Bu protokol yararlıdır, çünkü fonksiyonel hava yolu epitel hücrelerinin üretilmesine izin veren ve daha sonra hava yolu biyolojisinin çeşitli yönlerini incelemek için kullanılabilecek adımları izlemesi kolaydır. Bu protokolün temel avantajı, birçok fonksiyonel hava yolu epitel hücre kültürü üretme ve aynı zamanda birincil hava yolu hücrelerinin elde edilmesi ve kültürlenmesinin zorluklarından kaçınma yeteneğidir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan yüksek lisans öğrencisi Taylor Matte olacaktır.
Buz üzerinde yeterli miktarda 3D matris çözerek başlayın. Kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde tutun. iBC'lerin daha önce kriyokorunmuş tek hücreli süspansiyonlarından oluşan bir şişeyi, görünür donmuş ortam kalmayana kadar 37 santigrat derecelik bir su veya boncuk banyosunda inkübe ederek çözün.
Beş mililitrelik serolojik pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücre süspansiyonuna damla damla altı ila 10 mililitre DMEM / F12 ekleyin. Hücreleri peletlemek için 300 RCF'de beş dakika boyunca hafifçe karıştırın ve santrifüj yapın.
Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini bir P1000 mikropipet ile bir mililitre Bazal Hücre Ortamında yeniden askıya alın. 10 mikrolitrelik bir aliquot hazırlayın ve bir hücre sayımı yapın. Hücreleri beş dakika boyunca 300 RCF'de santrifüj yapın.
Süpernatantı aspire edin ve hücreleri daha önce bir P1000 mikropipet ile 3D matriste çözülmüş mikrolitre başına 4.000 hücre yoğunluğunda yeniden askıya alın. Bir P200 mikropipet ile, 12 delikli doku kültürü ile muamele edilmiş bir plakanın her bir kuyucuğunun tabanına yaklaşık 25 ila 50 mikrolitreye karşılık gelen matris çözeltisinin bir damlacığını ekleyin. Plakayı yaklaşık 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Ardından, beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak damlacığı tamamen suya batırmak için her bir kuyucuğa yeterli bazal hücre ortamı ekleyin. Plakayı nemlendirilmiş bir inkübatöre geri koyun. Her iki günde bir taze Bazal Hücre Ortamı kullanarak hücreleri besleyin.
Hücre damlacığını rahatsız etmemeye dikkat ederek beş mililitrelik bir serolojik pipetle kuyunun kenarına taze ortam ekleyin. Buz üzerindeki 3D matrisin yeterli hacmini çözün. Kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde tutun.
Kültür plakalarını yaklaşık beş ila yedi gün inkübe ettikten sonra, ortamı her bir kuyucuktan aspire edin, daha sonra bir P1000 mikropipet kullanarak, matrisin damlacığından ayrılmak için doğrudan sferoidlerin üzerine bir mililitre dispase II ekleyin. Plakayı 10 ila 15 dakika boyunca 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin. Bir P1000 mikropipet kullanarak, 3B matrisin büyük kümelerini parçalayarak dispazeyi iki kez yukarı ve aşağı pipetleyerek, karıştırın.
Plakayı 30 ila 40 dakika daha 37 santigrat dereceye geri döndürün ve matrisin tamamen çözünmesini sağlayın. 3D matrisin damlacığı artık ışık mikroskobu altında görünmediğinde, serbestçe yüzen sferoidleri beş mililitrelik bir serolojik pipet ucu kullanarak 15 mililitrelik bir konik tüpe ekleyin. Konik tüp başına 10 mililitrelik son hacim için DMEM / F12 ekleyin ve sferoidleri peletlemek için üç dakika boyunca 200 RCF'de santrifüj yapın.
Süpernatantı aspire edin ve ayrışmış her ilk damlacık için bir mililitre% 0.05 tripsin ekleyin. 37 santigrat derecede inkübe edin, her iki ila üç dakikada bir tritüre edin. Çözümü birkaç dakikada bir ışık mikroskobu ile değerlendirin.
Sferoidlerin% 90'ından fazlası tek hücrelere ayrıştığında, tripsine% 10 fetal sığır serumu ekleyin. Hücreleri 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden süzün ve beş dakika boyunca 300 RCF'de santrifüj yapın. Bir hücre sayımı yapın ve çözülmüş 3B matrisin mikrolitresi başına 400 hücre yoğunluğunda hücreleri eşit şekilde yeniden askıya alın.
Hava kabarcıkları sokmaktan kaçının. Aşağı akış uygulaması için gerektiği kadar damlacığı yeniden askıya alın. Bu işlemi her kuyucuk için tekrarlayın.
En son geçişten 10 ila 14 gün sonra, sferoidleri daha önce gösterildiği gibi tek bir hücre süspansiyonuna ayırın ve bir hücre sayımı yapın. Hücreleri sıralama arabelleğinde yeniden askıya alın. Bu ana nüfus olacak.
25 ila 50 mikrolitrelik küçük bir alikotu ayrı bir tüpe aktarın. Bu küçük nüfus olacak. Ana hücre popülasyonuna konjuge anti-NGFR antikoru ekleyin.
Minör hücre popülasyonuna izotip kontrol antikoru ekleyin. Hücreleri ışıktan koruyun ve 30 dakika boyunca buz üzerinde tutun, peletlenmeyi önlemek için hücreleri aralıklı olarak Tritüre edin. 30 dakika sonra, sıralama arabelleğini her hücre tüpüne ekleyin.
Hücreleri beş dakika boyunca 300 RCF'de santrifüj yapın. Süper natantı aspire edin, peletlenmiş hücreleri sıralama tamponunda yeniden askıya alın ve canlı veya ölü hücre boyası ekleyin. Uygun bir NGFR pozitif geçit stratejisi kullanarak, gerekli aşağı akış uygulamaları için yeterli sayıda NGFR pozitif hücreyi sıralayın.
Üreticinin talimatına göre apikal odaya 200 mikrolitrelik bir matris ekleyerek 6,5 milimetre gözenekli membran ekleri hazırlayın. Gerekmeden önce en az iki saat boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin. Kaplama matrisini kesici ucun apikal odasından aspire edin.
Bazolateral odaya 500 mikrolitre Bazal Hücre Ortamı ekleyin. 100 ila 200 mikrolitre Bazal Hücre Ortamında en az 30.000 sıralanmış NGFR pozitif hücreyi yeniden askıya alın ve bir P200 mikropipet kullanarak apikal odaya aktarın. Kalan kuyucuklar için tekrarlayın.
Plakayı nemlendirilmiş 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin. İki ila üç gün içinde, apikal ve bazolateral odaları aspire edin ve taze Bazal Hücre Ortamı ile besleyin. Işık mikroskobu ile apikal odacığı günlük olarak izleyin.
Hücreler% 80'den fazla birleşmeye ulaştığında, Bazal Hücre Ortamını hem apikal hem de bazolateral odalarda ALI farklılaşma ortamı ile değiştirin. Medya kaplarını folyoya sarılmış halde tutarak ve mümkün olduğunda tepe lambalarını kapatarak ALI farklılaştırma ortamını ışıktan koruyun. Ertesi gün, ortamı apikal odadan aspire edin, böylece apikal yüzeyi havaya maruz bırakın.
Bazolateral odadaki ALI farklılaşma ortamını her iki ila üç günde bir değiştirin. Kültür görünümünü her bir ila iki günde bir izleyin. Biriken herhangi bir sıvıyı, hücre tabakasını rahatsız etmeden apikal odadan dikkatlice aspire edin.
Enkaz veya mukusları gidermek için apikal odaya kalsiyum veya magnezyum içermeyen 100 mikrolitre PBS'yi yavaşça ekleyin. 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin ve ardından PBS'yi dikkatlice aspire edin. TEER'i epitel bütünlüğü açısından değerlendirin.
Yedi ila 10 gün havaya maruz kaldıktan sonra, ışık mikroskobu kullanarak multicilia'nın görünümünü gözlemleyin. Planlanan deneye ve okumaya bağlı olarak, hücreler 14 ila 28 gün havaya maruz kaldıktan sonra analiz edilebilir. En son 3B kültür geçişinden 10 ila 14 gün sonra, sferoidleri daha önce gösterildiği gibi tek hücreli süspansiyona ayırın.
Bir hücre sayımı yapın, hücre süspansiyonunu bir kriyovyalde kriyoprezervasyon ortamında yeniden askıya alın. Sıcaklıkta sabit bir düşüş sağlamak için kriyovalleri bir kaba yerleştirin. Ve 24 ila 48 saat boyunca eksi 80 santigrat dereceye aktarın, ardından uzun süreli depolama için eksi 150 santigrat dereceye aktarın.
Bu geçit tekniği ile canlı tek hücrelerin %28'i NGFR pozitifti. İki gün sonra, bireysel hücreler başlangıçta kolayca tanımlanabilir hale geldi ve uzun iğ şeklinde bir görünüme sahipti. İki gün sonra, hücreler akıcı ve gevşek bir şekilde paketlenmiş tek katmanlı bir tabaka oluşturdu.
Sonraki günlerden haftalara kadar, hücreler sıkıca paketlenmiş, yüksek hücresel bir epitel tabakası oluşturdu. Ve yedi ila 10 gün sonra, kirpik ve mukus üretimini yenen açık bir şekilde ortaya çıktı. Örneklerin TEER'i ölçüldü ve sonuçlar primer hava yolu epitel hücre kontrol örneklerinin ölçümlerine benzerdi.
Daha sonra paraform aldehit ile fiksasyon ve kanonik hava yolu epitel hücre belirteçleri için immünoetiketleme MUC5AC ve asetillenmiş alfa-tübülin için diğerleri arasında gerçekleştirildi. Bu protokolü takiben, araştırmacılar hem hastalık hem de sağlıkta bazal, sekretuar ve multisiliye hücrelerin işlevlerini test edenler de dahil olmak üzere çeşitli okumaları değerlendirmek için çok sayıda hasta kaynaklı hava yolu epitel hücre kültürü oluşturabilirler.
