Biz Michela de Martino, Wilfred R. Hagen, ve yararlı tartışmalar için Kourosh Azim Honarmand İbrahimi minnettarız. Bu çalışma Delft Teknoloji Üniversitesi&#39;nden finansman start-up tarafından desteklenmiştir.

1. Dps İfade ve Arıtma Yüksek saflıkta protein elde DNA-koruma deneyi için önemli bir ilk adımdır. DPS protein saflaştırma, 4-5 gün içinde gerçekleştirilebilir. <ol><li> E. Bir proteaz eksikliği olan gerginlik Dönüşümü DPS protein-kodlama sekansı klonlanmıştır içine pET vektörü (örneğin pET17 gibi) coli (örneğin, BL21 (DE3) pLysS gibi). </li><li> Çizgi uygun antibiyotik (örneğin, 1.1 &#39;de verilen örnekler için, ampisilin ve kloramfenikol gibi) içeren Luria Broth (LB) agar plakaları üzerine hücreleri transforme. 37 gece boyunca inkübe ° C </li><li> Uygun antibiyotikler ihtiva eden LB ortamı, 30 ml içine plakadan tek bir koloni inoküle. 37 gece boyunca inkübe ° C 200-250 rpm sallayarak. </li><li> 10 ml gecelik kültürü her biri ile uygun bir antibiyotik içeren 2 x 1 L LB vasatı inoküle. OD 600, sallayarak ise, 37 ° C de büyümeye </alt&gt; yaklaşık 0.6. (Belirgin bir şekilde nihai ürünün saflığını ödün vermeden, yüksek bir protein verimi artar OD hücre yetiştirilmesi.) 0.3 mM bir konsantrasyona kadar IPTG ilave edilerek DPS ekspresyonunu ve çalkalama sırasında 37 ° C &#39;de 3-4 saat süreyle inkübe edin. </li><li> 15 dakika boyunca 6000 x g&#39;de santrifüj ile hasat hücreleri. Indüklenen hücre kültürü L başına DEAE tampon A (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 100 mM NaCI, 0.1 mM EDTA) içinde 7.5 ml hücre topakları yeniden süspanse edin. Örnekler sıvı nitrojen içinde dondurulur ve arzu edildiği takdirde, -80 ° C&#39;de saklanabilir. Bu prosedür daha sonra 4 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde örnekleri eritilmesi ile devam edilebilir </li><li> Aşırı ekspresyona DPS bozulmasını önlemek için hücre süspansiyonu proteaz inhibitörleri (örneğin, Calbiochem grubu III proteaz inhibitörleri olarak, hücre süspansiyonu, ml başına 0.167 ul) karışımı ekleyin. </li><li> Bir Fransız basını kullanarak hücre-ücretsiz özü hazırlamak. 20 ml DEAE Tampon A (sürekli-akış modeli kullanıyorsanız), daha sonra sınıfta yıkıcı ile Başbakan Fransız basınıt 20 kpsi az iki kez örnek. Çözünmeyen parçacıkların açıklamak için 4 ° C&#39;de 35 dakika boyunca 30,000 x g&#39;de santrifüj lizat ve süpernatant kaydedin. İstenirse Süpernatant daha sonra, sıvı azot ile dondurulmuş ve -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Bir FPLC DEAE ile tampon A ile 30 ml&#39;lik bir DEAE-Sefaroz CL-6B kolonu, dengelenmesi. Arka plan üzerinde 0,2 MPa arasında bir maksimum basınç ile 1-2 ml / dk &#39;da sütun üzerinden tampon çalıştırın. Sütun üzerine hücre ücretsiz özü yük ve akış yoluyla OD 280 sinyal temel üzerinde artmaya başladıktan sonra toplamaya başlar. DEAE Tampon ile sütun yıkayın bir sürekli akış yoluyla toplarken OD 280 değeri, temel dönene kadar. Akış yoluyla bağlı DNA&#39;dan serbest DPS proteinin, içermelidir. % 100 tampon B (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 1 M NaCI, 0.1 mM EDTA) ile sütun yıkayın. Bu eluat DPS-DNA kompleksleri gibi diğer proteinler içerir ve atılabilir. </li><li> Reklamı kaldırınamonyum sülfat çöktürme yoluyla protein ditional kirletici. Toplanmış akış yoluyla hacmi belirleyin. Yavaş yavaş (10-20 dakika arasında bir süre boyunca) 4 az% 62 doygunluk (solüsyonun ml&#39;si başına 390 mg), ° C de karıştırılarak kuru bir küçük taneli amonyum sülfat ekleyin. Tüm dengeleme sağlamak için amonyum sülfat son bölümü ilave edilmesinden sonra, 20-30 dakika boyunca karıştırılır. Kirletici proteinlerin çözeltiden çökelebilir olurken DPS, çözünür olmaya devam edecektir. </li><li> 4, 30 dakika boyunca 20,000 x g&#39;de santrifüj ile Çöken proteinler çıkarmak ° C ve süpernatan kaydedin. </li><li> Yavaş yavaş% 94 doygunluğa ulaşmak ve tam denge sağlamak için 20-30 dakika süreyle karışmaya süpernatan ml&#39;si başına ek bir 227 mg amonyum sülfat ekleyin. DPS bu yüksek tuz konsantrasyonunda çökelir ve 4 ° C de 30 dakika boyunca 20,000 x g&#39;de santrifüj ile toplanabilir DPS pelet olacak, süpernatant ekarte edilebilir. Pelet -80 saklanabilir ° C eğer desIRED. </li><li> Tabanda tampon içinde DPS-içeren pelet (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 150 mM NaCI, 0.1 mM EDTA) yeniden süspanse edin. 2.5 ml örnek ses seviyesini ayarlayın. </li><li> Tampon değişimi, bir PD-10 jel filtrasyon kolonu kullanılarak amonyum sülfat kaldırın. 25 mi tabanda tampon ile jel yatağı dengelenmesi. PD-10 sütunun üstüne DPS örnek 2.5 ml uygulayın ve Flow-through atın emmek sağlar. 3.5 mi tabanda tampon ile yıkanarak DPS toplayın. </li><li> 4, 10 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de tampon ile-yer değiştirilmiş örnek Santrifüj ° C çözülmeyen bileşenler kaldırmak ve 6-10 ml seyreltme tamponu (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 0.1 mM EDTA) ile seyreltin sağlamak için bu Tuz konsantrasyonu DPS SP Sepharose kolonuna bağlamak için yeterince düşüktür. DPS Özellikle konsantre örnekler olarak sıvı bulutlu kanıtladığı düşük tuz tamponu içine seyreltme ile daha az çözünür hale gelebilir, ancak tamamen küçük Amou ilavesiyle çözündürülmüş edilebilir5 M NaCl çözeltisi nt (ek 10-20 mm). </li><li> SP tampon A (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 50 mM NaCI, 0.1 mM EDTA) ile 30 ml&#39;lik bir SP Sefaroz Hızlı Akışlı kolon dengelenmesi. 1.5-2 ml / arka plan üzerinde 0.3 MPa&#39;lık bir basınç limiti olan dk kolonu boyunca tampon çalıştırın. Sütun üzerine örnek yerleştirin. OD 280 iz dönene kadar başlangıca SP Tampon A ile yıkayın ve flow-through atın. 2 ml&#39;lik fraksiyonlar toplarken, 0-100% Tampon B, 150 ml&#39;lik bir doğrusal gradyan çalıştırın. % 10 değişim mümkün olsa DPS, yaklaşık 50% B keskin bir tepe Zehir olacaktır. </li><li> % 15 SDS-PAGE jel üzerinde elüsyon kesirler çalıştırın ve bir spektrofotometre kullanılarak OD 260 / OD 280 oranı ölçülerek DNA kontaminasyonu kontrol edin. Jel sadece 19 kDa civarında bir grup göstermelidir, ve OD 260 / OD 280 0.7 civarında tipik olarak. Saf DPS kesirler havuzu. Bir ile bir santrifüj filtre ünitesi (örneğin Amicon Ultra Filtrasyon Ünitesi gibi) kullanın10K molekül ağırlığı kesme DPS konsantre ve depolama tampon (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 50 mM NaCl) içine alışverişinde. -80 Depolama için sıvı nitrojen içinde kısım arıtıldı DPS ve dondurma ° C </li></ol> 2. DNA koruma deneyi Tahlil birden fazla zaman duyarlı adımdan oluşuyor ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için ikinci zamanlı olmalıdır. Birçok maddeler ve pipetleme adımlar söz konusu, bir pipetleme tablo (Tablo 1) adım ve hacimleri takip etmek için tavsiye edilir böylece. Tahlil için gereken toplam süre en fazla 3 saat olduğunu. <ol><li> Hava geçirmez bir şişenin içine 30 ml su ölçün; çözüm oksijen kaldırmak için 10 dakika (iki şırınga iğneleri, sıvı bir, yukarıda birini kullanarak) için N 2 ile su yıkayın. 2 mM stok solüsyonu elde etmek için suya 0.0168 g FeSO 4 • 7H 2 O ekleyin. Flakon Seal ve karıştırın sonra, daha 5 dakika azot ile yıkayın. Çözüm olmalıdıraçık, sarı herhangi bir ipucu tespit ise, yeni bir demir solüsyon hazırlanır. </li><li> Buz üzerinde tutmak ve alüminyum folyo ile sararak ışıktan korumalı, H 2 O 2 çözeltisi (1 ml suya 9.2MH 2 O 2 10.87 ul) 100 mM olun. Spontan çürüme nedeniyle hazırlandıktan sonra yaklaşık 1-2 saat için kullanın. Hidrojen peroksit stok kısmen uygun depolama (karanlıkta, 4 ° C&#39;de) tarafından ıslah olabilir arıza, benzer tabidir. OD 240 ölçerek stok konsantrasyonu düzenli olarak kontrol tavsiye edilir. </li><li> Bir oda sıcaklığında su banyosunda hızla DPS saflaştırılmış bir kısım Çözülme ve buz üzerinde tutmak. Çökelti agrega için bir masa üstü picocentrifuge 4.000 x g&#39;de 10 saniye santrifüj. Bir spektrofotometre (OD 280 = 1.547 100 mcM monomer DPS bir konsantrasyon gösterir) kullanarak santrifüj sonra konsantrasyon ölçün. </li><li> 12x reaksiyon tamponu (1 kullanarak yüksek konsantrasyon stoktan lineer DNA sulandırmakNg / ml &#39;lik bir konsantrasyonda 100 M MOPS-KOH pH 7.0, 1 M NaCI). Lineer DNA miktar kolaylaştırmak için kullanılır, ancak plazmid DNA sıra kullanılabilir. </li><li> Bir PCR tüpü içine DNA tampon karışımı pipetle 1 ul. Nihai reaksiyon hacmi (eksi SDS), 12 ul olacak, böylece, reaksiyon içine yeterince su ilave edilir. Bu miktar pipetleme tablosunu kullanarak önceden hesaplanmalıdır. 3 mcM son bir dodecamer konsantrasyonu DPS ekleyin. DPS DNA&#39;ya bağlamak için izin vermek için, oda sıcaklığında 15 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Istenen konsantrasyona ulaşmak için yeterli 2 mM FeSO 4 çözüm ekleyin. Tipik bir deneyde, 0, 1 mM FeSO 4 ile bir konsantrasyon aralığında kullanılmaktadır. Daha yüksek konsantrasyonlarda daha geniş bir DNA bozulmaya sebep olacak, ama aynı zamanda demir, reaksiyon karışımı içinde çökeltilerinin oluşmasına neden olabilir. Çabuk 100 mm H2O 2 çözeltisi (10 mM nihai konsantrasyona kadar) 1 ul ekleyin ve Fenton izin vermek için 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübeGerçekleşmesi-aracılı bozulması tepki. </li><li> % 20 SDS (sodyum dodesil sülfat), 0.8 ul ekleyin. Mix ve DPS-DNA kompleksleri bozmaya 5 dakika 85 ° C&#39;de inkübe edin. SDS DPS-DNA kompleksi destabilizes ve miktar kolaylığı artırır DNA, için istenmeyen jel vardiya önler. Isteğe bağlı bir adım toksik olmayan ürünler haline katalitik olarak kırıcı hidrojen peroksit ile reaksiyon durdurmaktır. Bu protokol açıklanan koşulları için, bu adımı DNA bozulması geniş bir aralığı elde etmek için gerekli değildir. </li><li> Boya yükleme ekleyin, 1 dakika buz üzerinde inkübe ve bir agaroz jel üzerinde yük. Jel çalıştırın ve etidyum bromür kullanarak DNA leke. Jel jel etidyum bromür dağılımı ile engellemesini önlemek için SDS, elektroforez sonrası lekeli yerine elektroforeze tabi tutulmadan önce olmalıdır. </li></ol>

<ol>
	<li>Almiron, M., Link, A. J., Furlong, D., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+DNA-binding+protein+with+regulatory+and+protective+roles+in+starved+Escherichia+coli.">A novel DNA-binding protein with regulatory and protective roles in starved Escherichia coli.</a> Genes Dev. 6, 2646-2654 (1992).</li><li>Chiancone, E., Ceci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+capacity+of+Dps+proteins+to+combat+bacterial+stress+conditions:+Detoxification+of+iron+and+hydrogen+peroxide+and+DNA+binding.">The multifaceted capacity of Dps proteins to combat bacterial stress conditions: Detoxification of iron and hydrogen peroxide and DNA binding.</a> Biochimica et biophysica acta. 1800 (8), 798-805 (2010).</li><li>Ali Azam, T., Iwata, A., Nishimura, A., Ueda, S., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+phase-dependent+variation+in+protein+composition+of+the+Escherichia+coli+nucleoid.">Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid.</a> J. Bacteriol. 181 (20), 6361-6370 (1999).</li><li>Grainger, D. C., Goldberg, M. D., Lee, D. J., Busby, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+repression+by+Fis+and+H-NS+at+the+Escherichia+coli+dps+promoter.">Selective repression by Fis and H-NS at the Escherichia coli dps promoter.</a> Molecular Microbiology. 68 (6), 1366-1377 (2008).</li><li>Martinez, A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+DNA+during+oxidative+stress+by+the+nonspecific+DNA-binding+protein+Dps.">Protection of DNA during oxidative stress by the nonspecific DNA-binding protein Dps.</a> J. Bacteriol. 179 (16), 5188-5194 (1997).</li><li>Nair, S., Finkel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dps+protects+cells+against+multiple+stresses+during+stationary+phase.">Dps protects cells against multiple stresses during stationary phase.</a> J. Bacteriol. 186 (13), 4192-4198 (2004).</li><li>Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+Dps,+a+ferritin+homolog+that+binds+and+protects+DNA.">The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA.</a> Nat. Struct. Biol. 5 (4), 294-303 (1998).</li><li>Zhao, G., Ceci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+and+hydrogen+peroxide+detoxification+properties+of+DNA-binding+protein+from+starved+cells.+A+ferritin-like+DNA-binding+protein+of+Escherichia+coli.">Iron and hydrogen peroxide detoxification properties of DNA-binding protein from starved cells. A ferritin-like DNA-binding protein of Escherichia coli.</a> J. Biol. Chem. 277 (31), 27689-27696 (2002).</li><li>Ceci, P., Cellai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+condensation+and+self-aggregation+of+Escherichia+coli+Dps+are+coupled+phenomena+related+to+the+properties+of+the+N-terminus.">DNA condensation and self-aggregation of Escherichia coli Dps are coupled phenomena related to the properties of the N-terminus.</a> Nucleic Acids Res. 32 (19), 5935-5944 (2004).</li><li>Ilari, A., Ceci, P., Ferrari, D., Rossi, G. L., Chiancone, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+incorporation+into+Escherichia+coli+Dps+gives+rise+to+a+ferritin-like+microcrystalline+core.">Iron incorporation into Escherichia coli Dps gives rise to a ferritin-like microcrystalline core.</a> J. Biol. Chem. 277 (40), 37619-37623 (2002).</li><li>Swift, J., Wehbi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+functional+ferritin-like+proteins+with+hydrophobic+cavities.">Design of functional ferritin-like proteins with hydrophobic cavities.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (20), 6611-6619 (2006).</li><li>Ceci, P., Chiancone, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+iron+oxide+nanoparticles+in+Listeria+innocua+Dps+(DNA-binding+protein+from+starved+cells):+a+study+with+the+wild-type+protein+and+a+catalytic+centre+mutant.">Synthesis of iron oxide nanoparticles in Listeria innocua Dps (DNA-binding protein from starved cells): a study with the wild-type protein and a catalytic centre mutant.</a> Chemistry. 16 (2), 709-717 (2010).</li><li>Ceci, P., Ilari, A., Falvo, E., Chiancone, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dps+protein+of+Agrobacterium+tumefaciens+does+not+bind+to+DNA+but+protects+it+toward+oxidative+cleavage:+x-ray+crystal+structure,+iron+binding,+and+hydroxyl-radical+scavenging+properties.">The Dps protein of Agrobacterium tumefaciens does not bind to DNA but protects it toward oxidative cleavage: x-ray crystal structure, iron binding, and hydroxyl-radical scavenging properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 20319-20326 (2003).</li><li>Su, M., Cavallo, S., Stefanini, S., Chiancone, E., Chasteen, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+so-called+Listeria+innocua+ferritin+is+a+Dps+protein.+Iron+incorporation,+detoxification,+and+DNA+protection+properties.">The so-called Listeria innocua ferritin is a Dps protein. Iron incorporation, detoxification, and DNA protection properties.</a> Biochemistry. 44 (15), 5572-5578 (2005).</li><li>Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+Koelreuteria+paniculata+Laxm.+on+oxidative+stress+and+hydrogen+peroxide-induced+DNA+damage.">Protective effects of Koelreuteria paniculata Laxm. on oxidative stress and hydrogen peroxide-induced DNA damage.</a> Phytopharmacology. 1 (5), 177-189 (2011).</li><li>Stinefelt, B., Leonard, S. S., Blemings, K. P., Shi, X., Klandorf, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radical+scavenging,+DNA+protection,+and+inhibition+of+lipid+peroxidation+mediated+by+uric+acid.">Free radical scavenging, DNA protection, and inhibition of lipid peroxidation mediated by uric acid.</a> Annals of Clinical and Laboratory Science. 35 (1), 37-45 (2005).</li><li>Lopez-Gomollon, S., Sevilla, E., Bes, M. T., Peleato, M. L., Fillat, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+role+of+Fur+proteins:+FurB+(All2473)+from+Anabaena+protects+DNA+and+increases+cell+survival+under+oxidative+stress.">New insights into the role of Fur proteins: FurB (All2473) from Anabaena protects DNA and increases cell survival under oxidative stress.</a> The Biochemical Journal. 418 (1), 201-207 (2009).</li><li>Ebrahimi, K. H., Hagedoorn, P. L., Hagen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+and+stimulation+of+formation+of+the+ferroxidase+center+and+the+iron+core+in+Pyrococcus+furiosus+ferritin.">Inhibition and stimulation of formation of the ferroxidase center and the iron core in Pyrococcus furiosus ferritin.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1243-1253 (2010).</li><li>Smith, F. E., Herbert, J., Gaudin, J., Hennessy, D. J., Reid, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+iron+determination+using+ferene+triazine.">Serum iron determination using ferene triazine.</a> Clinical Biochemistry. 17 (5), 306-310 (1984).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Bu makalede açıklanan DPS bir arınma süreci çok sağlamdır. Saflık sürekli (&gt;% 99) yüksek olmuştur; başka proteinler görünür bantları gibi SDS-PAGE jel görünür. DPS çok yüksek konsantrasyonları ile inkübe, kısmi DNA yıkımı ile kanıtlandığı gibi buna rağmen, saflaştırılmış DPS bazı gruplar, nükleaz aktivitesi var gibi görünmektedir. Bu, arıtma yoluyla kaldırmak koyamadık, düşük konsantrasyonda yüksek derecede aktif DNase&#39;lann varlığına işaret olabilir. Bununla bir...

Aerobik organizmalar sürekli olarak DNA hem de diğer önemli biyolojik makromoleküllerin zarar verebilir reaktif oksijen türleri ile uğraşmak gerekir. Oksidatif hasar toksik etkilerini ortadan kaldırmak için bir güçlü bir araç hasret hücreler (DPS) DNA-bağlayıcı proteindir. Hasret E. 1992 yılında keşfedilmesinden bu yana coli kültürü 1, DPS bakteri ve Archaebacteria 2 300&#39;den fazla türün tespit edilmiştir. Sabit faz sırasında DPS Massive upregülasyonu bu E. en çok ifade nükleoit-ilişkili protein yapar açlık koşulları 3, 4 altında coli. Buna ek olarak, DPS açlık, yüksek demir konsantrasyonu, UV ışığına maruz bırakma, ısı şoku ve oksidatif stres 5, 6 da dahil olmak üzere pek çok çeşitli stres sırasında bakteriyel canlılığı ve DNA bütünlüğünü korumak için de gösterilmiştir. 12 monomerlerin, w istikrarlı bir homo-oligomerik kompleksi içine Yapısal olarak, DPS kendini ortaklarıhich bir küresel içi boş kabuk içine monte. ~ 4.5 nm çapında iç boşluğu küçük moleküllerin 7 geçişine izin gözenekleri ile çözücü dış erişilebilir, ve demir 8 gibi mineralli metaller ayırmak olabilir. DPS koruyucu etkisi non-spesifik DNA bağlayıcı 1, ferroxidase aktivite, ve demir depolama 8 de onun çeşitli biyokimyasal faaliyetleri, türemiştir. DPS yararlı biyokimyasal faaliyetlerin ayrıntılı çalışma ilk olarak arıtma gerektirir. DPS sadece başka proteinler ayrı olarak, aynı zamanda herhangi bir bağlı DNA&#39;nın 7 olması gerektiği gibi DPS saflaştırma, karmaşık bir işlemdir. Optimize edilen saflaştırma işlemi, iki iyon değişim ve amonyum sülfat ile çöktürme kademesi oluşan, çok yaygın teknikleri kullanır. Son derece konsantre DPS düşük tuz koşullarında çözüm dışında hızlandırabilir gibi çeşitli tampon değişim, ihtiyaç vardır. Bir kez DPS saflaştırılmış protein edilmiştir, Bu doğrudan ferroxidase aktivitesi 8, DNA bağlayıcı stokiyometri 9 ve 10 demir bağlama mekanizmaları ölçmek deneyleri ile uygulanabilir. Saf DPS de diğer potansiyel uygulamalar vardır. DPS sabit içi boş küresel yapısı, proteinin boşluğu 11 içine hidrofobik parçacıkların depolamak için iskelesi olarak kullanılmış ve bir reaksiyon haznesi yeni bir manyetik nano partiküller 12 sentezlemek için bile. Reaktif oksijen türleri nedeniyle zarar arabuluculuk DPS bir koruyucu yeteneği açıkça olması ve doğrudan DNA koruma deneyi 13, 14 ile ispat edilebilir. Demir Fenton kimya ile H 2 O 2 bozulması katalize zaman in vitro prosedüründe bu, radikal türleri üretilmektedir. Bu radikaller doğrudan reaksiyon DNA mevcut zarar ve tamamen yüksek konsantrasyonlarda bu düşürebilir. İki anahtar DPS faaliyetleri doğrudan Fent etkilerini karşı olabilir hemon-aracılı radikal üretimi. DPS sürecinde mevcut hidrojen peroksit tüketen, mineralizasyon ile katalitik demir konsantrasyonunu düşürür. Ayrıca, DNA bağlayıcı DPS potansiyel radikal hasarına karşı fiziksel olarak korumak ve daha az reaktif yüzey alanına sahip daha küçük bir hacim içine yoğunlaştırır olabilir. Bu iki özellik kombinasyonu de koruyucu DPS aktivitesinin ölçülmesi amacıyla, uygun DNA koruma deneyi yapar. DNA koruma deneyi oldukça çok yönlü ve DPS karakterizasyonu ötesinde çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. Radikal hasar hücrelerinde stres yaygın bir şeklidir, ve birçok farklı protein ve kimyasalların, önlemek için kullanılır. Radikal hasarı için bir belirteç olarak DNA bütünlüğü kullanılarak tahlil genel ilkesi, hemen hemen her türlü radikal üreten reaksiyon ya da mücadele maddesi ile kombinasyon halinde kullanılabilir. Diğerleri arasında, tahlil, başarılı bir şekilde bir anti-oksidatif özelliklerini belirlemek için kullanılmıştırK. hidroksil zarar arabuluculuk 16 ürik asit etkilerini karakterize etmek ve Kürk transkripsiyonel regülatör proteinlerin 17 fonksiyonu yeni bakış açıları kazanmak için gıda sektöründe 15, kullanılmak üzere Paniculata özü. Yayınlanan gazetelerde testin çeşitli kullanımlarını rağmen, ilk kez birçok araştırmacı için gereksiz yere zahmetli bir süreç için tahlil kurma yapar, birçok optimizasyon ve sorun giderme adımları gerekli olduğunu bulundu. Bu makalede mevcut protokol giriş için bu engeli kaldırmayı amaçlamaktadır.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21(DE3)pLysS competent cells</td>
 <td>Promega</td>
 <td>L1195</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pET-17b DNA</td>
 <td>EMD-Millipore</td>
 <td>69663-3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LB broth powder</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>L3022</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ampicillin sodium salt</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A0166</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloramphenicol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C0378</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>I6758</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>BDH</td>
 <td>441476L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium hydroxide</td>
 <td>Merck</td>
 <td>105033</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium chloride</td>
 <td>VWR</td>
 <td>443824T</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E9884</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease Inhibitor Cocktail Set III</td>
 <td>EMD-Millipore</td>
 <td>539134</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEAE-Sepharose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>DFF100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ammonium sulphate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A4418</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PD-10 Desalting Columns</td>
 <td>GE Healthcare LS</td>
 <td>17-0851-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SP-Sepharose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S1799</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amicon Ultra Centr. Filter (10K MWCO)</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>UFC901024</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ferrous Sulphate heptahydrate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F8048</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrogen peroxide solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>216763</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MOPS</td>
 <td>Calbiochem</td>
 <td>475898</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SDS solution</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>161-0418</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethidium bromide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E1510</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Model</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Static incubator</td>
 <td>Hettich</td>
 <td>INE500</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Shaking Incubator </td>
 <td>New Brunswick Sc.</td>
 <td>Inova 44</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cooled centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Avanti J-E</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top centrifuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5424</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell disrupter</td>
 <td>Constant Systems Ltd.</td>
 <td>TS2/40/AA/AA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FPLC Purifier</td>
 <td>General Electric</td>
 <td>AKTA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Airtight vials</td>
 <td>Cole-Parmer</td>
 <td>EW-08918-85</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe needles</td>
 <td>BD</td>
 <td>305128</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipettes</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>Z683779-1EA, Z683795-1EA</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

application of an in vitro dna protection assay to visualize stress mediation properties of the dps protein

Oksidatif stres aerobik yaşamın kaçınılmaz bir yan ürünü. Moleküler oksijen karasal metabolizması için gereklidir, ama aynı zamanda canlılar içinde birçok zararlı reaksiyonlar yer almaktadır. Yaşam için başka önemli bir bileşiktir aerobik metabolizma ve demir, kombinasyonu Fenton kimya ile radikaller üretmek ve hücresel bileşenleri azaltmak için yeterlidir. DNA tamiri çok önemsiz olduğu gibi DNA bozulması, belki hücre içi radikaller içeren en çok zarar veren bir süreçtir. Bu makalede sunulan tahlil radikal aracılı DNA hasar molekülleri ve enzimlerin etkisini ölçmek ve görselleştirmek için nicel bir teknik sunmaktadır. DNA koruma deneyi protein ya da kimyasal koruyucu özelliklerinin in vitro karakterizasyonu için, basit, hızlı ve güçlü bir araçtır. Bu zararlı oksidatif reaksiyona DNA açığa çıkar ve çeşitli bileşik konsantrasyonları eklemeyi içerir. Bileşik konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak, DNA hasarının azaltılması veya artışa daha sonra jel elektroforezi kullanılarak görselleştirildi. Bu yazıda aç bırakılmış hücreler (DPS) DNA-bağlayıcı proteinin koruyucu özelliklerini ölçerek, DNA koruma deneyi tekniğini göstermektedir. Dps güçlü çevresel stres ile mücadele için 300&#39;den fazla bakteri türleri tarafından kullanılan bir mini-ferritin olduğunu. Burada DPS arıtma protokolü ve DPS tarafından DNA koruma değerlendirmek için optimize edilmiş test koşulları sunuyoruz.

Burada açıklanan DPS için arıtma işlemi çok tekrarlanabilir. Tanımlanmış bir protokole göre DPS arıtma, E. 2 L kullanılarak bir başlangıç ​​noktası olarak coli kültür, genellikle 5 ila 12 mikron arası konsantrasyonlarda 12 DPS içeren proteinin 2.5 ml verecektir. Daha uzun indüksiyon kez (4 saat) Bu değişkenliği azaltmak gibi görünüyor. Protein saflığı SDS-PAGE jel (Şekil 1) ile kanıtlandığı gibi,% 99 üzerinde sürekli olarak. DNA kirli...

Watch this Scientific Journal Video about Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein at JoVE.com

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Hasret hücreler (DPS) gelen DNA-bağlayıcı protein bakteriyel stres mücadelede önemli bir rol oynar. Bu makalenin arıtma ele<em&gt; E. coli</em&gt; DPS ve için protokol<em&gt; In vitro</em&gt; Test reaktif oksijen türleri tarafından bozulması DNA DPS-aracılı koruma gösteren.

Bir uygulama<em&gt; In vitro</emDPS Protein Stres Arabuluculuk Özellikleri gözünüzde canlandırın için&gt; DNA Koruma Testi

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

application-an-vitro-dna-protection-assay-to-visualize-stress

Research

JoVE Journal

Biology

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

11.1K Görüntüleme.  Delft University of Technology. Hasret hücreler (DPS) gelen DNA-bağlayıcı protein bakteriyel stres mücadelede önemli bir rol oynar. Bu makalenin arıtma ele E. coli DPS ve için protokol In vitro Test reaktif oksijen türleri tarafından bozulması DNA DPS-aracılı koruma gösteren.

Video: Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to both secrete proteases that break down the basement membrane as well as migrate in order to be invasive. BD BioCoat Tumor Invasion System provides cells with conditions that allow assessment of their invasive property in vitro1,2. It consists of a BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert Plate with an 8.0 micron pore size PET membrane that has been uniformly coated with BD Matrigel Matrix. This uniform layer of BD Matrigel Matrix serves as a reconstituted basement membrane in vitro providing a true barrier to non-invasive cells while presenting an appropriate protein structure to study invasion. The coating process occludes the pores of the membrane, blocking non-invasive cells from migrating through the membrane. In contrast, invasive cells are able to detach themselves from and migrate through the coated membrane. Quantitation of cell invasion can be achieved by either pre- or post-cell invasion labeling with a fluorescent dye such as DiIC12(3) or calcein AM, respectively, and measuring the fluorescence of invading cells. Since the BD FluoroBlok membrane effectively blocks the passage of light from 490-700 nm at &gt;99% efficiency, fluorescently-labeled cells that have not invaded are not detected by a bottom-reading fluorescence plate reader. However, cells that have invaded to the underside of the membrane are no longer shielded from the light source and are detected with the respective plate reader. This video demonstrates an endpoint cell invasion assay, using calcein AM to detect invaded cells.

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

This video demonstrates how to measure cell invasion through cell culture inserts using a fluorescence-based methodology.

Bir In vitro FluoroBlok Tümör Invasion Testi

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Biyoloji

Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein

Transient kinetic analysis is indispensable for understanding the workings of biological macromolecules, since this approach yields mechanistic information including active site concentrations and intrinsic rate constants that govern macromolecular function. In case of enzymes, for example, transient or pre-steady state measurements identify and characterize individual events in the reaction pathway, whereas steady state measurements only yield overall catalytic efficiency and specificity. Individual events such as protein-protein or protein-ligand interactions and rate-limiting conformational changes often occur in the millisecond timescale, and can be measured directly by stopped-flow and chemical-quench flow methods. Given an optical signal such as fluorescence, stopped-flow serves as a powerful and accessible tool for monitoring reaction progress from substrate binding to product release and catalytic turnover1,2.
Here, we report application of stopped-flow kinetics to probe the mechanism of action of Msh2-Msh6, a eukaryotic DNA repair protein that recognizes base-pair mismatches and insertion/deletion loops in DNA and signals mismatch repair (MMR)3-5. In doing so, Msh2-Msh6 increases the accuracy of DNA replication by three orders of magnitude (error frequency decreases from ~10-6 to10-9 bases), and thus helps preserve genomic integrity. Not surprisingly, defective human Msh2-Msh6 function is associated with hereditary non-polyposis colon cancer and other sporadic cancers6-8. In order to understand the mechanism of action of this critical DNA metabolic protein, we are probing the dynamics of Msh2-Msh6 interaction with mismatched DNA as well as the ATPase activity that fuels its actions in MMR. DNA binding is measured by rapidly mixing Msh2-Msh6 with DNA containing a 2-aminopurine (2-Ap) fluorophore adjacent to a G:T mismatch and monitoring the resulting increase in 2-aminopurine fluorescence in real time. DNA dissociation is measured by mixing pre-formed Msh2-Msh6 G:T(2-Ap) mismatch complex with unlabeled trap DNA and monitoring decrease in fluorescence over time9. Pre-steady state ATPase kinetics are measured by the change in fluorescence of 7-diethylamino-3-((((2-maleimidyl)ethyl)amino)carbonyl) coumarin)-labeled Phosphate Binding Protein (MDCC-PBP) on binding phosphate (Pi) released by Msh2-Msh6 following ATP hydrolysis9,10.
The data reveal rapid binding of Msh2-Msh6 to a G:T mismatch and formation of a long-lived Msh2-Msh6 G:T complex, which in turn results in suppression of ATP hydrolysis and stabilization of the protein in an ATP-bound form. The reaction kinetics provide clear support for the hypothesis that ATP-bound Msh2-Msh6 signals DNA repair on binding a mismatched base pair in the double helix.
F. Noah Biro and Jie Zhai contributed to this paper equally.

Msh2-Msh6 is responsible for initiating repair of replication errors in DNA. Here we present a transient kinetics approach towards understanding how this critical protein works. The report illustrates stopped-flow experiments for measuring the coupled DNA binding and ATPase kinetics underlying Msh2-Msh6 mechanism of action in DNA repair.

DNA Onarım Protein Eylem Mekanizması Soruşturma Durduruldu akış Kinetiği Yöntemleri Uygulama

Transient kinetic analysis is indispensable for understanding the workings of biological macromolecules, since this approach yields mechanistic ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the physical properties of the nucleus contribute significantly to the overall biomechanical behavior of cells under physiological and pathological conditions. For example, in migrating neutrophils and invading cancer cells, nuclear stiffness can pose a major obstacle during extravasation or passage through narrow spaces within tissues.1 On the other hand, the nucleus of cells in mechanically active tissue such as muscle requires sufficient structural support to withstand repetitive mechanical stress. Importantly, the nucleus is tightly integrated into the cellular architecture; it is physically connected to the surrounding cytoskeleton, which is a critical requirement for the intracellular movement and positioning of the nucleus, for example, in polarized cells, synaptic nuclei at neuromuscular junctions, or in migrating cells.2 Not surprisingly, mutations in nuclear envelope proteins such as lamins and nesprins, which play a critical role in determining nuclear stiffness and nucleo-cytoskeletal coupling, have been shown recently to result in a number of human diseases, including Emery-Dreifuss muscular dystrophy, limb-girdle muscular dystrophy, and dilated cardiomyopathy.3 To investigate the biophysical function of diverse nuclear envelope proteins and the effect of specific mutations, we have developed experimental methods to study the physical properties of the nucleus in single, living cells subjected to global or localized mechanical perturbation. Measuring induced nuclear deformations in response to precisely applied substrate strain application yields important information on the deformability of the nucleus and allows quantitative comparison between different mutations or cell lines deficient for specific nuclear envelope proteins. Localized cytoskeletal strain application with a microneedle is used to complement this assay and can yield additional information on intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton. Studying nuclear mechanics in intact living cells preserves the normal intracellular architecture and avoids potential artifacts that can arise when working with isolated nuclei. Furthermore, substrate strain application presents a good model for the physiological stress experienced by cells in muscle or other tissues (e.g., vascular smooth muscle cells exposed to vessel strain). Lastly, while these tools have been developed primarily to study nuclear mechanics, they can also be applied to investigate the function of cytoskeletal proteins and mechanotransduction signaling.

We present two independent, microscope-based tools to measure the induced nuclear and cytoskeletal deformations in single, living adherent cells in response to global or localized strain application. These techniques are used to determine nuclear stiffness (i.e., deformability) and to probe intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton.

Fazlararası Hücre Çekirdek Mekanik Özellikleri Probe Biyofiziksel Tahliller: Yüzey Gerilme Uygulama ve Microneedle Manipülasyon

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

Kabuklu uzun vadeli Lethal Toksisite Testi Artemia Franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

In vitro Metilasyona Tahlil Protein Arginin metilasyon Okuyacak

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively inert because it has two unpaired electrons located in different pi * anti-bonding orbitals. These two electrons have parallel spins, meaning they rotate in the same direction about their own axes. This is why the oxygen molecule is not very reactive. Activation of oxygen may occur by two different mechanisms; either through reduction via one electron at a time (monovalent reduction), or through the absorption of sufficient energy to reverse the spin of one of the unpaired electrons. This results in the production of reactive oxidative species (ROS). There are a number of ways in which the human body eliminates ROS in its physiological state. If ROS production exceeds the repair capacity, oxidative stress results and damages different molecules. There are many different methods by which oxidative stress can be measured. This manuscript focuses on one of the methods named cell gel electrophoresis, also known as &#8220;comet assay&#8221; which allows measurement of DNA breaks. If all factors known to cause DNA damage, other than oxidative stress are kept constant, the amount of DNA damage measured by comet assay is a good parameter of oxidative stress. The principle is simple and relies upon the fact that DNA molecules are negatively charged. An intact DNA molecule has such a large size that it does not migrate during electrophoresis. DNA breaks, however, if present result in smaller fragments which move in the electrical field towards the anode. Smaller fragments migrate faster. As the fragments have different sizes the final result of the electrophoresis is not a distinct line but rather a continuum with the shape of a comet. The system allows a quantification of the resulting &#8220;comet&#8221; and thus of the DNA breaks in the cell.

Comet assay measures DNA breaks, induced by different factors. If all factors (except oxidative stress) causing DNA damage are kept constant, the amount of DNA damage is a good indirect parameter of oxidative stress. The goal of this protocol is to use comet assay for indirect measurement of oxidative stress.

Sistemik Oksidatif Stresin bir Dolaylı Tedbir olarak Comet Assay

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

Kronik sonra fare dalak DNA hasar ve Onarım Ölçme<em&gt; In Vivo</em&gt; Beta ve gamma-Radyasyonun Çok Düşük Doz Maruz Kalma

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi<em&gt; İn Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

Montaj ve &#39;Kayma Rings&#39; Uygulama: Orbital tek yönlü ve Periyodik Akışkan Akışının ve Kayma Stres için Yeni Bir Endotel Modeli

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. To improve the mating efficiency of B. Xylophilus and to increase the chances of mating observation, virgin adults were cultured and used for the investigation. Eggs were obtained by keeping the nematodes in water and allowing the females to lay eggs for 10 min. The second-stage juveniles (J2) were synchronized by incubating the eggs for 24 h at 25 &#176;C in the dark, and the early J4 were obtained by culturing the J2 with grey mold, Botrytis cinerea, for another 52 h. At this time point, most J4 nematodes could be clearly distinguished as being male or female using their genital morphology. The male and female J4 were collected and cultured separately in two different Petri dishes for 24 h to get virgin adult nematodes. A virgin male and a virgin female were paired in a drop of water in the well of a concave slide. The mating behavior was filmed with a video recorder under a stereomicroscope. The whole period of the mating process was 82.8 &#177;3.91 min (mean &#177;SE) and could be divided into 4 different phases: searching, contacting, copulating, and lingering. The mean minutes of duration were 21.8 &#177; 2.0, 28.0 &#177; 1.9, 25.8 &#177; 0.7 and 7.2 &#177; 0.5, respectively. Eleven sub-behaviors were described: cruising, approaching, encountering, touching, hooping, locating, attaching, ejaculating, separating, quiescence, and roaming. Interestingly, obvious intra-sexual competition was observed when one female was grouped with 3 males or one male with 3 females. This protocol is useful and valuable, not only in investigating the mating behavior of B. xylophilus, but also in acting as a reference for ethological studies of other nematodes.

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.

Pinewood Nematodu gözlem ve Çiftleşme Davranış miktarının belirlenmesi,<em&gt; Orijinli olanlar</em

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...