincil Elektrona ayarlayın. Navigasyon kamerası görüntüsünde silikon sonda çift tıklayın, Quadrant Üç sonda yaklaşık konumuna sahne taşımak için. Aktif kadranda seçmek için Quadrant One'a tıklayın ve SEM taramasını başlatmak için duraklatma düğmesine basın.
Taraya çalışma süresini 300 nanosaniyeye ayarlayın ve Scan Interlacing, Line Integration ve Frame Ortalamasını kapatın. Işın Denetimi sekmesinde Scan Döndürme'yi sıfıra ayarlayın. Işın Kaydırma 2D Ayarlayıcısı'na sağ tıklayın ve sıfır'ı seçin.
Büyütme tonuzunu mikroskop kullanıcı arabirimi panelinde saat yönünün tersine çevirerek büyütmeyi minimum değere ayarlayın. Kullanıcı arabirimi panelindeki veya otomatik kontrast lı parlaklık araç çubuğu simgesindeki düğümleri kullanarak görüntü parlaklığını ve kontrastını ayarlayın. Bir özellik üzerinde fareyi tıklatarak sahneyi çift sola tıklayarak ortalayarak taşıyın.
Daha sonra istenilen silikon probu sem görüntünün merkezine desenli olarak hareket ettirin. Toz parçacığı veya çizik gibi bir kenar veya başka bir özelliği bulun. Büyütme tonmasını saat yönünde çevirerek büyütmeyi 2000x'e yükseltin.
Görüntü odaklanana kadar mikroskop kullanıcı arabirimindeki kaba ve ince odak düğümlerini çevirerek SEM'nin odağının ayarını ayarlayın. Görüntü netlince, araç çubuğundaki çalışma mesafesi düğmesine Bağlantı örneği Z'yi seçin. Gezinti sekmesindeki Z ekseni koordinatına bakarak işlemin tamamlandığını doğrulayın.
Değeri yaklaşık 11 milimetre olmalıdır. Z ekseni konumuna 4,0 milimetre yazın ve fareyle Git düğmesine basın. Silikon sondanın omzunu bulmak için X ve Y'deki sahneyi hareket ettirin.
MÜMKÜN OLDUĞUNCA SEM merkezine yakın konumlandırın. Sahne eğimini T koordinatına 52 yazıp Enter tuşuna basarak 52 dereceye değiştirin.
Probun omzunu SEM görüntüsünün merkezine geri getirmek için Sahne Z kaydırıcısını kullanın. Yalnızca Z konumunu ayarlayın. X, Y, T veya R eksenini hareket ettirin.
Sahne açılır menüsünde yer alan yerleşik XT Hizalama Özelliğini çalıştırın. Sondanın kenarına paralel iki noktaya tıklamak için fareyi kullanın. Açılan pencerede yatay radyo düğmesinin seçildiğinden emin olun ve Bitir'e tıklayın.
Sahne, probu sahnenin X ekseni ile hizalamak için döndürülür. Sondanın alt omzunu sem görüntüsünün ortasına tekrar koymak için fareyi kullanarak XY'deki aşamayı ayarlayın. Quadrant Two'daki FIB'yi seçin ve ışın akımının hala 24 pikoamp olduğundan emin olun.
Büyütmeyi 5000X'e, çalışma süresini ise 100 nanosaniyeye ayarlayın. FIB odağı 13 milimetreye ayarlamak için klavyedeki Control-F yazın. Işın Denetimi sekmesinde, Stigmator 2D ayarlayıcısına sağ tıklayın ve sıfır'ı seçin.
Ayrıca, Beam Shift 2D ayarlayıcısı sağ tıklatın ve sıfır seçin. Tetkik döndürmeyi sıfır dereceye ayarlayın ve araç çubuğundaki otomatik kontrast parlaklık düğmesini tıklatın. Quadrant 2'deki sonda omzunun görüntüsünü arayın.
FIB'de görüntü elde etmek için anlık görüntü aracını kullanın. Sonda omzunun FIB görüntüsünün merkezinde olduğunu doğrulayın. Değilse, orta doğru taşımak için prob omzuna çift tıklayın.
Klavyedeki sol ok tuşunu yaklaşık 10-15 kez iterek sahneyi sola doğru hareket ettirin. Başka bir anlık görüntü alın ve sonda tarafının hala FIB'nin merkezinde olup olmadığını gözlemleyin. Prob omzunun kenarı sahnenin X ekseni ile mükemmel bir şekilde hizalanana kadar bu adımları tekrarladıktan sonra, sahneyi sondanın alt omzuna geri taşımak için FIB'yi kullanın.
Ekle düğmesini tıklatarak sahne konumunu konum listesine kaydedin. FIB ışını akımını 2,5 nanoamp'a değiştirin ve FIB'nin büyütülmesinin hala 5000X olduğundan emin olun. Otomatik parlaklık kontrast işlevini çalıştırın ve FIB yaşam süresini 100 nanosaniyeye ayarlayın.
Taramaya başlamak için duraklat düğmesine basın. FIB odağı ve astigmat'ı, kullanıcı arabirimi panelindeki kaba ve ince odak topuzlarını ve X ve Y stigmator topuzlarını kullanarak mümkün olduğunca hızlı ve hassas bir şekilde ayarlayın. FIB taramasını durdurmak için duraklatma düğmesine basın.
Nanobuilder yazılımı içinde, Silikon Problar Desenleme için dosyayı açın. Mikroskop açılır menüsünü seçin ve Sahne Başlangıç ını Ayarla'yı seçin. Mikroskop açılır menüsünü seçin ve ardından Dedektörleri Kalibre Edin'i seçin.
Mikroskop kullanıcı arabiriminde, Quad One'ı seçmek için fareyle bir kez Quad One'a tıklayın. Kalibrasyonu başlatmak için Tamam'ı tıklatın. İşlem yaklaşık beş dakika sürecek.
ETD ve ICE dedektörlerinin kalibre olduğundan emin olun. Yazılım içinde, Microscope açılır menüsünü seçin ve desen dizisini başlatmak için Yürüt'ün'u seçin. Desen tamamlandığında, yazılımı kapatın.
Mikroskop kirişleri kapatmak ve havalandırma döngüsünü başlatmak için mikroskop kullanıcı arayüzü Kiriş Kontrol sekmesinde Vent hit. Oda havalanırken, sahneyi uygun koordinatlara taşıyın. Oda boşaltıldıktan sonra, temiz nitril eldivenleri giyin ve oda nın kapısını açın.
1,5 milimetrelik hex anahtarı nı kullanarak saplama adaptöründeki set vidasını gevşetin. Desenli sondayı içeren alüminyum sapı hazneden çıkarın. Mikroskop odası nın kapısını dikkatlice kapatın.
Kapıyı kapatırken Quadrant Four'daki CCD kamera görüntüsünü izleyin. Sahne adaptörünü mikroskop odasındaki herhangi bir kritik bileşenden güvenli bir mesafede olduğundan emin olun. Burada gösterilen sap arka tarafında FIB kazınmıştır nano-mimarileri ile fonksiyonel olmayan tek saplı silikon probların SEM görüntüleri.
Kazınmış nano-mimarinin son boyutları 200 nanometre genişliğinde paralel çizgiler 300 nanometre arayla aralıklı ve 200 nanometre derinliğe sahipti. Sondanın yüzeyine nano mimarilerin aşındırma implantın etrafındaki nöronal yoğunluğu hemen nasıl etkilediğini belirlemek için nöronal çekirdekler lekelenmiş ve ölçüldü. Nöronal sağkalım, implant bölgesinden 50 mikron luk aynı hayvan uzaklıklarından arka plan bölgesinin bir yüzdesi olarak sunulur.
İmplant alanından 100 ila 150 mikron uzaklıkta nano-mimari probların etrafında, implantasyon sonrası dört hafta olan düz kontrol implantlarıyla karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha fazla nöron vardı. Nano-mimariler de fonksiyonel tek saplı silikon mikroelektrotların arka tarafına FIB kazınmış ve gravür nano-mimarilerin elektrot performansını nasıl etkilediğini araştırmak için elektrofizyolojik ölçümler ölçüldü. Elektrofizyolojik sonuçlar, nano-mimari mikroelektrotlardan tek ünitekaydeden kanalların yüzdelerinin, düzgün kontrol mikroelektrotlarına kıyasla arttığını göstermiştir.
Nano-mimari mikroelektrot için istatistiksel analiz yapılmadı çünkü konsept pilot çalışmasının kanıtı için sadece bir tanesi yerleştirildi. FIB gravür, araştırmacıların tıbbi cihazlara topografik ipuçları eklemenin hücresel yanıtı ve nihayetinde cihazın performansını nasıl iyileştirebileceğini araştırmalarına olanak tanır. FIB çeşitli malzemelerde, yüzey geometrilerinde ve en önemlisi zaten üretilmiş cihazlarda yapIlebildiği için, bu yöntemlerin uygulanabileceği tıbbi cihazların genişliği sınırsızdır.
