We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.

<html> 1. Hücre Kültürü (24-48 saat transfeksiyondan önce), <ol><li> Transfeksiyon öncesi tohuma 24-48 saat 96 oyuklu plakalar sayısına göre HEK293T hücrelerin yeterli bir miktarı ile transfekte edilir. NOT: tutarlı transfeksiyonlar için, yeterli bir yoğunlukta plaka hücreleri hızlı bir şekilde bölünme lehine, ancak transfeksiyon zamanı en fazla% 70-90 konfluent olarak vermeye. </li><li> Her 96 oyuklu plaka (rezervuar ve çok kanallı pipet kullanımı için hesap oyuk başına 75,000 hücre, plaka başına 120 kuyu) 9 x 10 6 hücre gerektirir. HEK293 hücreleri (tipik olarak ~ 20 saat) iki katına çıkma süresi hesaplayın ve hücreler uygun sayıda transfeksiyon zamanı en az 9 x 10 6 hücre elde etmek üzere tohum. Yeni bir levha reseed kalan hücrelerin ~% 10, ~% 90 konfluansa kadar yetiştirilen bir 145 mm&#39;lik dairesel kültürü plakası, tipik olarak 3 96 oyuklu Transfeksiyonlar için yeterlidir. </li></ol> Transfeksiyondan 2. Hazırlık Önceki _content &quot;&gt; Not: bu reaktiflerin hazırlanması zaman alıcı olabilir çünkü aşama 2.0-2.2 tamponların ve plazmid DNA hazırlanması, transfeksiyondan önce günde yapılmalıdır. <ol><li> 3&#39;LIFE testi ile uyumlu İnsan 3&#39;UTR klonları kamu plazmid deposu 30 edinilebilir. Elle veya sıvı taşıma robotlar ile DNA plazmid arındırın. Bir transfeksiyon dereceli alkali lizis mini hazırlık 96-kuyu kiti kullanın ve üreticinin talimatlarına uyun. Kuyuya ~ 100 ng / ml başına saflaştırılmış vektörler süspanse. NOT: plazmid konsantrasyonu aşağıda 40 ng / ul düşerse yetersiz lusiferaz sinyali neden olacaktır. </li><li> PLIFE-miRNA Şekil 1B 24 boru hattını kullanarak 30 veya klon vektörleri elde edilir. Her miRNA ve boş kontrol plasmidler için 500 ng / ul&#39;lik bir konsantrasyonda vektörleri yeniden süspanse edin. </li><li> Nucleofection tampon koşulları hassasiyeti nedeniyle, sağlamak(hücreler ve plasmidler de dahil olmak üzere), transfekte edilmiş malzemelerin toplam hacmi 96 çukurlu transfeksiyon plakanın her bir toplam sıvı% 10 geçmez. Bunu elde etmek için, en az 500 ng / ul&#39;lik bir konsantrasyonda pLIFE-MiRNA plazmid stok konsantre edilir. </li><li> 10x ateşböceği lusiferaz tampon reaktifleri (Tablo 1) ve 6 aya kadar saklanabilir 1x Renilla lusiferaz tampon reaktifleri (Tablo 2), hazırlayın. Not: ateşböceği lusiferaz tampon çözeltisi içindeki DTT, tek kullanımlık parçalar halinde -20 ° C&#39;de çözelti içinde saklanabilir olması gerekir. </li></ol> 3. Transfeksiyonu için hemen öncesinde ardından Ürünleri hazırlayın <ol><li> PBS ihtiva eden transfeksiyon tamponu,% 1.5 HEPES, pH 7.0 hazırlanır. Bu Transfeksiyon etkinliğindeki fark düşüşler olmadan 4 ° C&#39;de en fazla 1 aya kadar saklanabilir, ancak, bu taze hazırlayın. Tampon ve plazmid DNA hacimleri formüle ederken, su için her 96 oyuklu plaka için 120 reaksiyonlar kabulfficiently pipetle sıvı rezervuarları ve çok kanallı pipet kullanarak kayıp hacim hataları oluşturmaktadır. Kısım kuyu transfeksiyon tamponu başına 18 ul (/ 96-plaka 120 kuyu = plaka başına 2.16 ml) ve bir kenara koyun. NOT: hücre elektroporasyon cihazı hücrelerini transfekte etmek için kullanılan tampon koşulları son derece duyarlıdır. Hazırlama tamponlar ekipman tutarlı performans sağlayacak Doğruluk. Özellikle bu tampon mikrosantrifüj tüpleri, 96-yuvalı plakalar, rezervuar ve elektrot plakaları içinde ortaya kalan zamanı en aza düşürülmesiyle, tamponlar buharlaşmasını önlemek için tahlil yapmak azami dikkat edilmelidir. </li><li> Rezerv Aşağıdaki denetimler için dört kuyu, hiçbir pLIFE-3&#39;UTR (lusiferaz tahlil arka ölçmek için), pLIFE-SV40 3&#39;UTR (negatif hedef kontrolü), miRNA # 1 için pozitif kontrol, miRNA # için pozitif kontrol 2. NOT: Bu vektörler 30 kamuya mevcuttur. Alternatif olarak, daha önce onaylanmış bir hedefBir pozitif kontrol olarak da kullanılabilir. </li><li> Sıcak ortam, 37 ° C tripsin (% 0.25). </li><li> DMEM,% 10 FBS,% 1 Pen / Strep ile takviye edilmiş 96 oyuklu hücre kültürü plakasının her bir oyuğuna, 200 ul ve transfeksiyonu takiben kullanılmak için bir 37 ° C kuluçka makinesi içine yerleştirilmiştir. </li><li> Destek yazılımları tarafından takip tüm cep elektroporasyon aygıtları açın. HEK293T hücreleri ve PBS / HEPES tamponu için Darbe kod FF120 kullanın. </li></ol> Plazmid DNA ve hücre karışımı 4. hazırlanması Not: Aşağıdaki protokol, iki miRNA&#39;ların (miRNA- # 1 ve miRNA- # 2) ile birlikte, bir ekran için bir deneyde, üç, 96 gözlü levhalar transfekte varsayar. Her bir plaka pLIFE-3&#39;UTR plasmidlerin, aynı 96-yuvalı plaka karşılık gelir, ve pLIFE-miRNA boş pLIFE-miRNA- 1. veya pLIFE-miRNA- # 2 ile üç kez tedavi edilebilir. <ol><li> Her miRNA için pLIFE-miRNA + transfeksiyon tamponu 3 stokları hazırlayın. Bu stok her birinin toplam hacminin% 50&#39;si (10 ul) ayarlanabilmelidiriyi, 120 kuyular ile çarpılır. Böylece, her bir hisse senedi 1.08 ml tampon + 120 ul plazmid DNA (pLIFE-miRNA) içermelidir. </li><li> Medya elüsyon PBS ile hafifçe yıkanır ve 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca ~ 5 mi,% 0.25 tripsin ile muamele etmek suretiyle 145 mm kültür hücreleri plakadan çıkarın. 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de eşit medya hacmi ve pelet hücreleri ile tripsin nötralize eder. </li><li> 5-10 ml medya (hücre yoğunluğu ve hücre sayacın doğru aralığına bağlı olarak) ~ tripsini / medya ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. </li><li> Bir hücre sayacını kullanarak hücreleri saymak. % 95 canlı ve makinenin doğru aralığında&gt; hücreler olduğundan emin olun. NOT: tutarlı hücre sayısı, son derece yüksek hücre konsantrasyonlarında (&gt; 6.0x 10 6 / ml) bir sonucu olabilir. Hücre oranı ve / veya transfeksiyon verimliliği azalan: transfecting çok hücre ölçüde plazmid azaltarak hedef miRNA verimliliğini azaltabilir. </li><li> Kısım üç tüp her biri 9 x 10 6 hücre, hücrelere karşılık gelen rBir 96-yuvalı plaka transfeksiyonu için equired. 3 dakika boyunca 300 xg&#39;de hücreleri Spin. </li><li> Ortamı çıkarın. Aşırı medya transfeksiyon etkinliğini etkileyebilir olarak pelet minimal rahatsızlık ile mümkün olduğunca çok ortamı çıkarmak için emin olun. </li><li> 1.2 ml transfeksiyon tamponu / miRNA plazmid karışımı ve bir kenara yeniden süspanse hücreleri. </li><li> Aşağıdaki transfeksiyon tamponunda pLIFE-3&#39;UTR plazmid detay tabanda yineleyin. Bu 96 kuyucuğu oluşur gibi, her zaman plakaları kaplayarak tampon buharlaşmasını önlemek için özen gösterin. <ol><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, 96 PCR plakanın her oyuğuna transfeksiyon tamponu ul 32,4 hareket ([transfeksiyon başına] 9 ul * 3: [plakaları] * 1.2 [pipet hata için hesap]). </li><li> Her kuyuya 3.6 ul mini prepped pLIFE-3&#39;UTR plazmid (± 100 ng / | il) ilave edin ve iyice karıştırın. </li><li> Pipet 96 oyuklu transfeksiyon levhasının ve kapağın her oyuğuna Bu karışımın 10 ul. </li></ol></li></ol><ol><li> Rezervuar içine ilk hücre / tampon / pLIFE-miRNA plazmid karışımı 1.2 ml taşıyın. Iyice karıştırın. </li><li> Önce 10 ul transfeksiyon tampon / pLIFE-3&#39;UTR içeren birinci 96 oyuklu transfeksiyon plaka içine bu karışımın 10 ul ekle. Yukarı pipetleme ve birkaç kez aşağı iyice karıştırın. NOT: tamponunda hücrelerin Eşit süspansiyon bile emin ve küvet ile elektrik akımının geçişi kapsamlı ve transfeksiyon verimliliği maksimize edecek. </li><li> Hücre elektroporasyon cihazda 96-iyi transfeksiyon plaka koyun ve transfeksiyon başlatmak. </li><li> Transfeksiyon tamamlandıktan sonra, 96-çukurlu transfeksiyon plakanın her oyuğuna 96 oyuklu bir kültür plakasına gelen önceden ısıtılmış ortam 100 ul ekleyin ve iyice karıştırın. 96-çukurlu kültür plakasına her bir göze 100 ul taşıyın. </li><li> Hücreler w yanlarındaki topaklaşma eğilimi gibi, iyi merkezinde dikey olarak yerleştirilmiş pipetle kültür plakasına hücreleri karıştırınell düzgün karışık sürece. </li><li> Geri kalan iki tabak 5,1-5,5 tekrarlayın. </li><li> Temizleme 96-kuyu transfeksiyon plaka <ol><li> 96 oyuklu plakalar, transfeksiyon deneyler arasında, nükleik asitlerin üzerinde hiçbir yürütülmesini sağlamak üzere,% 70 EtOH ile yıkanarak geri dönüştürülebilir. Tamamen elektrot şeritler aşırı EtOH silerek (alt taraf) ve kültürü kaputu tamamen kuru transfeksiyon plakaları izin vererek, ardından her iyi doldurmak için bir sprey şişesi kullanarak iki% 70 EtOH yıkar gerçekleştirin. NOT: bir plazmid DNA ile% 70 EtOH ile tek bir yıkama ve bir ikinci transfeksiyon, ardından HEK293T hücrelere her biri, plazmid pmaxGFP 2 ug ile 12 kuyu transfekte edilmesiyle carry-over DNA kontaminasyonu için test edilmiştir. Bu, son derece yüksek bir plazmid konsantrasyonu, son derece parlak muhabir ve tek bir yıkama ile, 12 kopya transfeksiyonlar herhangi gözlenebilir bir floresan olmasıdır. </li></ol></li><li> Çift lucif ardından 37 ° C&#39;de 48-72 saat süre ile kültür hücreleri,tahlil silebilirsiniz. </li></ol> 6. Hücre Lusiferaz Assay için Lizat hazırlanması <ol><li> 4 kısım su, bir rezervuar pasif lizis tamponu 5x 1 parça ile lizis tamponu ile seyreltilir. 26 ul / kuyu, ~ 20 ekstra hacimleri ekleyerek rezervuar kaybı hesaba hesaplayın. NOT: Tampon -20 ° C&#39;de saklanır ve pipetleme doğruluğu artıracak oda sıcaklığını yaklaşım 5x tampon izin böylece önce, son derece viskoz olabilir. </li><li> Floresan mikroskopi kullanılarak transfeksiyon etkinliği için de her bir analiz edin. Verimli transfect vermedi kuyularda tutarsızlıkları (&gt;% 90 transfeksiyon verim) Not veya kalabalık ya da medya bitkinlik göstergesidir RFP düşük seviyelerde ifade edilir. Analizden Bu kuyu çıkarın. </li><li> Tamamen hücreler ayırmak neden olan çok hızlı Zehir için dikkatli olmak, hücrelerden ortamı çıkarın. NOT: Kalan medya experime genelinde değerleri lizat ve neden dalgalanmaları sulandırmakNTS. </li><li> 20-30 dk ~ düşük / orta hızda bir plaka çalkalayıcı / rocker her iyi ve yere lizis tamponu 26 ul ekleyin. Lusiferaz tamponlar hazırlamak lüminometre (ler) yıkayın ve prime ve opak ölçüm plakalarına lizat aktarmak için bu kez kullanın. </li></ol> 7. Çift Lusiferaz Deneyi NOT: Birden plakaları tek lüminometre üzerinde sırayla ölçülen yapılıyorsa, hemen her plaka kullanmadan önce pH ayarlaması ardından bu reaktif ekleyerek, ATP ve yüzeylerde hariç her şeyi ile tampon ana karışımları oluşturun. ATP ve yüzeyler zamanla düşebilir; Bu reaktifler tampon içinde olan süreyi tutarlılık birden plakalar arasında tutarlılık artıracaktır. <ol><li> 1x lusiferaz tamponlar hazırlanması (Tablo 1): <ol><li> Yüzeyler ışığa duyarlı olabileceğinden, alüminyum folyo ile ateşböceği ve Renilla tamponlar içeren iki tüpleri (genellikle 15/50 ml santrifüj tüpleri) sarın. </li><li>1x Firefly lusiferaz tampon hazırlayın. Nihai 1x konsantrasyonu 5 ml H 2 0, EGTA son ekleme, her beş 10x ateşböceği lusiferaz reaktif 1 ml ekleyin. <ol><li> Ateşböceği tampon 1x 10 ml, 0.025 gr ATP ilave edin. Birkaç kez baş aşağı çevirerek kanştınn. Her zaman buz üzerinde ATP tutun. ATP düşer, bu nedenle birden fazla plaka sekans ölçülmesi halinde, tampon her bir ek plaka için bu adımda taze başlangıç ​​yapılmalıdır. </li><li> Tampon pH dayalı sarımsı renk değiştirmek gerekir 100 böceği luciferase (alt tabaka) (Tablo 1) 100 ul ekleyin. </li></ol></li><li> 1x Renilla lusiferaz tamponu sulandırma: 96 oyuklu bir plaka, kısım 1, 10 ml başına &quot;Renilla tampon&quot;. <ol><li> BSA, 100 ul (44 mg / ml stok) ilave edilir. </li><li> Birden fazla tabak, 10 ml&#39;lik içine ayrı ana karışımı tarama edin. </li><li> Tampon koelenterazin 100 ul ekle (daha önce bölünüp 100x konsantre C&#39;de saklandı.) </li></ol></li> &lt;li&gt; NaOH ve HCI kullanılarak 5.0 1x Renilla tamponu ardından, ateşböceği 8.0 tampon 1x pH ayarlayın. NOT: Her tampon aktivitesi, ve ateş böceği lusiferaz aktivitesini bastırmak için Renilla tampon kabiliyeti pH değerine oldukça bağlıdır. Tutarlı sonuçlar için bu adımda son derece doğru. </li><li> Luminometre astarlanması için yerleştirmek için 10.5 ml (1, 96 oyuklu plakaya tekabül eden) her bir tampon hacmi getirin. </li></ol></li><li> Opak beyaz plakalara lizat transfer Bu noktada hücreler, 20 dakika için ~ liziz tamponu içinde olmalıdır. Her bir kuyunun çok kanallı pipet kullanarak 25 ul alın, hücre kümeleri break up ve homojenleştirin aşağı iyice yukarı pipetlemeyin emin ve olmayacak. </li><li> Lüminometre hazırlayın. Lüminometre açın ve &quot;iki enjeksiyonları ile DLR&quot; adlı DLR klasöründe protokolü seçin. Diğer formatlar veri analizi boru hattı (aşağıda) ile uyumlu değildir. <ol><li> T olmak kuyuları seçinested (bütün kuyular varsayılan). </li><li> (Açıklama için 29 bakınız) 10 sn ölçüm süresi, 5 saniye ayarı &#39;ölçümden önce Delay&#39; uzatın. </li><li> Kılcal yıkama adımları: Su 3x, EtOH 3x, su 3x, kuru 3x. Arka tampon tüpleri içine bir kez atık haline Başbakan tamponlar ve daha sonra başbakan ikinci kez karıştırma sağlamak. Sağ kılcal Renilla ardından sol kılcal, ilk ve Başbakan ateşböceği tampon enjekte edilir. </li></ol></li><li> Lusiferaz deneyi başlatın. Her plaka okuma ~ 48 dk almalıdır. Tamamlanmasından sonra ilk dosyayı kaydedin ve sonra yıkama adımları tekrarlayın ve lüminometre kapatın. NOT: luminometre programı çökmesine nerede Çoklu plakalar okuma ve aynı saklanan veriler excel dosyası olabilir, sorunları birden plaka ile karşılaştı olabilir ancak okur. Ölçümlerin arasındaki tüm verileri kaydetmek ve kaydetme mümkün önce program çökerse ekran görüntüleri almak için emin olun. <ol><li> Eski tamponlar değiştirinYeni ile yeni plaka başlamadan önce en az iki kez yeni tamponlar ile Başbakan emin olmak. </li></ol></li></ol> 8. Veri Analizi <ol><li> Edinilebilir - ve &quot;multiplate analizi 3&#39;LIFE&quot; - excel tabloları &quot;tek plaka analizi 3&#39;LIFE&quot; yararlanın <a href="http://www.mangonelab.com">www.mangonelab.com</a> . Elektronik tablo - &quot;tek plaka analizi 3&#39;LIFE&quot; içine negatif durum, miRNA 1. ve miRNA 2. tekabül yerlere luminometre çıktı dosyasından ateş böceği ve Renilla lusiferaz ölçümleri için ham veri kopyalayın. </li><li> Elektronik tablo otomatik ateşböceği / Renilla oranını hesaplamak ve uygun negatif kontrol her miRNA normalleştirmek ve her plaka üzerinde baskı değerleri normale olacaktır. NOT: Bu e-tablo otomatik olarak anlamlı bastırılmış kuyu vurgulayın düşük lusiferaz sinyali ile kuyu tespit ve repressi tedbirlerini sağlayacaktüm plaka üzerinde üzerinde. İstatistiksel analiz detaylı açıklama için 24 Bkz. <ol><li> Test edilen her miRNA için 1. çoğaltmak tekabül eden konumda - &quot;multiplate analizi 3&#39;LIFE&quot; e-tabloda karşılık gelen hücrelere, &quot;Normalize RI Endeksi&quot; kutusundan değerleri kopyalayın. Farklı günlerde yapılan tüm biyolojik çoğaltır için tekrarlayın. </li></ol></li><li> Arzu edildiği takdirde, sırası ile, sütun B ve D gen isimleri ve hedef tahmini durumunu yerleştirin. <ol><li> Elektronik tablo otomatik olarak tüm plaka ortalamasını hesaplamak için izin verin. Bir ısı haritası olarak 96 sıra formatta (Şekil 2) verileri dikkate alınmalıdır. dosyası da liste biçiminde veri (Şekil 2) düzenler. NOT: baskı endeksi, farazi miRNA hedeflerini tanımlamak için kullanılan bir ölçüdür. Farklı sertlikteki parametreler tek tek tercihlerine bağlı olarak, kullanılabilir. Ortalama olarak biz 0 baskı endeksi altında muhtemel hit düşünün.8 ve t testi (p-değeri &lt;0.05) istatistiksel olarak anlamlı. Şekilde gösterildiği gibi, bu kriterlere göre 3 potansiyel hedefler kırmızı vurgulanır. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li><li>Pasquinelli, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+the+sequence+and+temporal+expression+of+let-7+heterochronic+regulatory+RNA.">Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA.</a> Nature. 408 (6808), 86-89 (2000).</li><li>Reinhart, B. J., Weinstein, E. G., Rhoades, M. W., Bartel, B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+plants.">MicroRNAs in plants.</a> Genes Dev. 16 (13), 1616-1626 (2002).</li><li>Ivey, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+regulation+of+cell+lineages+in+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 2 (3), 219-229 (2008).</li><li>Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+heterochronic+gene+lin-4+encodes+small+RNAs+with+antisense+complementarity+to+lin-14.">The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.</a> Cell. 75 (5), 843-854 (1993).</li><li>Wienholds, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+in+zebrafish+embryonic+development.">MicroRNA expression in zebrafish embryonic development.</a> Science. 309 (5732), 310-311 (2005).</li><li>Darnell, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+during+chick+embryo+development.">MicroRNA expression during chick embryo development.</a> Dev Dyn. 235 (11), 3156-3165 (2006).</li><li>Jin, P., Alisch, R. S., Warren, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+and+microRNAs+in+fragile+X+mental+retardation.">RNA and microRNAs in fragile X mental retardation.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1048-1053 (2004).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MicroRNA+feedback+circuit+in+midbrain+dopamine+neurons.">A MicroRNA feedback circuit in midbrain dopamine neurons.</a> Science. 317 (5842), 1220-1224 (2007).</li><li>Poy, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pancreatic+islet-specific+microRNA+regulates+insulin+secretion.">A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion.</a> Nature. 432 (7014), 226-230 (2004).</li><li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+in+human+cancers.">MicroRNA signatures in human cancers.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).</li><li>Paraskevopoulou, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIANA-microT+web+server+v5.0:+service+integration+into+miRNA+functional+analysis+workflows.">DIANA-microT web server v5.0: service integration into miRNA functional analysis workflows.</a> Nucleic Acids Res. 41 (Web Server issue), W169-W173 (2013).</li><li>Krek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+microRNA+target+predictions.">Combinatorial microRNA target predictions.</a> Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+target+recognition+and+regulatory+functions.">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136 (2), 215-233 (2009).</li><li>Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+microRNA+let-7+binds+to+imperfect+let-7+complementary+sites+from+the+lin-41+3'UTR.">The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR.</a> Genes Dev. 18 (2), 132-137 (2004).</li><li>Lal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-24+Inhibits+cell+proliferation+by+targeting+E2F2,+MYC,+and+other+cell-cycle+genes+via+binding+to+'seedless'+3'UTR+microRNA+recognition+elements.">miR-24 Inhibits cell proliferation by targeting E2F2, MYC, and other cell-cycle genes via binding to 'seedless' 3'UTR microRNA recognition elements.</a> Molecular Cell. 35 (5), 610-625 (2009).</li><li>Cevec, M., Thibaudeau, C., Plavec, J. N. M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+structure+of+the+let-7+miRNA+interacting+with+the+site+LCS1+of+lin-41+mRNA+from+Caenorhabditis+elegans.">NMR structure of the let-7 miRNA interacting with the site LCS1 of lin-41 mRNA from Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 38 (21), 7814-7821 (1093).</li><li>Shin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+microRNA+targeting+code:+functional+sites+with+centered+pairing.">Expanding the microRNA targeting code: functional sites with centered pairing.</a> Molecular Cell. 38 (6), 789-802 (2010).</li><li>Azzouzi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-96+directly+inhibits+gamma-globin+expression+in+human+erythropoiesis.">MicroRNA-96 directly inhibits gamma-globin expression in human erythropoiesis.</a> PLoS One. 6 (7), e22838 (2011).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-193b+Regulates+Mcl-1+in+Melanoma.">miR-193b Regulates Mcl-1 in Melanoma.</a> Am J Pathol. 179 (5), 2162-2168 (2011).</li><li>Chi, S. W., Hannon, G. J., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+mode+of+microRNA+target+recognition.">An alternative mode of microRNA target recognition.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (3), 321-327 (1038).</li><li>Jiao, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+targeting+oncogenes+are+down-regulated+in+pancreatic+malignant+transformation+from+benign+tumors.">MicroRNAs targeting oncogenes are down-regulated in pancreatic malignant transformation from benign tumors.</a> PLoS One. 7 (2), e32068 (2012).</li><li>Wolter, J. M., Kotagama, K., Pierre-Bez, A. C., Firago, M., Mangone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'LIFE:+a+functional+assay+to+detect+miRNA+targets+in+high-throughput.">3'LIFE: a functional assay to detect miRNA targets in high-throughput.</a> Nucleic Acids Res. , (2014).</li><li>Mangone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+C.+elegans+3'UTRs.">The landscape of C. elegans 3'UTRs.</a> Science. 329 (5990), 432-435 (2010).</li><li>Ekdahl, Y., Farahani, H. S., Behm, M., Lagergren, J., Ohman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A-to-I+editing+of+microRNAs+in+the+mammalian+brain+increases+during+development.">A-to-I editing of microRNAs in the mammalian brain increases during development.</a> Genome Res. 22 (8), 1477-1487 (2012).</li><li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m(6)A+RNA+methylation.">Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation.</a> Nat Rev Genet. 15 (5), 293-306 (2014).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screens+of+miRNA-mRNA+interactions+unveiled+that+the+3'UTR+of+a+gene+is+targeted+by+multiple+miRNAs.">Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3'UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs.</a> Plos One. 8 (7), e68204 (2013).</li><li>Dyer, B. W., Ferrer, F. A., Klinedinst, D. K., Rodriguez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+noncommercial+dual+luciferase+enzyme+assay+system+for+reporter+gene+analysis.">A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis.</a> Anal Biochem. 282 (1), 158-161 (2000).</li><li>Seiler, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNASU+plasmid+and+PSI:Biology-Materials+repositories:+resources+to+accelerate+biological+research.">DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research.</a> Nucleic Acids Res. , (2013).</li><li>Baek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+microRNAs+on+protein+output.">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 64-71 (2008).</li><li>Ebert, M. S., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+for+MicroRNAs+in+Conferring+Robustness+to+Biological+Processes.">Roles for MicroRNAs in Conferring Robustness to Biological Processes.</a> Cell. 149 (3), 515-524 (2012).</li><li>Pelaez, N., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+robustness+and+the+role+of+microRNAs:+a+network+perspective.">Biological robustness and the role of microRNAs: a network perspective.</a> Current Topics in Developmental Biology. 99, 237-255 (2012).</li></ol>

This work is supported by funds from the College of Liberal Arts and Science and the Biodesign Institute at Arizona State University and NIH Exploratory/Developmental Research Grant 1R21CA179144-01A1.

3&#39;LIFE deneyi yüksek throughput 3&#39;UTRs fonksiyonel MiRNA hedefleri tanımlar. Bu deney, kendi ilgi miRNA için farazi hedef çok sayıda tespit etmek isteyen araştırmacılar için yararlıdır. 3&#39;LIFE tahlil miRNA hedefleme fonksiyonel bir ölçü ve güvenle hitap edebilecek tek bir miRNA karşı 3&#39;UTR&#39;sinden :: tek muhabir ikili test sağlar ki 3&#39;UTR tahrik düzenlenmesi için sorgulamak için güçlü bir yaklaşımdır Bireysel genlerin hedef durumu. Bu yaklaşımı doğrulamak için, 275 ...

Bu yöntemin genel amacı algılamak ve hassas yüksek throughput microRNA (miRNA) hedefleri harita etmektir. MiRNA ~ uzunluğu 22 nükleotid endojen kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar bulunmaktadır. Transkripsiyonu ve işleme sonrasında, olgun miRNA&#39;lar bir protein kompleksi içinde dahil edilmiştir kompleksi (RISC) susturulması kaynaklı RNA çağırdı. Her miRNA çeviri baskıya veya mRNA bölünme 1 ya sonuçlanan öncelikle haberci RNA&#39;lar 3 &#39;çevrilmemiş bölgelerine (3&#39;UTRs) (mRNA)&#39; de yer alan unsurları hedef RISC yönlendirir. U baz eşleşmesi sallanmak ve olan dejenere doğada, birden eşleşmeyen baz çifti içeren ve bölgeler şişti: Mirna standart Watson-Crick ve G dayalı hedef siteleri tanır. Birçok miRNA&#39;lar geniş biyolojik rolleri çeşitli bir yelpazede oynamak insanlarda 2,3 için bitkilerden muhafaza edilir. Metazoan&#39;da ise miRNA&#39;lar hücre kaderinin kararları 4, gelişimsel zamanlama 5 dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçleri etkileyebilir </sup&gt; Ve çoğu zaman dokuya özgü ekspresyonu 6,7 sergiler. MIRNA misexpression aynı zamanda, hedef genlerin işlevine yalnızca temel hücre davranışı üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir olarak anormal gen regülasyonu, neden olabilir. Bu nedenle, miRNA&#39;ların nörodejenerasyon 8,9, diyabet 10 ve kanser de dahil olmak üzere 11, hastalıkların geniş bir bağlantılıdır. Biyoinformatik ve ıslak tezgah yaklaşımları her miRNA yüksek verimli veya genom yaklaşımlar potansiyel etkileşimler bu büyük bir havuz soruşturma için gerekli olduğunu belirten farklı mRNA 12-14 binlerce yüz hedefleme yeteneğine sahip olabileceğini düşündürmektedir. Hedef genlerin belirlenmesi mekanistik tanımlayan miRNA fonksiyonunun kritik bir bileşenidir, ve bunu yapmak için araştırmacılar büyük çapta hedeflerini ortaya gerekir. Çeşitli yaklaşımlar biyoinformatik tahmin algoritmaları da dahil olmak üzere miRNA hedefler, tanımlamak için geliştirilmiştir, yüksek hacimli dizilemebir mRNA&#39;ları hedeflenen ve raportör deneyleri tabanlı. Bu yaklaşımların her biri doğal güçlü ve zayıf yanları vardır. MiRNA hedefleme sekansı özgüllük tarafından yönlendirilir olduğu göz önüne alındığında, özellikle nükleotid miRNA 2-6, çeşitli algoritmalar birçok organizma genomu boyunca MiRNA hedefleri tahmin etmek için geliştirilmiştir (tohum bölge olarak da adlandırılır). Bu algoritmalar valide miRNA hedeflerinin gözlenen baz eşleşmesi motifleri kullanılarak eğitimli ve sık sık bu tür sıkı tohum eşleştirme, site korunması ve / veya termodinamik stabilite 15 gibi parametreleri kullanan vardır. Bu filtreler sadece yüksek güven hedefleri için yeterli tamamlayıcılık ile olası hedeflerin çok sayıda rafine ederken, onlar son kanıtlar 16-24 yaygın olduğunu düşündürmektedir türe özel ve kanonik olmayan miRNA hedef siteleri, dışarıda olabilir. Ayrıca, bu tahminlerin gibi alternatif poliadenilasyonu olarak miRNA hedef siteleri, dışarıda mRNA işleme hesap mekanizmaları yapmayız25, RNA düzenleme 26, RNA metilasyonu 27 ve kooperatif bağlama. Bu nedenle, yüksek yanlış pozitif ve yanlış negatif oranları birçok algoritmalar 22,24,28 için rapor edilmiştir. Bu algoritmalar sonraki deneysel doğrulama için aday miRNA hedefler belirlemek için yararlı olmakla birlikte, bu yüksek hata oranları sistematik miRNA hedef tespiti için biyoinformatik yaklaşımların etkinliğini sınırlamaktadır. Sistematik belirli bir miRNA arasındaki etkileşimler ve potansiyel olarak hedeflenmiş 3&#39;UTRs problanması için biz 3&#39;UTRs (3&#39;LIFE) 24 fonksiyon elementleri arasında Lüminesans tanımlanması adı verilen bir yüksek verimli bir deney geliştirilmiştir. Bu tahlil ölçer doğrudan etkileşimleri ve çift lusiferaz haberci sistemini kullanarak bir sorgu miRNA test 3&#39;UTR&#39;sinden translasyon baskı. Bu sistemde, ilgi konusu bir genin 3&#39;UTR ateşböceği lusiferaz (Fluc) raportör okuma çerçevesinin alt klonlanır. muhabir eksilerinitruct HEK293T hücrelerinde bir sorgu miRNA ile kotransfekte edilir. MIRNA hedefleme Test Fluc :: 3&#39;UTR muhabir ve ikinci bir non-spesifik Renilla lusiferaz raportör arasındaki nispi değişimin ölçülmesi ile tespit edilir. Önemli olarak, lusiferaz deneyleri, raportör translasyon çıkış etkileyen fonksiyonel MiRNA / mRNA etkileşimlerini tespit eder. Bu bu 3&#39;UTR tabanlı düzenlemenin bağımsız protein bolca mRNA bozulması ve translasyonel baskıya farklılıkları yanı sıra değişiklikleri atlar, bu tür RT-qPCR ve Western lekeleri olarak miRNA düzenleme, tespit etmek için geleneksel yöntemlere göre önemli bir avantajdır. Lusiferaz deneyleri, yaygın olarak tüketilebilir reaktifler ile ilişkili yüksek maliyetler ile sınırlıdır, çünkü göreceli basitlik ve hassaslık, ancak, yüksek verimli taramalara kullanımları doğrudan MiRNA hedeflerini doğrulamak için kullanılır, kamu kaynaklarından 3&#39;UTR kütüphanelerinin eksikliği ve yokluğu standart lusiferaz prot arasındaocols, birden veri setleri üzerinde fonksiyonel baskıya karşılaştırılmasında zorluklara yol açmaktadır. 3&#39;LIFE testinin kullanımını kolaylaştırmak için, düzenli olarak güncellenen ve genişletilmiş bir 3&#39;UTR kütüphane oluşturarak, deneysel tasarım, ticari olmayan transfeksiyon 24 ve lusiferaz reaktif 29 kullanımı basitleştirilmesi vurgu ve yoluyla kullanılabilir var kamu plazmid deposu 30. 3&#39;LIFE testinin ölçeklenebilirlik bioinformatically belirlenen genler doğru ekranı eğme olmadan belirli bir miRNA tarafından hedef için büyük bir 3&#39;UTR kütüphanenin tarama sağlar. Kanonik ve tahmin edilen etkileşimleri test etmek için ek olarak, bu sistematik bir yaklaşım, kurallı olmayan ve / veya tür spesifik etkileşimler yoluyla tahrik edilen yeni hedeflerin tanımlanmasına izin verir. Önemli olarak, protein üretimi ile ilgili hedef miRNA etkisi, genel olarak mütevazi bir translasyon baskı 15,31 &lt;neden anlaşılmalıdır/ Sup&gt;, miRNA düzenlemenin bir birincil rolü, protein çıkışı ince ayar gen ifadesinin anormal düzeylerde karşı koruma ve belirli programları 32,33 hücre sağlamlık sağlamak olduğunu düşündürmektedir. 3&#39;LIFE ekranında negatif MiRNA / mRNA etkileşimlerin doğal sayıda kombine lusiferaz deneyi duyarlılığı MiRNA genlerinin bir çok sayıda hedef ince etkilerinin belirlenmesine ve gen ağlarının birden çok bileşenden tanınmasını sağlar Belirli bir miRNA 24 düzenlenir. Burada 3&#39;LIFE protokol açıklar ve 275 insan 3&#39;UTRs (Şekil 1) &#39;in bir paneline karşı iyi karakterize edilmiş iki miRNA&#39;lar, miR-10b ve izin-7c taranmasıyla, fizibilite olduğunu göstermektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="406">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reagents</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glycylglycine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1127-25G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kx PO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P2222</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E3889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATP</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">FLAAS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTT</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D0632</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7506</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CoA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C4282</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">luciferin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L9504</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E0399</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K H2 P O4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">1551139</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2153</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaN3</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S2002</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coelenterazine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3230</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS/HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5546</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F2442</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pennicilin/Streptomicin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;">T2600000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Consumables</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MaxiPrep Kit</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A2392</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well miniprep plate</td>
			<td style="width:71px;">Pall</td>
			<td>8032</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well shuttle plates</td>
			<td style="width:71px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">V4SP-2096</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5x Lysis Buffer</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td>E1941&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instruments</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well GloMax Plate Reader</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E9032</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biomech FX Liquid Handler Robot</td>
			<td style="width:71px;">Beckmann</td>
			<td style="width:119px;">A31842</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4D-Nucleofector Core Unit</td>
			<td style="width:71px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">AAF-1001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well Shuttle System</td>
			<td style="width:71px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">AAM-1001</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell Counter Countess</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C10227</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of mirna targets in high-throughput using the 3'life assay

3&#39;UTRs fonksiyonel Elementlerin Lüminesans Tanımlama (3&#39;LIFE) sorgulanan 3&#39;UTRs yüzlerce bir dizi içinde spesifik miRNA&#39;ların hedefleri hızlı tanımlanmasını sağlar. Hedef tespiti MiRNA hedefleme işlevsel bir okuma verir translasyon çıkışının ölçülmesi mRNA düzeyinde bağlanmasını saptayan çift lusiferaz deneyi, dayanmaktadır. 3&#39;LIFE genom ekranlar yapma tescilli olmayan tamponlar ve reaktifler ve kamuya açık muhabiri kütüphaneleri kullanır uygulanabilir ve maliyet-etkin. 3&#39;LIFE standart laboratuar ortamında ya yapılmış ya da sıvı taşıma robotlar ve diğer yüksek verimli enstrümantasyon kullanılarak ölçeklendirilebilir. İnsan 96-yuvalı plakalar içinde klonlanmış 3&#39;UTRs ve iki test miRNA&#39;ların bir veri kümesi kullanılarak bir yaklaşımı göstermektedir, salma 7c ve miR-10b. Bu 96 gözlü bir formatta DNA hazırlama, transfeksiyon, hücre kültürü ve lusiferaz tahlilleri yerine ve veri için araçlar temin etmek gösterilmektedirAnaliz. Sonuç olarak 3&#39;LIFE yüksek, tekrarlanabilir hızlı, sistematik ve yüksek güven hedeflerini belirler.

luminometre çıktı dosyası hem ateş böceği ve Renilla lusiferaz proteinleri ham ölçümlerini içerir. Ve - Mangone laboratuvar web sitesinden (edinilebilir &quot;3&#39;LIFE multiplate analizi&quot; tabloları - Bu ham biçimi &quot;tek plaka analizi 3&#39;LIFE&quot; ile uyumludur <a href="http://www.mangonelab.com">www.mangonelab.com</a> ). Tek plaka analizi tablo otomatik ateşböceği / Renilla oranını hesaplar uygun negatif kontrole her miRNA normalleştirir ve her plaka üzerinde baskı d...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay at JoVE.com

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

3&#39;LIFE Test kullanma Yüksek throughput miRNA Hedefleri tespiti

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

detection-of-mirna-targets-in-high-throughput-using-the-3-life-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

10.0K Görüntüleme.  Arizona State University. Luminescent identification of functional elements in 3’ untranslated regions (3’UTRs) (3’LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3’UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Video: Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

Lignocellulosic Malzemeler için Yüksek verim Saccharification Testi

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Biyoloji

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

MİSYON Hedef Kimliği Kütüphane Kullanımı miRNA Hedefler için genom Ekran

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Yüksek verim Kristalizasyon lipidik Bicelle Yöntemiyle Membran Proteinleri

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

Otomatik kullanarak Kromozomlar Yüksek throughput Fiziksel Haritalama<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genom çapında Gen Delesyonlar içinde<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Yüksek Verimli PCR ile

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed "high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension", or SHAPE, allows prediction of RNA secondary structure with single nucleotide resolution. This approach utilizes chemical probing agents that preferentially acylate single stranded or flexible regions of RNA in aqueous solution. Sites of chemical modification are detected by reverse transcription of the modified RNA, and the products of this reaction are fractionated by automated capillary electrophoresis (CE). Since reverse transcriptase pauses at those RNA nucleotides modified by the SHAPE reagents, the resulting cDNA library indirectly maps those ribonucleotides that are single stranded in the context of the folded RNA. Using ShapeFinder software, the electropherograms produced by automated CE are processed and converted into nucleotide reactivity tables that are themselves converted into pseudo-energy constraints used in the RNAStructure (v5.3) prediction algorithm. The two-dimensional RNA structures obtained by combining SHAPE probing with in silico RNA secondary structure prediction have been found to be far more accurate than structures obtained using either method alone.

High-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) utilizes a novel chemical probing technology, reverse transcription, capillary electrophoresis and secondary structure prediction software to determine the structures of RNAs from several hundred to several thousand nucleotides at single nucleotide resolution.

Yüksek verim SHAPE kullanarak RNA İkincil Yapısı Tahmin

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

Bir ev yapımı Çift kızdırma Lusıferaz Testi kullanarak yüksek verim Fonksiyonel Taraması

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

Yüksek Verimli<em&gt; Danio rerio</em&gt; Enerji Harcaması Deneyi

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...