Yazarlar ölçüde Institut Curie&#39;nin (CNRS UMR144) de PICT Ibisa platformu kabul. Bu çalışma hibe tarafından finanse edildi: AM.LD için Avrupa Araştırma Konseyi (Strapacemi 243.103), Dernek Nationale la Recherche (ANR-09-PİRİ-0027-PCVI), InnaBiosanté vakıf (Micemico) MP ve PM dökün. AM.LD. LD ve ERC Strapacemi genç araştırmacı hibe

Önemli not: Bu protokol, istenen mikrokanalların şeklini içeren kalıp zaten yapılmış olduğunu varsayar. Kalıbın hazırlanması hakkında daha fazla bilgi 10, daha önce yayınlanmıştır. Bu protokol aynı zamanda kemik iliği DH&#39;leri kültürü bilindiğini varsayar. 1.. Chip Fabrikasyon <ol><li> Plastik bir kap içinde bir ağırlık oranı 10:1 PDMS yağ ve sertleştirme maddesi karıştırın. İyice her iki bileşiği karıştırın. </li><li> Kalıp yatak mikrokanalların üzerinde karışımı döküm. Toplam yüksekliği 0.5-1 cm arasında olmalıdır. </li><li> 1 saat boyunca bir vakum kavanoz çan hava kabarcıklarını çıkarın. </li><li> 65 ° C&#39;de 2 saat boyunca bir fırın içinde ikinci yerleştirerek küfü içinde katılaşmaya PDMS </li><li> PDMS oda sıcaklığında sonra, bir cerrahi bıçak ile yapı etrafında büyük bir parça kesilir ve kalıbın (Şekil 1A) onu soyulabilir. </li><li> Hücreleri enjekte edilecektir delik (tipik olarak 2 mm) bir matkap ve PDMS boyutlandırmagöç (Şekil 1B) değerlendirilecek olan cam alt yemekleri boyutuna uyması için bir cerrahi bıçak ile. Devam etmeden önce, temizleme kağıdı lens kullanarak yemeğin kalan toz kaldırmak. Bu aşama 1.10 tarif cam PDMS bağlayıcı yanadır. </li><li> Yapı tarafta yapışkan bant yapıştırma ve soyma kanalları içeren resized PDMS çipi temizleyin. </li><li> PDMS toz ve küçük parçacıkların ayrılması için% 70 etanol içinde PDMS parçaları da 30 saniye sonikasyon. Temiz hava üfleme hızla sonradan onları kurutun. </li><li> 300 mTorr 30 sn boyunca hava (veya oksijen) ile (yukarı yapılar) ve PDMS kültür kaplarına aktive plazma işleme. </li><li> Sürekli olarak alt-tabaka için, PDMS sopa temas halindeki her iki yüzey aktif yerleştirin. Eğer gerekirse, polimer ve çanak (Şekil 1C) ve cam arasındaki temas zorlamak için PDMS üstüne hafifçe basın metalik forseps kullanır. </li><li> 65 ° C de fo fırında çipi inkübebağlama güçlendirmek için r 1 saat. </li></ol> 2. Mikrokanallarda Kaplama <ol><li> 1 dakika boyunca 300 mTor hava plazma tarafından tüm yapıyı etkinleştirin. Bu, bir sonraki aşamada da kanal içine sıvının girişini teşvik edecektir. </li><li> Su içinde 10 ug / ml &#39;de hızlı bir fibronektin ile çipin giriş delikleri doldurun. PEG gibi diğer alt-tabakalar kanal duvarlarına hücre yapışmasını değiştirmek için kullanılabilir. Sıvı yapının tamamı yayılır dikkat ediniz. Bu kolaylıkla normal ışık altında ya da düzenli bir aydınlık alan mikroskobu kullanarak gözle kontrol edilebilir. NOT: difüzyon zor olan çok küçük yapılarda, kanallardaki sıvı girişi, en az 15 dakika boyunca bir vakum çan kavanoz yapıyı yerleştirerek zorlanabilir. Fluoresan alt-tabakalarını kullanılabilecek kaplama verimliliğini (Şekil 2) kontrol etmek için. </li><li> Fibronektin adsorpsiyonu ya da başka kaplama subst izin vermek için, oda sıcaklığında 1 saat inkübe edinkanalların duvarlarına hızı. </li><li> Bu yapıların nonbound tabakayı uzaklaştırmak için PBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> Yıkama işleminden sonra, Protokol 3 geçin veya sonraki bir kullanım (24 saat maksimum) 4 ° C&#39;de çipi saklayın. </li></ol> 3. Hücre Yükleniyor <ol><li> Plaka PBS çıkarın ve hücre ortamı ile mikrosistem doldurun. Ortam ile kanal doyurmak için 1 saat boyunca inkübe olsun. NOT: molekül inhibitörleri gibi ilaçları içeren deneyler için, doğru konsantrasyonda ilaç ihtiva eden bir ortam maddesi ile kanal Preincubate için tavsiye edilir. Ayrıca, bazı ilaçlar, etkin konsantrasyonunu azaltan PDMS yapısında çözünür olma eğilimindedir. Bazı çözümler bu sorunu 11-12 karşı ileri sürülmüştür. </li><li> Yüzer DC&#39;ler çıkarın ve kültür ortamı ile yıkama ile, yarı-yapışkan hücreleri iyileşir. Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. NOT: çekirdeği görüntüleme için, Hoechst 33342 boyama in tarafından önceden elde edilebilirtam ortam içinde 200 ng / ml &#39;de boya ile 30 dakika boyunca 2 x 10 6 hücre cubating. Protokolü devam etmeden önce boyanın fazlasının ayrılması için santrifüj ile iki kez yıkanır. </li><li> 5 dakika (zaman ve hız hücre türüne bağlı olarak farklı olabilir) esnasında 300 xg&#39;de hücreleri Santrifüj ve orta atın. 20 x 10 6 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyon elde etmek için topağı seyreltin. </li><li> Plakadan ortamın fazlalığını çıkarın ve bir mikropipet kullanılarak PDMS yapısındaki giriş delikleri boşaltın. Her giriş deliği 1 x 10 5 hücre bir miktarda ulaşmak için hücre çözümü 5 ul girdileri doldurun. NOT: Yüksek hücre yoğunluğu kanalları hücrelerin temas lehine için gereklidir. Düşük hücre yoğunluğu kanal ve deney hatası içinde hücre sayısı düşük neden olabilir. </li><li> Inkübatör içinde 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca inkübe edin mikroçip. Deney çanak tam ortam 2 ml ilave edilir. NOT: Bütün PDMS yapısı b gerekire deney sırasında hücrelerin kurumayı önlemek amacıyla kapalı. 2 ml yeterli değilse, tamamen PDMS yapısı karşılamak için daha fazla orta ekleyin. </li></ol> 4. Görüntüleme <ol><li> Mikroskop altında plakaları yerleştirmeden önce bir objektif temizleme beziyle yemekleri dış alt yüzeyini temizleyin. </li><li> Hücrelerin çok sayıda geçiş analiz etmek için, bir CO2 ve ısı donanımlı video mikroskop 10X büyütme ve geniş alan aydınlatma (Şekil 3) kullanın. Hücre izleme kolaylaştırmak için, Hoechst boyama ve UV ışığı (adım 3.2) de kullanılabilir. Göç aynı zamanda göç sırasında hücresel yapıların daha yüksek çözünürlük elde etmek için konfokal mikroskopi kullanılarak analiz olabilir. </li><li> 10X de zaman atlamalı mikroskobu için, beklenen hücre hızında (5 mm / dk &#39;lık bir hız ile göç eden dendritik hücreler tipik olarak 2 dakika)&#39; e uygun bir zaman frekansı seçin. Not: Burada açıklanan protokol n yaparot hücre göçü parametrelerin analizini içerir. Birkaç puan time-lapse film bilgileri ayıklamak için nasıl devam için okuyuculara tavsiye tartışma listelenmiştir. </li></ol>

<ol>
	<li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+a+physically+integrated+molecular+process.">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84 (3), 359-369 (1996).</li><li>L&#228;mmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing.">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li><li>Schor, S. L., Allen, T. D., Harrison, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+through+three-dimensional+gels+of+native+collagen+fibres:+collagenolytic+activity+is+not+required+for+the+migration+of+two+permanent+cell+lines.">Cell migration through three-dimensional gels of native collagen fibres: collagenolytic activity is not required for the migration of two permanent cell lines.</a> J. Cell. Sci. 41, 159-175 (1980).</li><li>Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decisions+about+dendritic+cells:+past,+present,+and+future.">Decisions about dendritic cells: past, present, and future.</a> Annu. Rev. Immunol. 30, 1-22 (2012).</li><li>Faure-Andr&#233;, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+dendritic+cell+migration+by+CD74,+the+MHC+class+II-associated+invariant+chain.">Regulation of dendritic cell migration by CD74, the MHC class II-associated invariant chain.</a> Science. 322 (5908), 1705-1710 (2008).</li><li>Renkawitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+force+transmission+in+amoeboid+cell+migration.">Adaptive force transmission in amoeboid cell migration.</a> Nat. Cell Biol. 11 (12), 1438-1443 (2008).</li><li>Jacobelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confinement-optimized+three-dimensional+T+cell+amoeboid+motility+is+modulated+via+myosin+IIA-regulated+adhesions.">Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions.</a> Nat. Immunol. 11 (10), 953-961 (2010).</li><li>Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchinson, T., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+stimulation+and+constrained+cell+migration+in+microfluidic+channels.">Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 7 (12), 1783-1790 (2007).</li><li>Moreau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+in+situ+cytometry+uncovers+T+cell+receptor+signaling+during+immunological+synapses+and+kinapses+in+vivo.">Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo.</a> Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).</li><li>Heuz&#233;, M. L., Collin, O., Terriac, E., Lennon-Dum&#233;nil, A. M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+in+confinement:+a+micro-channel-based+assay.">Cell migration in confinement: a micro-channel-based assay.</a> Methods Mol. Biol. 769, 415-434 (2011).</li><li>Ren, K., Zhao, Y., Su, J., Ryan, D., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convenient+method+for+modifying+poly(dimethylsiloxane)+to+be+airtight+and+resistive+against+absorption+of+small+molecules.">Convenient method for modifying poly(dimethylsiloxane) to be airtight and resistive against absorption of small molecules.</a> Anal. Chem. 82 (14), 5965-5971 (2010).</li><li>Ren, K., Dai, W., Zhou, J., Su, J., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Teflon+microfluidic+chips.">Whole-Teflon microfluidic chips.</a> PNAS. 108 (20), 8162-8166 (2011).</li><li>Maiuri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+World+Cell+Race.">The first World Cell Race.</a> Curr Biol. 22 (17), 673-675 (2012).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada tek deneylerde hücre sayıda göç özelliklerini incelemek için bir yöntem olarak mikro oluşan bir cihaz tarif etmektedir. Bu deneysel sistem endojen göçmen hücreler tarafından dokularda bulunan sınırlı çevresel kısıtlamalar taklit eder. Ancak, tek bir boyutta göç zorlayarak, otomatik hücre izleme ve measurables çıkarılması (Şekil 5) kolaylaştırır. Aynı zamanda cihaz floresan mikroskobu ile uyumlu olduğunu ve bu nedenle hücre motilitesini farklı aşamalarında <stron...

Göç gelişimi, bağışıklık yanıtı, doku rejenerasyonu ve da dahil olmak üzere çok-hücreli organizmada, pek çok fizyolojik süreçler için önemli olan bir kompleks hücresel fonksiyonudur. Buna ek olarak, bu tür tümör istilası ve metastaz gibi bazı patolojik durumlar, hücre motilitesi 1 dayanır. Bu nedenlerden dolayı, hücre göçü temel ve translasyonel hem araştırma bağlamında çalışmanın önemli bir alan haline gelmiştir. In vivo, çoğu dokuların zengin hücre-dışı matris ve yüksek hücre yoğunluğu ile karakterize edilir. Hücre göçü, bu nedenle, fizyolojik koşullar altında, bir kompleks kapalı bir ortamda meydana gelir. Klasik, çoğu tarihsel nedenlerden dolayı ve teknik sınırları olasılığı, hücre göçü gibi hapsi olarak dokularda bulunan çevre özelliklerinin çoğunu yeniden yok düz 2D sistemlerinde çalışılmıştır. Ayrıca, 2B motilite için gerekli olan hücre yapışması gibi faktörler, son zamanlarda necessa olmayabilir gösterdi edilmiştirrily 2B ve diğer ortamlarda hücre lokomosyonu kural mekanizmaları 2 ayrı olduğunu öne sürerek, in vivo veya jellerin içinde göç için gerekli. Çeşitli hücre dışı matris sistemleri, bileşimin 3 özelliklerini yansıtan nişan dokuların, en ünlü olmak kollajen jel, karmaşık özelliklerini taklit etmek için geliştirilmiştir. Burada kapalı bir ortamda bir boyutta çalışma hücre göçünü sağlayan basit bir tamamlayıcı bir yöntem olarak mikrokanalların öneriyoruz. Bu sistemde hücreler kendiliğinden girmek içine Mikrokanallar boyunca göç. Göç eden hücreler, daha sonra, büyük olasılıkla da bir polariteye güçlendiren boru şeklinde bir geometri benimseyerek, kanal şeklini kazanır. Kanallardaki hücrelerin doğrusal hareket otomatik hücre izleme ve deneylerden elde edilen kantitatif parametrelerin çıkarma sağlar. Görüş teknik açıdan bakıldığında, bu sistem kolay ve esnektir. Coatinkanal duvarlarının g kanalların boyutu ve şekli uyarlanabilir, manipüle edilebilir ve hücreler, çok sayıda tek deneylerde analiz edilebilir. Bu sistem aynı zamanda ölçekli yukarı olabilir hücre hareketi katılan moleküllerin orta menzilli ekran analizini gerçekleştirmek. Burada açıklanan protokol hücresel bir model olarak dendritik hücreler (DC) kullanılarak standardize edilmiştir. Bu 4.. In vitro, DCler kendiliğinden kapalı ortamlarda geçiş gösterilmiştir spesifik bağışıklık yanıtlarının başlatılması ve bakım katılabilir ve bu nedenle mikro 5,6 hücre hareketliliği incelemek için iyi bir model olarak bu hücreler bağışıklık sistemi için anahtar . Önemli olarak, bu sistem, T lenfositler, nötrofiller, ya da tümör hücreleri 7-9 gibi başka bir hücre tipi hareketli göçünü analiz etmek için uzatılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="947">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:273px;">PolyDimethylSiloxane (PDMS)</td>
			<td style="width:131px;">GE Silicones</td>
			<td style="width:139px;">RTV615</td>
			<td style="width:405px;">Package of 90% silicone base and 10% curing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Core sample cutter</td>
			<td>Ted Pella Int.</td>
			<td>Harris Uni-Core&#160;</td>
			<td>Diameter 2,5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass-bottom dish</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Fluorodish FD 35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultrasonic cleaner</td>
			<td>Branson Ultrasonics</td>
			<td>Branson 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC 32 G</td>
			<td>For small samples (35 dishes). A bigger version is also available</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG)</td>
			<td>Susos</td>
			<td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y27632</td>
			<td>TOCRIS</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of cell migration in microfabricated channels

Burada tarif edilen yöntem, bir boyutta kapalı alan içinde hücre göçü çalışma sağlar. Bu fiziksel kısıtlamaları ile hücrelere bir polarize fenotip empoze mikrofabrike kanalların kullanımına dayanmaktadır. Ileri ya da geri hareket: kanalların içine kez hücreler yalnızca iki olasılık var. Yön sınırlı olduğu bu basitleştirilmiş göç hücrelerinin otomatik izleme ve hücre hareketini tanımlamak için sayısal parametreler çıkarma kolaylaştırır. Bu parametreler, hareket esnasında hücre hız, yön değişimleri ve duraklar içerir. Mikro kanallar da floresan markerlerin kullanımı ile uyumludur ve yüksek çözünürlükte hücre geçiş sırasında, hücre içi organel ve yapıların lokalizasyonu incelemek için uygundurlar. Son olarak, kanalların yüzeyi kanallar ya da haptotaxis çalışma yapışkan özelliklerinin kontrol etmesine izin veren, farklı alt-tabaka ile fonksiyonalize edilebilir. Özet olarak, sistem here tarif bağımsız deneyin normalleştirme ve tekrarlanabilirlik kolaylaştırılması, geometri ve çevrenin biyo-kimyasal yapısı hem de kontrol edildiği koşullarda hücre sayıları büyük göçünü analiz etmek için tasarlanmıştır.

Her bir deneyde, PDMS yüzey çalışmanın ilgi uyarlanmış bir molekül ile kaplanır. Önce ve (adım 2.4) yıkandıktan sonra bir flüoresan molekül, PLL-PEG-g, kaplanmış Şekil 2, kanal Şekil. Böyle bir deney, kanallardaki kaplamanın homojenliği kontrol sağlar. Hücre Yükleme işleminden sonra, bir video mikroskobu hücre göçü takip gerçekleştirilebilir. Şekil 3A, DC hücreleri izlemek için uygun bir yoğunlukta mikro g...

Watch this Scientific Journal Video about Study of Cell Migration in Microfabricated Channels at JoVE.com

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

Tek boyutlu bir kapalı mikro hücrelerin spontan göç incelemek için nicel bir yöntem tarif edilmektedir. Bu yöntem, mikrofabrike kanalları yararlanır ve tek bir deneyde, farklı koşullar altında hücrelerin büyük sayıda göçünü incelemek için kullanılabilir.

Microfabricated Kanallar Hücre Göç Çalışması

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

study-of-cell-migration-in-microfabricated-channels

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.8K Görüntüleme.  Institut Curie.  Tek boyutlu bir kapalı mikro hücrelerin spontan göç incelemek için nicel bir yöntem tarif edilmektedir. Bu yöntem, mikrofabrike kanalları yararlanır ve tek bir deneyde, farklı koşullar altında hücrelerin büyük sayıda göçünü incelemek için kullanılabilir. 

Video: Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Mekanik Dinamik Hücre Kültürü için Microfabricated platformlar

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Biyomühendislik

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Protein ve hücre Etrafının İki Boyutlu Desenli Yüzeyler Oluşturma

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

2D ve 3D Ortamlarda Sinir Progenitör Hücreleri Elektrik Alanı kontrollü Yönetmen Göç

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to investigate mechanisms governing cell adhesion under dynamic flow conditions. For instance, cancer cells labeled with multiple fluorophores can be perfused over a potentially reactive substrate to model mechanisms of cancer metastasis. However, multi-channel single camera systems and color cameras exhibit shortcomings in image acquisition for real-time live cell analysis. To overcome these limitations, we used a dual camera emission splitting system to simultaneously capture real-time image sequences of fluorescently labeled cells in the flow chamber. Dual camera emission splitting systems filter defined wavelength ranges into two monochrome CCD cameras, thereby simultaneously capturing two spatially identical but fluorophore-specific images. Subsequently, psuedocolored one-channel images are combined into a single real-time merged sequence that can reveal multiple target molecules on cells moving rapidly across a region of interest.

Dual camera emission splitting systems for two-color fluorescence microscopy generate real-time image sequences with exceptional optical and temporal resolution, a requirement of certain live cell assays including parallel plate flow chamber adhesion assays. When software is employed to merge images from simultaneously acquired emission channels, pseudocolored image sequences are produced.

Eşzamanlı Dual Kamera Emisyon Yarma Sisteminin Kullanılması İki Emisyon Kanallarda Gerçek zamanlı yakalama Görüntüleri: Uygulamalar Yapışma Hücre

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

Canlı Görüntüleme ve Yaralanma Yanıtları Çalışması için Mikroakiskan Chips kullanma<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

Konsantrik Jel Sistemi 3D Hücre Göç Matrix mikroçevresinin biyofiziksel Rolü Eğitim için

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect

Without an active, thriving cell population that is well-distributed and stably anchored to the inserted template, exceptional bone regeneration does not occur. With conventional templates, the absence of internal micro-channels results in the lack of cell infiltration, distribution, and inhabitance deep inside the templates. Hence, a highly porous and uniformly interconnected trabecular-bone-like template with micro-channels (biogenic microenvironment template; BMT) has been developed to address these obstacles. The novel BMT was created by innovative concepts (capillary action) and fabricated with a sponge-template coating technique. The BMT consists of several structural components: inter-connected primary-pores (300-400 &#181;m) that mimic pores in trabecular bone, micro-channels (25-70 &#181;m) within each trabecula, and nanopores (100-400 nm) on the surface to allow cells to anchor. Moreover, the BMT has been documented by mechanical test study to have similar mechanical strength properties to those of human trabecular bone (~3.8 MPa)12.
The BMT exhibited high absorption, retention, and habitation of cells throughout the bridge-shaped (&#928;) templates (3 cm height and 4 cm length). The cells that were initially seeded into one end of the templates immediately mobilized to the other end (10 cm distance) by capillary action of the BMT on the cell media. After 4 hr, the cells homogenously occupied the entire BMT and exhibited normal cellular behavior. The capillary action accounted for the infiltration of the cells suspended in the media and the distribution (active migration) throughout the BMT. Having observed these capabilities of the BMT, we project that BMTs will absorb bone marrow cells, growth factors, and nutrients from the periphery under physiological conditions.
The BMT may resolve current limitations via rapid infiltration, homogenous distribution and inhabitance of cells in large, volumetric templates to repair massive skeletal defects.

A step-by-step generic process to create a bone-like template with engineered micro-channels is presented. High absorption and retention capabilities of the template are demonstrated by capillary action via micro-channels.

Mikro-kanallar tarafından Distinctive Kılcal Eylem Bone gibi şablonları Büyük Kemikli Defekt Restorasyon Hücreleri İşe Alım geliştirin edebilirsiniz

Without an active, thriving cell population that is well-distributed and stably anchored to the inserted template, exceptional bone regeneration does not ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

3D Etkileşimleri Çalışmaları 3D Kollajen jeller ve Mikrokanallarda Hazırlanması<em&gt; İn Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...