Bu çalışma, bir EMBO Uzun süreli araştırma bursu (ABW) tarafından desteklenen, Ulusal Bilim Vakfı Uluslararası Doktora Sonrası Araştırma Bursu (ABW), Max Planck Gesellschaft (ABW, DS, JS, ACO), bir kazılar-BB bursu (AO), ve (ACO DS) Avrupa Toplulukları Yedinci Çerçeve Programı STG-207634 altında Avrupa Araştırma Konseyi. Biz yazının yararlı yorumlar için Ravi Desai teşekkür ederim. Biz de Zebra balığı Fibronectin1 fragmanı, bakım ve bizim balık hatları ve görüntüleme desteği için MPI-CBG ışık mikroskobu tesisin bakımı için MPI-CBG balık tesisi personelinin üretimi için MPI-CBG protein ekspresyon tesis teşekkür etmek istiyorum.

1.. Diseksiyon önce <ol><li> Diseksiyon bir gün önce, transgenik allel için heterozigos zebra balığı çiftleri incross embriyolar elde edilir. <ol><li> 28 o C de metilen mavisi olmadan E3 ortamda embriyolar kaldırın kalkan aşamasında (6 saat sonrası fertilizasyon) kadar. </li><li> 20 o CO / N. metilen mavisi olmadan E3 ortamda embriyolar transfer Onlar tailbud aşamaya ulaştığında, 20 o C, embriyolar saat başına 1 hücre gruplarının oluşturacaktır. O 20 ° C&#39;de 17-20 saat O / N sonra, embriyolar diseksiyon protokol başında ertesi sabah sahne 5-8 hücre gruplarının olmalıdır. </li></ol></li><li> Araçları ve diseksiyon için gerekli reaktifleri birleştirin. <ol><li> Embriyo ve doku transferi için yangın parlatılmış cam pipet </li><li> Embriyolardan chorions çıkarılması için ince forseps çifti </li><li> Diseksiyon için Sylgard kaplı 35 mm çanak - 35 mm çanak içine Slygard polimer dökün ve 37 ° C O / N tedavi Iyi kullanarak diseksiyon yapmaktedavi polimerin küçük bir hacmini çıkarmak için bir iğne ucu. Çanak temizlenmiş ve daha sonra tekrar edilebilir. </li><li> PSM doku manipülasyon için bilenmiş, basık tungsten tel araçları </li><li> Kültüre PSM istenilen parçalar kesmek için mikro-neşter </li><li> Tripsin inkübasyon için 35 mm plastik tabak </li><li> % 10 fetal inek serumu ihtiva eden ortam L15 </li><li> % 0.25 tripsin / EDTA solüsyonu </li><li> Dağıtmaya sigmacoted jel yükleme ipuçları </li><li> Metilen mavisi olmadan E3 ortamı içeren plastik petri. </li></ol></li><li> Fibronectin1 alt-tabaka (PBS içerisinde 10 ug / ml) ile cam-alt görüntüleme çanak örtün. Diseksiyon sırasında kat bankta çanak bırakın. </li><li> Tanımlamak için uygun floresan filtre ve sıralama pozitif transgenik embriyolar (5-8 somite evre) ile Stereoskop kullanın. <ol><li> Floresan kanal altında YFP ekspresyon için presomitic mezoderm (PSM) (Şekil 1A) incelenerek transgenik embriyolar belirlenmesi. Floresan shoULD tailbud son oluşturulan hücre gruplarının arasındaki bölgede görünür. Parlak sinyal embriyo seçin; Yavruların% 25 Transgenin 2 kopyalarını taşıyan homozigot embriyolar olmalıdır. Gerekli tespit embriyo sayısı deney göre değişir. Bir disseke tailbud parça ortalama 1.000 hücreleri verecektir. Tipik olarak, birkaç ek olumlu embriyolar durumda hatalar diseksiyonu sırasında yapılan yararlıdır. </li><li> Sinyal, özellikle yumurta sarısı hücrede, bir otoflüoresanı ayırt etmek için bir konum referansı olarak iletilen ışık kullanın. </li><li> Metilen mavisi olmadan E3 ortamı içeren ayrı bir plastik petri olumlu embriyolar transfer. </li></ol></li></ol> 2.. PSM Diseksiyon ve Dağılma <ol><li> Diseksiyon için embriyolar hazırlayın. <ol><li> Diseksiyon mikroskobu altında, ince forseps kullanarak, dikkatli bir şekilde E3 ortamda her embriyo koryon çıkarın. Embriyo zarar veya sarısı hücreyi bozmak için değil emin olun. </li&gt; <li> Dolgu serum ile L15 orta ile diseksiyon çanak Sylgard kaplı. Forseps ya da başka düz aracını kullanarak, Sylgard yüzeyinden hava kabarcıkları. </li><li> Diseksiyon çanak yangın parlatılmış cam pipet kullanarak dechorionated embriyolar transfer. </li><li> Tel araçlarını kullanma, diseksiyon çanak bir tarafında tüm embriyoları taşımak. </li></ol></li><li> Tek embriyo PSM ayır. <ol><li> Orient de kesme çanak (Şekil 1 B) içindeki Sylgard katmanda yapılan küçük yan yüzeyi üzerinde tek bir embriyo. </li><li> Embriyo ve yumurta sarısı hücresi boyunca mikro-neşter, dilim kullanarak sadece arka beyin ve (kırmızı çizgi noktalı Şekil 1B) embriyonun ventral kutbu üzerinden anterior. </li><li> Yemeğin tarafına onu hareket, kuyudan embriyo ön parçasını çıkarın ve sonra da PSM da dahil olmak üzere arka bölümünden uzakta kalan yumurta sarısı hücre granüller kazımak için tel araçları. </li><li>Sarısı kazınarak edildikten sonra, düzleştirmek ve uzak deneyci işaret eden ön ucu ile PSM ve deneyci (Şekil 1C) doğru işaret posterior yönlendirin. </li><li> Ektoderm ince tabaka bu noktada çıkardı değilse, uzak PSM dokusunun üst onu soymak için tel araçlarını kullanın. </li><li> Mikro neşteri kullanarak uzak doku (kırmızı noktalı çizgi Şekil 1C) geri kalanından tailbud, Notokordun sonunun PSM&#39;sinin en arka ucu, kesti. Not: PSM gelen doku diğer parçaları, örneğin, ön PSM için yakın son hücre gruplarının oluşturduğu için, aynı deneysel soruna bağlı olarak, kültüre alınabilir. </li><li> Uzakta Diseksiyon alanından yemeğin bir köşesine tailbud taşı. Diseksiyon alanında herhangi bir enkaz ve istenmeyen embriyo doku temizlemek için tel araçlarını kullanın. </li><li> Sonraki embriyo ile tekrarlayın. </li></ol></li><li> Birden fazla e Havuz tailbud parçalarmbryos, deney için gerekli olacak kaç hücre bağlı olarak değişir. Ortalama olarak, tailbud doku tek bir parça 1000 hücreleri elde edilir. </li><li> Tripsin-EDTA küçük bir hacim ile boş 35-mm plastik çanak doldurun. </li><li> Yangın parlatılmış cam pipet kullanarak, tripsin / EDTA içeren çanak içine diseksiyon çanak dan tailbud parçaları aktarmak. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca tripsin / EDTA içinde tailbud parçaları inkübe edin. </li><li> Doku tripsin inkübe edilirken, cam tabanlı bir görüntüleme çanağından Fibronectin1 uzaklaştırın. <ol><li> MilliQ su ile cam 3 kez çözeltisi yıkayın. Her yıkama kaldırmak ve çanak tamamen kuru olduğundan emin olmak için emme kullanın. </li></ol></li><li> Görüntüleme için bir ortam içinde tailbud parçaları dağıtılır. <ol><li> Görüntüleme çanak içine serum ile L15 orta 100 ul pipet. </li><li> Kaplanmış bir jel ucunu kullanarak, mümkün olduğu kadar küçük bir hacim içinde tripsin / EDTA tailbud parçaları çıkarın. </li><li> Içindeki ortam içine tailbud parçaları Pipetgörüntüleme çanak. Birbirinden kırmak ve orta hücreleri askıya yukarı ve aşağı birden çok kez adet Pipet. Hava kabarcıkları tanıtmak için dikkatli olun. Mikroskop altında hücre kümeleri için kontrol edin ve gerekiyorsa daha fazla dağılırlar. </li><li> Süspansiyon içinde dağılmış hücreler oda sıcaklığında 20 dakika boyunca Fibronectin1 kaplı cam üzerine yerleşmek için izin verin. </li></ol></li><li> Görüntüleme başlamadan önce, hücrelere serum ilave L15 ortamı küçük bir hacim. Yerleşik hücreleri bozmak için değil dikkatli olun. </li><li> Deney sorun dikkate alındığında, kültüre bir tamamlayıcı ya da ilaç tedavisi ekleyin. </li></ol> Dağınık PSM hücrelerinin 3. Görüntüleme <ol><li> Time-lapse görüntüleme mikroskobu sıcaklık odasında görüntüleme çanak kurmak. Deney için istenen sıcaklığa Warner odası ayarlayın. Çanak görüntü elde etme başlamadan önce en az 30 dakika boyunca dengelenmeye bırakın. Gerekirse, dış sıcaklık probu ile Crosscheck sıcaklık, çanak içine yerleştirilmiştir. NOT: Nedeniylesıcaklık ve somitogenesis oranı 21 stabil sıcaklık kontrolü arasındaki ilişki tek PSM hücrelerinde dönemin hassas ölçümler için gereklidir. </li><li> Maruz kalma süresi ve kazanç gürültü düzeyleri için iyi bir sinyal sağlamak için doygunluk olmadan şiddetlerinin geniş bir dinamik aralığı sağlamak olduğunu kontrol etmek için floresan kanal test görüntü kazanır. Bu protokolü kullanarak bizim hatları oluşturulan dağılmış hücrelerden alınan tipik bir floresan görüntü 85 EM Kazancı çalışan bir EMCCD kamera ile iletilen ışık görüntü için 400 msn ve 40 msn gerektirir. Gelen ek olarak, pre-amp kazancı ve okuma hızı Kamera aynı zamanda gürültü üzerinden sinyal üst düzeye çıkarmak için gereklidir. </li><li> Iletilen ışık kanalını kullanarak, time-lapse edinimi için hücrelerin alanları seçin. </li><li> Zaman istenilen uzunlukta için time-lapse edinimi protokolü çalıştırın. <ol><li> Bir iletilen ışık ve alan başına bir floresan görüntü kazanır. NOT: iktisap ro arasındaki aralığı ayarlayınhücrelerde genişletilmiş görüntüleme veya uyaran toksisite üzerinde fotoğraf çizmeden zamansal dinamiklerini yakalamak olacaktır unds. Bu protokol 2 dk aralığını kullanır. </li></ol></li><li> Hücreler, herhangi bir yazılım veya donanım hataları, vb odak içinde kalmasını sağlamak için kayıt sırasında zaman zaman atlamalı set Check-up </li></ol> Edinsel Time-lapse Filmler 4. Görüntü İşleme <ol><li> Açık film bir görüntü işleme yazılımı kazanılmış bir alan için dosya. NOT: Bu protokol Fiji tüm işlem için kullanılmıştır. <ol><li> Bölünmüş görüntülerin 2 yığınlar oluşturmak için tek bir alandan ışık ve floresan çerçeveleri iletilir. </li></ol></li><li> Iletilen ışık kanalda bir tek hücre izlemek. <ol><li> Iletilen ışık kanalında ilk çerçevede seçilen hücrenin etrafında dairesel bir ROI (region of interest) yerleştirin. . NOT:. 1. kaydın sonunda sağlıklı Yalnızca hücreler, 2 alanın dışında hareket etmiyor ve 3 diğer ce ile temas yoktur.lls izlenir. </li><li> Bir ROI ROI yöneticisi her birkaç kare kaydedin. Son kareye kadar hücre izlemek. </li></ol></li><li> Floresan kanalda kayıtlı İB&#39;leri kullanarak yoğunluğunu ölçün. <ol><li> Floresan yığını seçin ve kaydedilen ROI&#39;ler ile zamanla izlenen hücre yoğunluğunu ölçmek için özel daire interpolator plug-in ve makro kullanabilirsiniz. </li><li> Makro çıkış izi kontrol edin. Iz niteliksel floresan time-lapse özelliklerini yakalar, bir Excel çalışma sayfasına değerleri ihracat. </li><li> Hücre için ROI listesini kaydedin. </li></ol></li><li> Iletilen kanal izleme ve alandaki diğer hücreler için floresan kanal ölçme tekrarlayın. </li><li> Deneyden ek alanlar için tüm adımları tekrarlayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Cooke, J., Zeeman, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clock+and+wavefront+model+for+control+of+the+number+of+repeated+structures+during+animal+morphogenesis.">A clock and wavefront model for control of the number of repeated structures during animal morphogenesis.</a> J Theor Biol. 58, 455-476 (1976).</li><li>Oates, A. C., Morelli, L. G., Ares, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+embryos+with+oscillations:+structure,+function+and+dynamics+of+the+vertebrate+segmentation+clock.">Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock.</a> Development. 139, 625-639 (2012).</li><li>Dequeant, M. L., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmental+patterning+of+the+vertebrate+embryonic+axis.">Segmental patterning of the vertebrate embryonic axis.</a> Nat Rev Genet. 9, 370-382 (2008).</li><li>Oates, A. C., Gorfinkiel, N., Gonzalez-Gaitan, M., Heisenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+approaches+in+developmental+biology.">Quantitative approaches in developmental biology.</a> Nat Rev Genet. 10, 517-530 (2009).</li><li>Oates, A. C., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy/E(spl)-related+(Her)+genes+are+central+components+of+the+segmentation+oscillator+and+display+redundancy+with+the+Delta/Notch+signaling+pathway+in+the+formation+of+anterior+segmental+boundaries+in+the+zebrafish.">Hairy/E(spl)-related (Her) genes are central components of the segmentation oscillator and display redundancy with the Delta/Notch signaling pathway in the formation of anterior segmental boundaries in the zebrafish.</a> Development. 129, 2929-2946 (2002).</li><li>Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinhibition+with+transcriptional+delay:+a+simple+mechanism+for+the+zebrafish+somitogenesis+oscillator.">Autoinhibition with transcriptional delay: a simple mechanism for the zebrafish somitogenesis oscillator.</a> Curr Biol. 13, 1398-1408 (2003).</li><li>Schroter, C., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segment+Number+and+Axial+Identity+in+a+Segmentation+Clock+Period+Mutant.">Segment Number and Axial Identity in a Segmentation Clock Period Mutant.</a> Curr Biol. 20, 1254-1258 (2010).</li><li>Riedel-Kruse, I. H., Muller, C., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchrony+dynamics+during+initiation,+failure,+and+rescue+of+the+segmentation+clock.">Synchrony dynamics during initiation, failure, and rescue of the segmentation clock.</a> Science. 317, 1911-1915 (2007).</li><li>Ozbudak, E. M., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+synchronizes+the+zebrafish+segmentation+clock+but+is+not+needed+to+create+somite+boundaries.">Notch signalling synchronizes the zebrafish segmentation clock but is not needed to create somite boundaries.</a> PLoS Genet. 4, e15 (2008).</li><li>Herrgen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+Coupling+Regulates+the+Period+of+the+Segmentation+Clock.">Intercellular Coupling Regulates the Period of the Segmentation Clock.</a> Curr Biol. 20, 1244-1253 (2010).</li><li>Sawada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf/MAPK+signalling+is+a+crucial+positional+cue+in+somite+boundary+formation.">Fgf/MAPK signalling is a crucial positional cue in somite boundary formation.</a> Development. 128, 4873-4880 (2001).</li><li>Giudicelli, F., Ozbudak, E. M., Wright, G. J., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+the+tempo+in+development:+an+investigation+of+the+zebrafish+somite+clock+mechanism.">Setting the tempo in development: an investigation of the zebrafish somite clock mechanism.</a> PLoS Biol. 5, e150 (2007).</li><li>Herrgen, L., Schroter, C., Bajard, L., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+embryo+time-lapse+imaging+of+zebrafish+development.">Multiple embryo time-lapse imaging of zebrafish development.</a> Methods Mol Biol. 546, 243-254 (2009).</li><li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+expression+of+the+bHLH+factor+Hes1+regulated+by+a+negative+feedback+loop.">Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop.</a> Science. 298, 840-843 (2002).</li><li>Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronised+cycling+gene+oscillations+in+presomitic+mesoderm+cells+require+cell-cell+contact.">Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact.</a> Int J Dev Biol. 49, 309-315 (2005).</li><li>Reppert, S. M., Weaver, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+circadian+timing+in+mammals.">Coordination of circadian timing in mammals.</a> Nature. 418, 935-941 (2002).</li><li>Welsh, D. K., Imaizumi, T., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+reporting+of+circadian-regulated+gene+expression+by+luciferase+imaging+in+plants+and+mammalian+cells.">Real-time reporting of circadian-regulated gene expression by luciferase imaging in plants and mammalian cells.</a> Methods Enzymol. 393, 269-288 (2005).</li><li>Soroldoni, D., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+transgenic+reporters+of+the+vertebrate+embryo's+Segmentation+Clock.">Live transgenic reporters of the vertebrate embryo's Segmentation Clock.</a> Curr Opin Genet Dev. 21, 600-605 (2011).</li><li>Masamizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+the+somite+segmentation+clock:+revelation+of+unstable+oscillators+in+the+individual+presomitic+mesoderm+cells.">Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1313-1318 (2006).</li><li>Soroldoni, D., Hogan, B. M., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+transgenesis+with+meganuclease+constructs+in+zebrafish.">Simple and efficient transgenesis with meganuclease constructs in zebrafish.</a> Methods in molecular biology. 546, 117-130 (2009).</li><li>Schroter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+zebrafish+somitogenesis.">Dynamics of zebrafish somitogenesis.</a> Dev Dyn. 237, 545-553 (2008).</li><li>Picker, A., Roellig, D., Pourquie, O., Oates, A. C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+micromanipulation+in+zebrafish+embryos.">Tissue micromanipulation in zebrafish embryos.</a> Methods in molecular biology. 546, 153-172 (2009).</li><li>Mould, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multiple+integrin+beta1+homologs+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Identification of multiple integrin beta1 homologs in zebrafish (Danio rerio).</a> BMC Cell Biol. 7, 24 (2006).</li><li>Mould, A. P., Koper, E. J., Byron, A., Zahn, G., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+ligand-binding+pocket+of+integrin+alpha5beta1+using+a+gain-of-function+approach.">Mapping the ligand-binding pocket of integrin alpha5beta1 using a gain-of-function approach.</a> Biochem J. 424, 179-189 (2009).</li><li>Zhao, Q., Liu, X., Collodi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+fibronectin+in+zebrafish.">Identification and characterization of a novel fibronectin in zebrafish.</a> Exp Cell Res. 268, 211-219 (2001).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+The+zebrafish+book+:+a+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Brachydanio+rerio).">In The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio).</a> , (1993).</li><li>Vallone, D., Santoriello, C., Gondi, S. B., Foulkes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+protocols+for+zebrafish+cell+lines:+maintenance+and+transfection.">Basic protocols for zebrafish cell lines: maintenance and transfection.</a> Methods Mol Biol. 362, 429-441 (2007).</li><li>Carr, A. J., Whitmore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+single+light-responsive+clock+cells+reveals+fluctuating+free-running+periods.">Imaging of single light-responsive clock cells reveals fluctuating free-running periods.</a> Nat Cell Biol. 7, 319-321 (2005).</li><li>Whitmore, D., Foulkes, N. S., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+acts+directly+on+organs+and+cells+in+culture+to+set+the+vertebrate+circadian+clock.">Light acts directly on organs and cells in culture to set the vertebrate circadian clock.</a> Nature. 404, 87-91 (2000).</li><li>Soroldoni, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Doppler+effect+in+embryonic+pattern+formation.">A Doppler effect in embryonic pattern formation.</a> Science. 345, 222-225 (1126).</li></ol>

Yazar Katılımlar: ABW geliştirilen ve dağılma, kültür, görüntüleme ve hücre izleme protokolleri rafine. DS transgenik hatları oluşturulur ve bu protokolde kullanılan time-lapse floresan mikroskop tasarımını yönetti. AO ayırmak için ilk kanıt-prensibi deney öncülük ve kültür görüntü PSM hücreler. JS time-lapse film floresan yoğunluğunu ölçmek için kullanılan Fiji daire interpolator eklenti aracı yazdı. ABW ve ACO el yazması yazdı.

Embriyonik gelişim boyunca yer alan bir hücresel süreç çalışma için, biyologlar tipik olarak tüm embriyo bağlamında bir yaklaşımı kullanır. Ancak, tam bir tek hücre gelişimsel bir zaman çerçevesinde nasıl davrandığını anlamak, incelemek ve izolasyon bireysel hücrelerin perturb bir yöntem de son derece faydalıdır. Transgenik zebra balığı embriyoları kullanılarak dağıtıldı PSM hücre kültürleri üreterek artık doğrudan bir nicel şekilde segmentasyon saat genetik salınımlarının hücre özerk doğasını incelemek için bir araç var. Bu, çeşitli koşullar altında hücre yüzlerce bizim floresan haberci olarak salınım dinamiği ölçmek mümkündür. Kültür içinde tek hücre gözlenen süre sağlam embriyo somitogenesis süresinden daha uzundur. Bu kültürde, bozulmamış bir PSM eksplant da tha düşündüren, dokunulmamış embriyo (veriler gösterilmemiştir) daha yavaş salınımların sergiler gözlemlemekt izole edilmiş hücrelerde gözlemlenen daha uzun bir süre dağılımı gelen hasara karşı sadece bağlı değildir. Bir değişken periyodu ve genliği bizim tek hücreli zaman serilerinin çoğunda görülmektedir. Bu değişkenlik kaynağı bilinmiyor, ancak segmentasyon saatin hızı verme devreleri hakkında önemli ayrıntılar ortaya koymalıdır. Bu yöntem ile biz bütün embriyo incelemek için zorlu genetik hücresel düzeyde segmentasyon bileşenleri ve adres çalışma soruları olabilir. Örneğin, kültürlere gelişen embriyonun bulunan bilinen sinyal molekülleri kontrollü eklenmesiyle, bir sağlam ve tekrarlanabilir bir deneyde bir PSM hücre osilatör üzerindeki etkilerini incelemek. Bizim PSM kültür sistemi bu titreşimleri engelleyen faktörler neler, yalnız, faktörleri, veya birlikte, bu hücrelerde salınımı teşvik ne bir titiz değerlendirme için kapıyı açar, ve bu tür moleküller arasındaki etkileşimi test etmek. Elinde Bu araçları ile, biz hedefliyoruzBütün embriyo test edilebilir tahminler üretmek için tek bir hücre içinde yayınlanan doku düzey veri yanı sıra, kullanım sonuçlarına dayalı somitogenesis mevcut modellerini değerlendirir. Bildiğimiz kadarıyla, bu tek hücre floresan akut time-lapse kayıt için ilk Zebrafish birincil hücre kültürü protokolü; Bu protokolün daha da geliştirilmesi ve arıtma mümkün kuşkusuz. Diğer protokoller genellikle muhabir ile transfekte edilmiş ve uzun süreli görüntüleme 27-29 için kullanılabilecek kararlı hücre kuşaklarının üretilmesi için zebra balığı embriyolar kullanın. Kararlı çizgiler gibi sirkadiyen saati geliştirme zamanlaması, bağlı olmayan bir süreç görüntüleme için yararlı olmakla birlikte, hücreler salınımlı, öncül devlet hala iken, embriyonik segmentasyon soru acil görüntüleme gerektirir. Hücreler salınan durdurmak sonra, onlar dokuda, bir hücre gruplarının dahil olacağını zaman bir farklılaşmış hücre kaderi varsayalım, ve. Bu poDoğru faktörü veya in vitro olarak mevcut faktörler ile önemli ölçüde daha uzun vadeli gözlemler, birden çok ardışık bozulmaları, ya da yüksek verimli tarama sağlayan titreşimli kalacağını PSM-benzeri zebra balığı hücre kültür hatları oluşturmak olabilir ssible. Biz zaman atlamalı görüntüleme için dağılmış hücrelerden primer kültürü hazırlama, bu yöntem kararlı Zebrafish hücre hatları kullanılarak ulaşılabilir değildir gelişimsel bir zaman dilimi içinde meydana gelen herhangi bir hücresel sürecin çalışması için çok uygun olduğunu düşünüyoruz. Diseksiyon ile veya FACS ile ya da uygun bir transgenik raportör hatlardan farklı gelişim aşamalarında farklı hücre tiplerinin izolasyonu embriyonik ayrıldıktan sonra, başlangıç ​​hücreleri sağlayabilir. Hücrelerin embriyo tarafından yönlendirilen kültür koşulları, bazı optimizasyonu, gerekli olabilir. Transgenik zebrafish hızla büyüyen koleksiyonu ile bu esnek ve hassas protokol birleştirerekçizgiler, biz klasik genetik ve embriyolojik yöntemlere tamamlayıcı olan bir in vitro gelişim biyoloji yaklaşımı kolaylaştırmak istedik.

Omurgalı vücut ekseni, ya da somitogenesis boyunca bölümlerinin periyodik oluşumu, gelişmekte olan embriyonun bir mekansal ve zamansal osilatör kanıtıdır. Somitogenesis kontrol tercih mekanizması kavramsal şimdi hücre siklik genlerin 2 bir dizi ritmik ifadesi tarafından tahrik edilmesi düşünülen hücresel osilatörler oluşan &quot;saat&quot;, oluşumunu kapalı keneler buradaki bir &quot;saat ve Wavefront&quot; modeli 1, tarafından açıklanan bir Somitlerin presomitic mezoderm (PSM) dan. Embriyo geliştikçe, PSM bir olgunlaşma &quot;Wavefront&quot; yavaşlatma ve 3 geçer gibi hücresel osilatörler tutuklanması, posterior doğru gerileyen dokusu ile uyum içinde hareket eder. Birlikte, bu spatiotemporally dinamik sistem bölümleme saati denir. Segmentasyon saat SPAN yerel bağlama inci tek hücrelerde genetik osilatör gelen üç organizasyon artan düzeyde çalışma Güncel yaklaşımlar, hücreler ve son olarak toplu doku PSM 4 konum bilgileri ve küresel düzenlemeye arasında ortaya çıkar. Önceki çalışmalar zebrabalıkları hücre özerk segmentasyon osilatör transkripsiyon baskının 5-7 ile bir negatif geri besleme döngüsü oluşturmak için düşünülen factorfamily onun / hes transkripsiyon, genlerin ve protein ürünlerden oluşmaktadır öneririz. Delta / Çentik sinyal yolu komşu hücreler arasındaki salınımlar eşitler ve nüfusun 8-10 toplu süre düzenler. Tailbud üretilen fgf sinyal molekülleri Zebrafish PSM degrade oluşturmak için görünür ve böylece anterior 11 salınan hücreleri yavaşlama ve tutuklamaya katkıda varsayılır. Şimdiye kadar, somitogenesis bu moleküllerin her birinin fonksiyonel rolleri genetik mutasyon, morfolino enjeksiyon, ısı-şok aşırı ifadesi ve antagonist ilaç trea tarafından incelenmiştirsaat bileşenleri ve hücreler arası sinyal 5,7,10,12 tment. Bu tedirginlikler kullanarak, segmentasyon saat fonksiyonu doku düzeyinde somite kusurları açıklamaları ve Her1, her7 ve delta gibi döngüsel genlerin ifadesinde üniforma salınımlarının kaybı olayla olmuştur C. Ancak, neredeyse tüm bu verilerin sabit embriyolar ve doğru bir segmentasyon saatin dinamik işlevi doğasında olan değişiklikleri yakalamak için başarısız. Daha yakın zamanlarda, birden fazla embriyo time-lapse görüntüleme değişmiş osilatör dönemi ile ilk mutantlar ortaya koymuştur, ancak bu gözlemler, aynı zamanda doku seviyesi 7,13 yapılmıştır. Bu nedenle, somitogenesis sırasında varsayılmış hücreye otonom osilatör davranışı gözlenmemiştir. Doğal olarak, işlem, bir titreşimli sistem tarafından tahrik edilir, çünkü somitogenesis statik anlık eksik bir görüntü verir. Fare ve civciv hücrelerinde önceki çalışmaları gösterdi transkript düzeylerive protein yükselişi ve düşüşü, ancak yaklaşık 2 saat salınım her 30 veya 45 dakika örnekleme mutlaka toplanan veri ve 14,15 çizilebilir nedenle sonuçlar kısıtlar. Diğer biyolojik osilatörler çalışma, en önemlisi, sirkadiyen saatler, gerçek-zamanlı floresan ve biyolüminesens gazetecilere 16,17 kullanarak izleme uzak gen ve protein ifade sahnelenen ölçümlerinden taşındı. Bu araçlar tek hücreler 18 saat özelliklerini göstermek için gereklidir. Hes1 siklik geninin bir bio-ışıldar haberci geliştirilmiş ve kısa bir süre için tek bir fare PSM hücre 19 ile karakterize edilmiştir. Ortalama süresi ve varyans salınımlar in vitro çok döngü boyunca devam olduğunu gösteren küçük bir hücre sayısı hesaplandı. Ancak bu çalışmalar kantitatif hücreleri kendiliğinden girmek veya çıkmak salınımlar olup olmadığını, osilatör frekans ve genlik kararlılık ve sağlamlık ele vermedi,ve nasıl hücreler faz ilişkileri sürdürmek. Buna ek olarak, hücre-özerk saati embriyo bulunan sinyal molekülleri etkiler, test edilmemiştir. Sonuç olarak, tek bir hücre osilatör bu temel özellikleri tamamen bilinmemektedir. Biz son zamanlarda Her1 ifade 30 Venüs (YFP) floresan gazetecilere sürücü BAC Recombineering 20 kullanılarak transgenik balık hatları geliştirdik. Bu çizgiler gömülü ve temporal dinamikleri ve Her1 uzamsal desen özetlemek edildiği dokunulmamış kromozomal düzenleyici ipuçları yararlanılmaktadır. Bu buluş, in vivo, gelişmekte olan embriyonun zebrafish gen ifadesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Temel hücre özerk salınım özellikleri ve ne tür ifade zaman içinde düzenlenir incelemek için, son zamanlarda in vitro PSM hücrelerinden izole etmek ve kaydetmek için güvenilir bir yöntem geliştirdi. Bu protocol biz tek hücrelere Zebra balığı segmentasyon saatin salınımlarını karakterize hangi dağınık hücre kültürleri, üretmek bizim transgenik muhabiri hatları kullanmıştır anlatıyor. Biz böylece üstün statik veya doku düzeyinde analiz ile erişilebilir değil alanındaki soruları, hem de doğrudan sinyal molekülleri ve inhibitörleri ile tek hücre düzeyinde segmentasyon saatini manipüle üstesinden gelebilirsiniz.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epifluorescence microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>Model: SZX16</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epifluorescence microscope</td>
 <td>X-cite Illumination</td>
 <td>Series: 120Q</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>Model: SZX12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps no. 55</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11295-51</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass transfer pipettes</td>
 <td>Assistent</td>
 <td>567/2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm plastic petri dishes</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>627102</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60 mm plastic petri dishes</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>628102</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard polymer</td>
 <td>SASCO</td>
 <td>266727</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manipulation tools</td>
 <td>Made in-house</td>
 <td></td>
 <td>For description of manipulation tools Ref. 22</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microsurgical knife</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>500249</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L15 medium</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>57322</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin/streptomyocin</td>
 <td>PAA</td>
 <td>P11-010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal bovine serum</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>257322</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.05% trypsin / 0.02% EDTA</td>
 <td>PAA </td>
 <td>L11-004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gel loading tips</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>253188</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sigmacote</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>254589</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micropipette set</td>
 <td>Gilson International</td>
 <td>F167300</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Zebrafish Fibronectin1 70 kD fragment</td>
 <td>MPI-CBG protein facility</td>
 <td></td>
 <td>Generated in-house from construct based on previously published work Ref. 23-25</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass bottom imaging dishes</td>
 <td>Mattek (single well)</td>
 <td>P35G-1.5-14-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass bottom imaging dishes</td>
 <td>Greiner (CellView -multi-well)</td>
 <td>262502</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E3 medium without methylene blue</td>
 <td>Made in-house</td>
 <td></td>
 <td>From The Zebrafish Book, 5th Ed. Ref. 26 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic transfer pipettes</td>
 <td>Ratiolab</td>
 <td>260011</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Warner heating/cooling chamber</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>TC-324B/344B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EM-CCD camera</td>
 <td>Andor</td>
 <td>Model: iXOn 888</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>Model: Axiovert 200M</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td></td>
 <td>NeoFluor 40x, NA 0.75</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td>Lumencor Light Engine</td>
 <td>Model: Spectra X</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td>BrightLine HC 575/15</td>
 <td>F39-575</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

generation of dispersed presomitic mesoderm cell cultures for imaging of the zebrafish segmentation clock in single cells

Segmentasyon omurgalılarda bir periyodik ve ardışık morfojenetik süreçtir. Vücut ekseni boyunca Somitlerin denilen doku blokları bu ritmik oluşumu gelişen embriyo desenlendirme genetik osilatör kanıtıdır. Zebra balığı, hücre içi saat sürüş segmentasyon negatif geri besleme döngüleri halinde organize Onun / Hes transkripsiyon faktörü ailesinin üyelerinden oluşur. Biz son zamanlarda presomitic mezoderm (PSM) içinde salınımlarının uzay-zamansal desen özetlemek döngüsel gen Her1 için transgenik floresan muhabiri hatları yarattı. Bu satırları kullanarak, tek, izole PSM hücrelerin içinde segmentasyon saat salınımlarının gerçek zamanlı analiz sağlayan in vitro kültür sistemi geliştirdi. Transgenik embriyolar PSM dokusunun çıkartılması ve daha sonra cam alt yemekler üzerine bölgelerini salınan hücreleri dağıtılarak, biz floresan sinyalinin zaman atlamalı görüntüleme gelen uygun kültürleri oluşturulanBireysel saat hücreleri. Bu yaklaşım kendi hücre-özerk ve doku düzeyi özellikleri ayırt ve disseke izin vererek, görülmemiş tek hücreli çözünürlükte segmentasyon saatin doğrudan manipülasyon için bir deneysel ve kavramsal bir çerçeve sunmaktadır.

Bu protokol floresan sinyalinin zaman atlamalı görüntüleme (Şekil 2) için uygun, dağınık, tek PSM hücre kültürleri üretir. Bizim transgen olan döngüsü üretimi ve yıkımı yarım saat emriyle embriyo endojen gen ve protein, benzer dinamikleri ile oluşan bir muhabir oluşturur. Nedeniyle, hızlı devir için, tek hücreler içinde YFP sinyal ağartma en aza indirmek için hızlı bir şekilde tespit edilir ve her bir salınım döngüsü özelliklerini yakalamak için yüksek zamansal çözünürlüğe sahip olmalıdır. Ayrıca, sinyalin göreli dimness verilen, kültür ve satın alma koşulları dikkatle hassas ve sağlam sonuçlar sağlamak için ayarlanmış edilmiştir. . Cam alt kültür kaplarına kaplanması için kullanılan bir ECM 1 alt-tabaka: Bu görüntüleme için en iyi PSM hücre kültürleri elde edilmesinde önemli olduğu şu faktörler bulduk. 2.. Diseksiyon ve görüntüleme ortamına serum eklenmesi. HETE çiftleşme sonrası alınan tespit embriyolardan PSM&#39;nin 3. Diseksiyonolan yavrular potansiyel Transgenin 2 kopyasını taşıyan rozygous çiftleri. Floresan sinyalin etkin yakalama sağlamak için daha yüksek bir NA objektif kullanarak optimal bir büyütme aralığında 4. Görüntü elde edilmesi,. 5.. Arka plan gürültü katkıda bulunabileceğini yoğunluk dalgalanmaları en aza indirmek için bir katı-hal ışık kaynağı ile aydınlatılması. 6.. Son derece hassas EM-CCD kamera ile Sinyal algılama sinyali okuma üst düzeye çıkarmak. Alt-optimal kültürleri kayıt boyunca yuvarlak ve sağlıklı kalması gerekmez hücreleri içerir. Biz ECM alt-tabaka, zebra balığı fibronectin1 bir fragmanı ya da poli-lisin, laminin gibi diğer yaygın olarak kullanılan alt-tabakalar ile karşılaştırıldığında, farklılaşmamış bir PSM-benzeri halde hücreleri tutan varsayıldı. Test Diğer alt-tabakalar hücreler kaydın boyunca cam ve salınan fluoresan sinyalinin kaybı düzleştirmek neden oldu. Ayrıca bulundu Diseksiyon sırasında ortama serumunun eklenmesi, dağılma,ve kayıt sadece ayrışması için kullanılan tripsin söndürmek için önemli değil, aynı zamanda geliştirilmiş nedeniyle hücre canlılığı muhtemel arka plan üzerinde floresan yoğunluğu, artmıştır. Tek hücre optimal sinyal yakalama sağlamak için bir yüksek NA ile spesifik floresan görüntüleme (Zeiss Planı NeoFluor serisi) için tasarlanmış bir 40x objektif kullanılır. Ayrıca, bir katı-hal ışık kaynağı gürültülü görüntüleri katkı plan dalgalanmaları en aza indirmek için kritik geleneksel cıva lambaları, daha stabil bir aydınlatma sağlanmaktadır bulundu. Bu değişiklikler sonucu sağlamak için önemlidir. Bu protokol kullanılarak beklenen belirli bir alanda hücrelerin çoğunluğu kayıt sırasında bir noktada floresan edildiği kültürler. Biz floresan hücreler tipik kayıtları sırasında bazen oldukça hareketli yuvarlak kalır ve olduğunu bulmak. Floresan hücreler de dahil olmak üzere bir kaç hücreleri, kayıt sırasında apoptotik olabilir. Bu hücreler, herhangi bir a hariç tutulmuşturnalysis. Ayrıca, diğer hücrelerle temas hücreleri hariç veya görüş alanının dışında hareket eder. Iletilen ışık kanalda sağlıklı hücrelerin sayısının sayılmasıyla ölçüldü Ortalama olarak, biz 10 saat kaydının sonuna kadar alan başına hücre sayısında% 12 azalma bkz. Bu kayıp, hücre ölümü ve alanının dışına taşındı hücreleri içerir. Bu uyarılar göz önüne alındığında biz, ortalama, tipik parça 5 florasan canlı ve görünür alan başına hücreleri ve durumuna başına 6 alanlarını kaydedebilirsiniz. Örneğin, 4 koşullara sahip bir deney 24 toplam alanları tipik durum başına yaklaşık 30 paletli hücreleri edinilen ve olacaktır. % 10 fetal inek serumu ihtiva eden L15 ortam maddesi ile standart görüntüleme koşullarında, PSM hücrelerinin (4 deney tekrarlanmış olan n = 101 hücreleri) 3 ± 1 tepe (2 ortalama ve standart sapma ile birlikte, 2 ve 7 tepe arasında üretebilir bulmak -3 siklus). Medyan peak sayısı, hem de% 25 yüzde, 2 tepe noktası ve% 75 yüzde i3. zirveleri var. Bizim yarı otomatik bir izleme ve analiz kullanarak, hızlı bir şekilde Şekil 2C&#39;de gösterilen temsili bir hücre iz, tek tek hücreler için PSM zaman izleri üzerinde floresan yoğunluğu oluşturabilir. Bu ham izleri daha sonra, frekans, genlik, döngü sayısı ve tepe zamanlaması olarak salınımlı PSM hücrelerinin özelliklerinin sayısal ölçümler yapmak için kullanılabilir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50307/50307fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50307/50307fig1.jpg" /> ~ 5-somite aşamada YFP floresan ifade eden bir transgenik zebrafish embriyo kendi diseksiyonu transgenik embriyolar ve şemaları Şekil 1.. Kimlik. (A) Yanal görünümü. Görüntü iletilen ışık ve floresan kanal bir bindirme olduğunu. Oklar l doğru, PSM boyunca tailbud ucundaki başlangıç ​​sinyalinin alanlarını gösterir<html> ast hücre gruplarının kurdu. Ankastre gelişimi ve in vivo davranışlarında daha fazla bilgi için Soroldoni vd. 30&#39;a bakın. Ilk diseksiyonu sırasında kesmek için önce embriyonun lateral görüntüsü (B) şematik. Noktalı kırmızı çizgi ilk kesim gösterir (raportör transgen bir şematik sadece tailbud sarısı granüller ve anterior-posterior ekseni boyunca yönlendirilmiş epidermal tabakasının ayrılmasından sonra yassı PSM&#39;nin. (C) şematik görünümü arkasında sarısı hücre. noktalı kırmızı çizgi ucu kaldırmak için ikinci kesimini göstermektedir da, arka beyin boyunca yapılan dağılma ve kültür için tailbud ait. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50307/50307fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> 07fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. Dağınık bir PSM kültüründe bir tek hücreden Temsilcisi görüntüler ve izler. (A) Kurulma bir 6-saat time-lapse kayıt tek PSM hücrenin ışık görüntülerini iletilir. Hücre kaydın kurs boyunca yuvarlak ve sağlıklı kaldığına dikkat edin. (B) tek bir hücreden PSM floresan görüntülerin karşılık gelen montaj. Hücre yoğunluğundaki pikleri kaydın boyunca numaralandırılır. Bu hücreye yerleştirilmiş bir ROI ölçüldüğü zaman (C) ortalama yoğunluğu. Değerler Fiji yazılı daire interpolator plug-in ve özel makro kullanarak 2 dakika başına birinin bir kare hızı ile bir film her karede alınır. Yoğunluk zirveleri tekrar iz boyunca numaralandırılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50307/50307fig2highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells at JoVE.com

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Somitogenesis ritmik bir gelişimsel süreç olduğu mekansal desenler, embriyonun vücut ekseni. Daha önce, biz bu süreci götürmek döngüsel genleri gözlemlemek için floresan gazetecilere kullanmak transgenik zebra balığı hatları geliştirdik. Burada, kültür in vitro zamanla bu satırları ve görüntü onların salınımların hücreleri dağınık.

Tek Hücrelerde Zebra balığı Segmentasyon Clock Görüntüleme Dağınık Presomitic Mesoderm Hücre Kültürleri Üretimi

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

generation-dispersed-presomitic-mesoderm-cell-cultures-for-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K Görüntüleme.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics.  Somitogenesis ritmik bir gelişimsel süreç olduğu mekansal desenler, embriyonun vücut ekseni. Daha önce, biz bu süreci götürmek döngüsel genleri gözlemlemek için floresan gazetecilere kullanmak transgenik zebra balığı hatları geliştirdik. Burada, kültür in vitro zamanla bu satırları ve görüntü onların salınımların hücreleri dağınık. 

Video: Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Zebra balığı Tek Hücre Kader Haritalama

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Biyoloji

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Morpholinos in vivo Elektroporasyon Yetişkin Zebra balığı Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

Yenileyici Yetişkin Zebra balığı Tail Fin içine Morpholinos in vivo olarak Elektroporasyon

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks (reviewed1,2). The circadian time-keeping system is a hierarchical multi-oscillator network, with the central clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) synchronizing and coordinating extra-SCN and peripheral clocks elsewhere1,2. Individual cells are the functional units for generation and maintenance of circadian rhythms3,4, and these oscillators of different tissue types in the organism share a remarkably similar biochemical negative feedback mechanism. However, due to interactions at the neuronal network level in the SCN and through rhythmic, systemic cues at the organismal level, circadian rhythms at the organismal level are not necessarily cell-autonomous5-7. Compared to traditional studies of locomotor activity in vivo and SCN explants ex vivo, cell-based in vitro assays allow for discovery of cell-autonomous circadian defects5,8. Strategically, cell-based models are more experimentally tractable for phenotypic characterization and rapid discovery of basic clock mechanisms5,8-13.
Because circadian rhythms are dynamic, longitudinal measurements with high temporal resolution are needed to assess clock function. In recent years, real-time bioluminescence recording using firefly luciferase as a reporter has become a common technique for studying circadian rhythms in mammals14,15, as it allows for examination of the persistence and dynamics of molecular rhythms. To monitor cell-autonomous circadian rhythms of gene expression, luciferase reporters can be introduced into cells via transient transfection13,16,17 or stable transduction5,10,18,19. Here we describe a stable transduction protocol using lentivirus-mediated gene delivery. The lentiviral vector system is superior to traditional methods such as transient transfection and germline transmission because of its efficiency and versatility: it permits efficient delivery and stable integration into the host genome of both dividing and non-dividing cells20. Once a reporter cell line is established, the dynamics of clock function can be examined through bioluminescence recording. We first describe the generation of P(Per2)-dLuc reporter lines, and then present data from this and other circadian reporters. In these assays, 3T3 mouse fibroblasts and U2OS human osteosarcoma cells are used as cellular models. We also discuss various ways of using these clock models in circadian studies. Methods described here can be applied to a great variety of cell types to study the cellular and molecular basis of circadian clocks, and may prove useful in tackling problems in other biological systems.

Circadian clocks function within individual cells, i.e., they are cell-autonomous. Here, we describe methods for generating cell-autonomous clock models using non-invasive, luciferase-based real-time bioluminescence technology. Reporter cells provide tractable, functional model systems for studying circadian biology.

Lusiferaz Biyoparlaklık Gazeteciler kullanma Gen Ekspresyonunun Hücre-özerk Sirkadiyen Saat Ritimleri İzlenmesi

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Zebra balığı adacıkları tek hücreli çözünürlük kalsiyum Imaging'i kullanma Beta hücre fonksiyonu Analizi

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

Situ Hibridizasyonda İki Renkli Tek Moleküllü Floresan Kullanarak Escherichia coli'de Uzay ve Zamanda MRNA KinetikLerini Sondalama

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...