Yazarlar tekniğinin gelişimine ve yazının üretimine katkıda Dowling laboratuar üyeleri (Aaron Reifler, Trent Waugh, Angela Busta, ve William Telfer) teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Taubman Enstitüsü, Michigan Üniversitesi Pediatri Bölümü ve Müsküler Distrofi Derneği (JJD MDA186999) ve Sağlık Ulusal Enstitüsü (JJD 1K08AR054835) hibe kısmen tarafından finanse edildi.

1.. Poli-L-Lizin hazırlanması kaplı kapak (Süre: 1 saat) Kaplama lamelleri hızlı miyofiberde oluşan çökmesi ve yapışma sağlar. Bu miyofiberde oluşan izolasyonu (Adım 2) &#39;in ayrışma aşaması esnasında gerçekleştirilebilir. <ol><li> Kesme ve bir 60 mm Petri kabı (herhangi bir marka) altındaki Parafilm yerleştirin. </li><li> Bir 60 mm doku kültürü çanağı içinde Parafilm mikroskop kapak camı fişleri (12 mm çapında) yerleştirilir ya da 24 oyuklu plakalar, tekli oyuklar içerisinde tek tek yerleştirin. </li></ol> Not 1: Bu küçük yuvarlak lamelleri miyofiberde oluşan sayılar konsantre ve aşırı antikor kullanımını azaltmaya yardımcı olur. Not 2: Diğer boyutu lamelleri çalışacaktır ancak, kullanılan reaktif ve embriyoların hacimleri buna göre ayarlanması gerekir. <ol start="3"><li> Pipet Petri kabındaki her bir kapak camı ile ilgili poli-L-lizin çözeltisi (% 0.01) 50-200 ul. </li><li> Lamelleri en az bir ho oturmak için izin37 ° C&#39;de ur Uzun inkubasyon olumsuz sonuçlarını etkilemeyecektir. </li><li> Kapak cam, poli-L-lisin çözüm çıkarın ve 100 ul 1 x PBS, en az iki kez yıkayın. </li><li> Lamelleri kurumasını bekleyin. </li><li> Lameller şimdi myofibers için hazırız. </li></ol> Not 3: sterilite sağlamak için, kaplama, bir başlık ve otoklav lamelleri yapılabilir. Not 4: alt Parafilm ile 60 mm Petri kabı tutun. Bu kurulum miyofiberde oluşan kaplama ve immunolabeling (daha sonra adım) sırasında kullanılan olacaktır. Alternatif 1: Bunun yerine, kullanımdan hemen önce kaplama lamelleri, kaplanmış bir lamel stok kullanılabilir. 2 ml poli-L-lizin ihtiva eden en az bir 60 mm Petri kabı, çok sayıda lamelleri içeren 4 ° C&#39;de saklanabilir. Bu alternatif ile myofibers için lamelleri işlem aşamasında 1,5 başlar. Alternatif 2: Ayrıca, poli-L-omitin kat lamelleri. Tonun daha yoğun emek olmakla birlikte, poli-L-ornitin kaplı lamelleri UV muamele edilmiş olabilir, çünkü daha uzun süreli kültür için yararlıdır. UV tedavisi ve dikkatli steril tekniği ile canlı myofibers genellikle 4-7 gün kültür içinde muhafaza edilebilir. 2. Myofibers Zebra balığı Embriyolar ve Kaplama (: 1 ila 3 saat Süresi) Ayrışma Not: standart protokol 3 dpf&#39;e (gün sonrası fertilizasyon) embriyolar için en iyi geçerlidir. <ol><li> Standart bir 1.5 ml santrifüj tüpüne zebra balığı embriyo transferi ve mümkün olduğu kadar fazla balık suyu çıkarmak. Tipik olarak, daha az olsa da tüp başına 10-20 embriyo, kullanılabilir. Birden fazla 20-25 embriyo kullanılması genellikle aşırı bir yoğunluk hazırlanması ile sonuçlanır. <ol><li> Elle 5 forseps # kullanarak, önce disosiyasyonundan chorions çıkarın. Seçenek olarak ise, kimyasal koryon kaldırma 10-15 dakika Pronaz tedavisi ile elde edilir. Tipik olarak, koryon önceki kaldırma sadece gerektiğinde bir mut önceden onaykarınca fenotip veya morfoloji gereklidir, ya da aşamaları kullanırken embriyolar doğal koryon yumurtadan nerede. </li></ol></li><li> Embriyoları içeren tüp CO 2 bağımsız medya 900 ul ekleyin. </li><li> 100 kollajenaz tip II ul, nihai konsantrasyonu 3.125 mg / ml ayrışmasını başlatmak için (31.25 mg / 1x PBS içinde seyreltilmiş ml Stock at kolajenaz solüsyon) eklenir. Kollajenaz IV, aynı zamanda ayrılması için de kullanılabilir. </li><li> Orbital bir karıştırıcı üzerinde embriyolar döndürün ve toz haline getirme için bir P1000 Pipetman kullanılarak oda sıcaklığında 30 dakika çiğnemek. </li></ol> Not 2: Dikkatle embriyo ayrışmayı izlemek; (özellikle over) üzerinden veya ayrışma altında protokol başarısızlığın en yaygın nedenleri vardır. Sindirim için Times toz haline getirme, tüp başına embriyo sayısı ve embriyo yaşı yoğunluğuna bağlı olarak değişecektir. Ayrıca kas iskelet mutantlardan embriyolar için (doğal tür ile karşılaştırıldığında), genellikle daha azdır. Not3: embriyo yaş Ortalama sindirim süresi: = 1 saat 1 dpf, 2 dpf&#39;e = 1.5 saat, 3 dpf&#39;e = 2 hr ve = 2-2.5 saat 4 dpflik. <ol start="5"><li> Hayır bütün embriyolar görünür, ama sağlam parçaları hala görünür olduğunda sindirim Dur - Bu Overdigestion önlemek için şarttır. </li><li> Pelet hücrelere 3-5 dakika boyunca 0,8-2,3 xg&#39;de ayrışmış embriyolar ile santrifüj tüpleri. </li><li> Peletleşmiş hücrelerden süpernatant kaldırmak ve CO 2 bağımsız medya ile 2x yıkayın. </li><li> Hücrelerin tekrar süspansiyon taze CO 2 bağımsız medya ekleyebilirsiniz. 1 ml tipik haliyle, 10-20 embriyo preparatlarıyla için kullanılır. Hacmi embriyo sayısına göre ölçeklenebilir. </li><li> P1000 bir pipet kullanarak, 70 um&#39;lik bir filtreden embriyo süspansiyon geçmektedir. Bu hazırlık istenmeyen enkaz kaldırmak yardımcı olur. </li></ol> Not 4: Embriyo Süspansiyon istenmeyen birikintileri temizlemek için bir 40 um&#39;lik bir filtreden bir kez daha filtre edilebilir. Bir çift filtrasyon, kurtarma approxim olduğunu1 ml &#39;lik bir başlangıç ​​hacminden rilmesi 800 ul. <ol start="10"><li> Her bir poli-L-lizin kaplı lamel miyofiberde oluşan süspansiyonu yaklaşık 50-100 ul ekleyin. </li></ol> Not 5: alt Parafilm ile Petri tabaklarında adım 2.9 yapın, önceden hazırlanmış. Parafilm kaplı lamelleri akıp miyofiberde oluşan süspansiyon tutar. Buharlaşmasını önlemek için kapalı Petri yemekleri tutun. <ol start="11"><li> Myofibers oda sıcaklığında kaplanan kapak slipleri üzerine, yaklaşık 1 saat yerleşmeye izin verin. </li></ol> Not 6: myofibers 5-10 dakika içinde yerleşmeye başlayacak. Ancak, iyi miyofiberde oluşan bağlanması için, 1 saat (1-2 saat) bir minimum tavsiye edilir. Myofibers uzun yerleşmek için izin hazırlık zarar vermez. (Gece ​​boyunca dahil) daha uzun inkubasyon için, antibiyotikler ortama ilave edilebilir. Antibiyotik ve steril tekniği ile canlı kültürler genellikle 1-2 gün süreyle muhafaza edilebilir. <ol start="12"><li> Canlı myofibers bu noktada görülmektedir. Embriyolar 2 dpf den myofibers ve daha sonra çizgili ve uzunlamasına hücreleri (Şekil 1) olarak görülecektir. Bu noktada, myofibers şimdi canlı analiz veya immunolabeling için hazırız. </li></ol> Not 7: embriyolardan dpf&#39;e 1&#39;den İskelet kası gibi uzun ve açıkça çizgili lifleri plaka değil. Bunun yerine, büyük myoballs görebilir. Buna ek olarak, peletleme sonrası faz ayrışması sırasında myoballs bir pelet elde etmek için 5000 x g&#39;de 8 dakika boyunca santrifüje tabi az olması gerekir 1 dpf (2.6 adım). Bu aşamada embriyolar analizi için, bu özellikle iskelet kası 23 EGFP ifade eden transgenik hat kullanmak tavsiye edilir. Bu, diğer kaynaklardan karşı kas kökenli hücrelerin tanımlanmasına izin verir. 3. Disosiye Zebra balığı myofibers floresan İmmünoboyama (Saat: yaklaşık 1 gün) 3.1. Immunolabeling <ol><li> Bir kısmını çıkarmakkaplanmış lamel yapışık myofibers medya </li><li> % 4 paraformaldehit ya da metanol kullanılarak, hücreler. PFA için, medya hacmi ½ kaldırmak ve PFA aynı miktarda değiştirin. , Tüm hacim kaldırmak, daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca saptamak PFA 50-100 ul ile değiştirin ve ek bir 10 dakika boyunca düzeltin. Alkol tespiti, buzla soğutulmuş metanol ya da aseton için, sırasıyla, 10 dakika ya da 5 dakika boyunca 4 ° C &#39;de uygulanabilir. </li><li> Myofibers en az 1 adet 1 x PBS ya da PBS ile 3-5x artı% 0.1 TWEEN yıkayın. Ortalama yıkama hacmi lamel ortalama 50-100 ul. </li><li> Myofibers solüsyonu (stokları çalışma) bloke edin ve oda sıcaklığında 20-60 dakika kuluçkalayın. Bloke edici çözelti, birincil ve ikincil antikorlar bağlı olarak değişecektir. Laboratuarda kullanılan en yaygın iki (1) 1x PBS, 2 mg / ml BSA,% 1 serum koyun,% 0.25 Triton X-100, kesin ve (2)% 0.2 Triton X-100, 2 mg / ml (0.2 olan % BSA) ve% 5 koyun / keçi serumu. </li><li> Çözümü engelleme çıkarın ve b ya seyreltilmiş primer antikor ekleyinçözeltisi ya da PBS kilitleme. 4 ° C de bir gece inkübe myofibers Parafilm ya emin olun veya antikor ile kaplanmış miyofiberde oluşan yüklü lamelleri içeren Petri şal saran sarın. Nemli bir kağıt havlu küçük parçalar nemlendirilmiş odası oluşturmak için ilave edilebilir. </li><li> Lamelleri primer antikor çıkarın ve 5 dakika PBS ile veya engelleme çözümü için lamelleri 3-5x yıkayın. </li><li> 1x PBS ya da oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca bloke çözeltisi içinde seyreltilmiş uygun konsantrasyonda ikincil antikor ekleyin. </li><li> İkinci antikorunu çıkarın ve oda sıcaklığında her biri 5 dakika boyunca PBS içinde myofibers 3-5x yıkayın. </li></ol> 3.2. Montaj lamelleri <ol start="9"><li> Bir mikroskop lamı antifade ayıracı 1-2 damla uygulayın. </li><li> Dikkatle pick-up kaplamalı ve immunolabled lamel mikroskop lamı üzerine antifade reaktif üzerinde lamel (myofibers aşağı) forseps ve yer kullanarak. </li></ol> C yönüne Dikkat: Not 1oated lamel kritiktir. <ol start="11"><li> Sert ve katı bir yüzeye 1-2 Kimwipes yatıyordu. Çabuk antifade reaktif üzerinde oturan kaplı lamelleri ile slayt ters ve Kimwipes (aşağı lamel) yerleştirin. </li><li> Aşırı antifade kaldırmak ve slayt ve lamel arasında sıkı bir mühür formu mikroskop lamı köşelerine hafif bir basınç uygulayın </li><li> , Oda sıcaklığında 5-10 dakika için kurumaya kalan antifade ardından myofibers 4 ° C &#39;de (Şekil 2A ve B) veya imajı hazır izin ver </li></ol> 4. GCaMP3 kullanarak canlı hücre Kalsiyum Görüntüleme Canlı hücre deneyleri (adım 2.10 aşağıdaki gibi) önceden tespit etmek myofibers yapılabilir. Aşağıdaki protokol GCaMP3 24, iskelet kası, belirli zebra balığı α-aktin promoteri (pSKM) 23 ile ifade edilen bir genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi, ifade myofibers canlı görüntüleme açıklar. Seçenek olarak,Bu teknik hali hazırda bu tür Fura-2 kalsiyum göstergesi boyalar kullanmak için adapte edilebilir. <ol><li> PSKM ile embriyolar enjekte: GCaMP3 1-2 hücreli aşamada inşa </li><li> 3 dpf, larvaları toplamak ve bölümler 1 ve 2 de tarif edildiği gibi myofibers hazırlar. Myofibers 1 saat arasında, en az yapışmaya izin verin. Bu teknik için, 24 oyuklu tabaklarda lamelleri hazırlanması gereklidir. </li><li> Dikkatle fazla ortamı çıkartın ve oda sıcaklığında taze CO 2 bağımsız medya 300 ul ekleyin. </li><li> Bir ters mikroskop altında hücre dikkate alınmalıdır. GCaMP3 olumlu myofibers yeşil floresan altında görünür olmalıdır. </li><li> Istenirse, kayıt için kamerayı ayarlayın. </li><li> CO 2 bağımsız medya 30 mM kafein çözeltisi hazırlayın. Hücreleri uyarmak için, yavaşça büyütme altında kuyuya kafein çözeltisi 300 ul pipet. 5-10 sn içinde, GCaMP olumlu myofibers floresan hızlı bir artış (Şekil 3) ile kafein yanıt vermelidir. Myofibers da sözleşme olabilir. Notun, kafein sarkoplazmik retikulum mağazalardan 25 kalsiyum salınımını uyarır. Bu tür KCl 26 ve riyanodin 4 gibi diğer maddeler, uyarılabilir kalsiyum serbest incelemek için kullanılabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Dulhunty, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation-contraction+coupling+from+the+1950s+into+the+new+millennium.">Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33, 763-772 (2006).</li><li>Bannister, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+the+myoplasmic+gap:+recent+developments+in+skeletal+muscle+excitation-contraction+coupling.">Bridging the myoplasmic gap: recent developments in skeletal muscle excitation-contraction coupling.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 28, 275-283 (2007).</li><li>Ohno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+defects+and+disorders+at+the+neuromuscular+junction.">Genetic defects and disorders at the neuromuscular junction.</a> Brain Nerve. 63, 669-678 (2011).</li><li>Lanner, J. T., Georgiou, D. K., Joshi, A. D., Hamilton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptors:+structure,+expression,+molecular+details,+and+function+in+calcium+release.">Ryanodine receptors: structure, expression, molecular details, and function in calcium release.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).</li><li>Dolphin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+diversity:+multiple+roles+of+calcium+channel+subunits.">Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 237-244 (2009).</li><li>Sparrow, J. C., Schock, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initial+steps+of+myofibril+assembly:+integrins+pave+the+way.">The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 293-298 (2009).</li><li>Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dystrophin+glycoprotein+complex:+signaling+strength+and+integrity+for+the+sarcolemma.">The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma.</a> Circ. Res. 94, 1023-1031 (2004).</li><li>Bassett, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+zebrafish+model+of+muscular+dystrophy.">Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).</li><li>Barresi, R., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystroglycan:+from+biosynthesis+to+pathogenesis+of+human+disease.">Dystroglycan: from biosynthesis to pathogenesis of human disease.</a> J. Cell Sci. 119, 199-207 (2006).</li><li>Emery, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+frequencies+of+inherited+neuromuscular+diseases-a+world+survey.">Population frequencies of inherited neuromuscular diseases-a world survey.</a> Neuromuscul. Disord. 1, 19-29 (1991).</li><li>Nance, J. R., Dowling, J. J., Gibbs, E. M., Bonnemann, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+myopathies:+an+update.">Congenital myopathies: an update.</a> Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 12, 165-174 (2012).</li><li>Bassett, D. I., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+for+muscular+dystrophy+and+congenital+myopathy.">The zebrafish as a model for muscular dystrophy and congenital myopathy.</a> Hum. Mol. Genet. 12, 265-270 (2003).</li><li>Dooley, K., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+a+model+system+for+the+study+of+human+disease.">Zebrafish: a model system for the study of human disease.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 252-256 (2000).</li><li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+myotubularin+function+results+in+T-tubule+disorganization+in+zebrafish+and+human+myotubular+myopathy.">Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy.</a> PLoS Genet. 5, (2009).</li><li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+successful+antioxidant+treatment+in+models+of+RYR1-related+myopathy.">Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy.</a> Brain. 135, 1115-1127 (2012).</li><li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5331-5336 (2011).</li><li>Detrich, H. W., Westerfield, M., M, L. I., Zon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+Zebrafish+system.">Overview of the Zebrafish system.</a> Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).</li><li>Nixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+caveolin-associated+muscle+disease;+caveolin-3+is+required+for+myofibril+organization+and+muscle+cell+patterning.">Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 1727-1743 (2005).</li><li>Schredelseker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta+1a+subunit+is+essential+for+the+assembly+of+dihydropyridine-receptor+arrays+in+skeletal+muscle.">The beta 1a subunit is essential for the assembly of dihydropyridine-receptor arrays in skeletal muscle.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17219-17224 (2005).</li><li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=neb:+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation.">neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis. Model Mech. 5, 389-396 (2012).</li><li>Dowling, J. J., Low, S. E., Busta, A. S., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+MTMR14+is+required+for+excitation-contraction+coupling,+developmental+motor+function+and+the+regulation+of+autophagy.">Zebrafish MTMR14 is required for excitation-contraction coupling, developmental motor function and the regulation of autophagy.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 2668-2681 (2010).</li><li>Schredelseker, J., Dayal, A., Schwerte, T., Franzini-Armstrong, C., Grabner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proper+restoration+of+excitation-contraction+coupling+in+the+dihydropyridine+receptor+beta1-null+zebrafish+relaxed+is+an+exclusive+function+of+the+beta1a+subunit.">Proper restoration of excitation-contraction coupling in the dihydropyridine receptor beta1-null zebrafish relaxed is an exclusive function of the beta1a subunit.</a> J. Biol. Chem. 284, 1242-1251 (2009).</li><li>Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+generation+of+transgenic+zebrafish+which+reliably+express+GFP+in+whole+muscles+or+the+whole+body+by+using+promoters+of+zebrafish+origin.">High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin.</a> Dev. Biol. 192, 289-299 (1997).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-sense+mutations+in+the+dihydropyridine+receptor+beta1+gene,+CACNB1,+paralyze+zebrafish+relaxed+mutants.">Non-sense mutations in the dihydropyridine receptor beta1 gene, CACNB1, paralyze zebrafish relaxed mutants.</a> Cell Calcium. 39, 227-236 (2006).</li><li>Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevation+of+intracellular+calcium+in+smooth+muscle+causes+endothelial+cell+generation+of+NO+in+arterioles.">Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 6529-6534 (1997).</li><li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=accordion,+a+zebrafish+behavioral+mutant,+has+a+muscle+relaxation+defect+due+to+a+mutation+in+the+ATPase+Ca2++pump+SERCA1.">accordion, a zebrafish behavioral mutant, has a muscle relaxation defect due to a mutation in the ATPase Ca2+ pump SERCA1.</a> Development. 131, 5457-5468 (2004).</li><li>van Eeden, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+somite+formation+and+patterning+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 153-164 (1996).</li><li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+dag1+mutant:+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies.">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 1712-1725 (2011).</li><li>Leuranguer, V., Papadopoulos, S., Beam, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+calcium+channel+beta1a+subunits+in+triad+junctions+in+skeletal+muscle.">Organization of calcium channel beta1a subunits in triad junctions in skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 281, 3521-3527 (2006).</li><li>Capote, J., Bolanos, P., Schuhmeier, R. P., Melzer, W., Caputo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+transients+in+developing+mouse+skeletal+muscle+fibres.">Calcium transients in developing mouse skeletal muscle fibres.</a> J. Physiol. 564, 451-464 (2005).</li><li>Adams, B. A., Tanabe, T., Mikami, A., Numa, S., Beam, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramembrane+charge+movement+restored+in+dysgenic+skeletal+muscle+by+injection+of+dihydropyridine+receptor+cDNAs.">Intramembrane charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs.</a> Nature. 346, (1990).</li><li>Sakowski, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+study+motor+neurons+from+zebrafish+embryos+and+larvae+in+culture.">A novel approach to study motor neurons from zebrafish embryos and larvae in culture.</a> J. Neurosci. Methods. 205, 277-282 (2012).</li><li>Nakano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+GPI-anchored+proteins+is+essential+for+surface+expression+of+sodium+channels+in+zebrafish+Rohon-Beard+neurons+to+respond+to+mechanosensory+stimulation.">Biogenesis of GPI-anchored proteins is essential for surface expression of sodium channels in zebrafish Rohon-Beard neurons to respond to mechanosensory stimulation.</a> Development. 137, 1689-1698 (2010).</li><li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+deletion+of+lysine+7+expands+the+clinical,+histopathological+and+genetic+spectrum+of+TPM2-related+myopathies.">Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies.</a> Brain. 136, 508-521 (2013).</li><li>Schredelseker, J., Shrivastav, M., Dayal, A., Grabner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Ca2+-conducting+Ca2++channels+in+fish+skeletal+muscle+excitation-contraction+coupling.">Non-Ca2+-conducting Ca2+ channels in fish skeletal muscle excitation-contraction coupling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5658-5663 (2010).</li></ol>

Yazarlar çatışan çıkarları beyan ederim.

Zebra balığı vivo 25,27,28 kas gelişimi ve işlevi çalışmak için güçlü bir omurgalı model sistem. Onlar da insan kas hastalıkları 14,15,20,29 modelleme için değerli bir varlık olarak ortaya çıkmıştır. Büyük atılımlar kas fonksiyonu ve kas hastalığı çalışma için zebrafish uygulanmasını ve kullanımını geliştirmek için alınmış olsa da, davranışsal ve fonksiyonel genetik, morfolojik, övgü daha derinlemesine analiz sağlayacak araçları g...

İskelet kası motilite için gerekli kasılma kuvvetleri üreten sorumlu son derece özel bir dokudur. Daralma içi mağazalardan 1,2 kalsiyum serbest elektrik sinyalleri dönüştüren eksitasyon-kasılma (EC) bağlantı olarak bilinen bir süreç yoluyla başlatılır. Hücre içi kalsiyum bırakma kuvvetinin kısaltmak ve oluşturmak için sarkomerinde geçirir. Nöromüsküler kavşak iletimi 3, AK kaplin 4,5 ve aktin-miyozin bağımlı kasılmalar 6 aracılık sorumlu moleküler makinelerin çok özel bileşenler yoğun araştırma devam eden konu olmaya devam etmektedir. Ayrıca, daralma 7,8 ve miyofiberde oluşan ve hücre-dışı matris 7,9 arasında sinyal olduğu mediate sırasında kas membranı stabilize proteini, tespit edilmiştir ve ayrıntılı olarak incelenmiştir. Kas yapısı a için önemli olan bir dizi genlerde mutasyonlarnd fonksiyonu (insan iskelet kası hastalıklarının nedeni olarak tanımlanmıştır <a href="http://www.musclegenetable.org/" target="_blank">http://www.musclegenetable.org/</a> ). Klinik ve histopatolojik özelliklere dayanarak iskelet miyopatilerde ve kas distrofilerinde gibi genel olarak sınıflandırılabilir Bu hastalıklar, kas güçsüzlüğü, yaşam boyu sakatlık ve erken mortalite 10,11 ile ilişkilidir. Zebra balığı insan iskelet kası hastalıkları 8,12,13 modelleme ve eğitim için olağanüstü bir sistem olduğu kanıtlanmıştır. Bu, yeni gen mutasyonları 8 doğrulamak hastalığın patofizyolojisi 14,15 yeni yönlerini tanımlamak ve yeni tedavi yaklaşımları 15,16 tanımlamak için istihdam edilmiştir. Insan kas hastalığı incelemek için Zebra balığı gücü yavrular, kas yapısı ve fonksiyonu, Zebra balığı embriyo optik netlik ve gelişmekte olan zebra genetik ve farmakolojik manipülasyon kolaylığı hızlı gelişme çok sayıda ilgilidirbalık 17. Biz ve diğerleri 12,18,19 son zamanlarda gelişen zebrafish myofibers hızlı ve verimli izolasyonu için basit bir teknik geliştirdik. Bu yöntem, tüm embriyo analiz edilmesi için daha fazla ayrıntılı olarak myofibers incelenmesini sağladı. Bu teknik, yeni geliştirilmiş hastalık modellerinde 21 doğrulama çalışmalarının bir kısmı olarak önemli histopatolojik özelliklerinin tanımlanması için protein alt hücresel lokalizasyonu 20 hem de karakterizasyonu için istifade edilmiştir. Ayrıca, izole myofibers ayrıca canlı görüntüleme ve elektrofizyolojik çalışmalar 22, kas fonksiyonlarının temel yönleri sorgulama için izin teknikleri kullanılabilir. Sonraki analitik deneyler iki örnekleriyle birlikte miyofiberde oluşan izolasyon için özel bir protokol, bu yazının geri kalan bölümlerinde ayrıntılı.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well culture plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Invitrogen Gibco</td>
			<td>70011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Independent medium</td>
			<td>Invitrogen Gibco</td>
			<td>18045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004186</td>
			<td>Lot 41H12764</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>L5004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>322415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Fischerbrand</td>
			<td>12-545-82 12CIR-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m Filter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m Filter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-Actinin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RYR antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>34C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Fischerbrand</td>
			<td>0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Fischerbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations

Zebra balığı iskelet kası fonksiyonunu keşfetmek için ve insan kas hastalıklarının araştırılmasında değerli bir model sistem olduğu kanıtlanmıştır. Özellikle bütün embriyolar, kas fonksiyonu için sorumlu karmaşık ve ince yapılı protein ortam görselleştirme, Zebra balığı iskelet kasının in vivo analizi tarafından sunulan birçok avantajlara rağmen, sorunlu olabilir. Bu engel Zebrafish iskelet kası (60 mikron) ve sarkomerinde daha küçük boyutu küçük boyutu kaynaklanmaktadır. Burada tarif ve zebra balığı embriyolar ve larva iskelet myofibers izole etmek için basit ve hızlı bir yöntem ortaya koymaktadır. Biz de kas yapısını ve fonksiyonunu analiz için yararlıdır sonrası hazırlama tekniklerini göstermek protokollerini içerir. Özellikle, biz detay iskelet kas proteinlerinin sonraki immünositokimyasal yerelleştirme ve canlı hücre kalsiyum görüntüleme yoluyla uyarılan kalsiyum sürümü kalitatif analizi. Genel olarak, bu videozebra balığı madde iskelet myofibers izolasyonu ve karakterizasyonu, kas yapısı ve fonksiyonu, sayısız sonraki çalışmalar için bir oluk sağlayan bir teknik için, doğrudan ve etkili bir yöntem sağlar.

Myofibers floresan immün (Şekil 2) Myofibers beklenen floresan etiketleme modelini gösteren resimler başarılı izole edilmesi ve sonra kaplama immunohistokimyasal. Myofibers anti-riyanodin reseptörü (1:100) (Şekil 2A) ya da anti-α-aktinin (1:100) (Şekil 2B) ya da antikorları ile etiketlenmiş ve sırasıyla üçlü ve Z-bandın immün ortaya edilmiştir. Kullanılan ikincil antikorlar, Alexa Fluor 555 (1:500) idi. Görün...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations at JoVE.com

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Zebra balığı iskelet kası bozuklukları insan modellemek için ortaya çıkan bir sistemdir. Biz embriyonik ve larva zebrafish iskelet kası myofibers izole etmek için hızlı ve etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, tek bir iskelet kas lifi morfolojisi çalışma için uygun olan yüksek yoğunluklu miyofiberde oluşan hazırlama, protein hücre içi lokalizasyonu ve kas fizyolojisi verir.

Disosiye Müstahzarlar gelen Embriyonik ve larval Zebra balığı İskelet myofibers Analizi

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

analysis-embryonic-larval-zebrafish-skeletal-myofibers-from

Research

JoVE Journal

Biology

11.5K Görüntüleme.  University of Michigan.  Zebra balığı iskelet kası bozuklukları insan modellemek için ortaya çıkan bir sistemdir. Biz embriyonik ve larva zebrafish iskelet kası myofibers izole etmek için hızlı ve etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, tek bir iskelet kas lifi morfolojisi çalışma için uygun olan yüksek yoğunluklu miyofiberde oluşan hazırlama, protein hücre içi lokalizasyonu ve kas fizyolojisi verir. 

Video: Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

Kemirgen Yenidoğanlar İlköğretim grubuyla orta beyin dopamin Hücre Kültürleri

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

Biyoloji

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

Gen İfadesi Analizi Embriyonik Zebra balığı ve cDNA Sentezi RNA İzolasyon

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

Zebra balığı Embriyonik Göz Dokular, Mikrodisseksiyon

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Yetişkin ve Embriyonik İskelet, Kas Microexplant Kültür ve İskelet Kası Kök Hücre İzolasyonu

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

Larvaların Kalp Diseksiyon, Çocuk ve Yetişkin Zebra balığı, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Zebra balığı Embriyonik Kalp Dissected, immün

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Zebra balığı Embriyonik İskelet Kası Lazer-yaralama

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

Görüntüleme ve Embriyonik Zebra balığı Serebrovasküler Yapıların 3D İmar

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.