Yazarlar destek için TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE-0098-00) ve NIH R21CA152473 ederim.

1. Hücre Seeding <ol><li> Hücreleri overconfluency büyümeye izin vermeyin. Birincil hücreler transfekte erken ne zaman geçiş hücreleri kullanın. </li><li> Transfeksiyon öncesi Yirmi dört saat, hücrelerin Trypsinize bir hemositometre kullanılarak hücrelerin sayısı, ve arzu edilen hücre yoğunluğu (hücre / hacim) elde etmek için ortam ile hücre süspansiyonu seyreltin. Net doku içine Tohum hücrelerinin bir rezervuar ve çok kanallı pipetler kullanarak düz alt 96-kuyucuğu kültür-tedavi. Seçilen yoğunluk transfeksiyon gününde confluency% 70-80 vermelidir. Tablo 1 &#39;de gösterildiği gibi, örneğin, hücre burada gösterilen veri transfeksiyon için 25-50 hücre / ml&#39; ye seyreltilir edildi. </li></ol> 2. Hücre Transfeksiyon <ol><li> Polimer ve DNA stokların seyreltilmesi. Oda sıcaklığında (RT) az polimer ve DNA stok çözeltileri, çözülme. On iki kanallı pipet kullanarak net 96-kuyucuğu ayrı polimer stok solüsyonu ve DNA stok solüsyonu, sulandırınız, DNA ağırlık oranı (ağırlık / ağırlık) için arzu edilen polimer ağırlığı elde etmek için gereken konsantrasyon ile uygun bir solvent ile. Bu durumda, seçilen çözücü, 25 mM sodyum asetat tamponu (pH = 5.2) &#39;dir. <ol><li> DNA seyreltme. Tipik olarak, 1 mg / ml &#39;de saklanan DNA olmayan bir doku kültürü ile tedavi edilen berrak 96-kuyulu plaka (tek bir formülasyon için iyi bir) 0,03-0,06 mg / ml&#39; lik bir konsantrasyon ile sodyum asetat tamponu içinde seyreltilir. Tablo 2 Adım 1 hücreleri ile tohumlanan 96 çukurlu bir plaka içinde dört tekrarlanan kuyu transfekte etmek için kullanılan tek bir formülasyon için tipik seyreltme DNA protokolü. </li><li> Polimer seyreltme. 100 mg / ml polimer / DMSO çözeltisi DNA ağırlık / ağırlık oranı arzu edilen polimer elde etmek için gerekli olan konsantrasyon göre sodyum asetat tamponu içinde seyreltilir. Genellikle poli (beta-amino ester) s (PBAEs) ile gen dağıtımı için kullanılan ağırlık / ağırlık oranları aralığı 20 ila 100 &#39;dür. PBAE polimerler ilk seyreltme s, ardından 10 mg / ml &#39;ye seyreltilirotokol, Tablo 3&#39;te gösterilmiştir. Polimer seyreltmeler DNA seyreltme plaka yönlendirme örnek uygun olmayan bir doku kültürü ile tedavi edilen berrak 96-kuyulu plaka içinde gerçekleştirilebilir. </li></ol></li><li> Nanoparçacık oluşumu. On iki kanallı pipet kullanarak plazmid DNA çözeltisi eşit hacmi PBAE çözümü eklenir ve şiddetle karıştırın. Kendi montaj izin vermek için 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışım izin verin. </li><li> Nanoparçacık transfeksiyon. Kendi montaj sonrasında, 20 ul nanopartiküller on iki-kanallı bir pipet kullanılarak kültür ortamı ile damla damla başına de eklendi. Replicate kuyu tedavi edilmeyen kontroller olarak veya ticari olarak mevcut reajanlardır ile transfekte edilir. Transfekte hücreler, 37 ° inkübe edilir 2-4 saat sonra kuyular için C taze ortam (100 ul / çukur) ile değiştirilir. İnkübasyon süresi seçimi hücre hattı, kültür koşulları ve transfeksiyon sisteminize bağlıdır. Transfeksiyon farklılıkKuluçka süresi değişen bir sonucu olarak verim ve hücre toksisitesinin Aşama 3&#39;te tarif edildiği gibi analiz protokol ile ölçülür. </li></ol> 3. Transfeksiyon Verimlilik ve Hücre Toksisitesi Analizi Transfeksiyon etkililiği, flöresanlı bir mikroskop ile görsel olarak incelendi ve bir akış sitometresinde kırk sekiz saat post-transfeksiyon kullanılarak ölçülür. Hücre toksisite, flöresanlı bir mikroskop ile görsel olarak incelendi ve CellTiter 96 sulu bir tahlil yirmi-dört saat post-transfeksiyon kullanılarak ölçülür. <ol><li> Floresan mikroskobu. Görsel olarak uygun floresan kanalı kullanılarak transfekte edilen raportör gen (örneğin, EGFP veya DsRed) ifadesi için analiz kuyu. Uygun özel formülasyon (Şekil 1) için transfeksiyon verimliliği temsil görüş alanları seçerken, her sıra için görüntüleri edinin. Görsel gözlemlenen herhangi hücre toksisite bir yere not edin. </li><li> Akış sitometrisi. <ol><li> Akım sitometri için 96-plaka hazırlamak için çok kanallı pipetler kullanın. PBS ile yıkayın, ul / kuyu tripsin / EDTA 30, kenarlarda da dahil olmak üzere, her bir kuyuya, 170 ul FACS tampon (PBS +% 2 FBS) ile pipet kadar nötralize ve aşağı Trypsinize, ve tüm 200-ul hacim transferi Bir yuvarlak tabanlı veya V-alt 96-plaka karşılık gelen kuyulara her iyi. </li><li> 4, 5 dakika boyunca 130 xg&#39;de levha santrifüje ° C. </li><li> Kabarcıklar kaçınarak her süspansiyonu iyi ve pipet hücrelerden 170 ul ortamı çıkarın. Her bir kuyucuğa, a canlılığı propidyum iyodür (PI) gibi leke kullanmak için, FACS tamponu + PI (PI stok konsantrasyonu 1 mg / ml &#39;PI seyreltme 50:1 FACS tampon) 10 ul ekle. Hemen buz üzerine yerleştirin ve ışıktan kapsamaktadır. </li><li> C6 Accuri akış sitometresi, 96-eki HyperCyt ve HyperView yazılımını başlatın. Uygun p seçmek HyperView Tasarım ve Protokol sekmeleri kullanınGeç tipi, plaka düzeni ve bu tür sallamak / yudum gibi diğer ayarlar / / durulama zamanı sallayın. Yukarıdaki protokol için, aşağıdaki parametreler bir dakika ve 2400 rpm&#39;de 30 saniye boyunca bir ön plaka sallamak için, bir ön plaka asal kullanılmıştır. Sip süresi 15 rpm&#39;de 15 sn için kuruldu, bir prob 2 sn de her durulayın ve bir inter-de 2,400 rpm&#39;de 12 saniye boyunca her 12 kuyuda sallayın. Inter-de sarsıntı hücrelerin kuyu grupları arasında zamanlanmış sonları (bu durumda 12 saniye içinde) ekleyerek verileri işlemek için gelişmiş yeteneği yanı sıra, medyada dağınık tutmak için önemlidir. </li><li> Uygun zamanda (Şekil 2) içine veri ve ayrı işleme HyperView Peki Kimlik sekmesini kullanın. Bireysel kuyular tespit etmek için, bu yazılım gürültü filtresi yanı sıra gelişmiş ayarları altında bile filtre bir baz dahil olmak üzere kullanmak için yardımcı olabilir. </li><li> Farklı açılır ayırmak için uygun yolluk tarafından olumlu transfekte canlı hücrelerin yüzdesi sayısalulations (Şekil 3). İlk enkaz (Şekil 3A) ayrı hücreleri için bir FSC vs SSC dağılım arsa üzerinde akış verileri görüntülemek. Propidium iyodür (PI) kullanılmışsa, kapı bireysel hücre popülasyonu ve görünümü bir FSC vs FL3 arsa üzerinde veri ölü hücreleri ve kapı canlı hücrelerin canlı hücreleri ayırmak için. Transfekte edilmiş hücrelerin sayısı ölçmek için, uygun kanal üzerinde bir canlı hücre nüfusunun görünüm, örneğin GFP FL1 görülebilir. Kapısı arka plan sinyali (Şekil 3B) tespit etmek için, tedavi edilmeyen nüfus işlenmemiş hücreler kullanılması. Olumlu transfekte hücreler daha sonra bu kapı kullanılarak izole ve scatter ve kontur grafikleri (Şekil 3C ve 3D) her ikisini de kullanarak transfekte nüfus görüntüleyerek. Edilebilir Farklı hücre floresan farklı derecelerde transfekte edileceği gibi, pozitif olarak transfekte edilmiş hücrelerin bir süreklilik içinde olabilir. </li></ol></li><html><li> CellTiter 96 sulu bir tahlil <ol><li> Hücre toksisite ölçümleri için tam olarak aynı şekilde başka bir plaka transfekte. </li><li> 10 ml taze medya ile CellTiter 96 sulu bir test solüsyonu Premiks 1 ml. Hücreleri bulunan ortamı çıkarın ve premix çözüm 110 ul + kuyu başına medya eklemek için bir çok kanallı pipet kullanın. </li><li> Işlenmemiş koşulu ile kuyudan absorbans testin lineer aralığında kadar 490 nm 1 ila 4 saat için her bir saat arayla absorbansı ölçülür. Bir arka plan absorbans okuma için tek çözüm + medya ile dört kontrol kuyuları ekleyin. </li><li> Ortalama absorbans koşulu başına dört tekrarında kuyulardan değerleri ve her ortalama ortalama plan absorbans çıkarın. Yüzde hücre yaşayabilirliği belirlemek için, tedavi edilmeyen durumun düzeltilmesi için ortalama her bir tedavi edilen durum için düzeltilmiş ortalama normalize edilir. </li></ol></li></ol>_title &quot;&gt; 4. Nanoparçacık NTA ve Plazmid Başına Parçacık Hesaplamaları ile Boyutlandırma <ol><li> Yaklaşık 1/5th maksimum hız ve maksimum hız yaklaşık 1/10th de geriye örnek pompa ileri seyreltici pompa çalıştırarak Nanosight NS500 Prime Sıvıların sistemi. Sıvıların sistemi seyreltici ile temizlendi kadar devam edin. </li><li> Analiz edilecek nanoparçacıklar hazırlayın. PBAEs durumunda, ayrı ayrı stok plasmid DNA (1 mg / ml) ve Eppendorf tüpleri içinde sodyum asetat tampon içinde stok PBAE (100 mg / ml) (25 mM, pH 5) seyreltin. </li><li> 0.06 mg / ml &#39;ye plazmid DNA konsantrasyonu seyreltilir. Polimer konsantrasyonu DNA polimer için gerekli ağırlık-ağırlık oranına bağlı olarak değişebilir (60 ağ / ağ parçacık için, örneğin, polimer 3.6 mg / ml &#39;ye seyreltilir). </li><li> Plazmid DNA çözeltisinin eşit bir hacmi ile polimer solüsyonu eklenir ve güçlü bir şekilde karıştırılır. Kendi montaj izin vermek için 10 dakika için oda sıcaklığında karışım inkübe edin. </li><li> DiUd nanoparçacık konsantrasyon için sırayla 100 kat PBS içine nanoparçacık çözelti NTA için uygun bir aralık içinde olması ve en azından 500 ul nihai hacim elde etmek için. </li><li> Örnek Eppendorf tüpü (Şekil 4A), yükleme borusu içine yerleştirerek Nanosight içine örnek yerleştirin. Hava kabarcıkları tanıtmak için değil emin olun. </li><li> Parçacıklar görülebilir kadar yakalama modunda, kamerayı düzeyini artırmak. Partikülleri (Şekil 4A ve 4B) düzgün bakmak böylece odak ayarlayın. </li><li> Standart modda iken, tüm parçacıkların ekranda görülebilir noktadan kamera düzeyini ayarlayın. Ardından parçacıklar hâlâ görülebilir böyle düşük seviyeye kamera seviyesini azaltmak. Bir ara kamera seviyesinde gerekli ise, gelişmiş moduna geçer ve kamera deklanşör değiştirmek ve uygun düzeylere kazanmak. </li><li> Görme 20 arasında olmadığından emin olmak için kontrol edin - s 100 partiküllerkontrastını ve parlaklığını. Nanoparçacık izleme için ideal sayı yaklaşık 50 parçacıklardır. Çok fazla veya çok az varsa, NS500 floş PBS içine seyreltme ayarlayın ve örnek yeniden yükleyin. </li><li> Standart mod tabloya göre yakalama süresini ayarlayın. Genellikle 30 - 60 saniye uygun bir yakalama uzunluğu (Şekil 4B) &#39;dir. </li><li> Sonraki örnek yüklemek için, yeniden yüklemek yeni bir örnek daha sonra, sistem yıkayın. </li><li> Bir kez videoları yakalanır, bir video dosyasını açarak işlem aşamasına geçin. </li><li> Iyi (Şekil 4C) bir video işlemek için ayarlanabilir parametreleri vardır. Amaç en iyi şekilde her parçacık (Şekil 5) üzerindeki ekranda kırmızı bir çarpı işareti ile belirtilir ekrandaki her parçacık, yakalama parametrelerini seçmektir. </li><li> Iyi partikülleri görmek için ekrana kazanç artırın. Standart veya gelişmiş modu altında, otomatik üzerine tıklayarak tarafından parametrelerini ayarlamak seçing uygun kutuları. Otomatik ayarlar yeterli parçacıklar seçmemeniz durumunda, unclick kutusu ve parametreleri manuel olarak (Şekil 4C) ayarlayın. </li><li> Bir zamanlar tüm parçacıkların ekranda toplanır, video dosyası (Şekil 4C) işlemek için yazılım süreci düğmesini tıklatın. Bu, parçacık boyutu dağılımı, ortalama boyutu, hem de partikül konsantrasyonu sağlar. </li><li> Partikül konsantrasyonu doğru olduğundan emin olmak için, 2x seyreltme artırarak PBS seyreltme gibi değiştirin ve yukarıdaki işlemi tekrarlayın. Aynı örnek çoklu dilüsyonları ölçülmesi örnek konsantrasyon ölçüm doğru olduğundan emin olmak için tavsiye edilir. Ölçümü için iyi bir dizi 10 7 -10 9 parçacıklar / ml &#39;dir. </li><li> Tüm plazmidler nanopartiküller jel elektroforezi çalışan ve herhangi bir serbest DNA mevcut olup olmadığını değerlendirerek nanopartiküller dahil olduğunu doğrulayın.Tüm plazmid kapsüllü ise, toplam kapsüllü plazmidler ölçmek amacıyla DNA absorbans ölçmek için standart teknikleri kullanın. </li><li> Parçacık başına plazmidlerin ortalama sayısını hesaplamak için, NTA ölçülen partikül konsantrasyonu ile toplam kapsüllü plazmid konsantrasyonu bölün. Plazmid başına parçacık örnek dağılımını tahmin etmek için, ilk olarak partikül her bir 1-nm kabın hacim fraksiyonu hesaplamak için NTA parçacık boyutu histogram kullanır. Her bin plazmid sayısını elde etmek için toplam plazmid miktarı ile bu hacim fraksiyonu dağıtım çarpın. Her parçacık boyutu (Şekil 6) plazmidler başına partikül sayısını elde etmek için, her bin parçacıkların sayısı bu sayıyı böler. </li></ol>

<ol>
	<li>Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymers+for+gene+delivery+across+length+scales.">Polymers for gene delivery across length scales.</a> Nature Materials. 5, 439-451 (2006).</li><li>Sheyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+cells+in+regenerative+medicine+and+tissue+engineering.">Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).</li><li>Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rita+Schaffer+Lecture:+Nanoparticles+for+Intracellular+Nucleic+Acid+Delivery.">Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery.</a> Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).</li><li>Lynn, D. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradable+poly(beta-amino+esters):+Synthesis,+characterization,+and+self-assembly+with+plasmid+DNA.">Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA.</a> J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).</li><li>Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+transfection+with+polymeric+nanoparticles+are+dependent+on+polymer+end-group+structure,+but+largely+independent+of+nanoparticle+physical+and+chemical+properties.">Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties.</a> Mol. Pharm. , (2012).</li><li>Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+nanoparticles+specific+for+human+microvasculature+and+macrovasculature.">Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).</li><li>Bhise, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+terminal+functionalization+and+molecular+weight+of+a+gene+delivery+polymer+and+transfection+efficacy+in+mammary+epithelial+2-D+cultures+and+3-D+organotypic+cultures.">The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures.</a> Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).</li><li>Tzeng, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+gene+delivery+nanoparticles+based+on+poly(beta-amino+esters)+for+treatment+of+glioblastoma.">Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma.</a> Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).</li><li>Sunshine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+End-Groups+of+Linear+Polymer+Determine+Cell-Type+Gene-Delivery+Efficacy.">Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy.</a> Adv. Mater. 21, 4947 (2009).</li><li>Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+quantifying+the+number+of+plasmids+encapsulated+by+polymer+nanoparticles.">A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles.</a> Small. 8, 367-373 (2012).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences.">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li><li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET.">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).</li><li>Kreiss, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+DNA+size+does+not+affect+the+physicochemical+properties+of+lipoplexes+but+modulates+gene+transfer+efficiency.">Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency.</a> Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).</li><li>Pitard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-sized+self-assembling+lamellar+complexes+between+plasmid+DNA+and+cationic+micelles+promote+gene+transfer.">Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).</li><li>Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+solution+of+(Lys)(16)-containing+bifunctional+synthetic+peptide/DNA+nanoparticles+for+gene+delivery.">Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).</li><li>Green, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+polymeric+vectors+for+gene+delivery+to+human+endothelial+cells.">Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells.</a> Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).</li></ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması rapor.

Yukarıdaki protokol nanoparçacık formülasyonların transfeksiyon etkinliği gibi parçacık boyutu ve nanoparçacıkların DNA yükleme karakterize etmek için bir yöntem değerlendirme yöntemleri açıklanmaktadır. Parçacık başına plazmit sayısı parçacık etkisini tahmin yardımcı olabilir önemli bir parametre olan ve aynı zamanda doz tayini için kullanılabilir. Nanopartikül izleme analizi, tuz konsantrasyonunun farklı olanlar gibi çeşitli sulu çözeltiler, bir dizi içinde gerçekleştirilebili...

Nanoparçacık başına komplekslenmiş plazmid sayısının belirlenmesi, özellikle de aynı hedef hücre için birden çok plazmit ortak dağıtımı için etkili nanoparçacık tabanlı bir gen aktarım stratejilere tasarlamak için önemli olan, sıklıkta çalışmaları 12 yeniden programlanması kök hücre gereklidir. Tek bir nanoparçacık ile ilişkili plazmid sayısını hesaplamak için birkaç yaklaşım tarif edilmiştir ve her bir yaklaşım tahmin 13-16 için kullanılan teknikler de dezavantajları vardır edilmiştir. TEM ile birlikte Kuantum nokta (QD) etiketleme kitosan tabanlı nanopartiküller parçacık başına plazmidler tahmin etmek için kullanılır olmuştur. Kapsüllü etiketsiz DNA doğrudan tespit edilememesi olasılığı;; potansiyel örtüşen plazmidler ve parçacıkların 2D TEM görüntülerde QDS; Bu QD teknik ile Kestirimi nedeniyle kendinden montaj özelliklerini değiştirebilir DNA, etiketlemek için ihtiyaç karmaşık ve Diğer basitleştirici kabuller 13. Bir alternatif bir yaklaşımpplicable sipariş microdomains parçacıklar mevcut olduğunda kriyo-transmisyon elektron mikroskobu (kriyo-TEM), X-ışını saçılması ve dinamik ışık saçılımı (DLS) 14,15 aracılığıyla Lipopolyamine-DNA kompleksleri incelemek için kullanılır olmuştur. Ne yazık ki, bu tür araştırmak burada polimer nanopartikülleri gibi malzemeler bu yöntem ile uygulanabilir değildir. . Ancak, kendi yöntemi sadece büyük, mikron boyutlu parçacıklar 16 değerlendirebilir; başka bir çalışmada, Collins ve ark çalışmak için bir akış parçacık görüntü analizi tekniği (Lys) 16-içeren peptid / DNA kompleksleri kullanılır. Böylece, son zamanlarda nanoparçacık 11 başına plazmit sayısı ölçmek için bir roman ve esnek analiz geliştirilmiştir.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reaktif </td></tr><tr><td> Fosfat, 1x (PBS) Tamponlu Salin </td><td> Invitrogen </td><td> 10010 </td><td></td></tr><tr><td> EGM-2mV BulletKit </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin </td><td> Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum asetat tampon </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7899 </td><td> Deiyonize su 25mM için seyreltin </td></tr><tr><td> Dimetil sülfoksit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 276855 </td><td></td></tr><tr><td> pEGFP DNA </td><td> Elim Biyofarmasötikler </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> DsRed DNA </td><td> Addgene </td><td> 21718 </td><td></td></tr><tr><td> PEI, dallı </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 408727 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> CellTiter 96 sulu One </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Malzemeler </td></tr><tr><td> Şeffaf düz dipli 96-plaka, steril </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1581.001 </td><td></td></tr><tr><td> Açık bir yuvarlak tabanlı 96-kuyulu plaka, steril </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> 12 kanallı Finnpipette </td><td> Thermo Scientific </td><td> NA </td><td> 5-50 ve 50-300 ul </td></tr><tr><td> Floresan Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> NA </td><td> Model numarası: AX10 </td></tr><tr><td> C6 Accuri flowsitometri </td><td> BD Biosciences </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> HyperCyt eki </td><td> Intellicyt </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> NS500</td><td> Nanosight </td><td> NA </td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles by nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry

Polimerik nano partiküller kullanarak Sigara viral gen teslimat genetik hastalıklar 1. tedavisinde gen tedavisi için cazip bir yaklaşım olarak ve rejeneratif tıp 2 için bir teknoloji olarak ortaya çıkmıştır. Önemli güvenlik sorunları var virüsler, aksine, polimerik nano partiküller büyük nükleik asit kargo ve biyolojik olarak parçalanabilen ve / veya çevreye duyarlı taşıma kapasitesine sahip, kimyasal olarak çok yönlü, sentezlemek için non-toksik, non-immünojen olmayan mutajenik, daha kolay olması için dizayn edilebilir. Katyonik polimerler yaygın polimerik nano partiküller olarak adlandırılır 100 nm sırasına komplekslerini oluşturmak için elektrostatik etkileşim yoluyla negatif yüklü DNA ile kendi kendine monte. Nano ölçekli polikatyonik gen aktarımı nanopartikülleri oluşturmak için kullanılan biyomateryaller örnekleri arasında bir non-parçalanabilir off-the-shelf bir polilisin, polyphosphoesters, poli (amidoamines) s ve polietilenimin (PEI), yaygın olarak bulunur nükleik asit aktarımı ile 1,3 kullanılan katyonik polimer. Poli (beta-Aminoester) s (PBAEs), 5,6 hidrolitik olarak parçalanabilir olan ve bu tür insan retina endotel hücreleri (HRECs) 7 gibi sert-transfekte hücre tipleri için gen aktarımının etkili olduğu gösterilmiş olan katyonik polimerler 4 yeni bir sınıfıdır fare meme epitel hücreleri 8, insan beyninin kanser hücreleri 9 ve 10 makrovasküler (insan umbilikal ven, HUVEC&#39;lere) endotel hücreleri. Nanoparçacık izleme analizi (NTA) kullanılarak polimer nanopartikülleri karakterize etmek için yeni bir protokol tarif edilmektedir. Bu yaklaşıma göre, partikül büyüklük dağılımı ve parçacık başına plazmid sayısı dağılım hem de 11 elde edilir. Buna ek olarak, polimer nanopartikülleri ile transfeksiyon etkinliğinin hızlı taranması için olan bir yüksek verimli 96-plaka transfeksiyon deneyinde sunulmuştur. Bu protokol, poli (beta-amino ester) s (PBAEs) model polimerler ve insan retina endotel hücreleri (HRECs) olarak kullanılır mo olarak kullanılmaktadırdel insan hücreleri. Bu protokol, kolayca herhangi bir polimerik nanoparçacık ve bir multi-plaka biçiminde ilgi herhangi bir hücre tipi değerlendirmek için adapte edilebilir.

Şekil 1, plazmid EGFP HRECs ile başarılı bir şekilde aktarılmasının bir örnek olarak, flöresanlı bir mikroskop görüntüsü gösterilmektedir. Aydınlık görüntü hücreleri normal morfoloji korumalarını sağlamak için yardımcı olur. Ayrıca, bu tür MTS ya da benzer deneyler gibi hücre canlılığı deneyleri, nanoparçacık toksisite 7 değerlendirmek için de kullanılabilir. Akış sitometrisi, tarif edildiği gibi, transfeksiyon etkinliği ölçmek için kullanılabil...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry at JoVE.com

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Nanoparçacık izleme analizi (NTA) ve polimerik gen teslimat nanopartiküller değerlendirmek için high-throughput Akım sitometri için bir protokol tanımlanmıştır. NTA nanoparçacık parçacık büyüklüğü dağılımı ve plazmid başına parçacık dağılımını karakterize etmek için kullanılmaktadır. Yüksek throughput flow sitometri gen teslimat biyomalzemelerin bir kütüphane için nicel transfeksiyon etkinliği değerlendirilmesini sağlar.

Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

evaluation-polymeric-gene-delivery-nanoparticles-nanoparticle

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.7K Görüntüleme.  Johns Hopkins University School of Medicine. Nanoparçacık izleme analizi (NTA) ve polimerik gen teslimat nanopartiküller değerlendirmek için high-throughput Akım sitometri için bir protokol tanımlanmıştır. NTA nanoparçacık parçacık büyüklüğü dağılımı ve plazmid başına parçacık dağılımını karakterize etmek için kullanılmaktadır. Yüksek throughput flow sitometri gen teslimat biyomalzemelerin bir kütüphane için nicel transfeksiyon etkinliği değerlendirilmesini sağlar.

Video: Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale (nanoparticles). Nanoparticles can be engineered in a precise fashion where their size, composition and surface chemistry can be carefully controlled. This enables unprecedented freedom to modify some of the fundamental properties of their cargo, such as solubility, diffusivity, biodistribution, release characteristics and immunogenicity. Since their inception, nanoparticles have been utilized in many areas of science and medicine, including drug delivery, imaging, and cell biology1-4. However, it has not been fully utilized outside of "nanotechnology laboratories" due to perceived technical barrier. In this article, we describe a simple method to synthesize a polymer based nanoparticle platform that has a wide range of potential applications. 
The first step is to synthesize a diblock co-polymer that has both a hydrophobic domain and hydrophilic domain. Using PLGA and PEG as model polymers, we described a conjugation reaction using EDC/NHS chemistry5 (Fig 1). We also discuss the polymer purification process. The synthesized diblock co-polymer can self-assemble into nanoparticles in the nanoprecipitation process through hydrophobic-hydrophilic interactions.
The described polymer nanoparticle is very versatile. The hydrophobic core of the nanoparticle can be utilized to carry poorly soluble drugs for drug delivery experiments6. Furthermore, the nanoparticles can overcome the problem of toxic solvents for poorly soluble molecular biology reagents, such as wortmannin, which requires a solvent like DMSO. However, DMSO can be toxic to cells and interfere with the experiment. These poorly soluble drugs and reagents can be effectively delivered using polymer nanoparticles with minimal toxicity. Polymer nanoparticles can also be loaded with fluorescent dye and utilized for intracellular trafficking studies. Lastly, these polymer nanoparticles can be conjugated to targeting ligands through surface PEG. Such targeted nanoparticles can be utilized to label specific epitopes on or in cells7-10.

This article describes a nanoprecipitation method to synthesize polymer-based nanoparticles using diblock co-polymers. We will discuss the synthesis of diblock co-polymers, the nanoprecipitation technique, and potential applications.

Nanoprecipitation Tekniği Diblock Polimerik Nanopartiküller formülasyonu

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Biyomühendislik

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Biyomalzemelerin Yüksek Verimli Discovery için Polimer Mikroarray&#39;ler

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

Kombinatorik Sentezi ve Polimer Film ve Nanoparçacık Kütüphaneler gelen Yüksek throughput Protein Yayın

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

Polianhidrid Nanopartiküller Yüksek throughput Karbonhidrat sentezi ve işlevsel

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Fotolitografiyle polimerik Microneedle Dizi Fabrikasyon

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and biodegradability, as well its ability to protect and subsequently release its payload in response to a trigger. While silk can be formulated into various material formats, silk nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems. Therefore, this article covers the procedures for reverse engineering silk cocoons to yield a regenerated silk solution that can be used to generate stable silk nanoparticles. These nanoparticles are subsequently characterized, drug loaded and explored as a potential anticancer drug delivery system. Briefly, silk cocoons are reverse engineered first by degumming the cocoons, followed by silk dissolution and clean up, to yield an aqueous silk solution. Next, the regenerated silk solution is subjected to nanoprecipitation to yield silk nanoparticles &#8211; a simple but powerful method that generates uniform nanoparticles. The silk nanoparticles are characterized according to their size, zeta potential, morphology and stability in aqueous media, as well as their ability to entrap a chemotherapeutic payload and kill human breast cancer cells. Overall, the described methodology yields uniform silk nanoparticles that can be readily explored for a myriad of applications, including their use as a potential nanomedicine.

Nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems for a broad range of indications. Here, we describe a simple yet powerful method to manufacture silk nanoparticles using reverse engineered Bombyx mori silk. These silk nanoparticles can be readily loaded with a therapeutic payload and subsequently explored for drug delivery applications.

İpek Nanopartiküller imalatı ve İlaç Dağıtım Uygulamaları

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Akış Sitometresi ile Primer Sıçan Retinalı Ganglion Hücrelerinin (RGC) İzolasyonu

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Yüksek üretilen iş kullanımı otomatik Microbioreactor sistemi modeli Igg1 CHO hücrelerdeki imalatı için

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

Hidrofobik ve hidrofilik bileşikler polimer nano tanecikleri Kapsülleme için NanoPrecipitation flash

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...