DK065872 (AKP), Biyomedikal Araştırma Mükemmellik Smith Aile Vakfı Ödülü (AKP), F31 DA023760 (BMG, ENP) ve P30 NS047243 Tufts (Neuroscience Araştırma Merkezi) tarafından desteklenmiştir.

Kültür Önceki Hazırlık Not: ** Glial hücreler çoğalmalı ve yemekleri alt kapağı var, böylece önceden iyi kaplanmış olmalıdır. , Atipik ya da deneysel genetik bir arka plan ile fareler için, genotip açısından glial ve nöronal kültürlerin maç emin olun. Not: diseksiyonu ** 1-7 gün önce, taze nöronal orta hazırlamak ve 2ml yemekler glial orta yerine. Not: ** diseksiyon bir gün önce, aşağıdaki öğeleri gecede UV ışık altında sol gerekir: <ul><li> 4 diseksiyonu plakalar </li><li> Bir mikro-manyetik karıştırıcı ile 2 disosiasyon şişeleri </li><li> 2 flakon kapaklar (2 küçük delikler üst dürttü) </li><li> Slayt halkalar (70% EtOH kat) Spread - kutusu da açık bırakın </li><li> EN AZ 2 tam kutu sarı (10-200μl) pipet uçları </li><li> 1 kutu (100-1000μl) mavi pipet uçları </li></ul> Kültür Günü Not: * GECELİK UV İÇİN dışında kaldı ANYTHING TOUCH İÇİN EMİN OLUN! Kaputun altında steril bir ortamda bakımı çok önemlidir. 1) Set Up: Not: ** papain çözüm olmak için tüm dondurulmuş maddeler kenara koyun. <ol><li> % 70 EtOH Temizlik forseps. Her ucu steril bir sarı pipetlemeyin ucu ile kaplayın. Kendi kutusunda steril slayt yüzük yerleştirmek için kullanın. </li><li> Sıcak plaka: <ol><li> 1000ml beher 500-600ml dH 2 O ve büyük bir manyetik karıştırıcı çubuk dolu bir başlık altında bir mini-magnetic/hot tabak koyun. </li><li> Beher, su seviyesinin hemen üzerinde plastik bir disk yerleştirin. </li><li> Strafor disk küçük bir delik termometre kaydırın. Isı çevirmeli ihtiyacı biraz 2 &#39;nin üzerinde olması (34 ° C geçici bir) ve heyecan arama ~ 5-6 olmalıdır. </li></ol></li><li> PBS: <ol><li> Hazırlayın ve steril PBS (4-6 ml steril korumak için emin olun 15 15ml steril tüpler doldurmak. tekniği). </li><li> Kaputun yanında buz üzerinde tüpler ve stok şişe yerleştirin. </li></ol></li><li> Carbogen: <ol><li> Break yarısında 5ml stripette ve bir lastik tıpa ile itin stripette ucu stoper geniş ucunu dışarı taşacak. </li><li> 400-500ml dH 2 O (stripette kırık ucu IN dH 2 O olmalıdır) 500ml cam şişe içinde stoper yerleştirin. </li><li> Balonun yan açılışında bir tüp bağlayın. </li><li> Sarı bir pipet ucu kapalı kesin ve tüp sonunda (kesme yüzü dışarı bakacak şekilde) bağlayın. Carbogen tankı 5ml stripette ucu bağlayın. </li></ol></li><li> Papain sol&#39;n hazırlayın: <ol><li> * Dikkatli steril teknik kullanın. </li><li> 50ml steril bir tüp içinde karıştırın. </li></ol></li><li> Filtre ayrışma şişenin içine papain sol&#39;n: <ol><li> 25ml stripette (OR yer 20ml bir piston şırınga ucu yeni bir 0.2μm şırınga filtresi aracılığıyla Steriflip filtrasyon ünitesi ve disosiasyon flakon transfer kullanın. piston kaldırmak ve tüm şırıngaya papain sol&#39;n aktarmak için bir stripette (25ml) kullanabilirsiniz. </li><li> Filtre ayrışma şişenin içine). </li><li> Flakon kapağı, steril bir şırınga eklemek kap delikten ve şırınga tabanına 0.2μm steril bir şırınga filtre takmak. </li><li> Filtre ve parafilm bu yer carbogen bağlayın. Strafor disk / tutucu flakon yerleştirin. * Mikro-manyetik karıştırıcı hareket edilmelidir. * Gaz şişenin içine ZORUNLU. * Sıcaklık 34 stabilize ZORUNLU ° C </li></ol></li><li> Diseksiyon hazırlık: <ol><li> Kaputun altında diseksiyon mikroskobu getirin. </li><li> Tüm diseksiyon aletleri, alüminyum folyo Lay% 70 EtOH ile sprey, aşırı kapalı dökün ve kurumaya kaputun altında bırakın. </li></ol></li><li> Nöronal orta hazırlayın: <ol><li> Inkübatör taze nöronal orta 30ml bırakın. </li></ol></li><li> 1 büyük alüminyum folyo kare ve 12 küçük kareler yerleştirin. Alüminyum folyo ile baş kesme makası bırakın. Küçük bir strafor kutu buzlu su ile doldurun ve kaput tüm dışında bırakın. </li><li> Hazırlık anestezi (0.075ml ketamin ve 0.075ml xzylazine). </li><li> 100 plaka yavrular için en az 12 (P0-P2) alın. Fareler için, bütün çöp için bir genotip maç olduğundan emin olun. Genotipi bilinmeyen ise, ayrı bir kapta her yavru plaka hücreleri, fare numaraları doğru kayıtları tutmak ve onları maç hücre kültürü yemekleri ve glial substrat genetik arka plan hücre kültürleri tektip olduğundan emin olun. </li></ol> 2) Diseksiyon <ol><li> Intraperitoneal enjeksiyonu ile ilk hayvan anestezisi. Hayvan sedasyon gösterir ve tail-flick testi yanıt vermiyor; 30 saniye (hipotermik kadar) buz koyun. Küçük bir alüminyum folyo kare, decap durulayınprogram akreditasyonunun makas, ve% 70 EtOH ile baş. </li><li> Başını kesmek, kafa alüminyum folyo kare üzerine düşebilir ve kaputun altında taşımak için izin verir. 15ml tüp içine buz gibi soğuk PBS bir beyin yavaşça çıkarın. Sonraki beyin çıkarırken geri buz tüpü yerleştirin. </li><li> Buz üzerinde 3 beyinleri vardır kadar bu ilk adımları tekrarlayın. Mikroskop altında ilk diseksiyon tabağa 3 beyin ve PBS dökün. Beynin ilgili bölümüne (MCM) çıkarın ve papain sol&#39;n segmentleri koymak için transfer pipetlemeyin kullanabilirsiniz. Ilk bölümler içeri Sayacı başlat </li><li> Tüm beyinleri papain sindirilir kadar önceki 3 adımları tekrarlayın. Sindirim için ortalama süresi 2 saat olmalıdır. Ilk bölümleri son olanları içeri zaman yaklaşık 1 saat olacak Fark bölmek deneyin. </li><li> * Sindirim sırasında: <ol><li> Banyo sıcaklığı 34 olduğundan emin olun ° C </li><li> Alanlar, ilk bakışta heyecan bar yapışabilir, ama zaman geçtikçe yaymak olmalıdır. Yoksa, flakonun alt dokunun. </li></ol></li></ol> 3) ezerek toz haline getirme: <ol><li> Bir transfer pipet kullanarak, steril bir 15ml tüp (aşırı papain sol&#39;n önlemek için deneyin) beynin bölümleri aktarmak ve onları inkübatör ısıtılmış glial orta 2ml 3 kez YIKAMA. Tüp içinde glial medya koyduktan sonra, bölümleri segmentler bozmadan yerleşmek ve sonra dikkatle mümkün olduğu kadar çok sol&#39;n kaldırmak için izin verir. Kontaminasyonu önlemek için pipetler değiştirin! ** Kaldırılır sol&#39;n tutmayın. </li><li> Taze bir transfer pipet kullanarak glial medya 2ml triturations başlar. Karışım 25 kez (hava kabarcıkları kiralanmasından önlemek) ve undissociated segmentleri yerleşmek kadar tüp 3 dakika oturup bekleyin. Altındaki segmentleri bozmadan mümkün olduğunca sol&#39;n TUTUN ve kaldırmak için bir transfer pipet kullanın. Yeni bir (steril) 15m tüp süpernatant tutun. </li><li> 1000μl pipet ve 200μl pipet kullanarak tamamen ayrışmış kadar önceki adımı yineleyin. </li><li> Bir transfer pipeti ile 10 kez Karışım veya hücreler tamamen sol&#39;n yeniden süspanse kadar. </li></ol> 4) Kaplama Hücreler <ol><li> Forseps her ucu kapsayan, steril bir sarı pipet kullanarak, dikkatli bir şekilde her bir çanak içinde de mümkün olduğunca cam merkezli bir slayt halka bırakın. </li><li> Hemasitometre ve sayım hücre çözümü 10μl koyun. (Önemsiz kitleler hariç tut). </li><li> Hücre sayısı 10 ile çarpın. Bu hücre / ml. Bu sayı 1,000,000-1,500,000 (veya istenilen yoğunluk) Böl. Bu çanak ortalama eklemek için ul sayısıdır. </li><li> Uygun ul / çanak eklemek gibi merkez her yemeğin yüzük slayt pipet kullanın. Hafifçe Plaka ve HER yemek için ipuçları geçiş. </li><li> 100μl (seyreltilmiş, GDNF sol&#39;n) her yemeğin slayt halka içine ekleyin. </li><li> Şu anda, inkübatör tepsileri ve soğuk oda nöronal orta getirmek. </li><li> Hücreleri gecede yerleşmek için izin ver. </li><li> Ertesi gün: kaldır halkaları (HER yemek için forseps ipuçları kapsayan yeni steril pipet uçları kullanarak) </li></ol> 5) Mitotik inhibisyonu: BİR SONRAKİ GÜN <ol><li> 1.8 ml steril MEM 200μl FDU stok ekleyerek 1000X stok 1:10 FDU alikotları sulandırınız. </li><li> Her yemeğin dışında halka 20μl seyreltilmiş FDU sol&#39;n ekleyin. Pipet uçları sık sık değiştirin. Kapak ve inkübatör dönmek. * Bir sonraki 7-10 gün için mümkün olduğunca az yemekler Rahatsız. Enfekte yemekleri için kontrol edin ve herhangi bir enfeksiyonun ilk belirtileri enfekte yemekleri kaldırmak. Kültürler 3 hafta içinde test etmek için hazırız. </li></ol> MEDYA / ÇÖZÜMLER Nöronal Orta (200ml için) Yıkar / öğütme için kullanmadan önce bir gecede şişeler glia klimalı ** En iyi <table style="width: 435px; height: 231px;" border="0"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Miktar </td><td> Notlar </td></tr><tr><td> BSA% 5 </td><td> 0.5 g </td><td> Fraksiyon V </td></tr><tr><td> MEM sıvı </td><td> 94.0 ml </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> DMEM sıvı </td><td> 80.0 ml </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> F-12 sıvı </td><td> 20.0 ml </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Glikoz 45% sıvı </td><td> 1.50 ml </td><td> Sigma çözümü </td></tr><tr><td> Glutamin 200mm </td><td> 0.5 ml </td><td> Aliquotted Sigma çözümü </td></tr><tr><td> Diporzio Conc. </td><td> 2.0 ml </td><td> Sigma çözümü </td></tr><tr><td> Sıvı Katalaz </td><td> 0.1 ml </td><td></td></tr><tr><td> 0.5M Kynurenic asit </td><td> 200μl </td><td> 1N NaOH </td></tr><tr><td> HCL 5N </td><td> 50 ul </td><td></td></tr></tbody></table><ol><li> Bir 250m maddeler (BSA son gider) ile birleştirinl plastik şişe. </li><li> Filtre, etiket ve buzdolabına kaldırın. </li></ol> Kynurenic Asit (FW = 189.2) 0,5 M = 94.6mg/ml 200μl STERİL alikotları 756.8mgKA/8ml 1N NaOH ve pipet: 8 ml stok olun DiPorzio Medya A) DiPorzio Conc. Hisse Senetleri: <table style="width: 620px; height: 251px;" border="0"><tbody><tr><td colspan="3"> İHTİYACINIZ </td><td colspan="3"> Birleştirmek </td><td colspan="3"> Alliquot </td></tr><tr><td> Katkı </td><td> Çözücü </td><td> Tüp </td><td> Miktar </td><td> ml </td><td> ml / tüp </td><td> Kons. </td><td> Miktar </td><td> # Aliq. </td></tr><tr><td> İnsülin </td><td> 20mm HCL (1) </td><td> plastik </td><td> 250mg şişe </td><td> 10 </td><td> 1 </td><td> 25mg/ml </td><td> 25mg </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Transferrin </td><td> Hank </td><td></td><td> 500mg şişe </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> 100mg/ml </td><td> 100mg </td><td> 5 </td></tr><tr><td> SOD </td><td> Hank </td><td></td><td> 70mg şişe </td><td> 14 </td><td> 1 </td><td> 5mg/ml </td><td> 5mg </td><td> 14 </td></tr><tr><td> Putrescine </td><td> Hank </td><td></td><td> 50mg </td><td> 3 </td><td> 0,12 </td><td> 20mg/ml </td><td> 2.4mg </td><td> 21 </td></tr><tr><td> Na 2 SeO 3 </td><td> Hank </td><td></td><td> 0.104mg </td><td> 10 </td><td> 0,5 </td><td> 10μg/ml </td><td> 5.2μg </td><td> 20 </td></tr><tr><td> T3 </td><td> 10mM NaOH </td><td></td><td> 2mg </td><td> 10 </td><td> 0,1 </td><td> 0.20mg/ml </td><td> 0mg </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Progesteron </td><td> 100% EtOH </td><td> Cam </td><td> 12.5mg </td><td> 10 </td><td> 0,05 </td><td> 1.25mg/ml </td><td> Pipetlemeyin kullanın. </td><td></td></tr><tr><td> Kortizol </td><td> 100% EtOH </td><td> Cam </td><td> 20mg </td><td> 10 </td><td> 0,02 </td><td> 2.00mg / ml </td><td> Pipetlemeyin kullanın. </td><td></td></tr></tbody></table><ol><li> 20mm HCl = 41.5μl kons. HCl/25ml. </li><li> 1mg/ml stok yapın ve 10ml için 104μl ekleyin. </li></ol> B) DiPorzio Medya Stok: <table style="width: 618px; height: 211px;" border="0"><tbody><tr><td> Katkı </td><td> Miktarı (ml) </td><td> Miktarı (ml) X2 </td><td> Final Conc. mg / ml </td><td> Final Conc. Molarite </td></tr><tr><td> Progesteron </td><td> 0,05 </td><td> 0,1 </td><td> 0,06 </td><td> 200 nm </td></tr><tr><td> Kortizol </td><td> 0,02 </td><td> 0,04 </td><td> 0,04 </td><td> 125nM </td></tr><tr><td> Hank BSS </td><td> 6,21 </td><td> 12,42 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> İnsülin </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 25 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 SeO 3 </td><td> 0,5 </td><td> 1 </td><td> 0,01 </td><td> 30nm </td></tr><tr><td> T3 </td><td> 0,1 </td><td> 0,2 </td><td> 0,02 </td><td> 30nm </td></tr><tr><td> SOD </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 5 </td><td></td></tr><tr><td> Putrescine </td><td> 0,12 </td><td> 0,24 </td><td> 2,4 </td><td> 15nM </td></tr><tr><td> Transferrin </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 100 </td><td></td></tr></tbody></table><ol><li> 15ml steril tüp polipropilen, progesteron ve kortizol eklemek için kullanın. (Tüp EtOH sıvı aspire için çok dikkatli olmak, yarım ve yerde yarı yolda bozuldu 5ml stripette pipetlemeyin Kimwipes ile güvenli bir şekilde tutun ve sonra ucu getirmek: EtOH buharlaşma hızı, bir aspiratör pipetlemeyin ve vakum kullanın. tüp tarafında bulunan 500μl işareti. </li><li> Yukarıdaki grafikte göründükleri sırayla sonraki alikotları ekleyin. </li><li> Sol&#39;n bulutlu yapar insülin, eklenmesinden sonra, pH nötralize etmek için 1N NaOH 20μl ekleyin. Sol&#39;n sarı, pembe ve hemen açık gitmek gerekir. AYRICA, transferin yanı sıra sonra, hemen pH nötralize ve Çökelek oluşumunu önlemek için, 1N NaOH 20μl ekleyin. </li><li> 5 alikotları (tek parti) bir serolojik pipetlemeyin ve bölme içine 10ml çizin. </li><li> Store @ -20 ° C </li><li> 2 toplu bir seferde yapabilir. </li></ol> Disosiyasyon Medya A. Papain (1 şişe): ** Sağ diseksiyon önce kaplama güne hazırlayın. <table style="width: 536px; height: 156px;" border="0"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Tutar &lt;/ Strong&gt; </td><td> (Notlar) Final Conc. </td></tr><tr><td> Sistein Su </td><td> 7.8mL </td><td> 1mm sistein </td></tr><tr><td> Papain </td><td> Şişe (* 190μl değişir. 44.0mg/ml) </td><td> 20 adet / ml (toplam 400 adet sol&#39;n 20ml değerinde) </td></tr><tr><td> H &amp; B kons. </td><td> 2mL </td><td></td></tr><tr><td> Carbogen </td><td> % 95 O2 +% 5 CO2 </td><td></td></tr><tr><td> HCl 5N </td><td> 10μl </td><td></td></tr><tr><td> % 0.5 fenol kırmızısı </td><td> 20μl </td><td> % 0.001 &#39; </td></tr><tr><td> 0.5M Kynurenate </td><td> 10μl </td><td> (1N NaOH) 0.5mm </td></tr></tbody></table><ol><li> İLK sistein su papain ekleyin. </li><li> H &amp; B kons. Kynurenate, HCl ve fenol kırmızısı ekleyin. </li><li> Disosiasyon flakon içine Filtresi (set-up yönde açıklandığı gibi) ve carbogen bağlanmak. </li></ol> B. H &amp; B Konsantre (5X 100 ml): <table style="width: 583px; height: 243px;" border="0"><tbody><tr><td> Malzemeler </td><td> MW </td><td> Powder/50ml H 2 O </td><td> Kons. (M) </td><td> Birleştirin (ml) </td><td> Final Conc. (MM) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,44 </td><td> 11,699 g </td><td> 4 </td><td> 14,5 </td><td> 116 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,56 </td><td> 3,728 g </td><td> 1 </td><td> 2,7 </td><td> 5,4 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 84,01 </td><td> 4.2 g </td><td> 1 </td><td> 13 </td><td> 26 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 * H 2 O </td><td> 137,99 </td><td> 6,90 g </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 120,38 </td><td> 6,019 g </td><td> 1 </td><td> 0,5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> EDTA (ED2 SS) </td><td> 292 </td><td> Sigma% 5 (make 5g/100ml stok) </td><td> 0,134 </td><td> 0,3722 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> Glikoz </td><td> 180 </td><td> Sigma 45% </td><td> 2,5 </td><td> 5 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> TC H 2 O </td><td></td><td></td><td></td><td> 62,93 </td><td></td></tr></tbody></table><ol><li> Miktarlarda stok çözümleri birleştirin. </li><li> 4ml alikotları içine bölün. </li><li> Kısım papain ekledikten sonra sistein su ekleyin. </li></ol> C. Sistein Su (1X bir 157.5ml): <table style="width: 644px; height: 137px;" border="0"><tbody><tr><td> Malzemeler </td><td> MW </td><td> Bileşenleri Toz (mg) </td><td> H 2 O (ml) </td><td> Stok Conc (mM) </td><td> Birleştirin (ml) </td><td> Final Conc. (MM) </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 147,2 </td><td> 736 </td><td> 10 </td><td> 500 </td><td> 0,6 </td><td> 1.9mM </td></tr><tr><td> Sistein </td><td> 121,7 </td><td> (1.5) </td><td> 24 </td><td> 20mm (0.02M) </td><td> 10 </td><td> 1.27mM (0.88) </td></tr><tr><td> TC su </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 146,9 </td><td></td></tr></tbody></table><ol><li> Ve 4, 0,5 M CaCl2 stok sol&#39;n tutmak ° C </li><li> Sistein bir kullanım sol&#39;n olun ve diğer maddeler ile birleşerek </li><li> 4 mağaza 15.75 ml ve 10 alikotları içine Böl ° C </li></ol> GDNF Hazırlık <ol><li> Kısım hazırlık: <ol><li> 2.4mL steril deiyonize su, 5μg GDNF steril, liyofilize pelet çözülür. Bu GDNF sol&#39;n = 2.08μg/mL konsantrasyon. </li><li> 2.08μg/mL GDNF sol&#39;n steril cryovials 76.9μl alikotları içine dağıtın. Bu = 160ng vialde. </li><li> -20 ° C&#39;de muhafaza </li></ol></li><li> Kültürlere Ek: <ol><li> Her 8 yemekler için 1 kısım çözülme. </li><li> 723.1μl nöronal medya / kısım ekleyerek kısım sulandırınız. Bu 160ng/800μl GDNF bir sol&#39;n yapacaktır. </li><li> Bu sol&#39;n ml başına 10ng GDNF son bir konsantrasyon için her çanak orta 2mL 100μl ekleyin. </li></ol></li></ol> FDU Hazırlık FDU-sol&#39;n 1000X Stok: <table style="width: 564px; height: 80px;" border="0"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Miktar </td><td> (Notlar) Final Conc. </td></tr><tr><td> Üridin </td><td> 247 mg </td><td> 16,5 mg / ml </td></tr><tr><td> 5-FDU (5 fluorodeoxyuridine) </td><td> 100 mg (şişe) </td><td>6.7 mg / ml </td></tr><tr><td> TC Su </td><td> 15 ml </td><td></td></tr></tbody></table><ol><li> 15 ml 16,5 mg / ml üridin biraz üzerinde olun. </li><li> 6.7 mg / ml sol&#39;n FDU, 15 ml üridin sol&#39;n FDU 100 mg şişe ekleyin. </li><li> -20 ° C 200μl alikotları ve donma içine Böl </li></ol> Kullanım sulandırınız: <ol><li> Non-nöronal hücrelerin büyümesini engeller. 1.8 ml MEM 200μl stok ekleyerek 1000X stok 01:10 sulandırınız. </li><li> 20μl seyreltilmiş FDU her yemeğin dışında halka ekleyin. Sık sık pipetlemeyin ipuçları değiştirin. Kapak ve inkübatör dönmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+defective+mesolimbic+dopamine+exocytosis+in+obesity-prone+rats.">Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats.</a> FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).</li><li>Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+dopamine+quantal+size+in+midbrain+and+hippocampal+neurons.">Regulation of dopamine quantal size in midbrain and hippocampal neurons.</a> Behavioural Brain Research. 130, 203-207 (2002).</li><li>Pothos, E. N., Larsen, K. E., Setlik, W., Gershon, M. D., Krantz, D., Liu, Y. -. J., Edwards, R. H., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+transporter+expression+regulates+vesicle+phenotype+and+quantal+size.">Synaptic vesicle transporter expression regulates vesicle phenotype and quantal size.</a> The Journal of Neuroscience. 20, 7297-7306 (2000).</li><li>Pothos, E. N., Davila, V., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+recording+of+quanta+from+midbrain+dopamine+neurons+and+modulation+of+the+quantal+size.">Presynaptic recording of quanta from midbrain dopamine neurons and modulation of the quantal size.</a> The Journal of Neuroscience. 18, 4106-4118 (1998).</li><li>Sulzer, D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+mechanisms+that+regulate+quantal+size.">Presynaptic mechanisms that regulate quantal size.</a> Reviews in the Neurosciences. 11, 159-212 (2000).</li></ol>

Burada açıklanan yöntemler, aksi bir sistemik veya in vivo yaklaşım mevcut değildir merkezi dopamin nöronlar morfolojik ve nörokimyasal özellikleri ince çözümü için izin .

Malzemeler protokol metninde yer almaktadır.

primary dissociated midbrain dopamine cell cultures from rodent neonates

Beyin başka sistemik girişi, izolasyon dopamin nöronların presinaptik özellikleri çalışma için, dopamin nöronlar primer hücre kültürleri oluşturma yeteneği sağlar. Bizim laboratuvarda, karbon fiber amperometri, kantitatif PCR ve immünhistokimya kullanarak dopamin ilgili genler ve proteinlerin ekspresyon düzeyleri yanı sıra dopamin salınımını kinetiğini değerlendirmek için bu nöronların kullanın. Biz kemirgen yenidoğanlarda bu kültürlerin üretmek nasıl Bu videoda, size gösteriyor. Bu süreç kortikal glial astrositler kaplama, klima glial substrat nöronal hücre kültür ortamı, yenidoğanlarda Ortabeyin diseksiyonu, sindirim, ekstraksiyon ve dopamin nöronlarının kaplama ve nörotrofik faktörlerin eklenmesi de dahil olmak üzere birkaç adım içerir hücre sağkalım sağlamak. Böyle bir hazırlık için uygun uygulamalar elektrofizyoloji, immünhistokimya, kantitatif PCR, video mikroskobu (yani, plazma zarı ile gerçek-zamanlı veziküler füzyon), hücre canlılığı deneyleri ve diğer toksikolojik ekranları içerir.

Watch this Scientific Journal Video about Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates at JoVE.com

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

İlköğretim ayrışmış orta beyin dopamin hücre kültürleri dopamin nöronların presinaptik özellikleri çalışma için izin verir. Onlar gerçek zamanlı dopamin salınımını kinetik ve dopamin ekzositoz düzenleyicilerin protein / mRNA seviyeleri izlemek için kullanılabilir. Burada, biz kemirgen yenidoğanlarda bu kültürlerin nasıl oluşturmak göstermektedir.

Kemirgen Yenidoğanlar İlköğretim grubuyla orta beyin dopamin Hücre Kültürleri

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

primary-dissociated-midbrain-dopamine-cell-cultures-from-rodent

Research

JoVE Journal

Biology

14.8K Görüntüleme.  Tufts University. İlköğretim ayrışmış orta beyin dopamin hücre kültürleri dopamin nöronların presinaptik özellikleri çalışma için izin verir. Onlar gerçek zamanlı dopamin salınımını kinetik ve dopamin ekzositoz düzenleyicilerin protein / mRNA seviyeleri izlemek için kullanılabilir. Burada, biz kemirgen yenidoğanlarda bu kültürlerin nasıl oluşturmak göstermektedir.

Video: Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

ES Cell-derived Neuroepithelial Cell Cultures

ES cells have the potential to differentiate into cells from all germ layers, which makes them an attractive tool for the development of new therapies. In general, the differentiation of ES cells follows the concept to first generate immature progenitor cells, which then can be propagated and differentiated into mature cellular phenotypes. This also applies for ES cell-derived neurogenesis, in which the development of neural cells follows two major steps: First, the derivation and expansion of immature neuroepithelial precursors and second, their differentiation into mature neural cells. A common method to produce neural progenitors from ES cells is based on embryoid body (EB) formation, which reveals the differentiation of cells from all germ layers including neuroectoderm. An alternative and more efficient method to induce neuroepithelial cell development uses stromal cell-derived inducing activity (SDIA), which can be achieved by co-culturing ES cells with skull bone marrow-derived stromal cells (1). Both, EB formation and SDIA, reveal the development of rosette-like structures, which are thought to resemble neural tube- and/or neural crest-like progenitors. The neural precursors can be isolated, expanded and further differentiated into specific neurons and glia cells using defined culture conditions. Here, we describe the generation and isolation of such rosettes in co-culture experiments with the stromal cell line MS5 (2-5).

Derivation of neuroepithelial precursors from embryonic stem (ES) cells using stromal cell-derived inducing activity (SDIA).

ES Hücre türetilen nöroepitelyal Hücre Kültürleri

ES cells have the potential to differentiate into cells from all germ layers, which makes them an attractive tool for the development of new therapies. In ...

Biyoloji

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

Geç Stage Drosophila pupa Brain İlköğretim Nöronal Kültürler

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Nöronal Kültürler Midgastrula Sahne Drosophila Embriyolar hazırlanması

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Grubuyla Fare Kortikal Nöron Kültürler hazırlanması

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

Büyüme Konileri Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme için Aplysia Nöronal Hücre Kültürleri

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key symptoms, such as tremor, rigidity and bradikinesia, develop when about 3/4 of dopaminergic cells are lost in the substantia nigra, and fail to provide for the smooth, coordinated regulation of striatal motor circuits. Depression and hallucinations are common, and dementia eventually occurs in 20% of patients. At this time, there is no treatment to delay or stop the progression of PD. Rather, the medications currently available aim more towards the alleviation of these symptoms. New surgical strategies may reversibly switch on the functionally damaged circuits through the electrical stimulation of deep brain structures, but although deep brain stimulation is a major advance, it is not suitable for all patients. It remains therefore necessary to test new cell therapy approaches in preclinical models.
Selective neurotoxic disruption of dopaminergic pathways can be reproduced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) or MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tertahydropyridine) whereas depleting drugs and oxidative-damaging chemicals may also reproduce specific features of PD in rodents. Unlike MPTP, 6-OHDA lesions cause massive irreversible neuronal loss, and can be uni- or bilateral. The 6-OHDA lesion model is reliable, leads to robust motor deficits, and is the most widely used after 40 years of research in rats1. As interactions between grafted cells and host can now be studied more thoroughly in mice rather than in rats, the model has been transposed to mice2,3, where it has been recently characterized4.
In this video, we demonstrate how to lesion the left nigro-striatal pathway of anesthetized mice by slowly delivering 2.0 &mu;L of 6-OHDA through a stereotaxically inserted micro-syringe needle. The loss of dopaminergic input occurs within days, and the functional impairments can be monitored over post-operative weeks and months by rating animal rotations induced by dopaminergic agents5. Here, we show full-body contralateral rotations occurring 10 minutes after a single subcutaneous administration of apomorphine, measured one month after the lesion. Outcomes and drawbacks are discussed below.

Murine Model for Parkinson&#039;s Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson disease is caused by loss of dopaminergic innervation to the striatum, which can be experimentally induced by 6-OH-dopamine. We describe how to perform a stereotaxic lesion and to monitor apomorphine-induced rotational behavior in mice. This model is useful and reliable for testing new therapies for Parkinson disease.

Parkinson Hastalığı için murin Model: 6-OH Dopamin Lezyon Davranış Testi

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized. Primary cells are preferred in studies of cell cycle control, apoptosis, and DNA repair, as cancer cells carry mutations in genes involved in these processes. Primary cells cannot be cultured indefinitely due to the onset of replicative senescence or aneuploidization. Hence, new cultures need to be established regularly. The procedure for isolation of rodent embryonic fibroblasts is well established, but isolating adult fibroblast cultures often presents a challenge. Adult rodent fibroblasts isolated from mouse models of human disease may be a preferred control when comparing them to fibroblasts from human patients. Furthermore, adult fibroblasts are the only available material when working with wild rodents where pregnant females cannot be easily obtained. Here we provide a protocol for isolation and culture of adult fibroblasts from rodent skin and lungs. We used this procedure successfully to isolate fibroblasts from over twenty rodent species from laboratory mice and rats to wild rodents such as beaver, porcupine, and squirrel.

This article describes a protocol for isolation and maintenance of primary fibroblast cultures from skin and lung tissue of wild rodents.

Kemirgenler itibaren İlköğretim Yetişkin Fibroblast Kültürleri kurulması

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Birincil Hücre Kültürleri Drosophila Gastrula Embriyolar

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system maintains hESCs from undergoing spontaneous differentiation during cell expansion. However, this co-culture method is labor intensive, requires highly trained personnel, and yields low hESC purity4. Many laboratories have attempted to minimize the number of feeder cells in hESC cultures (i.e. incorporating matrix-coated dishes or other feeder cell types5-8). These modified culture systems have shown some promise, but have not supplanted the standard method for culturing hESCs with mitomycin C-treated mouse embyronic fibroblasts in order to retard unwanted spontaneous differentiation of the hESC cultures. Therefore, the feeder cells used in hESC expansion should be removed during differentiation experiments. Although several techniques are available for purifying the hESC colonies (FACS, MACS, or use of drug resistant vectors) from feeders, these techniques are labor intensive, costly and/or destructive to the hESC. The aim of this project was to invent a method of purification that enables the harvesting of a purer population of hESCs. We have observed that in a confluent hESC culture, the MEF population can be removed using a simple and rapid aspiration of the MEF sheet. This removal is dependent on several factors, including lateral cell-to-cell binding of MEFs that have a lower binding affinity to the styrene culture dish, and the ability of the stem cell colonies to push the fibroblasts outward during the generation of their own "niche". The hESC were then examined for SSEA-4, Oct3/4 and Tra 1-81 expression up to 10 days after MEF removal to ensure maintenance of pluripotency. Moreover, hESC colonies were able to continue growing from into larger formations after MEF removal, providing an additional level of hESC expansion.

Despite ongoing efforts to transition cultures to feeder-free conditions, the derivation and culture of human embryonic stem cells (hESC) remain largely dependent on co-cultures with mouse embryonic feeders (MEFs). Here, we show a novel methodology for rapidly removing feeders from hESC cultures prior to experimentation.

Yüksek Yoğunluklu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kültürleri gelen Rapid Fibroblast Kaldırma

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system ...