Biz eleştirel okuma ve yorumlar sağlamak için Sarah Dick teşekkür etmek istiyorum. MAR Moleküler Genetik Kanada Araştırma Başkanı tutan ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü Uluslararası Araştırmacı olduğunu. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, Howard Hughes Tıp Enstitüsü, Sağlık Araştırması Kanada Enstitüleri, Müsküler Distrofi Derneği ve Kanada Araştırma Başkanı Programı MAR bağışları ile desteklenmiştir.

Tüm deneyler hayvan bakımı ve kullanımı için Ottawa düzenlemeler Üniversitesi&#39;ne göre ele alınmıştır. Protokol genel bir bakış için Tablo 1&#39;e bakınız. 1. İzolasyon Başlamadan Önce <ol><li> Aşağıdaki çözümleri hazırlayın: % 0.2 collagenase tip DMEM I (Dulbecco&#39;nun modifiye edilmiş Eagle ortamı, 110 mg / ml sodyum piruvat, yüksek glikoz, L-glutamin). İki EDL kasları DMEM% 0.2 Collagenease 2 ml hazırlamak için. 0.22 um filtre içinden çözelti filtre. 37 prewarm izole edilmesinden önce 10 dk ° C su banyosu içinde. Seyreltilmemiş kollajenaz ilave alikotları daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C de donduruldu edilebilir. Not: prosedürünün tüm boyunca sodyum piruvat ile DMEM kullanın. Elyaf sodyum pirüvat içermeyen ortamda hayatta yoktur. <ul><li> Yıkama medya (tüm yıkar gerçekleştirmek için kullanın). % 1 penisilin / streptomisin ile DMEM, Supplement. 0 süzülürKullanımdan önce 22&#39;lik um bir filtreden. </li><li> Myofiber kültür ortamı. % 20 FCS,% 1 tavuk embriyo özü ve% 1 penisilin / streptomisin ile DMEM, Supplement. Kullanmadan önce filtre 0.22 mikron süzülür. </li><li> Kaplamalı yemekleri Matrigel. Uzun süre için kültür elyaf için, kaplama substrat olarak Matrigel kullanmanızı öneririz. Matrigel kaplı yemekleri hazırlamak için, 4 ° C gecede Matrigel bir kısım Çözülme. Gün sonra, DMEM Matrigel 01:10 sulandırmak. Her zaman 4 ° C Matrigel tutun ve bu düzensiz kaplama sonuçlanan Matrigel çözüm içindeki mikroskobik kristalleri oluşturmak gibi ani sıcaklık değişikliklerinden kaçının. Yer bulaşık buz üzerine kaplanmıştır gerekir. Yüzey kaplamak için yeterli hacmi ile kaplayın yemekler. Bunun 1 dakika bekletin. Tamamen artık Matrigel çıkarın. Kullanımdan önce ya da gece boyunca en azından 3 saat için 37 ° C &#39;de bulaşık kuruması beklenir. </li></ul> Not: 4 &amp; de saklandığında seyreltilmiş Matrigel hacimde kaplama amacıyla birden çok kez tekrar kullanılabilirg; C. </li><li> Son olarak,% 70 etanol ile mikroskop istasyonu ve diseksiyon araçları temizlemek için emin olun. </li><li> : İki EDL izolasyonların (bir fare) aşağıdaki gibi beş plastik petri (60 * 15mm) hazırlamak için <ul><li> Izolasyonu için dört yemekleri (kas disosiyasyon için 1, seri yıkama için 3). Tüm yemekler plastik takılarak gelen myofibers önlemek için at serumu (HS) ile kaplanmış olmalıdır. Ceket için, her yemeğin, girdap içine at serumu olarak pipetle 3 ml hatta kaplama sağlamak için, at serumu çıkarmak ve en az 30 dakika süreyle çanak kurumaya bırakın. Her çanak DMEM 4 ml ekleyin. Kullanımdan önce bir% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde 37 ° C &#39;de bulaşık tutun. </li></ul> Not: Steril devam edersem At serumu, birden çok kez yeniden kullanılabilir. Alternatif olarak, DMEM içinde% 10 HS içindeki bir çözeltisine kat bulaşık için kullanılabilir. Bütün protokol boyunca HS kaplı yemekleri kullanın ve yüzen koşullar olduğunda kültür myofibers. <ul><li> Bir yemeğin izolasyon sonra kültür myofibers için kullanılır. Alternative çanak boyutları veya biçimleri alt-uygulamalara bağlı olarak myofibers nihai kültür için de kullanılabilir. Ancak, biz 60 * 15mm daha büyük çanak boyutları önermiyoruz. Hiper daralma meydana gelmeden önce Myofibers artık fazla 96 saat süreyle askıya saklanabilir. Uzun kültürü zamanlar için, biz Matrigel kaplı yemekleri veya plakaları kullanmanızı öneririz. </li></ul></li><li> Myofiber manipülasyon kas işleme ve bir küçük kalibreli pipet için büyük bir delik pipet: bir fiber izolasyon (2 EDL) için, iki steril Pasteur pipetler hazırlamak. İstenilen boy ve pipet kenarları düzeltmek için ısı cilası her cam pipet kesmek için bir elmas kalem kullanın. Alev kullanılarak, dar çaplı bir pipet eğri ucu. Bu tek elyaf işleme yardımcı olacaktır. Sterilize etmek Alev. Kullanmadan önce HS ile kaplayın Her pipet. </li></ol> 2. Muscle Diseksiyon ve Sindirim <ol><li> Rosa26TdTomato (; Bu deneylerin amacı, 8 haftalık SV129, Pax7 CreER Cklr içinPax7Cre-TdTomato) ve Myf5-Cre; Rosa26YFP kullanılmıştır. </li><li> % 70 etanol ile arka bacaklarda püskürtün. İşlem sırasında arka bacak daha iyi kavramak için bir destek kuruluna hayvan (yüz yukarı) Pin. </li><li> Makas yardımı ile, bacak tüm uzunluğu boyunca kesilmiş ve altta yatan kas maruz kalmaktadır. Cildin yanı sıra herhangi bir saç veya kürk (Şekil 1A) sökün. </li><li> Ince bir makas ile, altta yatan kasları zarar vermeden ince fasya kesti. Görme EDL yerelleştirilmesine. EDS, sadece tibialis anterior (TA) kas altında arka bacak ön bölme bulunmaktadır. </li><li> Iki forseps yardımıyla, distal tendon maruz. </li><li> Keskin Cohann-Vannas yay makas ile distal tendon (TA ve EDL hem) kesin. </li><li> Forseps yardımıyla kendi tendon TA ve EDL kasları hem tutun ve ince proksimal sonuna doğru kasları yukarı çekin. Bu noktada açıkça görmek mümkün olmalıdırsadece TA kas altında EDL kasının. Şimdi, zıt yönlerde (Şekil 1B) iki tendon çekerek TA kas EDS ayırır. Bu myofibers zarar verecektir Bu işlem gerçekleştirilirken EDL kas germe kaçının. </li><li> EDS tendonu Açığa. Daha proksimal tendon görselleştirmek için bu ta kas kaldırmak için bu noktada yardımcı olabilir. Ayrıca diz çevresindeki bazı bağ dokusu (Şekil 1C) kesmek için yardımcı olabilir. </li><li> Proksimal tendon kesin ve hafifçe EDL (Şekil 1D) çıkarın. </li><li> Onun tendonlar aracılığıyla kas tutarak, önceden hazırlanmış kollajenaz çözüm 2 ml aktarın. Bir su banyosunda 37 ° C&#39;de inkübe edin. Not: başarılı bir şekilde elyaf izolasyon için, bu myofiber bütünlüğünün korunmasını sağlar, böylece tendondan tendona EDS izole etmek için önemlidir. 2,3-2,9 adımları diseksiyon mikroskop altında yapılabilir. Alternatif olarak, bir MAGN kullanımıcam ifying da kasların daha iyi bir görünüm için yardımcı olabilir. </li><li> İkinci EDL yalıtmak için 2,3-2,9 adımları tekrarlayın. Aynı tüp içinde ikinci EDS aktarın. Düzensiz sindirim önlemek için, ikinci EDL izolasyonu ilk sonra en fazla 5 dk tamamlanması gerekmektedir. Not 1: İnkübasyon süresi kollajenaz aktivitesine bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. Uzun veya kısa inkübasyon büyüklüğü, yaş ve / veya kas durum (ör. fibrotik kasları uzun sindirim süresi gerekir) bağlı olarak gerekli olabilir. Not 2: kas sindirim süresi boyunca, sakinleştikten koşullarda ajitasyon uydu hücrelerin davranışını inceleyen uydu hücreleri 10 aktive olabilir varsa. </li><li> Sindirim süresi boyunca, düzenli olarak aşırı sindirim önlemek için kas kontrol edin. Kasları gevşetmek başlar ve myofibers görünür olduğunda sindirimi durdurur. Sindirim durdurmak için, dikkatli DMEM 4 ml (dissociati ile önceden ısıtılmış Petri kabı hem kas transferiyemeğin üzerine). Bu işlemi gerçekleştirmek için büyük Çapla pipet kullanın. Not: hiper sözleşmeli myofibers üzerindeki izolasyonun bu kaçınılmaz sonuç olarak kas overdigestion kaçının. </li></ol> 3. Tek Myofiber Ayrışma ve Kültür <ol><li> Myofibers serbest bırakmak için, lifler doğal serbest bırakılması başlayana kadar sıcak ortamı ile kas temizlemek için büyük kalibreli cam pipet kullanın. Bu kaçınılmaz zararlı lifler neden olacağı kas çiğnemek etmeyin. Bu ve bir diseksiyon mikroskobu altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin. </li><li> İstediğiniz numaraya ulaşana kadar myofibers bırakmadan devam edin. Çanak fazla 10 dakika süreyle oda sıcaklığında gerekiyorsa, 37, 5 dakika (en az) inkübasyon ° C,% 5 CO2 orta yeniden denge sağlaması için izin verir. Not: orta uzun bir süre fizyolojik altındaki sıcaklıklarda (37 ° C) ulaşırsa myofibers ölecek. </li><li> Küçük kalibreli pipet, transfe kullanmar yeni bir önceden ısıtılmış yemek (üç ardışık yıkama ilk) tek myofibers yaşıyor. Yerine tümünü bir seferde myofibers toplu aktarımı tek tek her myofiber taşıyınız. Gerekirse, 37 ° C&#39;de inkübe, orta yeniden dengelenmesi için 10-15 dakika için% 5 CO2. </li><li> 2 kez daha için adım 3.3 tekrarlayın veya tüm ölü myofibers ve enkaz kaldırılıncaya kadar. Biz uygun temiz-up için en az üç ardışık yıkama önerilir. Not: Kısa ve hiper mikroskop ışık altında sözleşmeli olarak ölü myofibers görünecektir. </li><li> 37 tek myofibers inkübe ° C, daha önce kültür ortamı için geçiş için en az bir saat boyunca geçen yıkama bulaşık (sadece DMEM) içinde% 5 CO2. Bu myofibers serum yokluğunda in vitro koşullarında ayarlamak için olanak sağlar. Serum zengin orta lif daralma arttırmaktadır myofibers bu acil kültürü bulundu. </li><li> Bir saat sonra, yeni bir önceden ısıtılmış çanak ya da uygun bir kültür biçimine myofibers aktarmakdownstream uygulamaya bağlı. Yüksek serum ortamında kültive lifler uydu hücre aktivasyonuna izin vermektir. Alternatif olarak, serum ya da tavuk embriyo özü farklı konsantrasyonları da kullanılabilir. Her gün orta değiştirin. </li></ol> 4. Mansap Uygulamaları <ol><li> Immün. Canlı myofibers izolasyon sırasında herhangi bir zaman noktasında sabit ve lekeli olabilir. Immunofluorescence kayan alt tabaka ve ikisi de ekli myofibers üzerinde gerçekleştirilebilir. Kayan myofibers boyama, başka bir çözüm myofibers aktarmak için küçük bir delik cam pipet kullanın. Alternatif olarak, tüm işlem boyunca aynı kuyuda myofibers tutmak ve bir cam pipet kullanarak çözümler eklemek / çıkarmak mümkündür. Bu yanı myofibers çıkarılması neden olacak gibi standart aspirasyon kaçının. Kısaca, tamamen kültür ortamı çıkarın; 5 dakika önceden ısıtılmış% 4 paraformaldehid (PFA) düzeltme myofibers. Yaygın PBS birkaç kez yıkayın. InkübasyonPBS veya diğer standart soğutma çözümleri% 1 glisin te myofibers PFA plan boyama en aza indirmek için. Eğer gerekirse,% 0,1 Triton PBS içinde 5 dakika yıkama ve ardından 10 dakika boyunca PBS içerisinde X-100. Myofibers geçirgen 1 saat oda sıcaklığında ya da tercihan bir gece boyunca 4 ° C&#39;de için blokaj çözeltisi içinde elyaflar (% 10 at serumu,% 0.1 Triton X-100,% 1 NaN) inkübe Alternatif çözümler engelleme ilgili antikor bağlı olarak kullanılabilir. 5 dakika boyunca PBS içinde bir kere yıkayın. 4 ° C&#39;de 1 saat oda sıcaklığında veya gece boyunca bloke etme çözeltisi ile seyreltilir uygun birincil antikor ile inkübe Bağlanmamış antikor kaldırmak için PBS içinde yıkama başına 5 dk lifler 3 kere yıkayın. Oda sıcaklığında 45 dakika, 1 saat için uygun ikincil antikor ile inkübe edin. PBS içinde yıkama başına 5 dk az 3 kere yıkayın. 1 mg / ml DAPI ile çekirdekler Counterstain. Yüzen elyaf boyama varsa, mikroskopi için uygun bir cam slayt her lif transfer. PBS veya orta herhangi bir aşırı çıkarın. Medi montaj Uygulaum ve sonra lamel ekleyin. Bir floresan mikroskop altında myofibers görselleştirmek için devam edin. EDL myofibers üzerine temsili immünofloresan için Şekil 4&#39;e bakın. Güçlü bir fiksatif kullanan alternatif boyama prosedürleri Verma, M. et al. 11 ve Wosniak, AC ve ark. 12&#39;de tarif edilmektedir. </li><li> Oligonükleotid ya da plazmid geçici transfeksiyon. Canlı myofibers özgü gen / ilgi s plazmid ya da siRNA ile transfekte edilebilir. SiRNA kullanırken, çift transfeksiyon verimli gen demonte için tavsiye edilir. Bu izolasyon itibaren 8 saat sonra, ilk transfeksiyon icra öneriyoruz. Transfeksiyon sonra altı saat, taze ortam ile değiştirin. SiRNA transfeksiyon için, 50 nM bir nihai konsantrasyon kullanılarak başlangıç ​​göstermektedir. Gen ekspresyonu knockdown RNA ekstraksiyon veya tercihen immün analiz edilebilir. </li><li> Viral enfeksiyon. Canlı myofibers enfeksiyonu mümkün olmakla beraber hücre sıklığıölüm oligo transfeksiyon ve enfeksiyon verim ile daha yüksek kas koşullar ve yaşa bağlı olarak değişken olabilir. Örneğin, sağlam bir yetişkin kas myofibers ana enfeksiyon, 13, 14 karşı koruyucu bir bariyer sağlamak için gösterilmiştir bazal laminanın varlığı nedeniyle viral enfeksiyon için, özellikle duyarlı olmayan vardır. Onlar hareketsiz (non mitotik) hücreleri enfekte edebilir çünkü lentiviral vektörler retroviral vektörler tercih edilir. Viral enfeksiyon için bir Matrigel kaplı çanak veya plaka ve myofibers ilk 24 saat için ortam koşullarına uyum izin kültürün lifleri tavsiye edilir. </li><li> Görüntüleme Canlı. Myofibers görüntülenmesi, özellikle zaman alıcı ve bir 37 ° C,% 5 CO2 bölme ile donatılmış bir mikroskop gerektirmektedir canlı. Tek bir uydu hücrelerin davranışını değerlendirirken zaman yararlıdır. Bu teknik kullanılarak yapılan çalışma, uydu hücre heterojenitesini keşif için etkili olmuştur ve onların Beha çalışmalifleri üzerine vior (15 ve 16). </li></ol>

<ol>
	<li>Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+muscle+satellite+cells+on+intact+myofibers+in+culture.">Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture.</a> Dev. Biol. 115 (1), 129-139 (1986).</li><li>Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+satellite+cells+from+living+single+muscle+fiber+explants.">Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 31 (10), 773-779 (1995).</li><li>Anderson, J. E., Wozniak, A. C., Misunoya, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+muscle+fiber+isolation+and+culture+for+cellular+molecular,+pharmacological,+and+evolutionary+studies.">Single muscle fiber isolation and culture for cellular molecular, pharmacological, and evolutionary studies.</a> Methods Mol. Biol. 798, 85-102 (2012).</li><li>Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+skeletal+muscle+myofibers+as+a+means+to+analyze+satellite+cells.">Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells.</a> Methods Mol. Biol. 290, 281-304 (2005).</li><li>White, R. B., Bi&#233;rinx, A. S., Gnocchi, V. F., Zammit, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+muscle+fibre+growth+during+postnatal+mouse+development.">Dynamics of muscle fibre growth during postnatal mouse development.</a> BMC Developmental Biology. 10 (21), 1-11 (2010).</li><li>Siegel, A. L., Kuhlmann, P. K., Cornelison, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+satellite+cell+proliferation+and+association:+new+insights+from+myofiber+time-lapse+imaging.">Muscle satellite cell proliferation and association: new insights from myofiber time-lapse imaging.</a> Skeletal Muscle. 2 (1), 1-7 (2011).</li><li>Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+muscle+stem+cells+by+fluorescence+activated+cell+sorting+cytometry.">Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 798, 53-64 (2012).</li><li>Engler, A. D., Griffin, M. A., Sen, S., Bonnemann, C. G., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotubes+differentiate+optimally+on+substrates+with+tissue-like+stiffness:+pathological+implications+for+soft+or+stiff+microenvironments.">Myotubes differentiate optimally on substrates with tissue-like stiffness: pathological implications for soft or stiff microenvironments.</a> J. Cell. Biol. 166 (4), 877-887 (2004).</li><li>Boonen, K. J., Post, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+muscle+stem+cell+niche:+regulation+of+satellite+cells+during+regeneration.">The muscle stem cell niche: regulation of satellite cells during regeneration.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 14 (4), 419-431 (2008).</li><li>Wozniak, A. C., Anderson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-fiber+isolation+and+maintenance+of+satellite+cell+quiescence.">Single-fiber isolation and maintenance of satellite cell quiescence.</a> Biochem. Cell Biol. 83 (5), 674-676 (2005).</li><li>Verma, M., Asukura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Single+Muscle+Fiber+Isolation+from+Alcohol-Fixed+Adult+Muscle+following+&#946;-Galactosidase+Staining+for+Satellite+Cell+Detection.">Efficient Single Muscle Fiber Isolation from Alcohol-Fixed Adult Muscle following &#946;-Galactosidase Staining for Satellite Cell Detection.</a> J. Histochem. Cytochem. 59 (1), 60-67 (2001).</li><li>Wosniak, A. C., Pilipowics, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-Met+expression+and+mechanical+activation+of+satellite+cells+on+cultured+muscle+fibers.">C-Met expression and mechanical activation of satellite cells on cultured muscle fibers.</a> J. Histochem. Cytochem. 51 (11), 1437-1445 (2003).</li><li>Huard, J., Feero, W. G., Watkin, S. C., Hoffman, E. P., Rosenblatt, J. D., Glorioso, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basal+lamina+is+a+physical+barrier+to+herpes+simplex+virus-mediated+gene+delivery+to+mature+muscle+fibers.">The basal lamina is a physical barrier to herpes simplex virus-mediated gene delivery to mature muscle fibers.</a> J. Virol. 70 (11), 8117-8123 (1996).</li><li>Feero, W. G., Rosenblatt, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+gene+delivery+to+skeletal+muscle:+insights+on+maturation-dependent+loss+of+fiber+infectivity+for+adenovirus+and+herpes+simplex+type+1+viral+vectors.">Viral gene delivery to skeletal muscle: insights on maturation-dependent loss of fiber infectivity for adenovirus and herpes simplex type 1 viral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 8 (4), 371-380 (1997).</li><li>Kuang, S., Kuroda, K., grand, F. L. e., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+self-renewal+and+commitment+of+satellite+stem+cells+in+muscle.">Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle.</a> Cell. 129 (5), 999-1010 (2007).</li><li>Siegel, A. L., Atchison, K., Fisher, K. E., Davis, G. E., Cornelison, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+timelapse+analysis+of+muscle+satellite+cell+motility.">3D timelapse analysis of muscle satellite cell motility.</a> Stem Cells. 27 (10), 2527-2538 (2009).</li><li>Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax7+is+required+for+the+specification+of+myogenic+satellite+cells.">Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells.</a> Cell. 102 (6), 777-786 (2000).</li><li>Zammit, P., Golding, J. P., Nagata, Y., Hudon, V., Partridge, T. A., Beauchamp, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+satellite+cells+adopt+divergent+fates:+a+mechanism+for+self-renewal.">Muscle satellite cells adopt divergent fates: a mechanism for self-renewal.</a> J. Cell Biol. 166 (3), 347-357 (2004).</li></ol>

Hiçbir rakip çıkarlar.

Bozulmamış kaslardan tek myofibers ve izolasyonu ve kültürü kas rejenerasyon işlemi incelemek için bir in vitro model mükemmel içerir. Bu sistemin benzersiz bir özelliği bazal lamina altında fizyolojik ortamda uydu hücrelerin korunmasıdır. En önemlisi, teknik sükunet ve aktif devletler hem de kas kök hücre davranışlarını araştırmak için kullanılabilir. Son 20 yılda, myofiber kültür sistemi içsel ve dışsal belirleyicileri bakımından, uydu hücre popülasyonu biyolojisi kavrayış sağladı. Kültür bireysel myofibers tarafından, myofiber, kas türü veya rejeneratif potansiyeli açısından uydu hücre heterojenitesini 15 ele alınmıştır. Uydu hücre göçü desen 16 kazanıyor bilgiler için izin tek kültürlü liflerin canlı görüntüleme kullanarak iyileştirme çalışmaları. Nicel veri toplama birMümkün LSO. Zaman alıcı olsa da, belirli olaylar (kök hücreler asimetrik bölünme, proliferasyon ve farklılaşma oranı, vb) dağılımı ve oluşumu hakkında önemli bilgiler sağlar. FACS ya da başka yollarla uydu hücre nüfusunun saf izole bir moleküler seviyede protein ya da gen ekspresyonu değişiklikleri tespit ederek daha iyi bir platform bulunmasına karşın birlikte daha önce tarif uygulamalarda, elyaflar tek bir protein ya da RNA ekstraksiyonu, aynı zamanda mümkün olmaktadır. Bizim tecrübelerimize göre, başarılı elyaf izolasyon için en kritik adımı izolasyonu (2,5 2,9 protokol metninde adımlar) &quot;tendon tendon&quot; dir. Bu kas sindirim sonra, lifler çok az veya hiç hasar dolayısıyla aşağıdaki adımları kendi performansı artan EDL serbest olduğunu garanti eder.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reaktif / Malzeme </td></tr><tr><td> Kollajenaz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C0130-1g </td><td> Optimal sonuçlar için taze her zaman hazırlayın. Seyreltilmemiş kollajenaz Ek alikotları -20 ° C&#39;de saklanabilir </td></tr><tr><td> DMEM Yüksek Glukoz + NaPyr </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td> Pen / Strep eklenmesi hava kontaminasyon en aza indirmek için gerekli olan </td></tr><tr><td> Karakterize Fetal Bovine Serum </td><td> Hyclone </td><td> SH30396.03 </td><td> Lot # KUJ35152 </td></tr><tr><td> At Serumu </td><td> Hyclone </td><td> SH300.74.03 </td><td> Lot # AVJ82494 </td></tr><tr><td> Tavuk embriyo Özü </td><td> Doğru Kimyasal </td><td> CE-650-T, Toplu B7035010 </td><td> Donma-çözülme döngüleri kaçının. </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD </td><td></td><td> -20 ° C&#39;de saklayın alikotları Donma-çözülme döngüleri kaçının. 4 ° C&#39;de seyreltilmiş alikotları Mağaza </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ekipman </td></tr><tr><td> Cohann-Vannas Bahar Makas Bıçakları Düz-Sharp 6mm </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 15000-02 </td><td></td></tr><tr><td> Ekstra İnce Iris Makas-10.5cm </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Moria-Iris Forseps Eğimli </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11373-12 </td><td></td></tr><tr><td> Pasteur Pipetler </td><td> VWR </td><td> 14672-380 </td><td> 14672-200 </td></tr><tr><td> Elmas Kalem </td><td> VWR </td><td> 52865-005 </td><td></td></tr><tr><td> 60 * 15mm Petri Dish </td><td> VWR </td><td> 25384-092 </td><td></td></tr><tr><td> Acrodisc 0.22 um bir filtreden </td&gt; <td> VWR </td><td> CA28-145-477 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop StemiV6 Diseksiyon </td><td> Zeiss </td><td></td><td> Ek bir ışık kaynağı daha iyi bir odaklama görünüm için gerekli olabilir </td></tr></tbody></table>

isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle

Erişkin kas rejenerasyon uydu hücreler denir ikamet kök hücreleri tarafından yapılır. Uydu hücreler bazal lamina ve her bir myofiber bir sarcolemma arasındaki konum ile tanımlanır. Onların davranışları Güncel bilgi yoğun tek myofiber izolasyon protokolü kullanımına dayanır. 1985 yılında, Bischoff myofiber ve kök hücreleri arasındaki fiziksel ilişki 1 korunduğu vitro sistemde oluşturmak amacı ile erişkin sıçanların Fleksör digitorum Brevis (FDB) gelen tek canlı lifleri ayırmak için bir protokol nitelendirdi. 1995 yılında Bischoff protokol şekilde myofibers tek başına aldı ve yerine yerçekimi sedimentasyon 2, 3 ile izole olma kollajenaz sindirim sonra ayrı ayrı ele alınmıştır Rosenblattmodified. Rosenblatt veya Bischoff protokolü yana farklı kasları, yaş veya koşulları 3-6 adapte edilmiştir. Tek myofiber izolasyon tekniği vazgeçilmez olduğunukendine has avantajları nedeniyle aracı. İlk olarak, tek bir myofiber protokol, uydu hücreler bazal laminanın altında muhafaza edilir. Böyle Floresans Aktif Hücre Ayırma gibi diğer tekniklerin kimyasal ve mekanik doku disosiyasyon 7 ihtiyaç olarak bu protokol benzersiz bir özelliktir. Myofiber kültür sisteminin in vivo çalışmalar için yerini alamaz rağmen kas kök hücrelerinin ilgili biyolojik özellikleri ele mükemmel bir platform sunuyor. Tek myofibers kaplama standart koşullar altında ya da yüzer koşullar altında kültüre edilebilir. Yüzer myofibers uydu hücreleri myofiber ortam dışında hemen hemen hiçbir etkisi tabi tutulur. Yüzey sertliği ve kaplama kasları 8, 9 yeniden uydu hücreler &#39;yeteneğini etkilediği gösterilmiştir yüzden bu faktörlerin her birinin kontrol edememek bağımsız veriyor niş-bağımlı ve bağımsız yanıtları arasındaki ayrım. Serum Farklı konsantrasyonlardaAyrıca sakinleştikten gelen aktivasyon geçiş üzerinde bir etkiye sahip olduğu gösterilmiştir. Ilişkili uydu hücrelerin sükunet durumunu korumak için, lifler 1-3 düşük serum ortamda tutulmalıdır. Sakinleştikten devletin ilgili genler okuyan bu özellikle yararlıdır. Serum zengin bir ortam, uydu hücreler hızla etkinleştirmek, böylece 1-3 vivo rejeneratif süreç içinde taklit, göç ve farklılığı, çoğalırlar. Virüs teslimat gen ektopik ifade;; oligonükleotid temelli gen knock-down veya canlı görüntüleme sistemi, kimyasal inhibitör testi gibi testler çeşitli gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu video makale şu anda erişkin farelerde (6-8 haftalık) ve ekstansör digitorum longus (EDL) kas tek myofibers yalıtmak için laboratuarda kullanılan protokol açıklar.

Burada yetişkin farelerin EDL kasının gelen tek myofibers arasında izolasyonu nitelendirdi. Başarılı myofibers gibi kollajenaz aktivitesi veya kas koşulları ya da yaş gibi birçok faktöre bağlıdır verim. En önemlisi, tendon gelen EDL kasının uzun, sağlam myofibers tendon sonuçlarına kas izolasyonu. Şekil 1 izolasyon &quot;tendon tendon&quot; adım grafiksel bir adım gösterir. Kası tamamen sindirilir sonra, myofibers kas hafif basınç uygulayarak serbest bırakılır. Şekil 2A ilk yıkamadan sonra myofiber yalıtım deneyi temsilcisi resmini gösterir. Bu noktada kültür uzun ve parlayan tübüler yapılar olarak görünürler tek myofibers demetleri bir karışımı içeren, hiper sindirim sürecinden karanlık ve kısa ve enkaz vardır myofibers daralmıştır. En az üç ardışık yıkama sonunda, sadece tek bir canlı myofibers di kalmalıdırKültür ya da alt analiz için sh (Şekil 2B). Şekil 2C, bir hiper daralan lif (C &#39;) ile karşılaştırıldığında uzun, canlı bir lif göstermektedir. Izolasyon zamanda, uydu hücreler myofiber yüzeyi (Şekil 3A) üzerinde çok küçük çıkıntılar olarak görünür. Serum zengin ortamda muhafaza ederseniz, uydu hücreleri aktive çoğalırlar, göç ve sonunda myotubes (B) kaynaşmasına. Kültüründe 15 gün sonra tüm myotubes erişkin kas yenilenme gelişim sırasında bazı noktada miyojenik belirleyici Myf5 ifade ettiğini hücreleri tarafından yapılır düşündüren Myf5 muhabiri YFP (C) ifade eder. Tüm uydu hücreler eşleştirilmiş kutusu transkripsiyon faktörü Pax7 17 ifade. Raportör fare hat Pax7Cre-TdTomato TdTomato floresan sinyali (Şekil 3B ve E) &#39;nın ekspresyonu yoluyla uydu hücreleri izlemek için kullanılabilir. Şekil 4, bir temsilci İmmünoblotçift ​​Pax7 + / myod uydu hücre nofluorescence. Klasik çift Pax7 + / myod + uydu hücreleri ya aşağı myod düzenleyen ve Pax7 ifadesi 18 sürdürerek myod ifade veya sakinleştikten dönüş koruyarak aşağı Pax7 düzenleyerek farklılaşma programını tamamlamak proliferatif ilişkide kas ataları olarak kabul edilir <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. Fare bacak EDL kas izolasyonu. 8 haftalık erişkin fareden bir. Bacak. Oklar distal (diz) tendon ve proksimal (ayak) tendon gösterir. B. Tibialis anterior (TA) kas ve ekstansör digitorum longus (EDL) kas. C Anatomik pozisyonu. Proksimal tendon aracılığıyla EDL tutarak, kas distal tendon maruz diz doğru çekilir. D. Distal tendonkesilmiş ve EDL serbest bırakılır. <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig2.jpg" alt="Şekil 2,"/> Şekil 2. Tek bir myofiber izolasyon deney Örnek sonuçları. İlk yıkama adımında bir myofiber yalıtım deneyi bir. Aydınlık alan resim. Kırmızı ok canlı myofibers gösterir, beyaz ok hiper sözleşmeli myofibers gösterir ve sarı ok hücreleri myofiber veya ECM enkaz gösterir. B. DMEM ardışık yıkamadan sonra, sadece canlı myofibers kalır. C ve C &#39;. Görüntü uzun bir dokunulmamış canlı myofiber (C) temsil etmektedir ve bir kısa hiper myofiber (C &#39;) küçülmüştür. Bar 10 mikron. Resimleri AxioCam İK ile donatılmış bir Zeiss Axio Gözlemci Z1 mikroskobu ile alınmıştır. <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Figür<html> e 3. Tek bir myofiber kültür deney Örnek sonuçları. Sağ izolasyon sonrasında ilişkili uydu hücre (ok) (Zaman 0). B ile tek bir canlı myofiber A. Aydınlık alan resim. Tek myofibers Matrigel üzerine kaplama ve 15 gün boyunca serum zengin ortamda kültüre edildi. Beyaz ok tek hücreleri (sarı ok) C ile karşılaştırıldığında farklılık myotubes gösterir. Bir Myf5Cre gelen Tek myofibers; RosaYFP fare B olarak ekildi. Ok Myf5 türetilmiş myotubes gösterir. D ve E. Pax7Cre gelen Tek myofibers; TdTomato hemen sonra izole ve düzeltildi. Oklar Pax7 pozitif sakin uydu hücre (E, kırmızı) gösterir. Çekirdekler DAPI (D) ile zıt edildi. Bar: 50 mikron. Resimleri AxioCam İK ile donatılmış bir Zeiss Axio Gözlemci Z1 mikroskobu ile alınmıştır. yolları &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig4.jpg" alt="Şekil 4,"/> Şekil 4&#39;e. Myofibers uydu hücrelerin immünofloresan boyama örneği. Tek myofibers izole ve değişken koşullarda 72 saat boyunca kültüre edildi. Myofibers üzerindeki Uydu hücreleri uydu hücre spesifik bir işaretleyici Pax7 (B, kırmızı) ve miyojenik düzenleyici faktör myod (C, yeşil) için boyandı. Çekirdekler DAPI (A) ile zıt edildi. Barlar: 50 mikron. Resimleri AxioCam İK ile donatılmış bir Zeiss Axio Gözlemci Z1 mikroskobu ile alınmıştır. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Muscle Diseksiyon (5 dk her kas) </td><td><ul><li> Tendon izolasyon Tendon </li><li> Keskin aletlerin </li><li> Minimal kas hasarı </li></ul></td></tr><tr><td> Muscle Sindirim (30-45 dk) </td><td><ul><li> Sıcaklıkduyarlı </li><li> Overdigestion kaçının </li></ul></td></tr><tr><td> Fiber izolasyon </td><td><ul><li> Liflerin manipülasyon üzerinde kaçının </li><li> Birçok yıkar ile enkaz eleyin </li></ul></td></tr><tr><td> Fiber Kültür (Yukarı 3-4 hafta) </td><td><ul><li> Biçim: Herhangi </li><li> Kaplama: at serumu, Matrigel </li><li> Orta: bazal veya serum yüksek </li></ul></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Myofiber izolasyon protokolü genel bakış. Myofiber izolasyon protokolü 4 ana adımdan oluşuyor. Her adım için, yaklaşık zamanı ve önemli kritik noktalar tartışıldı. Her adımı ayrıntılı bir tartışma için, Protokol metni için bkz.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle at JoVE.com

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Myofibers izolasyonu ve kültürü altın standarttır<em&gt; In vitro</emSükunet, aktivasyonu ve farklılaşması yoluyla uydu hücrelerin geçişi çalışmaya&gt; sistemi. Önemlisi, tek myofiber kültür sistemi kas kök hücre niş bir unsurudur myofiber / kök hücre derneği, korur.

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

isolation-culture-individual-myofibers-their-satellite-cells-from

Research

JoVE Journal

Biology

62.1K Görüntüleme.  Ottawa Hospital Research Institute. Myofibers izolasyonu ve kültürü altın standarttır In vitro sistemi. Önemlisi, tek myofiber kültür sistemi kas kök hücre niş bir unsurudur myofiber / kök hücre derneği, korur.

Video: Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Yetişkin ve Embriyonik İskelet, Kas Microexplant Kültür ve İskelet Kası Kök Hücre İzolasyonu

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Biyoloji

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

İskelet Kası Mitokondrial İzolasyon

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

İnsan Cilt Yetişkin Epitel Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

Disosiye Müstahzarlar gelen Embriyonik ve larval Zebra balığı İskelet myofibers Analizi

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

Kas Uydu Hücreleri İzolasyon, Kültür ve Transplantasyon

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

İnsan İskelet Kası Kan-damar-türevli Multipotent Öncüleri İzolasyonu

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Yetişkin Fare insizör Diş Epitel Kök Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Elektroporasyon, Myofibers İzolasyon ve Görüntüleme

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

İskelet Kası Fibroblastlarından Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...