Geleneksel olarak, makrofajlar hücreleri yavaş hareket çünkü gerçek zamanlı kemotaksis tahlilleri çalışmak zor olmuştur. Bu protokol, bir chemotactic gradient içinde altı saat veya daha uzun süre göç makrofajlar görüntü için bir araç sağlar. Transfer tahlilleri gibi implant denemeleriyle karşılaştırıldığında, bu teknik makrofaj morfolojisinin gözlemlenebildiği avantajlara sahiptir ve hücre hızı ve kemotaktik verimlilik gibi parametreler ölçülebilmektedir.
Makrofajlar birçok inflamatuar hastalıkta rol oynarlar ve bu teknik kemotaksisi inhibe etmek için tasarlanmış ilaçların incelenmesinde yararlı olabilir. Ayrıca insan monositler gibi diğer hücre tiplerine de uygulanabilir. Bu tekniği ilk kez denerken, hücrelerle çalışmadan önce kemotaksis odalarını doldurma alıştırması yapmak en iyisidir.
Tekniğin en önemli yönlerinden biri hava kabarcıkları kaçınmaktır. Bir veya iki chemotaxis slaytının bağlantı kanallarını el yazması talimatlara göre hazırlanmış değiştirilmiş RPMI 1640 HEPES Medium ile önceden doldurarak başlayın. Bir hücre kültür çanak içine bir slayt yerleştirin ve 37 santigrat derece ye ısıtılan bir alüminyum blok üzerine çanak ayarlayın.
Ardından bir ve dört numaralı bağlantı noktalarına fişleri takın. Modifiye RPMI 1640 HEPES Medium'un 15 mikrolitresini dolum portu üç'e yatırmak için 200 mikrolitrelik bir boru ucu kullanın. Daha sonra, pipet ucunu ikinci bağlantı noktasına takın ve 15 mikrolitreyi orta hızda aspire edin, bu da bağlantı kanalını ve iki yan besleme kanalını önceden dolduracak.
İki ve üç dolum bağlantı noktalarını kapaklarla kaplayın ve chemotaksis kaydırayı kapalı nem odasında, 37 derece kuru ve karbondioksitsiz bir kuluçka makinesiiçinde bir rafa yerleştirin. Makrofajları izole etmek için, kurban edilmiş üç ila dört aylık bir farenin periton boşluğuna 24 kalibrelik plastik kateter yerleştirin ve kalsiyum veya magnezyum olmadan hank'in tamponlanmış tuz çözeltisi ile boşluğu lavajlamak için beş mililitrelik plastik şırınga kullanın. Lavaged orta bir tüp içinde topladıktan sonra, 6,5 dakika 300 kez G santrifüj.
Supernatant atın ve değiştirilmiş RPMI 1640 orta 200 mikrolitre hücreleri yeniden askıya. Hücrelerin bir aliquot 1 ila 20 süspansiyon seyreltin. Sonra hücreleri saymak için bir sayma cihazı kullanın.
Hücreleri mililitre başına altı hücreye 10 kat 10'luk son konsantrasyonla seyreltin ve ısıtmalı alüminyum blokta 37 derecede koruyun. Pili topaklamayı azaltmak için hücre süspansiyonuna beş kez yukarı ve aşağı boru yerleştirin ve 10 mikrolitreyi yavaşça kemotaksis odasının üçüncü limanına yatırın. Pipet ucunu ikinci bağlantı noktasına yerleştirin ve hücre süspansiyonuna yavaşça bağlantı kanalına çekin.
Hücre süspansiyonu kullanıma sunulduğu anda, akışı yakalamak için bir ve dört numaralı bağlantı noktalarındaki fişleri çıkarın ve dört dolum portuna da kapak yerleştirin. Daha sonra, 2-3 saat boyunca 37 derece santigrat nem odasına chemotaxis slaytlar yerleştirin. Gözlem alanını ters bir mikroskopla inceleyin.
Daha sonra bir ve iki dolum portlarına fişleri yerleştirin ve üç numaralı bağlantı noktasının üst kısmı na kadar orta ve hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol edin. Gerekirse, hava kabarcıklarını yerinden çıkarmak için steril 27 gauge şırınga iğnesi kullanın. Daha sonra, 100 mikrolitrelik mekanik pipetli 60 mikrolitre orta maddeyi aspire edin ve ucu üç dolum portuna yerleştirin.
Bir ila iki dakika sonra dolum portu dört üstüne ulaşana kadar yavaş ve sürekli rezervuar içine orta enjekte etmek için ses ayar halkası kullanın. İkinci hazneyi doldurmak için fişi birinci bağlantı noktasından hareket ettirin ve yavaşça üçüncü bağlantı noktasına takın. 50 mikrolitre orta noktayı aspire edin ve pipet ucunu dördüncü bağlantı noktasına yerleştirin ve orta yı yavaşça ikinci rezervuara enjekte edin, böylece bir ila iki dakika sonra dolum portunun üst bölümüne ulaşır.
İki mililitrelik mikro-santrifüj tüpüne 495 mikrolitre orta ekleyin ve beş mikrolitre patent mavisi beş ekleyin. Kısaca karışımı girdap, sonra rekombinant Fare Kompleman C5a ve girdap tekrar karıştırmak için 5.4 mikrolitre ekleyin. Birinci limanın üst kısmındaki sığ depresyonun orta serbest olduğundan emin olun ve orta içeren mavi Kompleman C5a'nın 15 mikrolitresini tevdi edin.
Daha sonra 200 mikrolitrelik pipet ucunu dolum portu dört'e takın ve ortayı ters rezervuara çekmek için hacim ayar halkasını yavaşça döndürün. Akışkan-hava arabirimi sütunun ortasında olana kadar dolum portu bir kısa dikey sütun içine hava çizin. Ardından pipeti dördüncü bağlantı noktasından hafifçe kaldırmadan önce bir bağlantı noktasını takın, kaydıraktan sonra yerinde kaldığından emin olun ve yavaşça bağlantı noktası dörtünü takın.
Zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için, bir sahne inkübatör ile donatılmış bir ters mikroskop sahnesine kemotaksis slayt yerleştirin ve makrofaj lamellipodia odaklanan bir 10X faz kontrast objektif lens ile gözlem alanı görüntü. Fare periton makrofajlarının zaman atlamalı video mikroskobunda kullanılan kemotaksis slaytında her biri dört dolum noktası bulunan üç kemotaksik odası vardır. Hücreler her odanın gözlem alanında tohumlandı.
Ve 2-3 saatlik kuluçkadan sonra, odalar yavaşça orta ile doldu. Gözlem alanındaki hücreler incelendiğinde, hücrelerin üçte ikisi yıkanmıştı. Genellikle, zayıf yapışık B-1 hücreleri yıkanmış ve kalan hücreler ağırlıklı olarak makrofajlar vardı.
Makrofajları B hücrelerinden ayırmak için, yeni izole edilmiş hücreler spesifik antikorlarla etiketlendi. Makrofajlar yeşil floresan, kırmızı b hücreleri ve mavi hücre çekirdekleri ile etiketlendi. Makrofaj göçü, bir kemoattractant olan Kompleman C5a'nın iki rezervuardan birine getirilmesiyle araştırıldı.
Kompleman C5 gradyan'da göç eden makrofajların geçiş izleri kaydedildi. Her geçiş parçasının başlangıç noktası x'e normalleştirildi sıfıra eşit, Y ise bir geçiş çizimi oluşturmak için sıfıra eşittir. Daha sonra bireysel makrofajların hücre hızı ve kemotaktik etkinliği hesaplandı.
Bu teknik, G protein alt birimlerinin ve Rho GTPases'in rollerini ve kemotaksizde makrofaj hareketliliğini incelemek için yararlı olmuştur.
