Yazarlar bu teknikler geliştirmeye yardımcı laboratuarlarımızda geçmiş ve mevcut üyelerine teşekkür ederim. Kısmi finansman Rejeneratif Tıp / CIRM (RN1-00538) için California Institute hibe tarafından DE sağladı.

1.. Zebra balığı Yetiştiriciliği, Embriyo Üretimi ve Tedavisi <ol><li> Kurumsal bir hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (IACUC) gözetiminde ve NIH veya diğer düzenleyici kurumlar / kurallar hayvan bakımı kurallar içinde aşağıdaki Zebra balığı protokolleri Davranış. </li><li> Belirli dokulara, hücrelere veya organlarda floresan proteinleri ifade Zebrafish suşları Zebrafish Uluslararası Resource Center (Zirc) den temin edilebilir. Örneğin, Tg (KDR: EGPF) Bu protokol gösterildiği gibi tam bir 3D vasküler yapılar üretmek için kullanılabilen vasküler endotel hücrelerinin 6, EGFP ifade s843. Transgenik zebrafish hatları Diğer Zirc mevcuttur. </li><li> PH, tuzluluk, sıcaklık, çözünmüş oksijen, ışık, ve diğer çevresel faktörler 7 izler uygun bir yetiştiricilik sisteminin Evi yetişkin zebrabalıkları. Burada gösterilen zebra balığı bir 14 saat lig ile 28.5 ° C&#39;de bir Aquaneering Inc sistemi (San Diego, CA) barındırılmıştırht/10 saat karanlık döngüsü. Yetişkin Zebra tuzlu su karidesi ve NRD 4/6 Balık yemek (Artemia Direct, Ogden, Utah) dengeli bir diyet besleyin. </li><li> Yetişkin erkek ve üreme çağındaki kadın zebra balığı çiftleşme başarılı artırmak için ayrı muhafaza edilmelidir. </li><li> Birlikte yumurta yoluyla düşmek için yeterince büyük delikli bir örgü dibi vardır bir çiftleşme kapta dişileri (2-4) ve erkek (4-6) koyarak yumurtalamasını ve gübreleme teşvik, ama çok küçük Zebrafish yetişkin geçmek için . Önce akşam çiftleşmesi kurmak; yumurta gündüz ışık döngüsü yavaş yavaş yoğunluğu (şafak) artar, genellikle ise, sabaha yakın koyulur. Çiftleşme kabın alt her 15-30 dakika da yumurta kontrol edin. </li><li> E3 tamponu (5 mM NaCI, 0.17 mM KCI, 0.33 mM CaCI2, 0.33 mM MgSO 4) ile bir kafes süzgeç kullanılarak ve temiz yumurta toplamak. Bir 28 ° C kuluçka makinesi içinde E3 tamponu ve mağaza ile doldurulmuş 100 mm kültür plakalarına yumurta aktarın. </li><li> Cer değiştiren kimyasallar çalışmaebrovascular arzu edilen kimyasal konsantrasyonlarda eklemek dallanma. Örneğin neovasular dallanma 24, başlangıç ​​γ-sekretaz inhibitörü 4 DMSO içinde çözülmüş (CBS IX/DAPT/N- [N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanil)]-S-phenylglycinet-butil ester) ile indüklenebilir saat sonra döllenme (hpf). O zaman noktası embriyolar koryon içinde hala vardır ve birçok kimyasal bunun 8 geçebilir. Bir tedavi durum koryon ücretsiz kırmak için embriyoların yeteneğini bozabilir nöral veya motor etkileri varsa, o embriyolar Pronaz 2 ya forseps ile yapılabilir 24 ve 48 hpf arasında de-chorionated edilmelidir. Sağlanan görüntülerde gösterilen embriyolar yavaşça iki bilenmiş forseps ile koryon kapma ve açık şekilde yırtılarak dechorionated edildi. </li><li> Gerekirse / istenirse, pigment oluşumu 24 hpf E3 tampona% 0.003 N-feniltiyoüre (PTU) eklenmesi ile inhibe edilebilir. </li></ol> Serebrovasküler Struct 2.. Konfokal GörüntülemeSabit Zebra balığı Embriyolar ures <ol><li> 250 mg / L Tricaine metansülfonat embriyolar kurban, ve daha sonra 2 daldırılarak onları gidermek - 4 ° C&#39;de bir gece% 4 paraformaldehit Floresan embriyolar ile Konteynerler folyo sarılmış olmalıdır. Bir kez, sabit görüntülenmiş kadar, embriyolar, 4 ° C&#39;de PBS içinde saklanmalıdır - EGFP floresan yoğunluğu yaklaşık bir hafta sonra daha az çözülmüş hale gelir, ancak morfoloji (parlak alanda gösterildiği gibi) çok daha uzun süre korunur. </li><li> Önce bir bilenmiş tungsten iğne kullanılarak bir gözü kaldırarak embriyo monte hazırlayın. Göz bağlayan doku etrafında kesin ilk önce kas kesilir ve son olarak bir göz yerinden için optik sinir kesti. (Not: her iki tarafını görüntülenmesi isteniyorsa kaldırmak hem de gözleri.) </li><li> Göz kaldırıldıktan sonra,% 3 metilselüloz bir damla kullanarak coverglass embriyo monte. Kaldırılan gözle yan coverglass bakan ve mümkün olduğunca cam olarak yakın böylece embriyo yönlendirin. Mctil ile tüm embriyo Kapakgörüntüleme sırasında kuruma önlemek için lcellulose. </li><li> Resim hemen yüksek kaliteli bir 20x objektif Plan Apo (sayısal açıklık = 0.75 ya da daha iyi) ile donatılan bir ters konfokal mikroskop kullanılarak monte embriyo. Bu yapılandırma, iki cam düzlem arasındaki embriyo sandviç ve üst camın embriyo presleme gerektirecek olmayan bir ters mikroskop tercih edilir. </li><li> Orta veya büyük diyafram ayarını kullanarak 1 mikron aralıklarla optik dilimleri toplayın. 2.5 um&#39;lik Büyük adımları da kullanılabilir, ama daha küçük nesnelerin uzaysal sırasını belirlemek için daha zor olabilir. Küçük delikler keskin detay üretmek, ancak gerekli olan uzun tarar EGFP çamaşır suyu ve de elde edilebilir embriyonun içine görüntüleme derinliğini sınırlayabilir. Bir konfokal mikroskop bir embriyo üzerinden yarım yaklaşık görüntüleme için izin verir. </li><li> Tüm balık görüntüleme isteniyorsa, (adım 3.2 Not) başlangıçta iki gözü kaldırmak, hayal gerçekl sonra embriyo döndürmekKarşı taraf için 2.5 - g bir tarafı ve tekrar 2.3 adımları. </li></ol> Embriyonik Zebra balığı Cerebrovasculature 3. 3D İmar <ol><li> Ücretsiz, 3D görüntü için optimize ve PC, Mac ve Linux bilgisayarlar ile uyumlu olan açık kaynak ImageJ Fiji dağılımını 3 (http://fiji.sc) kullanın. </li><li> Eklentiler&gt; LOCI&gt; BioFormats İthalatçı 9, sonra Nikon yığınlarının (Şekil 2A) örneğin name.ids konfokal dosyayı seçmek için giderek Fiji İthalat konfokal yığınları. Bölünmüş kanalları kontrol, AutoScale kontrol gri tonlama: hyperstack, Renk modu gör yığını seçin. </li><li> Bu seçimler dört ayrı kanal panel açılacaktır; EGFP için tek, genellikle üçüncü bir aşağı gerekli olacaktır. C = 1 (Şekil 2A) ardından uzun bir adı olan 16-bit görüntü bırakarak, diğer üç panelleri (kırmızı, mavi ve alfa) kapatın. </li><li> Görüntü kaydırma ta kullanarak rağmen tarayarak ayarlayabilirsiniz.Özellikb ilgi bölgeyi ya da yapıya sahip bir dilim bulmak için alt kısımdaki, sonra (Şekil 2C)&gt; Eşik ayarlama&gt; Görüntü gidin. </li><li> Gelir panelinde, yapı arka plan üzerinde oldukça iyi görülebilir, böylece sol üst bar (siyah seviyesi) kaydırın ve (Şekil 2B) olduğu alt slayt (beyaz düzey) bırakın. B &amp; W tuşuna, Koyu arka plan seçin. Farklı ayarlamalar her dilim için, Siyah arka plan seçmek gerekli olmadıkça her resim için hesapla Eşik seçmeyin. Bu süreç, yeni bir 8-bit görüntü oluşturur. </li><li> UYARI: Eşik sökülme veya kaydedilmiş ImageJ, yani konfokal yığını bir değişiklik gerektiğinde, her zaman yeniden gerekecektir olamaz. Numaralarını yazmak ve istenen sonuç elde edilene kadar farklı ayarları deneyin. </li><li> Faktörü 1 (iyi) ya da 2 (iyi) örneklemek, Eklentiler&gt; 3D Görüntüleyici&gt; Eşik 0 yazan yeşil bir 3D çıkış yapmak için kırmızı ve mavi renk kutuları kaldırın - aksi takdirde will beyaz bir render üretmek - (Kendiliğinden) (Şekil 2E) Uygula&#39;yı seçin. </li><li> , Döndürmek spin ve fare ve klavye kontrolleri (Şekil 2F) kullanılarak 3D görüntü yakınlaştırma. </li><li> Menüsünden yakalama seçeneğini kullanarak herhangi bir noktada hareketsiz görüntüleri kaydetmek. Ekrandaki görüntü kutusunun boyutu üretilen görüntünün piksel boyutlarını belirler böylece yüksek çözünürlüklü bir görüntü makyaj sağ alt köşesini sürükleyerek kutu büyük isteniyorsa. </li><li> Görünüm&gt; Record 360 ° rotasyon (Şekil 2G) seçerek dönen bir 3D film oluşturun. Adım başı 2 derece dönme varsayılan, ama çok daha küçük dosya boyutları yaratacak örneğin 5 derece, değiştirilebilir, ancak animasyon silkeleme ekleyebilirsiniz. </li><li> Daha sonra, medya oynatıcılar ile inceleyen internete yükleyerek veya PowerPoint sunumları kullanmak için birkaç mevcut biçimlerden birinde dosyayı kaydedin. Açık kaynaklı medya oynatıcı VLC ( <a href="http://www.videolan.org/vlc/index.html">ht</a>) :/ / www.videolan.org / vlc / index.html tp, ücretsiz ve çok iyi bu videoları işler. </li></ol>

<ol>
	<li>Staudt, D., Stainier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+molecular+and+cellular+mechanisms+of+heart+development+using+the+zebrafish.">Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish.</a> Annu Rev Genet. 46, 397-418 (2012).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Cameron, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's-related+peptide+amyloid-&#946;+plays+a+conserved+role+in+angiogenesis.">Alzheimer's-related peptide amyloid-&#946; plays a conserved role in angiogenesis.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Cunvong, K., Huffmire, D., Ethell, D. W., Cameron, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-&#946;+increases+capillary+bed+density+in+the+adult+zebrafish+retina.">Amyloid-&#946; increases capillary bed density in the adult zebrafish retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54, 1516-1521 (2013).</li><li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish.">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li><li>Lawrence, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+husbandry+of+zebrafish+(Danio+rerio):+a+review.">The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review.</a> Aquaculture. 269, 1-20 (2007).</li><li>Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+major+permeability+barrier+in+the+zebrafish+embryo.">Characterization of a major permeability barrier in the zebrafish embryo.</a> Biol Reprod. 59, 1240-1250 (1998).</li><li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ.">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).</li><li>Opitz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+zebrafish+illuminate+the+dynamics+of+thyroid+morphogenesis+and+its+relationship+to+cardiovascular+development.">Transgenic zebrafish illuminate the dynamics of thyroid morphogenesis and its relationship to cardiovascular development.</a> Dev Biol. 372, 203-216 (2012).</li><li>Gleave, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroanatomical+phenotyping+of+the+mouse+brain+with+three-dimensional+autofluorescence+imaging.">Neuroanatomical phenotyping of the mouse brain with three-dimensional autofluorescence imaging.</a> Physiol Genomics. 44, 778-785 (2012).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Markaki, Y., Smeets, D., Cremer, M., Schermelleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+applications+for+super-resolution+3D+structured+illumination+microscopy.">Fluorescence in situ hybridization applications for super-resolution 3D structured illumination microscopy.</a> Methods Mol Biol. 950, 43-64 (2013).</li><li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system.">3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> J Vis Exp. 68, e4272 (2012).</li></ol>

Ifşa hiçbir şey yok.

Burada açıklanan yöntemler zebrafish gelişmekte olan damar sistemi görsel çalışmalar için bir temel sağlar. Sabit örnekleri yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme. Drosophila ve C için kullanılabilir ise canlı örnekleri, kalp hızı ve kalp vuruş hacmi olarak fizyolojik parametreleri değerlendirmek için kullanılabilir elegans tüm vücut görüntülemesi için izin verir, ama omurgalıların zebra balığı ve bir endotel hücre-kaplı damar sistemi de dahil olmak üzere omurgalı dokular için yararlı bir model sağlar. Bu çalışmalar Zebrafish araştırma eden önemli transgenik hatları ve genomik kaynaklar dahil edebilirsiniz. 3D rekonstrüksiyonu ve embriyonik zebrabalıkları ikinci eş odaklı görüntü oluşturma, burada açıklandığı gibi, damar dallanması ve bu sıçan ve fareler gibi daha büyük hayvan modelleri ile mümkün değildir damar yoğunluğu ile bir sistem biyoloji yaklaşımı için izin verir. Ayrıca, Zebra balığı değiştirilebilir bir ortamda (E3 tampon) geliştirmek amniotları gibi, nerede bir kolaylıkla c ekleyebilirsinizdamar gelişimini etkileyen belirli enzimleri veya diğer süreçlerini engelleyen hemicals. Kimyasal teslim konsantrasyonu ve zamanlaması araştırmacı ince ayar tedavi koşulları sağlayan, değiştirilebilir. 1.. Değişiklikler ve sorun giderme Bu sistem değişiklikler doku, organ veya bölgeye özel desenler 10 çeşitli EGFP ya da diğer floresan proteinleri ifade zebrabalıkları transjenik çizgileri dahil olabilir. Bundan başka, zebra balığı retinada neovasküler değişikliklerin analizi son 5 yayınlanmıştır. Büyük embriyolar ve yetişkin zebrabalıkları pigmentasyon problemleri ölçekli pigmentler veya retina pigment üretemez transgenik hatları ile geçerek telafi edilebilir. Azalmış floresan Sorunları genellikle uygunsuz tespit koşullarından kaynaklanabilir. 1 gün boyunca paraformaldehit (% 4) uygun olduğu, ancak bu glutaraldehit, ozmiyum tetroksit veya alkol gibi güçlü bir sabitleyici, mayEGFP floresan yok eder. Fiksasyon sonra, embriyolar 4 ° C&#39;de PBS tutulmalı ve her zaman doğrudan güneş ışığından korunmalıdır. Bu tekniğin 2. Sınırlamalar Bu protokol ile üretilen 3D görüntü kalitesi ve çözünürlüğü oluşturulan görüntülerin kalitesine bağlıdır. Bu embriyolar ile ışık penetrasyon standart bir konfokal mikroskop kullanılarak orta sajital düzlem ile sınırlıdır. Bu görüntüleme yönü büyük embriyolar ve yetişkinlerde görüntüleme derinliğini sınırlar, ancak daha gelişmiş çoklu foton mikroskopi sistemleri derinlikte görüntüleme için izin. Mevcut yöntemlere göre 3. Önemi Bu protokol, bütün bir hayvan dahil bir sistem bir düzeyde kan damarı ağları analizlerine bir yaklaşım sağlar. Bu verilerin daha önceki temsilleri sık sık birlikte ortaya koydu görüntülerin dizi dayanıyordu, ancak 3D render mekansal Yakınlarının daha iyi çözünürlük sağlariçeriyordu tin. 4. Gelecek uygulamalar Görüntüleme ve doku işleme yeni gelişmeler yaşlı embriyolar veya yetişkin şeffaf 11-14 yaparak içerebilir, bu yöntemler için yeni uygulamalar sağlayacaktır. Geliştirilmiş şeffaflık büyük ölçüde konfokal ve çoklu foton lazerler doku penetrasyonu artacak. Bundan başka, kamera ve foto çoklayıcı tüplerin hızı gibi yakında bir analiz 4. boyuta sağlayan, gerçek zamanlı olarak balık 3D kaplamalar üretmek mümkün olabilir artar. 5.. Kritik adımlar Bu protokol kritik bir adım, tam sabitlemeyi içeren görüntüleme için hazırlıktır. Görüntüleme mevcut en iyi sayısal deliklere sahip yüksek kalite hedefleri ile tespitin ardından en kısa sürede yapılmalıdır. Çözünürlük kullanılan görüntüleme sistemine bağlıdır, çok yüksek kalite sistemleri genellikle daha iyi. 3D render üreten, yoğun bellekbellek ve iyi bir grafik işlemciler büyük bir miktarı ile çok daha yeni, yüksek-uç bilgisayarlar için tavsiye edilir. Bu yöntemler, nöronlar, kas, bezler ya da herhangi bir sayıda popülasyonlarında, GFP ya da diğer floresan proteinleri ifade eden transgenik embriyo adapte edilebilir olsa da, burada açıklanan görsel biyoloji sistemi, vasküler endotelyal hücrelerde EGFP ifade eden transgenik zebrabalıkları için optimize edilmiştir Diğer hücreler. Bu sistemle birlikte çalışma konusunda büyük avantajı sabit ve / veya canlı hayvanlarda, bu gelişim sürecinde herhangi bir anda tüm embriyo neler olduğunu incelemek için yeteneğidir.

Zebra balığı gelişim biyolojisi okumak için güçlü bir sistem sağlamak ve onların embriyoların göreceli saydamlık görüntüleme bazlı çalışmalarda 1 elverişlidir. Zebrafish on yıllardır omurgalı gelişimi için bir model olarak kullanılmıştır. Zebra balığı dahil Teleost&#39;un, omurgasızlar hiçbir makul homoloğunu sahip basitleştirilmiş bir omurgalı damar sistemi var. Kan bu oksijenli solungaçları yoluyla iki bölmeli bir kalbin ön odasından pompalanır. Solungaçları Kan dorsal aorta yakınsarsa ve daha küçük ve daha küçük damarları içine şube arterler, organ dokularında sonunda ulaşan kılcal damarlar yoluyla geçer. Kılcal kısımlar, oksijen içinde serbest bırakılır ve karbon dioksit emilir. Kapiller venöz kan tarafında daha büyük ve büyük damarlar içine akar ve son olarak döngü tekrar kalp, posterior odacık içine çekilir. Bir yetişkin zebrabalıkları bir seferde 200 veya daha fazla yumurta, ve onc olabilire döllenmiş, hızla 2 gelişir. Bir gün içinde vücut ekseni de koryon zarı içinde etrafında embriyo hareket sözleşme ve kaslar da dahil olmak üzere, geliştirilmiştir. 2-7 günden sonrası fertilizasyon (DPF) çoğu vücut sistemleri gözleri ve gıda doğru veya uzakta parlak ışıktan yüzme koordine bir merkezi sinir sistemi de dahil olmak üzere, gelişir. Kadar 7 dpf&#39;e embriyolar mikroskobu ile görselleştirme için izin vermek için yeterince küçük. Floresan proteinleri sentezleyen transgenik hatları konfokal veya floresan mikroskobu ile görüntülü olabilir. Konfokal görüntüleme vasküler gelişimin bir sistem biyolojisi bakış açısı sağlamak Zebra balığı embriyolarının tam vasküler yapıların 3 boyutlu görüntü oluşturmak için açık kaynak yazılım 3 ile eşleştirilmiş olabilir. Bu damar ağlarının 4,5 bir sistem düzeyinde analiz için izin verir gibi vasküler ve serebrovasküler karmaşıklığı değişiklikleri ile ilgili çalışmalar, bu protokol yararlanacaktır. Yöntemleri ve kaynakların bir derleme sağlamak vardırembriyonik Zebrafish vasküler yapıların görüntülemesi gerektiren çalışmalar için kolay benimsenmesi ve bu tekniklerin izin d. Bir hayvan modeli olarak zebrabalıkları maliyet etkinliği, omurgalı gelişimi ve homeostazında moleküler yollarının anjiyojenik etkisini değerlendirmek için yeni platformlar sağlamak için ortaya çıkan görüntüleme teknolojileri ile bir araya getirmektedir.

<table><tbody><tr><td>N &amp;ndash; Phenylthiourea&amp;nbsp;</td><td>Alfa Aesar, catalog #41972</td><td></td><td>0.2 M in E3 buffer, kept at 4 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>E3 buffer</td><td>Sigma</td><td></td><td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 0.33 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Confocal microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U</td></tr><tr><td>Glass bottom dishes</td><td>Mat-Tek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSI IX/DAPT</td><td></td><td></td><td>N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences</td></tr><tr><td>24 well plates&amp;nbsp;</td><td>Becton-Dickinson, cat# 351147</td><td></td><td>BD Falcon</td></tr><tr><td>Transfer pipettes&amp;nbsp;</td><td>VWR, cat #414004-001</td><td></td><td>VWR disposable transfer pipettes</td></tr><tr><td>Methyl-cellulose&amp;nbsp;</td><td>Alfa Aesar, cat#43146</td><td></td><td>3% in E3 buffer</td></tr><tr><td>NRD 4/6 Fish food&amp;nbsp;</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td></td><td>Dried</td></tr><tr><td>Brine shrimp</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td></td><td>Live</td></tr><tr><td>Tungsten wire&amp;nbsp;</td><td>Small Parts # TW-016-60</td><td></td><td>0.016&amp;rdquo; OD</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>VWR # 101107-950</td><td></td><td>Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer</td></tr></tbody></table>

imaging and 3d reconstruction of cerebrovascular structures in embryonic zebrafish

Zebra balığı, in vivo gelişimsel biyoloji ve patoloji incelemek için güçlü bir araçtır. Küçük boyutu ve zebra balığı embriyoların nispi şeffaflık gibi kalp ve damar gelişimi gibi süreçlerinin görsel inceleme için özellikle kullanışlı hale getirir. Birçok son çalışmalarda, vasküler endotelyal hücrelerde EGFP ifade eden transgenik zebra balığı görüntü için kullanıldı ve konfokal mikroskopi kullanılarak, beyinde ve retinada kompleks vasküler ağların analiz. Tanımlar, hazırlama ve tedavi resim gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) ifade zebra balığı embriyolar ve daha sonra serebrovasküler sistemin kapsamlı 3D kaplamalar oluşturmak için temin edilmiştir. Protokoller embriyoların tedavi, konfokal görüntüleme ve EGFP floresan korumak tespit protokolleri bulunmaktadır. Ayrıca, bu tür zararlı yakındaki sinir doku olmadan çıkarılması göz gibi serebrovasküler yapıların, yüksek kaliteli görüntüler elde etme hakkında yararlı ipuçları verilmektedir. Potansiyel tuzaklarkonfokal görüntüleme ile serbestçe kullanılabilir açık kaynak kodlu yazılım kullanarak konfokal görüntü yığınlarının 3D rekonstrüksiyon oluşturmak için gerekli adımları birlikte tartışılmıştır.

Vasküler yapıların 3 boyutlu rekonstrüksiyon Zebra balığı bir gelişme kapsamlı ve görsel olarak ilginç bir bakış açısı sağlar. Onlar genellikle yapıldığı gibi 1 ve 2 yöntemleri Rakamlar. Şekil 3. endotel hücreleri EGFP ifade Zebra balığı embriyo dpf&#39;e 6 vasküler yapıların çeşitli açılarını göstermektedir. Bir katı yeşil veya beyaz renk ile bu sinyal yoğunluğunu takdir etmek zor olabilir; pseudo-boyama bir look-up-tablodan görüntü yoğunluğunu sağlamak ve yapıları örtüştüğü zaman daha iyi bir derinlik algısı sağlar. In damar bir sözde renkli 3D görüntü bir örneği, bir 6 zebra balığı, Şekil 4&#39;te sağlanmıştır dpf. Canlı embriyo Floresan Görüntüleme göz ve vücut hareketi içerir fizyolojik özelliklerini incelemek için kullanılabilir ve kalp aktivitesi. 3 ve 4, Şekil transgenik Zebrafish satırını kullanarak, bu yöntemlerle elde edilen temsili sonuçlar göstermektedir<html> tarif. Görüntüleme çözünürlüklü mikroskop özelliklerine bağlıdır, ancak EGFP sinyalinin parlaklık en ticari sistemler ile iyi görüntü kalitesi için yeterlidir. 3D temsillerinin İmar ve render tutarlı ve bu açık kaynak yazılım içindeki seçenekleri sürekli iyi sonuçlar sağlar. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig1highres.jpg" width="600" /> Şekil 1. Göz giderme. A) bir tungsten ihtiyacı olan sabit bir 3 dpf embriyo göze yanına yerleştirilir. Doku) bu pozisyon. B göz çevresinde kesilir gözü düşer ve altta yatan oküler kaslar ve optik sinir kesilir. Boş göz soket kesik daire ile gösterilir. C) Aynı embriyo üzerinde döndü ve metil-selüloz ile monte edilir, yukarı bakacak sağlam gözle.<html> hres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig2highres.jpg" width="600" /> Şekil 2. Adım-adım bir konfokal görüntü yığını 3D rekonstrüksiyon. A) ilgi bölge ile bir dilim bulduktan sonra. B) seçmek için Eklentiler&gt; LOCI&gt; Bioformat kullanarak Fiji içinde yüklü dosyayı aç (4104.1.ids), eşik ayarı gösterilmiştir. C) olarak seçilen eşik üst kullanılarak 214 ayarlanır kaymak ve uygulamak seçilir. gösterildiği gibi D) 3D görüntüleyici denir. E) 3 boyutlu rekonstrüksiyon yönlendirme için sağlam göz ile bir zebrabalıkları. F) görüntü yakınlaştırılmış ve. G) A 360 derece dönüş filmi döndürülmüş gelmiştir gösterilir gösterildiği gibi yapılır.<html> res.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg" width="600" /> Şekil 3.. 3D rekonstrüksiyon Perspektifler. A) 10x objektif ile görüntülü 6 dpf&#39;e embriyonun medial perspektif, ağız sağda, ağız içinde değil solungaçları. B aynı embriyo) Yanal, not fin ortada bir döngü. 20x objektif ile görüntülenmiş C) Aynı embriyo, 20x objektif görüntüleme medial perspektif, not solungaç çözünürlük. D) Yanal perspektif. Fin panelinin sağ kenarında. 20x objektif görüntüleme E) ön-medial görünümü, sağa bir 20x objektif, baş onunla görüntülü aynı embriyo ağız içinde not solungaçları. F) Karın. Sağ alt kısmında yumurta sarısının üzerine damarsal unutmayın.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" width="600" /> Sinyal yoğunluğu için bir Pseudocolor look-up-tablosunu kullanarak 6 dpf yeniden 6 dpf&#39;e embriyo Şekil 4. Yoğunluk farklılıklar. Image. Ağız, beyin, solungaçları ve yolk kesesi yönelim etiketli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still.jpg" width="500" /> 4 dpflik zebrabalıkları yeniden damar sisteminin Şekil 5. Movie. Balık 2,5 mikron ile görüntülendi. Görüntüler vardıEmbriyonun yarısını görüntüleme dan. Şekil 6&#39;da yer alan bir GSI ile muamele edilmiş zebrabalıkları yapılarla vasküler yapıları karşılaştır. Baş kan damarlarının daha düşük yoğunluklu ve daha büyük solungaçları not edin. (Yüklemeler altında &quot;Zfish_spin.avi&quot; ek dosyasına bakınız) <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still1.jpg" width="500" /> Şekil 6. 4 dpf&#39;e bir GSI-tedavi edilen embriyo damar sistemi 3D Film. Balıklar orta hatta lateral boyunca 2.5 mikron ile görüntülendi. Şekil 5&#39;te gösterilen balık dpf&#39;e kontrolü 4 ile vasküler yapıları karşılaştırın. Kemerli sırt ve küçük boyutu bu kimyasal ile tedavi embriyoların tipiktir. (Yüklemeler altında &quot;GSI-treated_4dpf_fish.avi&quot; ek dosyasına bakınız)

Watch this Scientific Journal Video about Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish at JoVE.com

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Larva Zebrafish serebrovasküler gelişme görüntüleme açıklanmıştır. 3D görüntüleme kolaylaştırmak ve kimyasal tedaviler kullanarak serebrovasküler gelişimini değiştirme teknikleri de verilmektedir.

Görüntüleme ve Embriyonik Zebra balığı Serebrovasküler Yapıların 3D İmar

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

imaging-3d-reconstruction-cerebrovascular-structures-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K Görüntüleme.  Western University of Health Sciences.  Larva Zebrafish serebrovasküler gelişme görüntüleme açıklanmıştır. 3D görüntüleme kolaylaştırmak ve kimyasal tedaviler kullanarak serebrovasküler gelişimini değiştirme teknikleri de verilmektedir. 

Video: Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Time-lapse aydınlık stereomikroskobi ile Zebra balığı Larva Doku Onarım yakalama

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Gelişim Biyolojisi

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biyoloji

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved cavities within the brain that are filled with cerebrospinal fluid.  In zebrafish, after neural tube formation, the neuroepithelium undergoes a series of constrictions and folds while it fills with fluid resulting in brain ventricle formation.  In order to understand the process of ventricle formation, and the neuroepithelial shape changes that occur at the same time, we needed a way to visualize the ventricle space in comparison to the brain tissue.  However, the nature of transparent zebrafish embryos makes it difficult to differentiate the tissue from the ventricle space.  Therefore, we developed a brain ventricle injection technique where the ventricle space is filled with a fluorescent dye and imaged by brightfield and fluorescent microscopy.  The brightfield and the fluorescent images are then processed and superimposed in Photoshop.  This technique allows for visualization of the ventricle space with the fluorescent dye, in comparison to the shape of the neuroepithelium in the brightfield image.  Brain ventricle injection in zebrafish can be employed from 18 hours post fertilization through early larval stages.  We have used this technique extensively in our studies of brain ventricle formation and morphogenesis as well as in characterizing brain morphogenesis mutants (1-3).

After neural tube formation, the neuroepithelium constricts and folds while the tube fills with embryonic cerebrospinal fluid (eCSF) to form the embryonic brain ventricles. We developed this ventricle injection technique to better visualize the fluid filled space in contrast to the neuroepithelial shape in a live embryo.

Zebra balığı Beyin Ventrikül Enjeksiyon

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

Diseksiyon ve Zebra balığı Embriyolar Yanal Montaj: Omurilik Kalkınma Analizi

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Nörobilim

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Brainbow ve Time-lapse Konfokal Görüntüleme kullanarak Yaşayan Zebrabalıklarında Gelişen Beyni Görselleştirme

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

4D konfokal mikroskopi kullanılarak Zebra balığı Kranyofasiyel morfogenez Analizi

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of visual impairment, yet mechanisms of eye morphogenesis are still poorly understood. The basic organization of the embryonic eye is conserved throughout vertebrates, thus live imaging of zebrafish embryos has become a powerful approach to directly observe eye development at real time under normal and pathological conditions. Dynamic cell processes including movements, morphologies, interactions, division, and death can be visualized in the embryo. We have developed methods for uniform labeling of subcellular structures and timelapse confocal microscopy of early eye development in zebrafish. This protocol outlines the method of generating capped mRNA for injection into the 1-cell zebrafish embryo, mounting embryos at optic vesicle stage (~12 hours post fertilization, hpf), and performing multi-dimensional timelapse imaging of optic cup morphogenesis on a laser scanning confocal microscope, such that multiple datasets are acquired sequentially in the same imaging session. Such an approach yields data that can be used for a variety of purposes, including cell tracking, volume measurements, three-dimensional (3D) rendering, and visualization. Our approaches allow us to pinpoint the cellular and molecular mechanisms driving optic cup development, in both wild type and genetic mutant conditions. These methods can be employed directly by other groups or adapted to visualize many additional aspects of zebrafish eye development.

This protocol describes an approach for in toto labeling and multidimensional imaging of zebrafish early eye development. We describe labeling, embedding, and four dimensional (4D) imaging using laser scanning confocal microscopy, and considerations for optimizing acquisition of datasets for dissecting mechanisms of optic cup morphogenesis.

Zebra Balığı Optik Kupası Morfogenezinin 4 Boyutlu Görüntülenmesi

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at cellular and subcellular resolution. Advances in molecular and imaging technologies have allowed us to gain numerous detailed insights into cellular and molecular mechanisms of brain development in the transparent zebrafish embryo. Recently, processes of refinement of neuronal connectivity that occur at later larval stages several weeks after fertilization, which are for example control of social behavior, decision making or motivation-driven behavior, have moved into focus of research. At these stages, pigmentation of the zebrafish skin interferes with light penetration into brain tissue, and solutions for embryonic stages, e.g., pharmacological inhibition of pigmentation, are not feasible anymore.
Therefore, a minimally invasive surgical solution for microscopy access to the brain of awake zebrafish is provided that is derived from electrophysiological&#160;approaches. In teleosts, skin and soft skull cartilage can be carefully removed by micro-peeling these layers, exposing underlying neurons and axonal tracts without damage. This allows for recording neuronal morphology, including synaptic structures and their molecular contents, and the observation of physiological changes such as Ca2+ transients or intracellular transport events. In addition, interrogation of these processes by means of pharmacological inhibition or optogenetic manipulation is feasible. This brain exposure approach provides information about structural and physiological changes in neurons as well as the correlation and interdependence of these events in live brain tissue in the range of minutes or hours. The technique is suitable for in vivo brain imaging of zebrafish larvae up to 30 days post fertilization, the latest developmental stage tested so far. It, thus, provides access to such important questions as synaptic refinement and scaling, axonal and dendritic transport, synaptic targeting of cytoskeletal cargo or local activity-dependent expression. Therefore, a broad use for this mounting and imaging approach can be anticipated.

Here we present a method to image the zebrafish embryonic brain in vivo upto larval and juvenile stages. This microinvasive procedure, adapted from electrophysiological approaches, provides access to cellular and subcellular details of mature neuron and can be combined with optogenetics and neuropharmacological studies for characterizing brain function and drug intervention.

Kafatası ve Deri Temizleme ile Uyanık Zebra Balığı Larvaları ve Yavrularında Tam Aktif Beyin Dokusunun In vivo Görüntülemesi

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...