Bu DNA tarama kütüphanesinin hazırlanması için MGH DNA Core John Darga ederiz. Perkin Elmer Christopher Chigas bizim VVallac 1420 luminometrede için çok değerli bir destek sağladı. Steven Ciacco ve Agilent Martin Thomae Bravo robot için destek sağladı. Biz cömertçe dual-kızdırma lusiferaz tahlil protokolü sağlamak için NIH Ron Johnson ve Steve Titus teşekkür ederim.

Deneysel bir bakış için Şekil 1&#39;e bakınız. 1.. Alpha-Sinükleinin Destekleyici İçeren Reporter Plazmidleri hazırlayın Alfa-sinüklein geni (Şekil 2) Düzenleyici elemanlar intron 2 3 boyunca yukan NACP (amiloid peptidinin non-A beta bileşen) dinükleotid sekansı tekrar 1,2 yaklaşık 10 kb, kapsar. Biz, bu bölgenin bir kısmını içerir Bizim muhabir yapı. Biz büyüme için gerekli olan 2 özel prosedürler intron içeren plazmidler, aşağıda özetlenen bulundu. Lusiferaz plazmidleri pGL4.10 ve pGL4.75 (Şekil 3), Promega&#39;dan ticari olarak mevcuttur ve geleneksel moleküler biyoloji protokoller kullanılarak çoğaltılabilir. <ol><li> Tablo 1 &#39;de tarif ve Tablo 2&#39;deki primerler kullanılarak, ayrı PCR reaksiyonlarında alfa-sinüklein promoterin 2 bileşeni yükseltin. </li><li> Verify PCR TE (Tris-EDTA), 50 ul sulandırarak Qiaquick PCR Saflaştırma kiti (Qiagen) kullanılarak agaroz jel ve clean ürünleri. Gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C&#39;de taşınan 0.9 kb fragmanı saklayın. </li><li> SacI ve XhoI ile tüm 3.4 kb PCR fragmanı ses, hem de pGL4.10 5 ug Digest. Buzağı Bağırsağı Alkalin Fosfataz (Roche) ile vektör tedavi ve jel PureLink Quick Jel Özümleme kiti (Invitrogen) kullanılarak saflaştırılması. </li><li> T4 DNA ligaz (NEB) kullanılarak fragmanı ve vektör Arter. 10 ul TE tampon maddesi içinde yıkanarak PureLink Micro PCR kiti (Invitrogen) kullanılarak, reaksiyonun tamamlandığını temizleyin. </li><li> ElectroMAX Stbl4 yetkili hücreleri (Invitrogen) içinde 20 ul içine temizlenmiş, bağlama reaksiyonunun 2 ul Dönüşümü ve üreticinin talimatlarına göre elektroporasyona. 90 dakika boyunca 225 rpm&#39;de 30 ° C kuluçka makinesi içinde çalkalayın. 100 mg / ml ampisilin ihtiva eden LB plakaları üzerine yayıldı 2 birimleri ve 2 gün boyunca 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Bir kürdan kullanarak, TB 2 ml (Müthiş Broth) içine aşılama için 4-6 küçük koloniler seçmek. Bir 30 ° C çalkalama O / N, bu miniprep kültürleri büyümek </li><li> PureLink HiPure Plasmid Miniprep kiti (Invitrogen) kullanılarak her bir miniprep kültürün 1.5 ml plazmid DNA arındırın. </li><li> BamHI ile miniprepleri sindirimi ve bir agaroz jeli üzerinde electrophorese. Doğru bir klon 2.8 kb ve 4.9 kb&#39;lik fragmanları üretmek gerekir. </li><li> Taze LB (Luria Et suyu) plakası üzerinde doğru klonundan geri kalan miniprep kültür Restreak ve 2 gün boyunca 30 ° C&#39;de büyür. </li><li> Küçük bir koloni seçin ve 1.5 ml TB starter kültür aşılamak. 30 ° C&#39;de O / N sallamak Starter kültür doygunluk büyümesine izin vermeyin. </li><li> Önceden ısıtılmış 150 ml TB içine tüm başlatıcı kültür seyreltilir ve 2 gün boyunca 30 ° C&#39;de çalkalanır. Bir sonraki adıma geçmeden önce, klon replicati sırasında mutasyona olmadığını teyit etmek için ek bir miniprepi ve sindirim için bu kültürün 1.5 ml kullanın<html> üzerinde. </li><li> PureLink HiPure Plasmid Maksiprep kiti (Invitrogen) kullanılarak geri kalan kültürden plazmid DNA arındırın. Bu ara plazmidin beklenen sonuçlar, kültür, 150 ml başına 50-150 ug bulunmaktadır. </li><li> Aşama 1.2 &#39;de dondurulmuş 0.9 kb fragmanı çözülme. 1,3-1,12 Kpnl ve Sacl ile sindirim yerine, ara plazmid içine 0.9 kb fragmanının klonlanması için adımları tekrarlayın. Ligatı, seçin, dönüşümü, ve yukarıdaki gibi maksi için büyür. BamHI ile sindirimi 5.8 kb ve 2.8 kb fragmanlarının verim gerekir. Bu ekran için kullanılacak olan bir plazmiddir. </li></ol> 2. Tarama için 293T Hücreler, Muhabir Plazmidleri ve Kütüphane DNA hazırlayın 293T hücreleri ilk olarak 96 oyuklu plakalara tohumlandı ve sonraki gün transfekte edilir. Reporter plazmid ve kütüphane DNA&#39;lar, 96 oyuklu plakalar içinde seyreltilir. Biz Massachusetts General Hospital (en DNA Çekirdek transfeksiyon dereceli kütüphane DNA plakaları elde= &quot;_blank&quot; olsun&gt; dnacore.mgh.harvard.edu). Bu protokol, 293T hücreleri 2 aynı plakalar (Şekil 1) içine tek bir kütüphane plaka transfects hücre böylece 2 plakaları taranabilir her kütüphane levha için ekildi olmalıdır. Not: Bu lusiferaz deneyleri müdahale ve sırasıyla transfeksiyonla sırasında toksisite arttıkça, kırmızı ya da antibiyotikler fenol olmadan medya hücreleri büyümek. <ol><li> Her kitaplık levha% 14 FBS ihtiva eden DMEM içinde 1.5 x 10 5 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyona kadar, tekrar süspansiyon tripsinize edilmiş 293T hücrelerinin taranması için. Steril bir rezervuar (Axygen) dökün. </li><li> Robot güverte rezervuarı, 2, berrak tabanlı, 96 oyuklu plakaları (Corning), ve filtre pipet uçları bir kutu (Agilent) yerleştirin. Oyuk başına 1.5 x 10 4 hücre yoğunluğunda için, her ikisi de plakaların her kuyuya 100 ul hücre dağıtın. </li><li> Eşit sağlamak için düşük rampa hızları kullanılarak, 2 dakika boyunca 50 xg&#39;de hücre plakaları santrifüjboyunca her bir hücre yoğunluğu. 37 ° C&#39;de inkübe edilir ve% 10 CO2 O / N. </li><li> Serumsuz ortam içinde 5 ng / ul ateş böceği ve Renilla raportör plasmidleri seyreltin. Bir 15 ml konik bir tüp içinde (hacimce) firefly Renilla plazmaya 05:03 oranında bir dilüsyonları birleştirin. </li><li> Her kuyuya, kütüphane plaka başına 17 ul artı 2-10 ul fazlalık dağıtma, 96 oyuklu plakanın her oyuğuna pipetle birleşik plasmidler. </li><li> Yukarıdaki gibi transfeksiyon dereceli DNA kütüphanesi plakaları elde edilir ve endotoksin içermeyen su ile 13.3 ng / ul seyreltin. Oyuk başına asgari hacmi 28 ul olmalıdır. </li></ol> 3.. Transfeksiyonlar gerçekleştirin Ekranın 2. günde, raportör plasmidleri ve kütüphane DNA&#39;lar 293T hücrelerine transfekte edilir. <ol><li> Her bir plaka için kütüphane, bir polistiren bir tüp içinde 4.3 ml serum barındırmayan ortam (1:40 seyreltme) ile RT Optifect (Invitrogen) 107.5 ul karıştırın. 5 dakika oda sıcaklığında ve inküben, 96 oyuklu, polistiren V-tabanlı bir plakanın (Greiner) her oyuğuna (kütüphane plaka başına) 44 ul dağıtmak. </li><li> Seyreltilmiş Optifect tabak, raportör plasmidleri (Aşama 2.5), kütüphane DNA&#39;lar (Aşama 2.6) ve robot güverte pipet uçları bir kutu yerleştirin. </li><li> Her aspirasyon arasında 5 ul hava boşluğu ekleme muhabiri plazmidler, seyreltilmiş Optifect 43 ul, ve kütüphane DNA 26 ul, aspire 17 ul. Kütüphane DNA çapraz bulaşmayı önlemek için son aspire edilmelidir. Yeni bir polistiren V-altlı plaka içine ipuçları içeriğini dağıtın, kapak karıştırın ve lipid / DNA kompleksleri oluşturmak için izin vermek için 20 dakika boyunca bir kenara ayrılmıştır. Birden çok kütüphane plakaları transfecting ise pipet ipuçları ve kütüphane plakasını değiştirin ve tekrarlayın. </li><li> Optifect / DNA karışımı, plaka ortaya çıkarmak ve 293T hücrelerinde 2 plakaları ile robot güverte üzerine yerleştirin. Pipet ipuçları tek bir kutu, aspire Optifect 80 ul Kullanımı: DNA karışımı ve yavaş yavaş hücrelerin her levha üzerine 40 ul dağıtmak. Trans eğerbirden çok kütüphane plakaları edilmesini, tüm Optifect için tekrarlayın: DNA plakaları. Hücreleri kapsayacak. </li><li> 30 dakika boyunca 1200 x g&#39;de hücre plakaları santrifüjleyin. Kapak ve inkübatör dönmek. </li><li> 4-6 saat boyunca hücrelerin inkübe edin. Bu kuluçka sırasında, her bir plaka için transfekte edilmiş kitaplık,% 10 FBS ve 10 ug / ml siprofloksasin (Cellgro) içeren 12 ml DMEM karıştırılmasıyla taze ortam hazırlar. Steril bir rezervuar içine taze medya dökün. </li><li> Robot ipuçları 2 kutu yerleştirin, hücrelerin tek bir tabak, robot güverteye taze medya ve atık haznesi içeren rezervuar. Aspire 100 hücrelerden ortam ul ve kısmen de% 70 etanol ile doldurulmuş atık rezervuar içine dağıtın. Taze ipuçları, taze medya aspire 100 ul kullanarak ve yavaş yavaş hücreleri üzerine dağıtmak. Bütün hücre plakaları için tekrarlayın. </li><li> 48 saat boyunca inkübatör plakaları dönün. </li></ol> 4.. Dual-Lusiferaz Deneyleri gerçekleştirme Ekranın 4. günde,ateşböceği ve Renilla lusiferaz tahlilleri gerçekleştirilir. Not:. Tablo 3 &#39;de tarif edildiği gibi, çift-lusiferaz deney Firefly ve Renilla lusiferazların böylece hücreler önce lusiferaz aktivitesinin ölçülmesi için lize olmalıdır salgılanmış olmamak üzere, 2 deney tampon maddeleri, ateş böceği 3X deney tamponu ve 3X Renilla deney tamponu ardışık olarak ilave edilmesini gerektirir . Firefly deney tamponu hücreleri lize ve ateş böceği lusiferaz alt-tabaka içerir; Renilla deney tamponu ateşböceği sinyali söndürür ve Renilla lusiferaz alt-tabaka üretmektedir. <ol><li> Tablo 3 &#39;de tarif edildiği gibi her bir kitaplık plaka için, stok çözeltilerinden 3X firefly deney tamponu içinde 8 ml hazırlamak ve bir 96 oyuklu V-tabanlı bir plakanın her oyuğuna 82 ul dağıtmak. </li><li> Her bir kütüphane için plaka, aynı zamanda 3X Renilla deney tamponu içinde 12 ml hazırlamak ve bir 96 oyuklu V-tabanlı bir plakanın her oyuğuna 122 ul dağıtmak. Her iki kenara koyunateşböceği ve Renilla tahlil tamponlar. </li><li> Robot Güvertede (aynı kütüphane plakadan nakledilen) pipetle ipuçları bir kutu, bir atık rezervuar, ve hücrelerin 2 tabak yerleştirin. </li><li> Aspire 60 Her levhadan ortam ul ve kısmen de% 70 etanol ile doldurulmuş atık haznesinde atın. Kenara kapak plakaları ve ayarlayın. Birden çok kütüphane plakaları transfecting ise, plakaların tüm setleri için tekrarlayın. </li><li> 2 pipet ipuçları kutuları, 3X ateşböceği tahlil tampon plaka, ve robot güvertede hücre plakaları bir dizi yerleştirin. </li><li> Aspire 40 3X firefly ul deney tamponu ve iyice karıştırma, hücrelerin birinci plaka ekleyin. Yeni pipetlemeyin ipuçları geçiş, ikinci hücre plaka için tekrarlayın. Lizizi tamamlamak için 10 dakika boyunca oda sıcaklığında hücreler yerleştirin. Birden çok kütüphane plakaları transfecting varsa, ipuçları ve hücre plakaların kutuları değiştirin ve tekrarlayın. </li><li> Her hücre 1 saniye kayıt bir lüminometre üzerinde plaka, başına iyi her kuyudan rekor lüminesans. Robot plakaları geri döngüverte. </li><li> 2 pipet uçları kasası, 3X Renilla deney tamponu plaka ve robot güverte hücre plakaları bir dizi yerleştirin. </li><li> Aspire 60 3X Renilla ul deney tamponu ve iyice karıştırma, hücrelerin birinci plaka ekleyin. Pipet ipuçları yeni bir kutuya geçiş, ikinci hücre plaka için tekrarlayın. Birden çok kütüphane plakaları transfekte ise, hücre plakalar her kümeleri için tekrarlayın. </li><li> Yukarıdaki gibi 1 saniye Her çukurun kayıt bir lüminometre tüm plakaları Tutanak lüminesans. Plakaları atın. </li></ol> 5. Veri Analizi <ol><li> Ateşböceği hesaplayın: Renilla lüminesans oranını (&quot;F: R oranı&quot;), Renilla sinyalin sayımlarının böceği sinyalinin sayımları bölünerek her bir oyuk için. </li><li> F bölerek indüksiyon değerini hesaplayın: iyi ortalama F tarafından her R oranı: plakasının R oranı, kuyuların en yüksek ve en düşük% 25 hariç. </li><li> Çoğaltır genelinde indüksiyon değerleri ortalamasınıTek bir transfekte edilmiş kitaplık levha. Üç kat daha alfa-sinüklein daha uyaran veya bastıran genleri Bu ekranda &quot;hit&quot; olarak kabul edilir ve daha fazla doğrulama ve ikincil ekranları tabidir. </li></ol>

<ol>
	<li>Chiba-Falek, O., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+allelic+variation+at+the+NACP-Rep1+repeat+upstream+of+the+&#945;-synuclein+gene+(SNCA)+on+transcription+in+a+cell+culture+luciferase+reporter+system.">Effect of allelic variation at the NACP-Rep1 repeat upstream of the &#945;-synuclein gene (SNCA) on transcription in a cell culture luciferase reporter system.</a> Hum. Mol. Genet. 10 (26), 3101-3109 (2001).</li><li>Chiba-Falek, O., Touchman, J. W., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+intra-allelic+variation+at+NACP-Rep1+in+the+alpha-synuclein+gene.">Functional analysis of intra-allelic variation at NACP-Rep1 in the alpha-synuclein gene.</a> 113 (5), 426-431 (2003).</li><li>Scherzer, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA+transcription+factors+directly+regulate+the+Parkinson's+disease-linked+gene+&#945;-synuclein.">GATA transcription factors directly regulate the Parkinson's disease-linked gene &#945;-synuclein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 10907-10912 (2008).</li><li>Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Synuclein+in+Lewy+Bodies.">&#945;-Synuclein in Lewy Bodies.</a> Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).</li><li>Pankratz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meta-analysis+of+Parkinson's+disease:+identification+of+a+novel+locus,+RIT2.">Meta-analysis of Parkinson's disease: identification of a novel locus, RIT2.</a> Ann. Neurol. 71 (3), 370-384 (2012).</li><li>Satake, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+study+identifies+common+variants+at+four+loci+as+genetic+risk+factors+for+Parkinson's+disease.">Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease.</a> Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).</li><li>Sim&#243;n-S&#225;nchez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+study+reveals+genetic+risk+underlying+Parkinson's+disease.">Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease.</a> Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).</li><li>Polymeropoulos, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+in+the+alpha-synuclein+gene+identified+in+families+with+Parkinson's+disease.">Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease.</a> Science. 276 (5321), 2045-2047 (1997).</li><li>Ib&#225;&#241;ez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causal+relationship+between+a-synuclein+gene+duplication+and+familial+Parkinson's+disease.">Causal relationship between a-synuclein gene duplication and familial Parkinson's disease.</a> Lancet. 364 (9440), 1169-1171 (2004).</li><li>Chartier-Harlin, M. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a-Synuclein+locus+duplication+as+a+cause+of+familial+Parkinson's+disease.">a-Synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease.</a> Lancet. 364 (9440), 1167-1169 (2004).</li><li>Singleton, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a-Synuclein+locus+triplication+causes+Parkinson's+disease.">a-Synuclein locus triplication causes Parkinson's disease.</a> Science. 302 (5646), 841 (2003).</li><li>Ahn, T. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a-Synuclein+gene+duplication+is+present+in+sporadic+Parkinson+disease.">a-Synuclein gene duplication is present in sporadic Parkinson disease.</a> Neurology. 70 (1), 43-49 (2008).</li><li>Boyce, F. M., Bucher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus-mediated+gene+transfer+into+mammalian+cells.">Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells.</a> Proc. Nat. Acad. USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).</li><li>Montigny, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+influencing+high-efficiency+transfection+of+bacterial+artificial+chromosomes+into+cultured+mammalian+cells.">Parameters influencing high-efficiency transfection of bacterial artificial chromosomes into cultured mammalian cells.</a> Biotechniques. 35, 796-807 (2003).</li><li>Gorman, C. M., Moffat, L. F., Howard, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+genomes+which+express+chloramphenicol+acetyltransferase+in+mammalian+cells.">Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells.</a> Mol. Cell. Biol. 2 (9), 1044-1051 (1982).</li><li>Li, J. J., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+ORC6,+a+Component+of+the+Yeast+Origin+Recognition+Complex+by+a+One-Hybrid+System.">Isolation of ORC6, a Component of the Yeast Origin Recognition Complex by a One-Hybrid System.</a> Science. 262, 1870-1874 (1993).</li><li>Dejardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Proteins+Associated+with+Specific+Genomic+Loci.">Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci.</a> Cell. 136, 175-186 (2009).</li><li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+map+of+the+cis-regulatory+sequences+in+the+mouseGenome.">A map of the cis-regulatory sequences in the mouseGenome.</a> Nature. 488, 116-120 (2012).</li><li>Fan, F., Wood, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+assays+for+high-throughput+screening.">Bioluminescent assays for high-throughput screening.</a> Assay Drug Dev. Technol. 5 (1), 127-136 (2007).</li><li>Hampf, M., Gossen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+combined+Photinus+and+Renilla+luciferase+quantification+compatible+with+protein+assays.">A protocol for combined Photinus and Renilla luciferase quantification compatible with protein assays.</a> Anal. Biochem. 356 (1), 94-99 (2006).</li><li>Auld, D. S., Thorne, N., Maguire, W. F., Inglese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+PTC124+activity+in+cell-based+luciferase+assays+of+nonsense+codon+suppression.">Mechanism of PTC124 activity in cell-based luciferase assays of nonsense codon suppression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (9), 3585-3590 (2009).</li><li>Pearlberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screens+using+RNAi+and+cDNA+expression+as+surrogates+for+genetics+in+mammalian+tissue+culture+cells.">Screens using RNAi and cDNA expression as surrogates for genetics in mammalian tissue culture cells.</a> Cold Spring Harb.Symp. Quant. Biol. 70, 449-459 (2005).</li></ol>

Bu çalışma lisanslama BacMamreagents (ABD patent 5731182) elde gayrimaddi tarafından desteklenmiştir.

Alfa-sinüklein Lewy 4, bu hastalık için patognomonik olarak hücre içi dahil olanlar bir bileşeni olarak, Parkinson hastalığı (PD) olarak işaret edilmiştir. Çok sayıda genom-geniş dernek çalışmaları sporadik PH 5,6,7 riski ile alfa-sinüklin tek nükleotid polimorfizmleri bağlantılı var. Sporadik PH daha az yaygın olsa da, ailesel PD aynı zamanda çoğaltılması ve alfa-sinüklein mahalinin 9,10,11 arasında triplication olarak, alfa-sinüklin 8 mutasyon...

Temel genetik düzenleyici unsurları ve onlara hareket faktörleri belirlemek için yeteneği çok sayıda biyolojik süreçlerin keşif için esastır. Bununla birlikte, bu spesifik sinir hücresi popülasyonları gibi nadir hücre tiplerinde gen ekspresyonunu düzenleyen faktörlerin tanımlanması, zor olabilir. Burada, alfa-sinüklein (SNCA) &#39;nin yeni transkripsiyon düzenleyici belirlenmesi için bir protokol mevcut, Parkinson hastalığı ile ilişkili ve substantianigra dopaminerjik nöronların ifade edilen bir gen, orta beyin bölgesini pars compacta. Biz, 293T hücrelerinde alfa-sinüklein ifade yapısızlaştırmak bir yüksek verimli, çift-lusiferaz, in vitro raportör ekran kullanarak bunu. Alfa-sinüklein promoter birinci ateşböceği lusiferaz geni ihtiva eden bir raportör plazmid içine klonlanır. Yapısal olarak aktif bir promotörün kontrolü altında Renilla lusiferaz içeren bir plazmid, bir iç kontrol olarak hizmet vermektedir. These raportör yapılan, her biri de tek bir kütüphane bir plazmid ile transfekte edilir, öyle ki, bir DNA sentezleme kütüphanesinden plazmidleri ile mikroplakalarda 293T hücrelerine ko-transfekte edilir. 48 saat sonra, her bir muhabir için lusiferaz aktivitesi, bir çift ışıma analizi kullanılarak ardışık olarak ölçülür sonra. Plaka bazlı normale döndükten sonra (R oranı F) her bir Renilla lusiferaz aktivitesi: Her kitaplık genine karşılık olarak alfa-sinüklein nispi ekspresyon böceği oranı ile anlaşılmaktadır. Bu protokol, insan gücü minimum (1-2 kişi) ve minimum maliyet (mikro-deney başına yaklaşık 3 $ maliyeti reaktifi) kullanılarak, raportör gen transaktivasyonu için kapasiteleri için genleri, çok sayıda (~ haftada 2500) taranması için olanağı sağlar. Genetik manipülasyon dirençli kültüre edilmiş nöronlarda çalışma zordur nöronal genlerin transkripsiyonel düzenleyici (örneğin, alfa-sinüklein), bu doğrudan fonksiyonel deneyde yan yana karşılaştırılabilir. Biz dahil bizimprotokolünün geleneksel prosedürler (Tartışma) ile yetiştirilen bu bölgeyi içeren plazmidler kararsız olduğu bulundu beri klonlama ve alfa-sinüklein promotörünü içeren plazmidlerin büyümesi için ayrıntılı bir yöntem. Ayrıca, yüksek verimli deneyler için ticari olarak temin edilebilen çift-lusiferaz reaktifler için ucuz bir alternatifi bulunmaktadır. Bu protokol, kolayca ilgili diğer düzenleyici elemanları, ya da yüksek verimli, geçici nakiller gerektiren herhangi bir işlem hedeflemek için adapte edilebilir.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAQuick PCR Purification Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLink Quick Gel Extraction Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K2100-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLink PCR Micro Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K310250</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K2100-03</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K2100-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bravo Robot</td>
 <td>Agilent</td>
 <td>-</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Robot Pipet Tips with Filter</td>
 <td>Agilent</td>
 <td>19477-022</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Robot Pipet Tips without Filter</td>
 <td>Agilent</td>
 <td>19477-002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clear-bottomed 96-well Plates</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3610</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Reservoirs</td>
 <td>Axygen</td>
 <td>RES-SW96-HP-SI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polystyrene V-bottomed 96-well Plate</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>651101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polypropylene V-bottomed 96-well Plate</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>651201</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adhesive Plate Covers</td>
 <td>CryoStuff</td>
 <td>#FS100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phusion DNA Polymerase</td>
 <td>New England Biolabs</td>
 <td>M0530L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BAC 2002-D6</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>2002-D6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calf Intestine Alkaline Phosphatase</td>
 <td>Roche</td>
 <td>10713023001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>T4 DNA Ligase</td>
 <td>New England Biolabs</td>
 <td>M0202L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pGL4.10</td>
 <td>Promega</td>
 <td>E6651</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pGL4.74</td>
 <td>Promega</td>
 <td>E6931</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ElectroMAX Stbl4 Competent Cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>11635-018</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Subcloning Efficiency DH5&alpha; Competent Cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>18265-017</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM without Phenol Red</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>31053-028</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optifect</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>12579017</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ciprofloxacin</td>
 <td>CellGro</td>
 <td>61-277-RF</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris-Hydrochloride Powder</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>93287</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris-Base Powder </td>
 <td>Sigma</td>
 <td>93286</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Triton X-100 Pure Liquid</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP151-100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15508-013</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coenzyme A</td>
 <td>Nanolight</td>
 <td>309</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ATP</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A6419</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luciferin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>L2912</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>h-CTZ</td>
 <td>Nanolight</td>
 <td>301</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PTC124</td>
 <td>SelleckBiochemicals</td>
 <td>S6003</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

high-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay

Bu alfa-sinüklein, Parkinson hastalığı ile ilişkili bir genin transkripsiyonel düzenleyici belirlemek için hızlı ve ucuz bir yüksek verimli tarama protokol mevcut. 293T hücreleri, bir tek gen başına oyuk mikro biçimde, bir arada lusiferaz haberci plazmidleriyle, bir dizilmiş ORF sentezleme kütüphanesinden plazmid ile transfekte edilir. Ateşböceği lusiferaz aktivitesi, bir iç kontrol yapısı (Renilla lusiferazı yönlendiren bir hCMV promotörü) ekspresyon normalize alfa-sinüklein transkripsiyon, üzerine her bir kütüphane genin etkilerini belirlemek için 48 saat sonra test edilir. Bu protokol, 96 kuyulu formatta aseptik sıvı taşıma yapan bir biyo-güvenlik kabini içinde bulunan bir tezgah üstü robot tarafından kolaylaştırılır. Bizim otomatik transfeksiyon protokol yüksek verimli bir kitaplık üretimi veya lentiviral konjugat olarak eşsiz bir kütüphane plazmidlerin çok sayıda üç transfections gerektiren diğer fonksiyonel eleme protokollere kolayca uyarlanabiliryardımcı plazmidin ortak bir set ile nction. Ayrıca, ucuz ve geçerli bir alternatif sunmak PTC124&#39;ün, EDTA, ve önceki Renilla lusiferaz ölçümü ateş böceği lusiferaz aktivitesini bastırmak için pirofosfat kullanan ticari olarak temin edilebilen, çift lusiferaz reaktifler için. Bu yöntemler kullanılarak, 7670 insan genleri elenir ve alfa-sinüklein 68 regülatörleri belirlenmiştir. Bu protokol, diğer ilgi genleri hedef kolayca değiştirilebilir olduğunu.

Tipik Lusiferaz değerleri, K: R, oranlar ve tek bir yarım plaka için indüksiyon değerleri Şekil 4&#39;te gösterilmiştir iyi H2, bir 32-kat indükleyici olarak isabet not edin.. Aşırı toksisite (örneğin, iyi E3), ya da kötü transfekte edildi kuyuları neden olan genler, hem ateşböceği ve Renilla lusiferazlarm düşük değerler üretmek, ama ortalama bir indüksiyon değer olacaktır. PGL4 omurgası ile etkileşim yoluyla olabilir lusiferaz aktivitesi, non-spesifik ind...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay at JoVE.com

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Bu yüksek verimli robot transfections ve bir ev yapımı çift ışıma lusiferaz deneyi kullanılarak transkripsiyon düzenleyiciler belirlenmesi için hızlı ve ucuz bir tarama yöntemi sunulmaktadır. Bu protokol, hızlı bir şekilde binlerce gen için doğrudan yan yana fonksiyonel veriler üreten ve ilgi duyulan herhangi bir geni hedef kolayca değiştirilebilir olduğunu.

Bir ev yapımı Çift kızdırma Lusıferaz Testi kullanarak yüksek verim Fonksiyonel Taraması

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

high-throughput-functional-screening-using-homemade-dual-glow

Research

JoVE Journal

Biology

23.3K Görüntüleme.  Massachusetts General Hospital.  Bu yüksek verimli robot transfections ve bir ev yapımı çift ışıma lusiferaz deneyi kullanılarak transkripsiyon düzenleyiciler belirlenmesi için hızlı ve ucuz bir tarama yöntemi sunulmaktadır. Bu protokol, hızlı bir şekilde binlerce gen için doğrudan yan yana fonksiyonel veriler üreten ve ilgi duyulan herhangi bir geni hedef kolayca değiştirilebilir olduğunu. 

Video: High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Biyoloji

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Mantar Endoglucanase Faaliyet Yüksek Verimli Tarama Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

Lignocellulosic Malzemeler için Yüksek verim Saccharification Testi

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Yüksek throughput Kristalizasyon için bir robot kullanımı

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

Lusiferaz ifade eden rekombinant virüsler yüksek verimlilik Titrasyon

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

Zebra balığı Embriyolar kullanılarak Yüksek verim Yaklaşıyor A Manuel Küçük Molekül Ekran

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

3&#39;LIFE Test kullanma Yüksek throughput miRNA Hedefleri tespiti

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag Analizi - A Yüksek Verimli, Sc2.0 Genotiplendirme için Real Time PCR Testi

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...