Biz Dr gelen tartışmalar, rehberlik ve destek için müteşekkiriz. Michael Andreeff MD, PhD., Ve Jared Burks Doktora. MD Anderson Sitometrisi ve Hücresel Görüntüleme Çekirdek Tesisinden. Bu çalışma FCM için Ulusal Kanser Enstitüsü (RC1-CA146381, CA-083.639, R01NS06994, CA116199 ve CA109451 hibe kısmen desteklenmiştir. ELS ayrıca Savunma Ordusu Bölümü (BC083397) tarafından desteklenmektedir.

Singeneik Fare Kemik İliği Transplantasyon (KİT) kurumsal IACUC protokolleri tarafından onaylanan (Not: Bu protokolün Başarı bantlı analizi için hedef olarak etiketli bir hücre tipi (ler) kullanımını gerektirir ve aşağı analizini kolaylaştırmak için, bir herhangi bir genetik yararlanabiliriz veya sabit hücresel etiketleme. Biz herhangi bir hücre, doku veya organ-to-be, bir transplant model ve araştırma yararlı gördüğü nakli gibi birçok etiketlenmiş popülasyonları içerebilir uygulanabilir olduğunu göstermektedir. Ayrıca, hücresel sistemler multi-etiketli , bu tür birden fazla soy ihtiva eden transgenik farelerde bulunanlar gibi kısıtlı floresan popülasyonları-olabilir bazı patolojik durumların çalışma için transplant komplikasyonları ortadan kaldırmak için tasarlanabilir etiketli. <ol><li> Öldürücü seviyede verici kemik iliği ile yeniden önce 9.5 Gy dört saatlik tek bir doz ile BMT alıcı fareler ışın. (BMT GFP alıcılar yaşı 6-10 hafta olmalıdır.) </li><li> Kırpma ve steril cerrahi makas ile arka bacaklarda ortaya çıkarmak için geri soyma önce% 70 etanol ile fare postu ıslatın. Sakroiliak eklem iliak dahil tüm bacak kaldırın. Sadece ayak bileği üzerinde ve sonra iyice kemikten tüm kas, bağ ve aşırı dokuyu keserek ayağını atın. PBS (PBS-2)% 2 steril FBS kullanarak bir 23 G iğne ile tibia, fibia ve iliak floş iliği. (BMT RFP vericiler kurumsal standartlara göre feda edilmesi gerekmektedir.) </li><li> Yavaşça Dilim ve bir neşter ve forsepsler kullanılarak fragmanlara kalan kemik ezmek ve daha sonra 300 rpm&#39;de 37 ° C&#39;de bir 1 saat boyunca 3 ug / ml kollajenaz ile 50 ml konik tüp yerleştirin. </li><li> PBS-2 ile tüp kapalı üst ve yeni bir tüp içine supernatant toplamak ve boşaltılan hücre ile birleştirir. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 250 rpm&#39;de aşağı Spin </li><li> PBS-2 hücreleri tekrar süspansiyon ve 40 nm hücre filtresi aracılığıyla filtre. Bu noktada, hücreler flüoresan için etiketlenebilirt bir BMT için özel popülasyonları işlemek istiyorsa (FACS) hücre aktive. </li><li> Fare başına 100 ul PBS başına 2 x 10 6 hücre, tekrar. Sistemik kuyruk veya retro-orbital ven-konik-side-up ile ışınlanmış GFP alıcı farelere enjekte 29 G iğne kullanın. Sadece engraftmınt kontrol olarak 100 ul PBS ile bir fare enjekte edilir. Enjeksiyondan önce damarları açmak ve enjeksiyon üzerine bir kuyruk damarı enjeksiyonu kısıtlama kullanmak için bir ısı lambası kullanın. Kuyruk sonrası enjeksiyon hafif bir basınç uygulamak için kullanılabilir, steril gazlı bez var. </li><li> Üç hafta sonra, kemik iliği nakli sonrası kan retro orbital toplar ve GFP dolaşan hücrelerin varlığı ve RFP dolaşan hücrelerin olmadığını teyit etmek için akış sitometrisi ile analiz. Kontrolü fare bu noktada ölmüş olacak. </li></ol> 2. Tümör Aşı Kurumsal IACUC Kılavuzu&#39;na göre <ol><li> ID8 önce in vivo enjeksiyonu ile (1 x 10 6 ° C ile, in vitro olarak yumurtalık kemirgen tümör hücrelerin büyümesinefare başına arşın). Enjeksiyon Day, trypsinize hücre, 100 ul başına 1 x 10 6 hücre PBS içinde PBS ile yıkayın ve tekrar süspansiyon. </li><li> Fare intaperitoneal boşluğuna tümör hücrelerini enjekte iğne konik tarafı-up olmalıdır. % 70 etanol ile enjeksiyon görüş sterilize edin. Sol alt veya karnın sağ alt kadranda içine enjekte edilir (kranial ve biraz dişi fare abdominal meme alt kümesine medial), organları çarpmamak. Berduş tarafından kapma ve serçe ve yüzük parmağı ile kuyruk tutarak fare kısıtlamaktadır. Fareler Bu prosedür için izofluran ile anestezi edilebilir. </li><li> Bu tür hafif abdominal şişkinlik gibi tümör engraftment belirtileri, belirgin olduğunda fareler kurban. Bu 4-12 hafta boyunca haftada meydana gelecektir. </li><li> IP boşluğundan Tüketim tümörler. Boşluğu içinde Tümörleri organların yüzeyinde ve çevresinde beyaz nodüller gibi görünecektir. Bir neşter ile, tümörler çıkarın ve 24 saat tespiti için% 10 formalin içinde bir boru / kavanoza yerleştirin. Histolojik ponarım patoloji / histoloji çekirdek dışarı kaynaklı olabilir reaktifler ve malzemeler parafine ve slayt hazırlama için hazır değilse. Sonraki boyama işlemleri için cam slaytlar 5-8 mikron dilimlere Bölüm doku. </li></ol> 3. Multi-parametre Immunofluorescent Boyama <ol><li> Deneyde kullanılan her floresan prob için tek renk kontrolü slaytlar hazırlayın. Bu senaryoda, dört renk kullanılır. Bu nedenle, her renk için dört slaytlar yanı sıra arka plan gürültü kontrolü ve tam kombinasyon boyama için nihayet bir slayt için bir slayt. (Toplam slaytlar = 6) tüm slaytlar deney varyasyonu en aza indirmek için benzer bir şekilde yan yana işlenir. </li><li> 1 saat boyunca 56 ° C&#39;de pişirin parafin kesitleri. </li><li> Yıkama slaytlar ksilen içinde 10 dk 3x. </li><li> 2x 5 min% 100 etanol ile yıkayın. </li><li> 1x 3 min% 95 etanol ile yıkayın </li><li> 1x 2 min90% etanol yıkayın. </li><li> 1x 2 min70% etanol yıkayın. </li><lSuda i&gt; yıkayın 1x 2 dk. Yavaş yavaş su 10x içinde ve dışında boyama raf batırmayın. </li><li> Son yıkama serisi sırasında, 2 dakika (yüksek mikrodalga) için önceden kaynatın sodyum sitrat tamponu. (Kullanılan antikorlar bağlı olarak, tris-EDTA tampon maddesi ile yerini alabilir) </li><li> Sodyum sitrat tampon maddesi (% 10 gücü veya bir düdüklü tencere içinde mikrodalga) içinde 20 dakika için slaytlar kaynatın. Tampon kaynar ise, mikrodalga kapatın ve bekletin. </li><li> Isı kaynağından alın ve slaytlar soğutmak için sodyum sitrat tampon maddesi içinde 30 dakika boyunca dinlenmeye bırakın. </li><li> 5 dakika boyunca su içinde slaytlar durulayın. </li><li> Pap kalem ile tümör bölümler etrafında Mark ve 1 saat süre ile blokaj tamponu% 2 BSA /% 1 FBS, maleik asit koydu. Onları bu adım sırasında kurumasına izin vermeyin için bireysel olarak slaytlar hazırlayın. </li><li> Bloke edici tampon içinde uygun seyreltide birincil antikor hazırlayın. (Kullanılan antikorlar, farklı türlerin tüm (veya IgG zincir varyasyon-ex olursa: Aynı türün IgG2a vs IgG1) onlar sırasında kombinasyon halinde kullanılabilirleringle kuluçka dönemi. Antikor türleri çakışırsa, o inkübasyonlar antikor çapraz reaksiyon en aza indirmek için ardışık olarak gerçekleştirilmelidir.) </li><li> Bu noktada, sadece bloke edici tampon ile iki slayt bırakın. Bu iki slaytlar lekesiz kontrolü ve nükleer leke kontrolü olarak hizmet edecektir. Diğer bir renk kontrolü ayrı primer antikorlar ile inkübe edilir. Sadece analiz slayt birincil antikorlar bir arada olacak. </li><li> Yavaş dönen bir karıştırıcı üzerinde bir nem odacık kutusu içindeki birincil antikor ile kuluçkaya bırakın 4 ° gece boyunca (~ 16-20 saat) (Not: 4 + fluoroforlar, ardışık lekeleme ya da doğrudan konjügasyon ile çalışırken antikor çapraz reaksiyonu minimize etmek için gerekli olabilir . tüm antikorlar slaytlara uygulanır kadar bu şartlar adımları 1,16-1,21 tekrarlayın altında.) </li><li> Hafifçe karıştırma cihazı üzerinde, PBST içinde 10 dakika boyunca (2x) için slaytlar yıkayın </li><li> Yıkama devam ederken, son bir seyreltme için AlexaFluor 488, 594 ve 647 ikincil antikorlar hazırlamakbloklama tamponu içinde 1:1,000. (Bu antikorlar sulandırmalar gruplar üzerinde ve zaman boyunca flöresandaki korumak için, her zaman, 4 ° C&#39;de ve karanlıkta tutulur emin olun.) </li><li> Tek bir renk kontrol slaytlar üzerinde, kullanılan birincil antikor türleri eşleşen bir AlexaFluor dilüsyonları yerleştirin. Tüm ikincil antikorlar analiz slayt üzerine yerleştirilecektir. Lekesiz ve nükleer lekeli kontrol slaytlar bu adımı boyunca tampon engelleme ile kalacaktır. </li><li> 2 saat boyunca oda sıcaklığında yavaş dönen bir karıştırıcı üzerinde (ışık maruz kalmasını önlemek için alüminyum folyo ile kaplı) bir nem odacık kutusu içinde inkübe edin. </li><li> Hafifçe karıştırma cihazı üzerinde, PBST içinde 5 dakika (2x) için slaytlar yıkayın. Işıktan korumak için alüminyum folyo ile örtün. </li><li> 1 DAPI sadece slayta dakika ve analiz slayt için DAPI (1:10000) ekleyin. Işıktan korumak için alüminyum folyo ile örtün. Diğer slaytlar yıkama kapalı kaplarda bırakılabilir. </li><li> İki DAPI-kuluçkaya yıkayınDAPI leke ile diğer slaytlar kontamine olarak ilk 5 dakika yıkama için ayrı bir kap içinde kayar. İkinci yıkama 5 dakika için, slaytlar (her yıkama ile bir çalkalama düzenine yapılmalıdır) PBST içinde birleştirilebilir. Işıktan korumak için alüminyum folyo ile örtün. </li><li> Suda kısaca dip slaytlar önce kapak kayma (floresan korumak için sulu montaj medya ile 1.5 kalınlığı) </li><li> Oda sıcaklığında, karanlıkta 3 saat kuru olsun. </li><li> Tırnak sertleştirici ile kapak kayma kenarları mühür. (Aseton floresan sinyal gidermek olabilir oje kullanmayın). </li><li> Hemen slaytlar analiz veya gelecekteki analiz için 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 4. Çokspektrumlu Görüntüleme <ol><li> Veri toplama için Nuance yazılımı ile Olympus X-63 dik mikroskop üzerinde (bir sıvı kristal ayarlanabilir filtresi içeren) bir Nuance EX kamera kullanılarak çok bantlı görüntüleri toplayın. </li><li> Çözünürlüğünü artırmak için bir yağ objektif kullanarak görüntüleri toplayın. </li><li> Inisiyatifil set-up kullanımı her floroforla için spektral aralığı ayarlarını içerir. <ol class="lalpha"><li> 4 rengi için: <ol class="lroman"><li> DAPI: 420-480nm </li><li> AF488: 490-580nm </li><li> AF594: 590-640nm </li><li> AF647: 650-720nm </li></ol></li></ol></li><li> Spektral aralıklarının her biri için uygun bir maruz bırakma sürelerinin elde edilmesi için analiz sürgünün bir ilk görüntü al. </li><li> Yazılım birbirinden Flüoroforlann sinyal-gürültü oranı ve arka plan sinyalini tanımlamak ve ayırmak için kullanacağı &quot;spektral kütüphane&quot; oluşturun. (Not: 3 flüoroforlar = 4 kontrol slaytlar; 5 flüoroforlar = 6 kontrol slaytlar: Her florokromla veri setinin doğru analiz Örnek sağlamak için uygun dalga boyu eğrileri ile bir spektral kütüphane monte etmek için kendi tek renk kontrolü slayt olmalıdır.). <ol><li> İlk görüntü, boyanmamış slayt. Bu slayt spektral kütüphaneleri içinde tayin edilecektirarka plan olarak y.&gt; </li><li> Görüntü DAPI sadece ikinci kaydırın. Bu slayt &quot;çizmek&quot; aracı ile DAPI-lekeli çekirdekleri belirtmek için kullanılır ve DAPI gibi spektral kütüphane içinde kaydedilir.&gt; </li><li> Görüntü AF488-sadece üçte kaydırın. Bu slayt &quot;çizmek&quot; aracı ile AF488-lekeli bölgeleri belirlemek için kullanılacak ve AF488 gibi spektral kütüphane içinde kaydedilir.&gt; </li><li> Görüntü AF594-sadece dördüncü kaydırın. Bu slayt &quot;çizmek&quot; aracı ile AF594-lekeli bölgeleri belirlemek için kullanılacak ve AF594 gibi spektral kütüphane içinde kaydedilir.&gt; </li><li> Görüntü AF647-sadece beşinci kaydırın. Bu slayt &quot;çizmek&quot; aracı ile AF647-lekeli bölgeleri belirlemek için kullanılacak ve AF647 gibi spektral kütüphane içinde kaydedilir.&gt; </li><li> Her bir spektral bileşenin toplanmasını takiben,spektral kütüphane ve protokolü kaydedin.&gt; </li></ol></li><li> Spektral kütüphane tamamlandığında, görüntüleri kaydetmek / mikroskop analiz slaytta ilgi alanları bulmak ve toplamak.&gt; </li></ol> 5. Çokspektrumlu Görüntüler Kantitatif Analiz <ol><li> Software bilgilendirmek kullanılarak elde Nuance görüntülerin temsili ürün yelpazesine ithalat. </li><li> Program tarafından belirtildiği kaydedilen spektral kitaplığını açmak </li><li> Analiz edilecek ilgi doku bölgeleri tanımlamak. (Adipoz doku versus örneğin tümör dokusu). </li><li> DAPI-leke dayanan bireysel hücreleri belirlemek. Sitoplazma çekirdeğin şekline göre otomatik olarak belirlenecektir. </li><li> Her floresan parametresi için tercih floresan yoğunluğu Okuması seçin (örneğin ortalama, standart sapma) </li><li> Toplu görüntüleri elde ve önerilen algoritmasını kullanarak yazılım süreci sağlar. </li><li> Görüntü işleme tamamlandığında, birleştirmesonuç dosyaları. </li><li> Excel (veya başka bir analitik yazılım paketi) sonuçları açın ve XY eksen üzerinde birbirine karşı iki floresan şiddetleri arsa. Her bir flüoresan yoğunluğu hücre başına verilir. Çift pozitif hücreler sağ üst kadranda görünecektir. Kullanıcı başlangıç ​​floresan şiddetlerini tanımlamanız gerekir. </li></ol>

<ol>
	<li>Kidd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+the+tumor+microenvironment:+quantitative+assessment+of+adipose-derived+and+bone+marrow-derived+stroma.">Origins of the tumor microenvironment: quantitative assessment of adipose-derived and bone marrow-derived stroma.</a> PLoS ONE. 7, e30563 (2012).</li><li>Quintavalla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+labeled+mesenchymal+stem+cells+(MSCs)+maintain+multilineage+potential+and+can+be+detected+following+implantation+into+articular+cartilage+defects.">Fluorescently labeled mesenchymal stem cells (MSCs) maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects.</a> Biomaterials. 23, 109-119 (2002).</li><li>Sasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+are+recruited+into+wounded+skin+and+contribute+to+wound+repair+by+transdifferentiation+into+multiple+skin+cell+type.">Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type.</a> Journal of immunology. 180, 2581-2587 (2008).</li><li>Spaeth, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+transition+to+tumor-associated+fibroblasts+contributes+to+fibrovascular+network+expansion+and+tumor+progression.">Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression.</a> PLoS ONE. 4, e4992 (2009).</li><li>Wels, J., Kaplan, R. N., Rafii, S., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+neighbors+and+distant+invaders:+Tumor-associated+niche+cells.">Migratory neighbors and distant invaders: Tumor-associated niche cells.</a> Genes and Development. 22, 559-574 (2008).</li><li>Weis, S. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+molecular+pathways+and+therapeutic+targets.">Tumor angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets.</a> Nat. Med. 17, 1359-1370 (2011).</li><li>Bataille, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+immunofluorescence+on+paraffin-embedded+tissue+sections.">Multiparameter immunofluorescence on paraffin-embedded tissue sections.</a> Applied immunohistochemistry &amp; molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 14, 225-228 (1097).</li><li>van Vlierberghe, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-color+staining+combining+fluorescence+and+brightfield+microscopy+for+simultaneous+immune+cell+phenotyping+and+localization+in+tumor+tissue+sections.">Four-color staining combining fluorescence and brightfield microscopy for simultaneous immune cell phenotyping and localization in tumor tissue sections.</a> Microscopy research and technique. 67, 15-21 (2005).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC cell biology. 9, 13 (2008).</li><li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li><li>Belizario, J. E., Akamini, P., Wolf, P., Strauss, B., Xavier-Neto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+routes+for+transgenesis+of+the+mouse.">New routes for transgenesis of the mouse.</a> Journal of applied. 53, 295-315 (2012).</li></ol>

FCM, SPK, ve ELS ifşa hiçbir çatışma ve hiçbir şey yok.

Burada biz tümör mikro-ortamınm kemik iliğinden elde edilen stromal bileşenleri analiz için, Çoklanmış hücresel bileşimlerin MIMicc-bantlı sorgulama olarak tanımlamak multispektral görüntüleme uygulanmasını açıklar, ancak bu yöntem ve kavram bir kompleks oluşturmak için diğer hücre öğeleri deşifre uygulanabilir Bu tür yara iyileşme reaksiyonlar sırasında veya rejeneratif doku gözlenenlere gibi dokuların. Bu deneylerde, floresan bir engrafted tümör mikro içinde konakçı hücrelerden ...

Doku gelişimini ve onarımını anlama yara iyileşmesi, 2,3 rejeneratif tıp, gelişim biyolojisi ve tümör biyolojisi katılan hücresel bileşenlerini anlamak önemlidir. Tamir şartlar altında, çok sayıda hücre türleri vaskülarizasyon, ECM birikimi, proliferasyon ve doku yeniden yardımcı olmak için çevreleyen mikro sızmak. Hücresel faktörler ve fenotipleri multiparametre, yerelleştirme belirleyebilir multiplexed belirteçler, farklılaşma durumu ve incelenen mikro içindeki hücresel bileşenleri arasındaki etkileşime dayalı tespit edilebilir. Bu yazıda, çok bantlı görüntüleme ve spektral Karışmama metodoloji ardından bu renkli-hücreli nakli model için bir prototip örnek olarak tümör gelişimini betimler. Tümör ilerlemesi gelişmiş çoğalması, a dahil birçok edinilen yetenekleri ile işaretlenir çok aşamalı bir süreçtir, ntiapoptotic, istilacı ve anjiyojenik özellikleri. 4 tümör gelişimi büyüme faktörleri, yapısal matrisler, vaskular ağlar ve bağışıklık modülasyon sağlamak için çevreye alınırlar neoplastik olmayan hücreler tarafından kolaylaştırılır. 1,5,6 Bu microhabitat türetilen hücrelerden oluşur yerel, komşu gibi adipoz gibi dokular ve kan damarları ve kemik iliği kökenli hücreler 1 olarak uzak kaynakları. Neoplastik olmayan hücre katılımı bir şekilde, genellikle, tümörün sahne / türü ile karşılık gelen tümör, gelen talebe bağlıdır. Tümör destekleyici mikroçevresinin rolünü kavramak için, bir non-neoplastik hücre popülasyonlarının kökeni ve farklılaşma potansiyelini anlamak gerekir. Bu protokol, lokal doku Türe de kemik iliğinden elde edilen hücre bileşenlerinin görselleştirme yoluyla tümör progresyonu yorumuna yardımcı olmak için tasarlanmıştır ve edilmiştirhücreler ed. Flüoresan raportör geni ifade eden transgenik fareler kullanarak, bir ölümcül ışınlanmış RFP (kırmızı flüoresan protein) fare içine, GFP (yeşil floresan protein), kemik iliği nakli. Başarılı kemik iliği engraftment ardından, sinjenik tümör hücre çizgisi orthotopically enjekte edilmiş ve 4-8 hafta boyunca sokmak bırakılır. Elde edilen tümör fareden çıkarıldı ve stromal bileşenleri görselleştirmek için boyama immunofloresans (IF) için işlenir. Çoklayıcı belirteçler ancak spektral örtüşme sahip floresan işaretleyici kombinasyonları için potansiyelini artırır bir çok bantlı görüntüleme / Karışmama platformunu kullanarak, anlamlı optimizasyon 7-9 içeren yaygın olarak kullanılan bir tekniktir IF. Bu yazıda biz hücresel kökeni, hücresel farklılaşma st analiz etmek için leke ve tek bir slayt üzerinde bir tümör bölüm içinde sekiz belirteçleri kadar analiz Çoklanmış hücresel kompozisyonlar MIMicc-çokbantlı sorgulama dediğimiz bir teknik mevcutATUS ve tümörün mikro-ortamı içinde parçalar, hücre-hücre etkileşimleri. Bu, basit bir örnek, antikorların kullanıldığı beş, altı veya daha fazla hücre içi işaretleri ya da promotör-tahrikli floresan ifadesi. Tablo 1, dikkate alınan uygun türleri, potansiyel bir floresan antikor boyama kombinasyonu analiz etmek amacıyla, üzerine genişletilmiş potansiyeline sahiptir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>.2 &mu;m filter</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>09-740-35A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>10 ml lure lock </td>
			<td >BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td >Cardinal</td>
			<td>BF305122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>40nm filter</td>
			<td >BD</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 ml conical tube</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 488-ms1</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 594-Rb</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 647-ch</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>A21449</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSA</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td >Corning</td>
			<td>2940-243</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CRI-Nuance</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dapi</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td >CellGro</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td >Dharmacon</td>
			<td>4004-DV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFP-ms1</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>ab38689</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insulin needle</td>
			<td >BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td >Acros</td>
			<td>100-16-7</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Moisture chamber box</td>
			<td >Evergreen</td>
			<td>240-9020-Z10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td >dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nail hardener</td>
			<td >Sally Hansen</td>
			<td>2103</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pap pen</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>Ab2601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen/Strep L Glut</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Steril PBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>14040-182</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>252000-56</td>
			<td> </td>
		 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 Blocking Buffer	
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>maleic acid</td>
 <td>14.51 g </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>10.95 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaOH pellets (to 7.5pH)</td>
 <td>9+g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>250 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. 
	Antigen retrieval buffers:
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>1.21 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>0.37 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*Store at RT for 3 months or at 4 &deg; C for longer
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tri-sodium citrate (dihydrate)</td>
 <td>2.94 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCl (adjust pH to 6.0)</td>
 <td>1N</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
		</tbody>
 </table>

quantitative multispectral analysis following fluorescent tissue transplant for visualization of cell origins, types, and interactions

Karmaşık doku gelişimine çoklu hücresel elemanların katkıları anlamak için arzusu ile, bu tür doku, tümör oluşumu veya vaskülojenez yenileyici katılmak çok sayıda hücre türleri olarak biz tümör gelişme çok renkli bir hücre transplant modeli geliştirmiştir hücre popülasyonlarının farklı renkli flüoresan raportör gen farelerden kaynaklanan ve transplant engrafted veya gelişmekte olan bir tümör içinde ve çevresinde enjekte edilmektedir. Bu renkli hücreler daha sonra alınmış ve tümör stromasında dahil edilmiştir. Nicel olarak, kemik iliği kaynaklı tümör stromal hücreleri değerlendirmek amacıyla, IACUC onaylı olarak farenin ifade ölümcül ışınlanmış RFP transgenik bütün kemik iliği nakli GFP sentezleyen. Orthotopically nakledilen farelere enjekte edilmiştir 0ovarian tümörler 6-8 hafta sonra bütünleşmesini kesilmiş ve ilgili tespit etmek için tümör kaynaklı kemik iliği işaretleyici (GFP) yanı sıra, antikor belirteçler için analiz edildibantlı görüntüleme teknikleri kullanılarak stroma. Biz o zaman nicel hücre hangi (orijinal raportör gen etiketlere dayalı) başlayan nüfus, ve 4, 5 unmix bizim yeteneği gibi geldi etiketlenmiş hangi değerlendirmek için fluoroprobes multispektral Karışmama kullanarak, biz Çoklanmış hücresel kompozisyonlar MIMicc-Çokspektrumlu Sorgulama dediğimiz bir metodoloji adapte , slayt artar başına 6 ya da daha fazla spektrumları, biz hücre soyları ya da hassasiyeti arttırmak için farklılaşma ile ilişkili ek immunhistokimya ekledik. Ko-lokalize multipleksli-floresan sinyalleri, tümör stromal nüfus, takip numaralandırılmış ve işaretleyici boyama dayalı karakterize edilebilir algılamak için yazılım kullanmak. 1

Bizim transgenik fare modelinde BMT engrafted tümörleri analiz etmek için bir çok bantlı görüntüleme tekniği kullanarak, kemik iliği kökenli stromal tümör bileşenleri ayırt edebiliyoruz. İlk BMT akış sitometri ile üç hafta post-transplant (Şekil 1) doğrulandı. Ortotopikal BMT melezleme teyit İlk tümör enjeksiyonunu takip eden kesilmiş ve formalin 6 hafta sabitlendi aşağıdaki etiketlenmemiş yumurtalık tümörleri enjekte edilir. Parafin tümör bölümleri &lt;8 mikron dil...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions at JoVE.com

Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

Kompleks doku kitleleri, organlardan tümörler, çeşitli hücresel elemanların oluşmaktadır. Bu hücre köken hem de protein ekspresyonu göre hücre özelliklerini deşifre spektral unmixing ardından çok parametreli immünofloresan boyama ile bir arada çok etiketli floresan transgenik fareler kullanılarak bir doku içinde hücre fenotipleri katkısını açıklanacaktır.

Hücre Origins, Türleri ve Etkileşimler Görselleştirme için Floresan Doku Nakli ardından Kantitatif Çokspektrumlu Analizi

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

quantitative-multispectral-analysis-following-fluorescent-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

9.3K Görüntüleme.  MD Anderson Cancer Center.  Kompleks doku kitleleri, organlardan tümörler, çeşitli hücresel elemanların oluşmaktadır. Bu hücre köken hem de protein ekspresyonu göre hücre özelliklerini deşifre spektral unmixing ardından çok parametreli immünofloresan boyama ile bir arada çok etiketli floresan transgenik fareler kullanılarak bir doku içinde hücre fenotipleri katkısını açıklanacaktır. 

Video: Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment for melanoma remains surgical excision, therefore, the key to extended survival is early detection 2,3. Considering the large numbers of patients diagnosed every year and the limitations in accessing specialized care quickly, the development of objective in vivo diagnostic instruments to aid the diagnosis is essential. New techniques to detect skin cancer, especially non-invasive diagnostic tools, are being explored in numerous laboratories. Along with the surgical methods, techniques such as digital photography, dermoscopy, multispectral imaging systems (MelaFind), laser-based systems (confocal scanning laser microscopy, laser doppler perfusion imaging, optical coherence tomography), ultrasound, magnetic resonance imaging, are being tested. Each technique offers unique advantages and disadvantages, many of which pose a compromise between effectiveness and accuracy versus ease of use and cost considerations. Details about these techniques and comparisons are available in the literature 4.
Infrared (IR) imaging was shown to be a useful method to diagnose the signs of certain diseases by measuring the local skin temperature. There is a large body of evidence showing that disease or deviation from normal functioning are accompanied by changes of the temperature of the body, which again affect the temperature of the skin 5,6. Accurate data about the temperature of the human body and skin can provide a wealth of information on the processes responsible for heat generation and thermoregulation, in particular the deviation from normal conditions, often caused by disease. However, IR imaging has not been widely recognized in medicine due to the premature use of the technology 7,8 several decades ago, when temperature measurement accuracy and the spatial resolution were inadequate and sophisticated image processing tools were unavailable. This situation changed dramatically in the late 1990s-2000s. Advances in IR instrumentation, implementation of digital image processing algorithms and dynamic IR imaging, which enables scientists to analyze not only the spatial, but also the temporal thermal behavior of the skin 9, allowed breakthroughs in the field.
In our research, we explore the feasibility of IR imaging, combined with theoretical and experimental studies, as a cost effective, non-invasive, in vivo optical measurement technique for tumor detection, with emphasis on the screening and early detection of melanoma 10-13. In this study, we show data obtained in a patient study in which patients that possess a pigmented lesion with a clinical indication for biopsy are selected for imaging. We compared the difference in thermal responses between healthy and malignant tissue and compared our data with biopsy results. We concluded that the increased metabolic activity of the melanoma lesion can be detected by dynamic infrared imaging.

We demonstrated that malignant pigmented lesions with increased metabolic activity generate quantifiable amounts of heat and the measurement of the transient thermal response of the skin to a cooling excitation allows quantitative identification of melanoma and other skin cancers (vs. non-proliferative nevi) at an early stage of the disease.

Kantitatif Görselleştirme ve Dinamik Termal Görüntüleme Deri Kanseri Tespiti

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

Tıp

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

Kombine tarafından Farelerde Tek Hücre çözünürlükte Akciğer Metastaz Geliştirilmiş Görselleştirme<em&gt; In-situ</emAkciğer Doku ve X-Gal Boyanma&gt; Perfüzyon<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Tümör Hücreleri

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

Post-mortem Doku gelen kardiyomiyosit Çekirdeklerin İzolasyonu

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

Hastalığında Kromatin Proteomlar Kantitatif Analiz

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Murine Heterotopic Heart Transplant Technique

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become proficient in and utilize this technique, it is now widely used by many laboratories around the world. A significant refinement to the original technique was developed and reported in 2001 by Niimi. Described here are the techniques that have evolved over more than a decade in the hands of three surgeons (Plenter, Grazia, Pietra) in our center. These techniques are now being passed on to a younger generation of surgeons and researchers.
Based largely on the Niimi experience, the procedures used have evolved in the fine details - details which we will endeavor to relate here in such a way that others may be able to use this very useful model. Like Niimi, we have found that a video aid to learning is a priceless resource for the beginner.

The manuscript describes the steps required to perform the heterotopic heart transplant in the mouse.

Mürin Heterotopik Kalp Nakli Tekniği

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which disrupt normal brain function. Despite treatment with currently available antiepileptic drugs targeting neuronal functions, one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant. In this condition, surgical resection of the brain area generating seizures remains the only alternative treatment. Studying human epileptic tissues has contributed to understand new epileptogenic mechanisms during the last 10 years. Indeed, these tissues generate spontaneous interictal epileptic discharges as well as pharmacologically-induced ictal events which can be recorded with classical electrophysiology techniques. Remarkably, multi-electrode arrays (MEAs), which are microfabricated devices embedding an array of spatially arranged microelectrodes, provide the unique opportunity to simultaneously stimulate and record field potentials, as well as action potentials of multiple neurons from different areas of the tissue. Thus MEAs recordings offer an excellent approach to study the spatio-temporal patterns of spontaneous interictal and evoked seizure-like events and the mechanisms underlying seizure onset and propagation. Here we describe how to prepare human cortical slices from surgically resected tissue and to record with MEAs interictal and ictal-like events ex vivo.

We here describe how to perform multi-electrode array recordings of human epileptic cortical tissue. Epileptic tissue resection, slice preparation and multi-electrode array recordings of interictal and ictal events are demonstrated in detail.

İnsan Epileptik Ameliyat sonrası Kortikal Doku Çok elektrot Dizi Kayıtlar

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Murine Kidney Transplant Technique

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become proficient in and utilize this technique, it is now widely used by many laboratories around the world. A significant refinement to the original technique using the donor aorta to form the arterial anastomosis instead of the renal artery was developed and reported in 1993 by Kalina and Mottram 2 with a further advancement coming from the same laboratory in 1999 3. While one can become proficient in this model, a search of the literature reveals that many labs still experience a high proportion of graft loss due to arterial thrombosis. We describe here a technique that was devised in our laboratory that vastly reduces the arterial thrombus reported by others 4,5. This is achieved by forming a heel-and-toe cuff of the donor infra-renal aorta that facilitates a larger anastomosis and straighter blood flow into the kidney.

The goal of this manuscript is to describe the steps required to perform a kidney transplant in a mouse, paying particular attention to the details of the arterial anastomosis.

Murin Böbrek nakli Tekniği

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

Ven interpozisyonu Model: baypas açıklığının Eğitim için uygun bir model

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

Bir Fulminan Miyokardit Modelinde Işık Yeri Mikroskopisi İle Lökosit İnfiltrasyonunun Nicel Görselleştirilmesi

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine balloon denudation model, which is comparable with established vessel injury models in large animals. The aorta denudation model with balloon catheters mimics the clinical setting and leads to comparable pathobiological and physiological changes. Briefly, after performing a horizontal incision in the aorta abdominalis, a balloon catheter will be inserted into the vessel, inflated, and introduced retrogradely. Inflation of the balloon will lead to intima injury and overdistension of the vessel. After removing the catheter, the aortic incision will be closed with single stiches. The model shown in this article is reproducible, easy to perform, and can be established quickly and reliably. It is especially suitable for evaluating expensive experimental therapeutic agents, which can be applied in an economical fashion. By using different knockout-mouse strains, the impact of different genes on MH development can be assessed.

This article demonstrates a murine model to study the development of myointimal hyperplasia (MH) after aortic balloon injury.

Fare Abdominal aort Myointimal Hiperplazi ikna etmek için balon tabanlı yaralanma

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine ...