Lindström Dr. P. é reconhecida por fornecer ob / ob. J. Lehtonen é reconhecido para a assistência com produção de vídeo e Gilbert J. ajuda com edição. Este estudo foi financiado por doações do Instituto de Pesquisa de Diabetes Foundation (AP), o Juvenile Diabetes Research Foundation (AP e UA), a Comissão Europeia (FP-7, Grant acordo não:. IP CP-228933-2) (JS e UA), as Fundações Kempe, Umeå University e do Conselho Sueco de Pesquisa para UA

1. Preparação de amostras e Digitalização 1,1 Preparação da amostra O procedimento seguinte é realizado essencialmente como descrito anteriormente 7. <ol><li> Colher o pâncreas. Use PBS gelado para evitar a degradação proteolítica. </li><li> Fixar o tecido em PFA a 4% em PBS em gelo durante 2-3 horas. Verifique se os lobos estão &quot;se espalhar&quot; durante a fixação. Isso irá facilitar a identificação de pontos anatômicos após a reconstrução. </li><li> Lavar com PBS em excesso durante 30 min. </li><li> Desidratar o pâncreas stepwise em metanol (33, 66%, 100%), 15 min / passo. Isto minimiza a formação de bolhas durante o branqueamento (ver passo 5) e impede a destruição das células durante a congelação-descongelação (ver passo 7). </li><li> Incubar o tecido em MeOH recentemente preparada: H 2 O 2: DMSO branqueamento tampão numa proporção de 02:01:03, à RT durante 24 h, para extinguir a fluorescência tecido endógeno. Para maiores amostras de troca, a nova bleachitampão ng e incubar durante uma outra hora 24. </li><li> Lavar com MeOH em excesso, ON. </li><li> Congelamento-descongelamento durante pelo menos 5 ciclos de -80 ° C - temperatura ambiente para facilitar a penetração dos anticorpos. </li><li> Reidratar stepwise volta para TBST (33, 66%, 100%), 15 min / passo. </li><li> Bloco em TBST com soro a 10% (de preferência com a mesma espécie na qual o anticorpo secundário foi gerado), DMSO a 5% e 0,01% Naaz durante 12-24 horas à temperatura ambiente </li><li> Incubar com anticorpo primário em tampão de bloqueio durante 48 h, à RT, estender a 72 horas para as amostras maiores (anticorpos usados ​​aqui são listados na tabela de reagentes). </li><li> Lavar em TBST excesso, ON. </li><li> Incubar com anticorpos secundários conjugados com fluorescência durante 48 h, à RT, estender a 72 horas para as amostras maiores. </li><li> Lavar em TBST excesso, ON. </li></ol> 1,2 O procedimento a seguir descreve como montar a amostra em agarose e anexá-lo ao suporte de amostras feitos (ver Figura 7) Antes de optar digitalização. <ol><li> Separa-se os lóbulos do baço, gástrica e duodenal, de acordo com a Figura 3A em Hörnblad et al 3. A relação entre os lóbulos é clarificado em Hörnblad et al 11. </li><li> Prepare a 1,5% (w / v) de agarose de temperatura de fusão baixo em dH 2 O, filtro, deixar arrefecer até 37 ° C e lavar o tecido em dH 2 O, para lavar o detergente e remover as bolhas antes agarose-incorporação em gelo. </li><li> Cortar um bloco de agarose encerrando a sua amostra e deixar um espaçador de 1 cm ~ entre a amostra e a base da agarose. Aparar arestas vivas (≤ 90 °) do bloco de agarose para reduzir a dispersão da luz. </li><li> Desidratar a amostra por passos em MeOH (33, 66%, 100%), dando tempo para equilibrar entre cada passo. Quando a amostra se afunda é considerado para ser equilibrada. </li><li> Limpar a amostra em uma solução 1:2 de álcool benzílico: Benzyl Benzoato de metila (BABB) até que se torne transparente. Troca BABB solução e incubar durante uma hora adicional 12. </li><li> Posicionar a amostra limpa no suporte de amostras e fixá-lo através da inserção de 2 agulhas através do espaçador de agarose através dos orifícios perfurados na flange do suporte. </li><li> Coloque a amostra no scanner e mergulhe-o em uma tina cheia de BABB solução de compensação. Quando se comparam uma série de pâncreas a mesma ampliação deve ser usada para todas as análises. A ampliação deve ser optimizado para o maior amostra na série. </li></ol> 1,3 Posicionamento da amostra no AR O protocolo seguinte descreve o procedimento para posicionar com precisão uma amostra usando o algoritmo de COM-AR. Este procedimento só é aplicável quando o ROI inclui toda a amostra. Para descrições detalhadas dos algoritmos, consulte Cheddad et al 2. <ol><li> Aquisição de imagens da amostra em duas posições para both a anatomia e canais de sinalização. Posição 1 a 0 ° C (associado com o eixo X), apresentando a maior área de projecção, e a posição 2 a 90 ° (associadas com o eixo Z). Estamos usando o canal GFP para visualizar a anatomia. </li><li> Aplicar o algoritmo de Maximização da Expectação (EM) nas imagens de limiar anatomia do ROI. </li><li> Calcular os pontos de COM (coordenadas x) das imagens binárias obtidas no passo 2 para ambos os 0 ° e 90 ° projecções. </li><li> Sobrepor uma linha vertical que passa pelo ponto COM identificado calculado no passo 3 no ° 0 e 90 ° imagens do canal de sinal. </li><li> Utilizar as imagens obtidas no passo 4, como referências para mover a amostra de forma que a linha de centro do campo de visão passa pelos pontos COM encontrados da amostra. </li></ol> 1,4 Digitalização <ol><li> Ajuste o tempo de exposição para atingir o maior relação sinal-ruído possível sem saturaçãoting todas as áreas das imagens de projeção. Repita o procedimento para todos os canais a serem verificados. </li><li> Selecione o conjunto de filtro para o primeiro canal de fluorescência a ser digitalizada. Emissão de fluoróforos mais curtos λ pode excitar fluoróforos com mais λ e, assim, causar foto branqueamento. Para minimizar esta possibilidade, a varredura do fluoróforo com λ maior excitação primeiro. </li><li> Abrir o obturador para iluminar a amostra e recolher o sinal de fluorescência ao longo de 360 ​​°, rotação da amostra ao longo do eixo vertical de cada canal. O ângulo de passo utilizado para a configuração de NIR-OPT é de 0,9 ° C e durante o digitalizador Bioptonics 3001 0,45 °. </li><li> Selecione o filtro apropriado para o canal seguinte e proceda como acima. </li></ol> 2. Processamento Computacional e Reconstrução 2,1 detecção desalinhamento pós-aquisição e correção (Um valor-tuning) Na tomografia de projecção, é, em geral, necessárioatribuir um valor pós-alinhamento com as projeções para afinar a imagens posição ao longo do eixo de rotação antes da reconstrução. No entanto, um pequeno desvio no ângulo da câmara na direcção do eixo óptico pode causar não-uniforme de valores ao longo do comprimento da amostra e, assim, induzir distorções geométricas. Para evitar estas distorções, um método computacional para determinar o exato valor e unificada pós-alinhamento (um valor) durante toda a amostra pode ser aplicada 2. <ol><li> Use uma transformada discreta de Fourier para dividir uma projecção do sinal específico a 0 ° e 180 ° em blocos de 8 pixels de altura e calcular o deslocamento ao longo do eixo x (o valor-A) entre cada bloco. </li><li> Aplicar um mínimo de regressão linear quadrados para ajudar a calcular o ângulo θ &quot;, que descreve a inclinação do eixo x-deslocamento ao longo do comprimento da amostra, e para encontrar um ponto central de rotação. </li><li> Corrigir distorções durante a varredura, rodando tudo projeCÇÕES θ &#39;/ 2 em torno do ponto central de rotação. </li></ol> 2,2 Contraste equalização de histograma limitado adaptativo (CLAHE) Para facilitar a detecção e a segmentação de objectos (ilhéus) que exibem sinais muito fracos, os quais se encontram em risco de ser &quot;limiarizadas para fora&quot; durante a reconstrução e / ou a segmentação para avaliações quantitativas, de um algoritmo de CLAHE pode ser aplicado a imagens de projecção. A operação é realizada com CLAHE duas transformações intensidade principais: <ol><li> O contraste local é estimada e empatou dentro não sobrepostos blocos na imagem de projeção. </li><li> As intensidades são normalizados nas regiões fronteiriças entre blocos através da interpolação bilinear. </li></ol> O nome de contraste limitada refere-se ao limite de grampo, o qual é configurado para evitar saturação pixels na imagem. Neste protocolo, o MATLAB função interna &quot;adapthisteq&quot; foi usado e aplicado com o padrão c<html> limite de lábio de 0,01 e um tamanho de telha 256. Note, o tamanho da telha óptima deve ser testada empiricamente e pode variar de acordo com a amostra analisada. Mais detalhes sobre o algoritmo e os exemplos podem ser encontrados em Hörnblad et al 3. Nota: As etapas de processamento acima listados computacionais (incluindo-COM AR, ajustando um valor e CLAHE, consulte 1,3-2,2) são construídas sobre algoritmos padrão e são executadas no MATLAB (Mathworks). 2,3 reconstrução tomográfica e iso-superfície renderização <ol><li> Usando um algoritmo de filtrado de volta projeção, as imagens corrigidas e normalizados pode agora ser reconstruído com compensação de desalinhamento unificada e exigência mínima para a otimização de faixa dinâmica. Neste protocolo, todas as reconstruções são realizadas usando o método de projeção filtrada de volta disponível no software NRecon (SkyScan), versão 1.6.8 (= &quot;_blank&quot;&gt; Http://www.skyscan.be/products/downloads.htm). Nota, a ampliação de um objecto com imagens depende da sua distância a partir do ponto focal da lente, a menos que a geometria de feixe paralelo é implementado na configuração de imagem. Portanto, quando a importação de um conjunto de dados de projeção para o software NRecon é importante incluir o objeto correto a distância da fonte (mm) e direção de rotação do scanner (para anti-horário de entrada &quot;cc&quot; e para a entrada no sentido horário &quot;cw&quot;) no acompanhamento arquivo de log, para evitar artefatos de feixe cônico induzidas durante a reconstrução. </li><li> Para visualizar e quantificar a pilha de seções virtuais obtidos, gerar 3D iso-superfícies utilizando software de processamento de imagem, como adequado ou Imaris Volocity. </li></ol> Isolamento de ilhotas murina e procedimentos de transplante foram realizados em Processamento de Diabetes Research Institute celular pré-clínica e Core Modelo Translational sob protocolos analisados ​​e aprovados pela Universidade de Miami Animal Care Institucional e Comitê de uso. O comitê de ética para pesquisas com animais, norte da Suécia, aprovou todos os outros experimentos envolvendo animais.

<ol>
	<li>Sharpe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies.">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li><li>Cheddad, A., Svensson, C., Sharpe, J., Georgsson, F., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+Assisted+Algorithms+for+Optical+Projection+Tomography.">Image Processing Assisted Algorithms for Optical Projection Tomography.</a> IEEE Trans. Med. Imaging. , (2012).</li><li>Hornblad, A., Cheddad, A., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+optical+projection+tomography+imaging+reveals+lobular+heterogeneities+in+pancreatic+islet+and+beta-cell+mass+distribution.">An improved protocol for optical projection tomography imaging reveals lobular heterogeneities in pancreatic islet and beta-cell mass distribution.</a> Islets. 3, 204-208 (2011).</li><li>Holmberg, D., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+pancreas:+from+ex+vivo+to+non-invasive+technology.">Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology.</a> Diabetologia. 51, 2148-2154 (2008).</li><li>Ahlgren, U., Gotthardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+for+imaging+islets:+recent+advances+and+future+prospects.">Approaches for imaging islets: recent advances and future prospects.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 654, 39-57 (2010).</li><li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+projection+tomography.">Optical projection tomography.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 209-228 (2004).</li><li>Alanentalo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+molecular+imaging+and+3D+quantification+within+adult+mouse+organs.">Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs.</a> Nat. Methods. 4, 31-33 (2007).</li><li>Alanentalo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+three-dimensional+imaging+of+islet-infiltrate+interactions+based+on+optical+projection+tomography+assessments+of+the+intact+adult+mouse+pancreas.">High-resolution three-dimensional imaging of islet-infiltrate interactions based on optical projection tomography assessments of the intact adult mouse pancreas.</a> J. Biomed. Opt. 13, 054070 (2008).</li><li>Alanentalo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+Three-Dimensional+Imaging+of+the+Insulitis-Induced+Destruction+of+beta-Cells+in+Murine+Type+1+Diabetes.">Quantification and Three-Dimensional Imaging of the Insulitis-Induced Destruction of beta-Cells in Murine Type 1 Diabetes.</a> Diabetes. 59, 1756-1764 (2010).</li><li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+AMP-activated+protein+kinase+alpha1+and+alpha2+from+mouse+pancreatic+beta+cells+and+RIP2.Cre+neurons+suppresses+insulin+release+in+vivo.">Ablation of AMP-activated protein kinase alpha1 and alpha2 from mouse pancreatic beta cells and RIP2.Cre neurons suppresses insulin release in vivo.</a> Diabetologia. 53, 924-936 (2010).</li><li>Hornblad, A., Eriksson, A. U., Sock, E., Hill, R. E., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+spleen+formation+perturbs+morphogenesis+of+the+gastric+lobe+of+the+pancreas.">Impaired spleen formation perturbs morphogenesis of the gastric lobe of the pancreas.</a> PLoS One. 6, e21753 (2011).</li><li>Lindstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+the+Obese-Hyperglycemic+Mice+(ob/ob+Mice).">The physiology of the Obese-Hyperglycemic Mice (ob/ob Mice).</a> The Scientific World JOURNAL. 7, 665-685 (2007).</li><li>Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+determines+the+size+and+structure+of+the+endocrine+pancreas.">Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas.</a> Diabetes. 54, 133-137 (2005).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

As técnicas descritas para a imagiologia OPT permite a extracção de parâmetros espaço-quantitativa em todo o volume do pâncreas murino. Devido às limitações na resolução alcançável para este tipo de mesoscópica imagiologia deve notar-se que, tal como para a maioria das modalidades de imagiologia, maior a amostra menor a resolução da (Embora a utilização de uma resolução mais alta CCD deve aumentar a resolução da digitalização OPT) . Assim, para a avaliação dos lóbulos intactos pancreáticas de rato, a técnica actualmente não fornece resolução única célula embora próximo (aproximadamente 15-20 mm) 7. Ainda assim, para a extracção de distribuição BCM no pâncreas de rato os protocolos proporcionam dados que corresponde bem mais do que as obtidas pelo ponto de contagem, por exemplo 3,13 a morfometria Deve notar-se que, embora a execução do protocolo CLAHE permite a detecção de um número significativamente maior ilhotas , estes ilhéus são geralmente menores e não contrite substancialmente para os totais de células β volumes. Os protocolos de imuno-histoquímica envolvidos são relativamente longos (até duas semanas), mas as mãos reais no tempo de preparação da amostra é pequeno e, portanto, a técnica é bem adequado para o estudo de grandes grupos de animais 9. Se o potencial de padrões de distribuição heterogêneas é um foco para a investigação, deve sublinhar-se que os cuidados devem ser tomados nas etapas sobre fixação e montagem para evitar que o tecido pancreático torna-se fixado de maneira desfavorável e um apartamento (&quot;se espalhar&quot; ) montagem do tecido deve ser buscado para facilitar tais avaliações. Uma questão importante no desempenho é que OPT COM a amostra é fixada no eixo de rotação e que não se move, na vertical ou na horizontal, durante o processo de digitalização. Portanto, é essencial ter uma configuração estável mecânico e um sistema que funcione bem para attaching a amostra. Resolvemos este problema através da construção de uma nova montagem (Figura 7). Geometria paralela não era verdade para o nosso NIR-OPT ou scanner Bioptonics 3001, que foi detectado como um deslocamento vertical entre a parte traseira e as posições da frente de objetos periféricos nas imagens gravadas de projeção. Ao ajustar o objeto a distância da fonte no arquivo de log do scanner respectivo (ver 2.3.1) que pode melhorar significativamente a qualidade de nossos dados e corrigir distorções geométricas nas bordas longe das imagens de projeção, que é de particular importância quando avaliar os espécimes maiores. No protocolo atual, nós fornecemos uma sugestão de conjuntos de filtros que permitem a visualização de três diferentes canais específicos e uma &quot;anatomia&quot; do canal nas avaliações de preparações pancreáticas intactos. Obviamente essas configurações pode ser modulada para melhor atender os fluorocromos utilizados para um determinado estudo, embora, como acontece com todas as formas de fluorescênciamicroscopia cento, o risco potencial de sinal de sangramento através deve ser cuidadosamente avaliada. O estudo das ilhotas de insulina marcados com fluorocromos que são excitados acima de 750 nm não foi ainda possível por nós usando a lâmpada de halogeneto de metal de que se utiliza o conjunto. É possível que a câmara com ainda maior eficiência quântica nos comprimentos de onda relevantes, em combinação com fontes de luz alternativas (por exemplo, lasers de diodo) pode aumentar o potencial de NIR-OPT adicional e permitir a imagiologia em comprimentos de onda mais elevados. OPT de imagem é uma técnica altamente versátil para avaliações espaciais e quantitativos da amostra biomédica na escala de milímetros cm. Embora os protocolos aqui apresentados foram desenvolvidos com a finalidade principal do pâncreas / diabetes de pesquisa que deverá ser possível traduzir a pesquisa sobre as outras espécies, tipos de amostras e os marcadores. Pelo potencial de visualizar vários canais distintos em preparações pancreáticas intactas, NIR-OPT imagem fUTRAS tem potencial como uma ferramenta para avaliar a especificidade de absorção de agentes de contraste destinados a avaliação não-invasiva de outras modalidades de imagem, desde que estes agentes de contraste podem ser concebidas para transportar também um fluoróforo detectável por OPT.

A correction was made to <a href="/video/50238">Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research</a>. In Protocol section 1.1, the order of the listed chemicals MeOH:H2O2:DMSO has accidentally been switched and should instead be MeOH:DMSO:H2O2.
Protocol section 1.1 was changed from:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:H2O2:DMSO bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.
to:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:DMSO:H2O2 bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.

A correction was made to <a href="/video/50238">Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research</a>. In Protocol section 1.1, the order of the listed chemicals MeOH:H2O2:DMSO has accidentally been switched and should instead be MeOH:DMSO:H2O2.

Erratum: Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

Produtoras de insulina β células são a chave para a capacidade do corpo para controlar a homeostase da glicose do sangue. Portanto, a avaliação da distribuição BCM pâncreas são fundamentais para muitas áreas de pesquisa pré-clínica diabetes. Na avaliação dos regimes terapêuticos, por exemplo, o impacto de ablação do gene alvo na diferenciação de células endócrinas ou estudos de etiologia diabetes em modelos de roedores para a doença muitas vezes dependem de tais análises. Tradicionalmente, esses tipos de avaliações basearam-se em demoradas abordagens estereológicas que são difíceis de realizar, devido ao tamanho e constituição anatómica complexa do pâncreas. Abordagens de resolução mais alta de imagem no presente (normalmente óptico), não fornecem a profundidade de penetração suficiente para permitir imagens de pâncreas em roedores. Por outro lado, as abordagens de imagem que não são limitadas pela sua profundidade de penetração (tipicamente nuclear) para proporcionar baixa resolução para resolver a distribuição BCM completo e são dificultadoscom a falta de agentes de contraste adequados 4,5. Tomografia projeção óptica é uma modalidade de imagem 3D que permite que as avaliações de alta resolução de amostras biomédicas na mm a escala de 6 centímetros. Por este meio, a informação sobre a posição espacial e volume do indivíduo expressar a insulina de ilhotas de Langerhans pode ser extraído todo o volume do pâncreas em ratos normais e diabéticos 3,7-10. O objectivo do estudo é o de melhorar ainda mais a capacidade desta técnica para a avaliação do pâncreas β células, a sua distribuição endógena, quando enxertado em outros tecidos, a sua relação com outros componentes do pâncreas (tal como os tipos de células infiltrantes) e em maior preparações de pâncreas do que era possível anteriormente. A tomografia de projeção óptico infravermelho próximo (NIR-OPT) de instalação No protocolos abaixo, um scanner de OPT com base no conjunto original se descrito por Sharpe <em&gt; et al 1, adaptado para imagiologia na gama do infravermelho próximo são descritos e utilizados. Para a avaliação de canal único, do pâncreas do rato (por exemplo, de BCM), a SkyScan 3001 scanner (Bioptonics) pode ser usado. Uma lâmpada de halogeneto de metal, que fornece a energia de excitação mais elevada do que uma lâmpada de arco de mercúrio a comprimentos de onda superiores a 650 nm, fornece a luz de excitação. A luz é transferida através de um guia de luz líquido. Uma combinação útil de fluorocromos e filtros passa banda para NIR fluorescência de imagem e separação de canais são mostrados na Figura 3. A luz emitida é detectada com uma câmara CCD de iluminação traseira, com elevada eficiência quântica no espectro NIR. A digitalização OPT é automatizado utilizando uma plataforma LabView que controla a câmera e motor de passo. Para suportar as amostras no tamanho de pâncreas de ratos intactos, um espelho de prata revestido e protegido numa cuvete grande é usado. Finalmente, um porta-amostras que elimina indesejadas movemen verticaists da amostra durante a análise foi concebida.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Scharlau </td><td> ME03162500 </td><td></td></tr><tr><td> 30% de H 2 O 2 </td><td> Scharlau </td><td> HI01362500 </td><td></td></tr><tr><td> Álcool benzílico </td><td> Scharlau </td><td> AL01611000 </td><td></td></tr><tr><td> Benzoato de benzilo </td><td> Scharlau </td><td> BE01851000 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose de baixo meltingpoint </td><td> LONZA </td><td> 50100 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeído (PFA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 158127 </td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5879 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X100 </td><td&gt; Sigma-Aldrich </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Rato anti-Asma-Cy3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6198 </td><td> O anticorpo primário </td></tr><tr><td> Coelho anti-CD3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7930 </td><td> O anticorpo primário </td></tr><tr><td> Cobaia anti-Ins </td><td> DAKO </td><td> A0564 </td><td> O anticorpo primário </td></tr><tr><td> Donkey anti GP-IRDye680 </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-32421 </td><td> Anticorpo secundário </td></tr><tr><td> De cabra anti-Rb DyeLight750 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 35570 </td><td> Anticorpo secundário </td></tr><tr><td> Cabra anti GP-Alexa594 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-11076 </td><td> Anticorpo secundário </td></tr><tr><td> Anti-cabra GP Alexa488 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-11008 </td><td> Anticorpo secundário </td></tr><tr><td> Anti cabraGP-Alexa594 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-11012 </td><td> Anticorpo secundário </td></tr><tr><td> Cabra anti GP-Alexa680 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-21076 </td><td> Anticorpo secundário </td></tr><tr><td> Cabra anti GP-Alexa750 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-21039 </td><td> Anticorpo secundário </td></tr><tr><td> OPT SkyScan 3001 </td><td> Bioptonics </td><td></td><td> OPT-Scanner </td></tr><tr><td> Leica MZ FLIII </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td> Estereomicroscópio </td></tr><tr><td> Leica Objetivo 0.5x </td><td> Leica Microsystems </td><td> 10446157 </td><td></td></tr><tr><td> Leica Camera adaptador 1.0x </td><td> Leica Microsystems </td><td> 10445930 </td><td></td></tr><tr><td> EL6000 HQI </td><td></td><td> 11504115 </td><td> Lightsource </td></tr><tr><td> Guia Liquid Light </td&gt; <td></td><td> 11504116 </td><td></td></tr><tr><td> Cuveta </td><td> Hellma Analytics </td><td> 6030-OG </td><td> 55 x 55 x 52,5 mm </td></tr><tr><td> Espelho </td><td> Edmund Optics </td><td> F68-334 </td><td> 50 x 50 mm </td></tr><tr><td> Andor Ikon-M </td><td> Andor Tecnologia </td><td> DU934N-BV </td><td> Retro-iluminado CCD </td></tr><tr><td> Filterset </td><td> Tecnologia Chroma </td><td> 41.021-MZFLIII </td><td> TXR, Alexa-594, Cy3 </td></tr><tr><td> Filterset </td><td> Tecnologia Chroma </td><td> 41.022-MZFLIII </td><td> IRDye680, Alexa-680 </td></tr><tr><td> Filterset </td><td> Tecnologia Chroma </td><td> 49.037-MZFLIII </td><td> Dylight750, Alexa-750 </td></tr><tr><td> ProteinG Sepharose-esferas </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0618-01 </td><td> Protein G Sepharose 4 Fast Flow </td></tr><tr><td> Azida de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 08591 </td><td> Azida de sódio a 0,1 M solução </td></tr></tbody></table>

near infrared optical projection tomography for assessments of &beta;-cell mass distribution in diabetes research

Ao adaptar OPT para incluir a capacidade de formação de imagens de infravermelho próximo do espectro (NIR), que aqui ilustrar a possibilidade de corpos grandes de imagem de tecido pancreático, tais como o pâncreas de ratos, e para aumentar o número de canais (os tipos de células) que podem ser estudado em um único espécime. Iremos descrever a execução de um número de ferramentas computacionais que fornecem: posicionamento 1 / precisa do centro de um espécime (no nosso caso, o pâncreas) de massa (COM), o eixo de rotação (AR) 2; dois algoritmos / melhoradas para pós Alinhamento de ajuste que impede que as distorções geométricas durante a reconstrução tomográfica 2 e 3 / de um protocolo para aumentar a intensidade de equalização do sinal para relações de ruído nas determinações OPT baseados BCM 3. Além disso, descreve-se um suporte de amostras que minimiza o risco de movimentos involuntários do corpo de prova durante a aquisição de imagem. Juntos, estes protocolos permitem avaliações da distribuição BCM e othfuncionalidades er, a serem realizados em todo o volume do pâncreas ou de outros órgãos intactos (por exemplo, em estudos de transplante de ilhotas), com uma resolução até o nível de ilhotas de Langerhans individuais.

No relatório atual nós descrevemos um protocolo para a extração e processamento computacional de dados BCM em pâncreas de roedores (e outros tecidos) usando NIR-OPT (Figura 1). Como ilustrado na Figura 2, a partir de tecido autofluorescense espécime pancreática é a esperada redução acentuada no espectro NIR. Isto leva a um aumento significativo no sinal de média ao ruído (S: N) razão para a avaliação dos ilhéus de Langerhans de insulina rotuladas. Pelas adaptações de OPT de imagiologia, na parte do espectro NIR, tal como aqui descrito, pelo menos, três canais específicos podem ser visualizados com suficiente S: relação N para permitir a avaliação de tipos de anticorpos rotulados de células ao longo do volume do pâncreas murino com distinto canal de separação (ver a Figura 3 e 4). Aplicado a imagiologia de processos diabetogênicos e / ou avaliações de BCM, em geral, a técnica permite, assim, para a visualização e quantificação deáreas-insulina em relação à envolvente e / ou interagindo tipos de células (ver Figura 4). Estas considerações são, graças ao aumento da profundidade de penetração do tecido obtido na gama NIR possível realizar em amostras muito maiores do que anteriormente, incluindo o pâncreas de rato, que é 3-5 vezes maior do que o seu homólogo de rato (ver Figura 5). Independentemente do facto de comprimentos de onda visíveis ou NIR são utilizadas, a implementação de CLAHE pode facilitar significativamente OPT avaliações baseadas de BCM durante as diferentes condições genéticas e fisiológicas ao aumentar a sensibilidade de detecção da técnica (ver Figura 6). Um modelo para o suporte de amostras desenvolvido é mostrado na Figura 7. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Fluxograma que descreve os passos críticos para OPT análises baseadas de BCM na murpâncreas ine. O tempo requerido para avaliar um pâncreas de rato normal é 13-14 dias. A maioria das vezes é consumida durante o processamento de tecidos e imunohistoquímica (10 dias), a limpeza de tecidos requer aproximadamente 2 dias enquanto que a duração do varrimento é dependente do tempo de exposição necessário (normalmente cerca de 1 hora). O processamento subsequente tipicamente computacional é realizada dentro de um dia. Note, o protocolo de coloração relativamente longo é idealmente adequada para o processamento em lotes de grandes quantidades de amostras. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig2highres.jpg" /> Figura 2. Sinal para relações de ruído para as avaliações de BCM em comprimentos de onda diferentes. Um rato do lobo duodenal do pâncreas, corado para a insulina e com um cocktail de fluorocromo-conjugados de anticorpos secundários (Alexa 488, 594, 680 e750), foi utilizada para determinar S: N proporções em comprimentos de onda diferentes. A Imagens, mostrar o quadro primeira projeção para cada canal de sinal. Gráfico B, que ilustra a média S: N, para cada canal de sinal. As proporções foram determinadas como a intensidade média da ilhota (com base em 215 ilhéus) dividida pela intensidade do fundo (a fluorescência tecido endógeno a partir do tecido exócrino). C, Gráfico mostrando S: proporções de N para os ilhéus individuais em cada um dos canais normalizados para o S: N obtidos para o canal 594 Alexa. Uma maneira ANOVA foi utilizado para análises estatísticas. Os níveis de significância indicados correspondem a ** p &lt;0,01. Barra de escala em (A) corresponde a 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50238/50238fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig3highres.jpg"/> Figura3. Separação de canais. A, anticorpos secundários conjugados com corantes Alexafluor listados na tabela foram imobilizados separadamente em proteinG-sepharose grânulos. B, As contas fluorescentes foram então embebidas em diferentes níveis de um fantasma de agarose e visualizados utilizando filtros indicados. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig4.jpg" alt="Figura 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig4highres.jpg"/> Figura 4. OPT imaging multicanal baseada na pesquisa da diabetes. A, OPT base iso-superfície de reconstrução de um pâncreas (12 semanas, lobo duodenal) do diabético não obeso (NOD) modelo de diabetes do tipo 1. O espécime é corado para a insulina (células islet β, pseudo cor azul); músculo liso α-actina (vasos sanguíneos, vermelho) e CD3 (linfócitos T infiltrantes, verde). Os anticorpos secundários utilizados foram correspondentes; Cy3, IRDye-680-750 e DyeLight respectivamente. Oinserções (A&#39;-A&#39;&#39; &#39;) mostram os canais de sinal individuais. B, OPT imagem (golpe de vista) de um lobo de fígado de rato (lateral lobus sinistros) enxertado com ilhotas singênicos e fotografada com duas semanas NIR-OPT após a transplantação. As ilhotas de insulina estão expressando pseuodocolored em azul e do músculo liso α-actina vasos positivos estão em vermelho. A abordagem permite avaliações da distribuição do enxerto ilhota dentro da rede vascular. Barras de escala correspondem a 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig5.jpg" alt="Figura 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig5highres.jpg" /> Figura 5. NIR-OPT facilita a criação de imagens de espécimes de maiores dimensões. A, render Iso-superfície da distribuição BCM em pâncreas de rato a partir do modelo Zucker Fatty para a diabetes do tipo 2 (lóbulo esplénica em 9 meses), exemplificando a possibilidade de espécime imagem no rato escala de pâncreas por NIR-OPT. Conforme determinadopor esta técnica é apresentada no lobo ~ 6 vezes maior (v / v) do que o seu homólogo de rato e abriga 10.139 expressando insulina das ilhotas de Langerhans, cuja célula-β volume faz-se 1,32% do volume total lobular. B, secção Tomographic correspondente à linha a tracejado em (A) ilustra que ilhotas de todas as profundidades do tecido são detectados. C, Iso-superfície de processamento da distribuição BCM em pâncreas de rato (lobo esplénica em 8 semanas) exibido como uma referência de tamanho. O lóbulo exibida abriga 2.490 ilhotas de insulina que expressam cujas células β volume faz-se 0,89% do volume total lobular. O pâncreas estão manchadas com o GP anti-insulina seguido de Alexa594 conjugado de cabra anti-GP (mouse) e Donkey IRDye 680 conjugado anti-GP (rato) anticorpos respectivamente. Os espécimes em (AC) são representadas à escala e a barra de escala em (C) corresponde a 2 mm. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig6.jpg" alt="Figura 6" fo:cONTEÚDO largura = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;files/ftp_upload/50238/50238fig6highres.jpg /&quot; /&gt; Figura 6. CLAHE facilita a detecção de ilhotas do pâncreas murino por imagem OPT. AC, representante iso-superfície imagens OPT prestados de uma pâncreas do rato C57Bl / 6 (lobo esplênica em 8 semanas) marcada para a insulina. Iso-superfície reconstruções de imagens de OPT foram realizadas antes (A, verde pseudo colorida) e após o protocolo CLAHE foi aplicado (B, pseudo cor vermelha). C, sobreposição dos dados não normalizadas, em (A) e os dados processados ​​CLAHE em (B). C&#39;-C &quot;, sobreposição de ampliação elevada representativas dos não normalizados (A) e CLAHE processada (B) as imagens. Tal como mostrado pela presença de&quot; vermelho &quot;somente ilhotas, o script CLAHE facilita a detecção de sinal pequena e baixa ilhotas intensidade. No exemplo actual, o espécime descrito (após CLAHE processamento), continham 2.419 ilhotas com um volume de 1,74 mm 3 (Números com base nos dados correspondentes de projecção não transformados era 1.057 ilhotas with um volume de 1,77 mm 3). D e E, a partir de dados de exemplo de controlo (D) e o modelo de ratinho ob / ob para o diabetes tipo 2 12 (E), 6 meses de execução do protocolo CLAHE. Notar o aumento massivo no tamanho geral dos ilhéus pancreáticos ob / ob (E). Em (D) e (E) do esboço pâncreas (cinza) está baseado no sinal de autofluorescência de tecidos. Barra de escala em C é 500 mm em CA. Barra de escala em C &quot;corresponde 200 um em C &#39;e C&#39;&#39; bar. Escala em E corresponde a 1 mm em (D) e (E). Imagens em (AC) são adaptados de Hörnblad et al 3 e foram gerados utilizando o Bioptonics scanner de 3001. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. Porta-amostras para a fixação das amostras OPT. O espécime é assegurado pela inserção de agulhas através do espaçador de agarose através dos orifícios pré-perfurados na flange. O suporte encontra-se articulado para o motor passo a passo através de umíman forte localizada na sua base. Esta configuração omite o uso de colas instáveis ​​e evita movimentos indesejados da amostra durante a análise.

Watch this Scientific Journal Video about Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of Î²-cell Mass Distribution in Diabetes Research at JoVE.com

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &amp;#946;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

Nós descrevemos a adaptação de tomografia projeção óptica (OPT)<sup&gt; 1</sup&gt; Para imagens no espectro infravermelho próximo, e da implementação de uma série de ferramentas computacionais. Estes protocolos permitem avaliações de massa pancreática β-célula (BCM) em amostras maiores, aumentar a capacidade de multicanal da técnica e aumentar a qualidade dos dados OPT.

Perto Tomografia Projeção óptico infravermelho para avaliações de β-célula distribuição em massa em Pesquisa do Diabetes

By adapting OPT to include the capability of imaging in the near infrared (NIR) spectrum, we here illustrate the possibility to image larger bodies of ...

near-infrared-optical-projection-tomography-for-assessments-cell-mass

Research

JoVE Journal

Medicine

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

16.2K visualizações.  Umeå University. Nós descrevemos a adaptação de tomografia projeção óptica (OPT) 1 Para imagens no espectro infravermelho próximo, e da implementação de uma série de ferramentas computacionais. Estes protocolos permitem avaliações de massa pancreática β-célula (BCM) em amostras maiores, aumentar a capacidade de multicanal da técnica e aumentar a qualidade dos dados OPT.

Vídeo: Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &#946;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

In vivo Near Infrared Fluorescence (NIRF) Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis

The vascular response to injury is a well-orchestrated inflammatory response triggered by the accumulation of macrophages within the vessel wall leading to an accumulation of lipid-laden intra-luminal plaque, smooth muscle cell proliferation and progressive narrowing of the vessel lumen. The formation of such vulnerable plaques prone to rupture underlies the majority of cases of acute myocardial infarction. The complex molecular and cellular inflammatory cascade is orchestrated by the recruitment of T lymphocytes and macrophages and their paracrine effects on endothelial and smooth muscle cells.1
Molecular imaging in atherosclerosis has evolved into an important clinical and research tool that allows in vivo visualization of inflammation and other biological processes. Several recent examples demonstrate the ability to detect high-risk plaques in patients, and assess the effects of pharmacotherapeutics in atherosclerosis.4 While a number of molecular imaging approaches (in particular MRI and PET) can image biological aspects of large vessels such as the carotid arteries, scant options exist for imaging of coronary arteries.2 The advent of high-resolution optical imaging strategies, in particular near-infrared fluorescence (NIRF), coupled with activatable fluorescent probes, have enhanced sensitivity and led to the development of new intravascular strategies to improve biological imaging of human coronary atherosclerosis.
Near infrared fluorescence (NIRF) molecular imaging utilizes excitation light with a defined band width (650-900 nm) as a source of photons that, when delivered to an optical contrast agent or fluorescent probe, emits fluorescence in the NIR window that can be detected using an appropriate emission filter and a high sensitivity charge-coupled camera. As opposed to visible light, NIR light penetrates deeply into tissue, is markedly less attenuated by endogenous photon absorbers such as hemoglobin, lipid and water, and enables high target-to-background ratios due to reduced autofluorescence in the NIR window. Imaging within the NIR 'window' can substantially improve the potential for in vivo imaging.2,5
Inflammatory cysteine proteases have been well studied using activatable NIRF probes10, and play important roles in atherogenesis. Via degradation of the extracellular matrix, cysteine proteases contribute importantly to the progression and complications of atherosclerosis8. In particular, the cysteine protease, cathepsin B, is highly expressed and colocalizes with macrophages in experimental murine, rabbit, and human atheromata.3,6,7 In addition, cathepsin B activity in plaques can be sensed in vivo utilizing a previously described 1-D intravascular near-infrared fluorescence technology6, in conjunction with an injectable nanosensor agent that consists of a poly-lysine polymer backbone derivatized with multiple NIR fluorochromes (VM110/Prosense750, ex/em 750/780nm, VisEn Medical, Woburn, MA) that results in strong intramolecular quenching at baseline.10 Following targeted enzymatic cleavage by cysteine proteases such as cathepsin B (known to colocalize with plaque macrophages), the fluorochromes separate, resulting in substantial amplification of the NIRF signal. Intravascular detection of NIR fluorescence signal by the utilized novel 2D intravascular NIRF catheter now enables high-resolution, geometrically accurate in vivo detection of cathepsin B activity in inflamed plaque.
In vivo molecular imaging of atherosclerosis using catheter-based 2D NIRF imaging, as opposed to a prior 1-D spectroscopic approach,6 is a novel and promising tool that utilizes augmented protease activity in macrophage-rich plaque to detect vascular inflammation.11,12 The following research protocol describes the use of an intravascular 2-dimensional NIRF catheter to image and characterize plaque structure utilizing key aspects of plaque biology. It is a translatable platform that when integrated with existing clinical imaging technologies including angiography and intravascular ultrasound (IVUS), offers a unique and novel integrated multimodal molecular imaging technique that distinguishes inflammatory atheromata, and allows detection of intravascular NIRF signals in human-sized coronary arteries.

In vivo Near Infrared Fluorescence NIRF Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis

We detail a new near-infrared fluorescence (NIRF) catheter for 2-dimensional intravascular molecular imaging of plaque biology in vivo. The NIRF catheter can visualize key biological processes such as inflammation by reporting on the presence of plaque-avid activatable and targeted NIR fluorochromes. The catheter utilizes clinical engineering and power requirements and is targeted for application in human coronary arteries. The following research study describes a multimodal imaging strategy that utilizes a novel in vivo intravascular NIRF catheter to image and quantify inflammatory plaque in proteolytically active inflamed rabbit atheromata.

In vivo Near Infrared fluorescência de imagem intravascular (NIRF) Molecular da placa inflamatória, uma Abordagem Multimodal para imagem da Aterosclerose

The vascular response to injury is a well-orchestrated inflammatory response triggered by the accumulation of macrophages within the vessel wall leading ...

Medicina

Doppler Optical Coherence Tomography of Retinal Circulation

Noncontact retinal blood flow measurements are performed with a Fourier domain optical coherence tomography (OCT) system using a circumpapillary double circular scan (CDCS) that scans around the optic nerve head at 3.40 mm and 3.75 mm diameters. The double concentric circles are performed 6 times consecutively over 2 sec. The CDCS scan is saved with Doppler shift information from which flow can be calculated. The standard clinical protocol calls for 3 CDCS scans made with the OCT beam passing through the superonasal edge of the pupil and 3 CDCS scan through the inferonal pupil. This double-angle protocol ensures that acceptable Doppler angle is obtained on each retinal branch vessel in at least 1 scan. The CDCS scan data, a 3-dimensional volumetric OCT scan of the optic disc scan, and a color photograph of the optic disc are used together to obtain retinal blood flow measurement on an eye. We have developed a blood flow measurement software called "Doppler optical coherence tomography of retinal circulation" (DOCTORC). This semi-automated software is used to measure total retinal blood flow, vessel cross section area, and average blood velocity. The flow of each vessel is calculated from the Doppler shift in the vessel cross-sectional area and the Doppler angle between the vessel and the OCT beam. Total retinal blood flow measurement is summed from the veins around the optic disc. The results obtained at our Doppler OCT reading center showed good reproducibility between graders and methods (&lt;10%). Total retinal blood flow could be useful in the management of glaucoma, other retinal diseases, and retinal diseases. In glaucoma patients, OCT retinal blood flow measurement was highly correlated with visual field loss (R2&gt;0.57 with visual field pattern deviation). Doppler OCT is a new method to perform rapid, noncontact, and repeatable measurement of total retinal blood flow using widely available Fourier-domain OCT instrumentation. This new technology may improve the practicality of making these measurements in clinical studies and routine clinical practice.

Total retinal blood flow is measured by Doppler optical coherence tomography and semi-automated grading software.

Doppler Tomografia de Coerência Óptica de circulação retiniana

Noncontact retinal blood flow measurements are performed with a Fourier domain optical coherence tomography (OCT) system using a circumpapillary double ...

Generation and 3-Dimensional Quantitation of Arterial Lesions in Mice Using Optical Projection Tomography

The generation and analysis of vascular lesions in appropriate animal models is a cornerstone of research into cardiovascular disease, generating important information on the pathogenesis of lesion formation and the action of novel therapies. Use of atherosclerosis-prone mice, surgical methods of lesion induction, and dietary modification has dramatically improved understanding of the mechanisms that contribute to disease development and the potential of new treatments.
Classically, analysis of lesions is performed ex vivo using 2-dimensional histological techniques. This article describes application of optical projection tomography (OPT) to 3-dimensional quantitation of arterial lesions. As this technique is non-destructive, it can be used as an adjunct to standard histological and immunohistochemical analyses.
Neointimal lesions were induced by wire-insertion or ligation of the mouse femoral artery whilst atherosclerotic lesions were generated by administration of an atherogenic diet to apoE-deficient mice.
Lesions were examined using OPT imaging of autofluorescent emission followed by complementary histological and immunohistochemical analysis. OPT clearly distinguished lesions from the underlying vascular wall. Lesion size was calculated in 2-dimensional sections using planimetry, enabling calculation of lesion volume and maximal cross-sectional area. Data generated using OPT were consistent with measurements obtained using histology, confirming the accuracy of the technique and its potential as a complement (rather than alternative) to traditional methods of analysis.
This work demonstrates the potential of OPT for imaging atherosclerotic and neointimal lesions. It provides a rapid, much needed ex vivo technique for the routine 3-dimensional quantification of vascular remodelling.

Ex vivo analysis of arterial lesions from animal models of cardiovascular disease classically relies on histological and immunohistochemical techniques. These provide 2-dimensional measurements in 3-dimensional lesions. This manuscript describes the generation of arterial lesions for quantitative analysis in 3-dimensions using optical projection tomography.

Geração e quantificação 3-Dimensional de Arterial lesões em ratos por meio de tomografia óptica de Projeção

The generation and analysis of vascular lesions in appropriate animal models is a cornerstone of research into cardiovascular disease, generating ...

Tissue-simulating Phantoms for Assessing Potential Near-infrared Fluorescence Imaging Applications in Breast Cancer Surgery

Inaccuracies in intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status result in suboptimal outcome of breast-conserving surgery (BCS). Optical imaging, in particular near-infrared fluorescence (NIRF) imaging, might reduce the frequency of positive surgical margins following BCS by providing the surgeon with a tool for pre- and intraoperative tumor localization in real-time. In the current study, the potential of NIRF-guided BCS is evaluated using tissue-simulating breast phantoms for reasons of standardization and training purposes.
Breast phantoms with optical characteristics comparable to those of normal breast tissue were used to simulate breast conserving surgery. Tumor-simulating inclusions containing the fluorescent dye indocyanine green (ICG) were incorporated in the phantoms at predefined locations and imaged for pre- and intraoperative tumor localization, real-time NIRF-guided tumor resection, NIRF-guided evaluation on the extent of surgery, and postoperative assessment of surgical margins. A customized NIRF camera was used as a clinical prototype for imaging purposes.
Breast phantoms containing tumor-simulating inclusions offer a simple, inexpensive, and versatile tool to simulate and evaluate intraoperative tumor imaging. The gelatinous phantoms have elastic properties similar to human tissue and can be cut using conventional surgical instruments. Moreover, the phantoms contain hemoglobin and intralipid for mimicking absorption and scattering of photons, respectively, creating uniform optical properties similar to human breast tissue. The main drawback of NIRF imaging is the limited penetration depth of photons when propagating through tissue, which hinders (noninvasive) imaging of deep-seated tumors with epi-illumination strategies.

Near-infrared fluorescence (NIRF) imaging may improve therapeutic outcome of breast cancer surgery by enabling intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status. Using tissue-simulating breast phantoms containing fluorescent tumor-simulating inclusions, potential clinical applications of NIRF imaging in breast cancer patients can be assessed for standardization and training purposes.

Phantoms Tissue-simulação para avaliação de potenciais aplicações de fluorescência de imagem infravermelho próximo na cirurgia do câncer de mama

Inaccuracies in intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status result in suboptimal outcome of breast-conserving surgery ...

In Vivo, Percutaneous, Needle Based, Optical Coherence Tomography of Renal Masses

Optical coherence tomography (OCT) is the optical equivalent of ultrasound imaging, based on the backscattering of near infrared light. OCT provides real time images with a 15 &#181;m axial resolution at an effective tissue penetration of 2-3 mm. Within the OCT images the loss of signal intensity per millimeter of tissue penetration, the attenuation coefficient, is calculated. The attenuation coefficient is a tissue specific property, providing a quantitative parameter for tissue differentiation. 
Until now, renal mass treatment decisions have been made primarily on the basis of MRI and CT imaging characteristics, age and comorbidity. However these parameters and diagnostic methods lack the finesse to truly detect the malignant potential of a renal mass. A successful core biopsy or fine needle aspiration provides objective tumor differentiation with both sensitivity and specificity in the range of 95-100%. However, a non-diagnostic rate of 10-20% overall, and even up to 30% in SRMs, is to be expected, delaying the diagnostic process due to the frequent necessity for additional biopsy procedures. 
We aim to develop OCT into an optical biopsy, providing real-time imaging combined with on-the-spot tumor differentiation. This publication provides a detailed step-by-step approach for percutaneous, needle based, OCT of renal masses.

In Vivo, Percutaneous, Needle Based, Optical Coherence Tomography of Renal Masses

Optical coherence tomography (OCT) is a high resolution imaging technique that allows analysis of tissue specific optical properties providing the means for tissue differentiation. We developed needle based OCT, providing real-time imaging combined with on-the-spot tumor differentiation. This publication describes a method for percutaneous, needle based OCT of renal masses.

Na Vivo, percutânea, Agulha Based, Tomografia de Coerência Óptica de massas renais

Optical coherence tomography (OCT) is the optical equivalent of ultrasound imaging, based on the backscattering of near infrared light. OCT provides real ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of stroke than relying on indirect measurements, and will be a potent and robust vascular research tool. We use an optical imaging approach that labels thrombi with a molecular imaging thrombus marker&#160;&#8212; a Cy5.5 near-infrared fluorescent (NIRF) probe that is covalently linked to the fibrin strands of the thrombus by the fibrin-crosslinking enzymatic action of activated coagulation factor XIIIa during the process of clot maturation. A micro-computed tomography (microCT)-based approach uses thrombus-seeking gold nanoparticles (AuNPs) functionalized to target the major component of the clot: fibrin. This paper describes a detailed protocol for the combined in vivo microCT and ex vivo NIRF imaging of thromboemboli in a mouse model of embolic stroke. We show that in vivo microCT and fibrin-targeted glycol-chitosan AuNPs (fib-GC-AuNPs) can be used for visualizing both in situ thrombi and cerebral embolic thrombi. We also describe the use of in vivo microCT-based direct thrombus imaging to serially monitor the therapeutic effects of tissue plasminogen activator-mediated thrombolysis. After the last imaging session, we demonstrate by ex vivo NIRF imaging the extent and the distribution of residual thromboemboli in the brain. Finally, we describe quantitative image analyses of microCT and NIRF imaging data. The combined technique of direct thrombus imaging allows two independent methods of thrombus visualization to be compared: the area of thrombus-related fluorescent signal on ex vivo NIRF imaging vs. the volume of hyperdense microCT thrombi in vivo.

This protocol describes the application of combined near-infrared fluorescent (NIRF) imaging and micro-computed tomography (microCT) for visualizing cerebral thromboemboli. This technique allows the quantification of thrombus burden and evolution. The NIRF imaging technique visualizes fluorescently labeled thrombus in excised brain, while the microCT technique visualizes thrombus inside living animals using gold-nanoparticles.

Combinada Near-infrared imagens fluorescentes e tomografia Micro-computado para Diretamente Visualizando Cerebral tromboêmbolos

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

Ultrahigh Resolution Mouse Optical Coherence Tomography to Aid Intraocular Injection in Retinal Gene Therapy Research

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the subretinal space, and to evaluate toxicity and efficacy in vivo. HR-SD-OCT uses near infrared light (800-880 nm) and has optics specifically designed for the unique optics of the mouse eye with sub-2-micron axial resolution. Transgenic mouse models of outer retinal (photoreceptor) degeneration and controls were imaged to assess the disease progression. Pulled glass microneedles were used to deliver sub retinal injections of adeno-associated virus (AAV) or nanoparticles (NP) via a trans-scleral and trans-choroidal approach. Careful positioning of the needle into the subretinal space was required prior to a calibrated pressure injection, which delivers fluid into the sub retinal space. Real time subretinal surgery was conducted on our retinal imaging system (RIS). HR-SD-OCT demonstrated progressive uniform retinal degeneration due to expression of a toxic mutant human mutant rhodopsin (P347S) (RHOP347S) transgene in mice. HR-SD-OCT allows rigorous quantification of all the retinal layers. Outer nuclear layer (ONL) thickness and photoreceptor outer segment length (OSL) measurements correlate with photoreceptor vitality, degeneration, or rescue. The RIS delivery system allows real-time visualization of subretinal injections in neonatal (~P10-14) or adult mice, and HR-SD-OCT immediately determines success of delivery and maps areal extent. HR-SD-OCT is a powerful tool that can evaluate the success of subretinal surgery in mice, in addition to measuring vitality of photoreceptors in vivo. HR-SD-OCT can also be used to identify uniform animal cohorts to evaluate the extent of retinal degeneration, toxicity, and therapeutic rescue in preclinical gene therapy research studies.

Here we demonstrate a novel approach to using high resolution spectral-domain optical coherence tomography (HR-SD-OCT) to assist delivery of gene therapy agents into the subretinal space, assess its areal coverage, and characterize photoreceptor vitality.

Tomografia de coerência óptica Mouse ultra alta resolução para auxiliar a injeção intra-ocular em pesquisa de terapia de genes da retina

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the ...

A New Best Practice for Validating Tail Vein Injections in Rat with Near-infrared-Labeled Agents

Intravenous (IV) administration of agents into the tail vein of rats can be both difficult and inconsistent. Optimizing tail vein injections is a key part of many experimental procedures where reagents need to be introduced directly into the bloodstream. Unwittingly, the injection can be subcutaneous, possibly altering the scientific outcomes. Utilizing a nanoemulsion-based biological probe with an incorporated near-infrared fluorescent (NIRF) dye, this method offers the capability of imaging a successful tail vein injection in vivo. With the use of a NIRF imager, images are taken before and after the injection of the agent. An acceptable IV injection is then qualitatively or quantitatively determined based on the intensity of the NIRF signal at the site of injection.

Here we present a method to validate tail vein injections in rats by utilizing near-infrared fluorescence imaging data from dyes incorporated into agents or biological probes. The tail is imaged before and after the injection, the fluorescent signal is quantified, and an assessment of the injection quality is made.

Nova prática recomendada para validar a cauda veia injeções no rato com agentes próximo-infravermelho-rotulado

Intravenous (IV) administration of agents into the tail vein of rats can be both difficult and inconsistent. Optimizing tail vein injections is a key part ...

Semi-Minimal Invasive Method to Induce Myocardial Infarction in Rats and the Assessment of Cardiac Function by an Isolated Working Heart System

Myocardial infarction (MI) remains the main contributor to morbidity and mortality worldwide. Therefore, research on this topic is mandatory. An easily and highly reproducible MI induction procedure is required to obtain further insight and better understanding of the underlying pathological changes. This procedure can also be used to evaluate the effects or potency of new and promising treatments (as drugs or interventions) in acute MI, subsequent remodeling and heart failure (HF). After intubation and pre-operative preparation of the animal, an anesthetic protocol with isoflurane was performed, and the surgical procedure was conducted&#160;quickly. Using a minimally invasive approach, the left anterior descending artery (LAD) was located and occluded by a ligature. The occlusion can be performed acutely for subsequent reperfusion (ischemia/reperfusion injury). Alternatively, the vessel can be ligated permanently to investigate the development of chronic MI, remodeling or HF. Despite common pitfalls, the drop-out rates are minimal. Various treatments such as remote ischemic conditioning can be examined for their cardioprotective potential pre-, peri- and post-operatively. The post-operative recovery was quick as the anesthesia was precisely controlled and the duration of the operation was short. Post-operative analgesia was administered for three days. The minimally invasive procedure reduces the risk of infection and inflammation. Furthermore, it facilitates rapid recovery. The &#8220;working heart&#8221; measurements were performed ex vivo and enabled precise control of preload, afterload and flow. This procedure requires specific equipment and training for adequate performance. This manuscript provides a detailed step-by-step introduction for conducting these measurements.

This article presents an efficient method to perform myocardial ischemia and subsequent chronic reperfusion in rats using a minimally invasive approach. In addition, left ventricular hemodynamic function of rats is assessed by echocardiography and isolated working heart methods.&#160;

Método invasivo semi-mínimo para induzir infarto do miocárdio em ratos e a avaliação da função cardíaca por um sistema cardíaco de trabalho isolado

Myocardial infarction (MI) remains the main contributor to morbidity and mortality worldwide. Therefore, research on this topic is mandatory. An easily ...

How to Administer Near-Infrared Spectroscopy in Critically ill Neonates, Infants, and Children

Near infrared spectroscopy (NIRS) calculates regional tissue oxygenation (rSO2) using the different absorption spectra of oxygenated and deoxygenated hemoglobin molecules. A probe placed on the skin emits light that is absorbed, scattered, and reflected by the underlying tissue. Detectors in the probe sense the amount of reflected light: this reflects the organ-specific ratio of oxygen supply and consumption - independent of pulsatile flow. Modern devices enable the simultaneous monitoring at different body sites. A rise or dip in the rSO2 curve visualizes changes in oxygen supply or demand before vital signs indicate them. The evolution of rSO2 values in relation to the starting point is more important for interpretation than are absolute values.
A routine clinical application of NIRS is the surveillance of somatic and cerebral oxygenation during and after cardiac surgery. It is also administered in preterm infants at risk for necrotizing enterocolitis, newborns with hypoxic ischemic encephalopathy and a potential risk of impaired tissue oxygenation. In the future, NIRS could be increasingly used in multimodal neuromonitoring, or applied to monitor patients with other conditions (e.g., after resuscitation or traumatic brain injury).

This protocol is designed to assist clinicians to measure regional tissue oxygenation at different body sites in infants and children. It can be used in situations where tissue oxygenation is potentially compromised, particularly during cardiopulmonary bypass, when using non-pulsatile cardiac-assist devices, and in critically ill neonates, infants and children.

Como administrar espectroscopia infravermelha em recém-nascidos, bebês e crianças em estado crítico

Near infrared spectroscopy (NIRS) calculates regional tissue oxygenation (rSO2) using the different absorption spectra of oxygenated and deoxygenated ...