Bu yüksek iş verme protokolü, yabani patojen Pseudomonas syringae'ye kadar domates fidelerinin hızlı bir şekilde taranmasına olanak sağlar. Fide sel testi bitki büyüme süresini ve büyüme odası ihtiyaçlarını en aza indirir, bitkilerin hızlı ciro sağlar ve büyük örnek boyutları test edilmesine olanak sağlar. Bu titreşme vahşi katılımlar ve karmaşık genetik geçmişe sahip diğer çizgilerde direnç için ekran için kullanılabilecek güçlü bir araçtır.
Protokol iki Pseudomonas syringae suşları sel innoculation için özel yönler sağlar. Ancak, çok yönlü ve diğer bakteriyel patojenlere karşı konak direncini tespit etmek için değiştirilebilir. Prosedürü gösteren Yana Hasan, benim laboratuvarda bir araştırma uzmanı olacaktır.
Domates fidesi yetiştirerek başlayın. 2.2 mililitrelik mikrosantrifüj tüp domates tohumları yerleştirin ve% 50 çamaşır suyu çözeltisi iki mililitre ekleyin. 25 dakika boyunca tüp rock sonra bir pipet ile çamaşır suyu çözeltisi kaldırın.
Ultra saf su iki mililitre ekleyin ve tüp beş kez ters çevirerek tohumları yıkayın. Tüpten sıvı aspire ve yıkama dört kez daha tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, ultra saf su iki mililitre ekleyin ve steril bir Petri kabına tohumları dökün.
Etanol onları alev tarafından forceps sterilize sonra 0.5 XMS artı 0.8 yüzde agar medya ile 100 x 25 mililitre plaka üzerine beş ila yedi tohum aktarmak için kullanabilirsiniz. Plakanın kenarlarını cerrahi bantla kapatın. Plakaların düz ve yüz yukarı yığılmış olduğundan emin olun.
Sterilize edilmiş tohumları en az üç gün karanlıkta dört derece sıcaklıkta tabakalaştırın ve çimlenmeyi senkronize edin. Üç gün sonra, dikey olarak kökleri plaka yüzeyi boyunca aşağı büyüyecek ve tohum hattı yatay olarak yönlendirilir böylece plakaları yönlendirmek. Tohumları 16 saatlik ışık ve 8 saatlik karanlık bir döngüyle 22 santigrat dereceye ayarlanmış bir büyüme odasına aktarın.
Bu noktada genellikle tamamen ortaya çıktı ve genişletilmiş cotyledons ve ortaya çıkan ilk gerçek yaprakları gösterecektir odasında on gün boyunca fide büyümek. Düz, steril kürdan ile uygun KB agar üzerine Streak taze bakteri. PstT1 için, taşkın deneyindeki bakterileri kullanmadan önce plakayı 48 saat boyunca 28 derecede kuluçkaya yatırın.
Inokül hazırlamak için, aseptik steril bakterileri resuspend, 0.1 optik yoğunluğuna on milimolar magnezyum klorür. Sonra 0075 bir OD600 ile çalışma konsantrasyonu elde etmek için iki seri seyreltme olun. Ayrıca on milimolar magnezyum klorür non-iyonik organosilikon sürfaktan kopolimer bir ila on seyreltme hazırlamak.
Girdap ve bakterilere ekleyin, karıştırmak için tüp dönen. 10 günlük fidelerin olduğu plakaları büyüme odasından biyogüvenlik kabinine aktarın ve cerrahi bandı çıkarın. Sonra her plakaya altı mililitre inokül aktarın.
Fideleri bir pipet ucuyla inoküle hafifçe itin ve üç dakika süreyle bir zamanlayıcı başlatın. Her elde bir tabak tutun ve fidelerin cotyledons ve yaprakları batırmak için aşağı plaka ön eğim. Inoculum tarafını 5-7 kez yan lara doğru swish, sonra inoculum ile kökleri kapsayacak şekilde plakaları geri ucu.
Plakaları tekrar aşağı yatırın ve döngüyü toplam üç dakika boyunca tekrarlayın. Tabaklardan inoculum dökün, düz bir yüzeye yerleştirin ve ikinci kez herhangi bir kalıntı inoculum dökün. Plakaları tekrar sarın ve büyüme odasına geri yerleştirin.
Moneymaker-PtoR ve Moneymaker-PtoS çeşitleri PSTDC3000 ile sular altında kaldı ve sel yedi ila on gün sonra fenotip. Moneymaker-PtoR fideleri PtoPRF gen kümesini taşır lar ve PSTDC3000'e karşı dirençlidirler. PSTDC3000 efektörleri AVRPto veya AVRPto-B tanıyamaz yakın izojenik Moneymaker-PtoS fideleri hızla öldü iken, sel sonra yedi gün içinde.
On günlük fideler PstT1 ile sular altında kaldı ve sel den en az on gün sonra fenotiplendi. Duyarlı katılımlar öldü, kahverengi apikal meristems vardı ve yeni büyüme yoktu. Buna karşılık, dirençli fideler yeni yeşil büyüme yüksek düzeyde görüntülenen ve PstT1 ile enfeksiyon atlattı.
PstT1 direncini ve Solanum NeoRici LA1329'u kantitatif olarak doğrulamak için bakteriyel büyüme denemeleri yapılmıştır. Dirençli ve duyarlı LA1329 ile dirençli LA1329 ile havale sonuçlarıyla ilişkili Moneymaker-PtoS arasında 1,6 günlük fark arasında bakteri üremesinde 1.7 günlük fark vardı. Bu titreyi yaparken hatırlanması gereken en önemli şey protokol boyunca aseptik tekniğe dikkat etmek ve tabaktaki tüm fidelerin iyice sular altında kalmasını sağlamaktır.
Enfekte bitki doku ve bakteri otoklav ve uygun yönetmeliklere uygun olarak malzeme imha emin olun.
