Name: single molecule analysis of laser localized psoralen adducts
Uploaded: 2017-04-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts at JoVE.com

Bu araştırma (Z01 AG000746-08) ve Fanconi Anemisi Araştırma Fonu Yaşlanma üzerine NIH, Ulusal Enstitüsü İntramural Araştırma Programı tarafından kısmen desteklenmiştir.

Dig-TMP hazırlanması 1. <ol><li> 50 mg (0.18 mmol) 8-trımetılpsoralen&#39;dır 4&#39;-klorometil-4,5&#39; , ve bir kuru 25 mL&#39;lik yuvarlak 590 mg (2.7 mmol) 4,7,10-trioksa-1,13-tridecanedi-amin karıştırın nitrojen altında bir şişeye -Dip. 12 saat için 10 ml toluen ve geri akış ekleyin. Indirgenmiş basınç altında, bir döner buharlaştırıcı içerisinde çözücüden çıkarın. <ol><li> Silika jel üzerinde flaş kolon kromatografisiyle artığı arıtın. (: 1: 0.5, 9), kloroform, metanol ve% 28 amonyak çözeltisi ile sütun elute. düşük basınç altında bir döner buharlaştırıcı çözücü buharlaşır ve geri saf 4 &#39;- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminometil-4,5&#39;, 8-trımetılpsoralen&#39;dır yapışkan sarı bir soluk sıvı. </li><li> 4, 5.5 mg (0.012 mmol) karıştırın &#39;- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminometil-4,5&#39;, digoksigenin NHS ester 5 mg (0.008 mmol) içindeki bir 8-trımetılpsoralen&#39;dır azot altında kuru bir yuvarlak dipli şişeye. 0.5 ml susuz dimetil formamid ekleme (DMF) bird trimetilamin 3.4 uL, 18 saat boyunca 50 ° C&#39;de karıştırın. </li><li> indirgenmiş basınç altında, bir döner buharlaştırıcı içerisinde çözücüden çıkarın. </li><li> diklorometan minimum miktarda tortu çözülür. yatay bir durağan faz olarak silis jeli ile hazırlayıcı ince tabaka levhasının alt kısmı boyunca 2 uL noktalar çözelti uygulanır. metanol: kloroform içinde hazırlayıcı TLC çalıştırın% 28 amonyum hidroksit (8: 1: 0.1). </li><li> dikey kenarlarda hariç plaka Maske ve kısa dalga boylu UV 254 nm lambası ile ürünün bandını belirlemek. Bir spatula ile plakadan kazıyın ve ürün kloroform kullanılarak saf ürün izole: metanol:% 28 amonyum hidroksit (8: 1: 0.1) karışımı ile gerçekleştirilmektedir. </li><li> indirgenmiş basınç altında, bir döner buharlaştırıcı içinde çözücüleri çıkarın. % 50 1 mL EtOH içinde kalan pelet çözülür: H2O, tüm solvent (~ 3 saat) buharlaştırılır kadar bir santrifüjlü buharlaştıncı içerisinde 1.5 ml tüpler (~ 20 kısımlar) ve kuru 50 uL&#39;lik bölümler halinde dağıtmak. </li><li>Bir santrifüjlü buharlaştıncı içerisinde yeniden H2O ve kuru:% 50 EtOH, 200 uL, her bir kısım yeniden çözündürülür. % 50 EtOH 200 uL yeniden her kısım çözülür: H2O, uzun süreli depolama için -20 ° C &#39;de santrifüj buharlaştırıcı ve mağaza peletler kuru. </li></ol></li><li> H2 O, 1 hazırlayın: H2O içinde çözülmüş Dig-TMP 100 seyreltme ve 250 nm &#39;de OD ölçümü kullanmak için,% 50 EtOH 50 uL pelet çözülür. Dig-TMP ekstinksiyon katsayısı 25.000&#39;dir. -20 ° C&#39;de muhafaza edildiğinde çözeltisi yaklaşık bir ay boyunca stabildir. Her kullanımdan önce, 250 nm &#39;de OD ölçümü ile konsantrasyonunu kontrol edin. <ol><li> Stok konsantrasyonu hesaplanır: Abs x 100 x 10 (uM olarak) 6 / 25,000 = Konsantrasyon. Tipik olarak, stok çözeltisi, yaklaşık 3 mM&#39;dir. Ortama ilave EtOH hacmini en aza indirmek için, bu aralık içinde olması önem taşımaktadır. </li></ol></li></ol> 2. Lazer Lokalize Dig-TMP ICLs <ol><li> peBir SRS azot lazeri (337 nm) ile bir eş odaklı mikroskop ile rform lazer lokalizasyonu 365 nm&#39;lik bir çizgi yayan ve 0.7 nW bir güç ile, 10 Hz, 3 ns darbeleri ateşleme bir boya hücresi içinden pompalanır. </li><li> 35 mm cam tarafında dikey bir işaret koyun bir işaret kalemi ile hücre kültür çanağı tabanı. Bir elmas kalem ile kültür yüzey üzerinde cam merkezinde bir çapraz kaşı bu çanak tarafındaki siyah şerit çapraz bir kol üstünde olduğundan emin olun. Bu ve hücreler aynı odak düzleminde olacak şekilde enine cam büyüme yüzeyi üzerine işaretlenir. </li><li> % 70 EtOH durulama ile işaretlendikten sonra plaka sterilize edin. Hücreleri kaplama önce kuru. </li><li> ortada plakası hücreleri (örneğin, HeLa veya U2OS gibi standart laboratuar suşları) bir ya da iki gün önce kültür kaplarına oldu. Hücre aktif olarak bölünen ve deney günü% 50-70 konfluent olmalıdır. eşit etiket DNA 1 uM 5-kloro-2-deoksiüridin (CldU) ile 24 saat inkübe edin. </li><li> Eklemek% 50 EtOH Dig-TMP: 20 uM nihai konsantrasyona kadar hücre kültürü ortamına H2O. 37 ° C&#39;ye kadar ortam getirin. Inkübatörde hücre ve yer üzerinde orta değiştirme (37 ° C,% 5 CO2) 30 dakika Dig-TMP dengeye gelmesine izin vermek için. </li><li> Hücreler kuluçka iken, lazer aktif olduğu görüş alanının x / y koordinatlarını belirlemek. Lazer, yatay ve diyagonal bir hat boyunca yansıtılmış cam slayt etch yazılım tarafından yönlendirildiği üreticinin kalibrasyon prosedürünü izleyin. iki satır lazer hedef grev hangi alanın sınırlarını tanımlar. </li><li> Mikroskop sahnede kontrol CO2 ve nem ile 37 ° C &#39;de, çevre odasında plaka koyun ve çapraz kesiştiği 60X yağa amacı ile odaklanır. </li><li> yazılım şekil aracıyla araştırmacı tarafından kurulmuş bir ROI, 365 nm lazer ışını doğrudan, 3 ve bir şerit oluşturmak üzere# 181; 0.6 um mx. ROI anahat haç kesiştiği hemen yakınında bulunan hücrelerin çekirdeklerinde imleç tarafından yerleştirilir. çekirdek boyunca lazer yarıda hedef z odak düzlemi ayarlayın. 350-370 nm aralığında bir lazer kullanın. 405 nm lazer çapraz bağ 19 neden olamaz. NOT: diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntülemede nükleolazma ayırt edilebilir nükleol dışında nükleoplazmik alanlarda yatırım getirisini bulun. </li><li> Bir hücreyi (hücre karartmak ve ardından kaybolur) yoketmek için yeterli bir seviyeye güç ayarını artırarak lazer odak ve aktivitesini kontrol edin. Bu mikroskopta ve sonra lamel içinden ve hücrelere lazer için engelsiz bir ışık yolu için önemli bir tanı olduğunu. <ol><li> psoralen ve ICL uyarılan DDR (bu her lazer / mikrofon için ampirik olarak tespit edilmelidir aktive etmek için yeterli güç ayarını düşürünroscope kombinasyon). (Γ-H2AX oluşumu ile izlenmiştir) psoralen yokluğunda DDR aktif olmayan bir lazer yoğunluğu ayarını (burada% 1.7) kullanın. NOT: Bu önemli bir belirlenmesidir ve lazer kaynağı veya ışık yolu bir bileşen değiştirilirse ayarlarının yapılmasını gerektirebilir. GFP birikimi lazer psoralen çizgili tür hızlı bir şekilde (saniye olarak) ortaya çıkar, her ikisi de XPC veya OPT_FAN1 gibi tamir etiketli proteinlerin izleyin, ancak tek başına lazer maruz ROI için değil. Birkaç dakika diğerleri için gerekli olabilecek iken DDR Bazı proteinler, saniyeler içinde görünür. Ilgi her protein için zaman ders saptamaları yapmak gereklidir. Biz de lazere maruz kalmamış hücrelerden yanıt proteinlerin hiçbir çizgiler olduğunu unutmayın. </li></ol></li><li> Bir alandaki tüm hücreler haç kesiştiği yakın kalarak hareket ettiremeyecek yeni bir alana plaka hedeflenmiş sonra. </li><li> deneylerde unsurlar için tasarlanmışarası lezyon mesafelerin dağıtım kesişme 20-25 alanları (4-5 hücre / görüş alanı), lazere hücreler maruz ine. lokalize ICLs yakın çoğaltma kalıpları analiz etmek için lazer atışı sonrasında 10 uM 5-İyodo-2-deoksiüridin (DUK) ile hücrelerin inkübe edin. NOT: DUK ile inkübasyon süresi biraz keyfi olduğu. Bu, 20 dakika kadar kısa ve en fazla 60, min (aşağıya bakınız) olarak kullanılmıştır. Daha uzun bakliyat (birkaç saat) genellikle böylece görüntüye tek çatal ilerlemesini fırsat kaybediyor, kaynaştırma çoklu çoğaltma yolları ile sonuçlanır. Bazı deneylerde, ces çoğaltma yolları darbe etiketleme ve ardından Dig-TMP maruz bırakılmadan önce etiket DNA muntazam üzere 24 saat boyunca CldU ile etiketlenmiştir. </li></ol> 3. Hücreleri hasat ve DNA Liflerin germe <ol><li> Sahneden plaka çıkarın orta kaldırmak ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yıkanır. PBS çözüm çıkarın. Ticari bir tripsin 10 mcL damla yerleştirin/ Cam yüzeyinin ortasında çapraz kesişme EDTA çözeltisi. </li><li> Oda sıcaklığında (RT) 3-4 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra pipet ucuna müstakil hücreler tripsin solüsyonu çizin. tripsin nötralize etmeye gerek yoktur. </li><li> bir silanize cam mikroskop lamı bir ucunda hücreler tripsin / EDTA damla yerleştirin. Hücreleri, ve kurumaya havuzun çevresini sağlayan,% 0.5 SDS çözeltisi 10 uL eklenmesiyle DNA&#39;yı serbest bırakmak ve pipet ucu ile hafifçe karıştırılarak oda sıcaklığında 3-4 dakika inkübe edilir. </li><li> slayt eğin 20 ° ve sıvı aşağı ucuna çalışmasına izin verir. DNA, lifler akan sıvının hidrodinamik kuvvetler tarafından gerilir / uzatılır. Slaytlar kuru hava (yaklaşık 10 dakika) izin 3 düzeltmek: 10 dakika için 1 metanol / asetik asit. Tekrar düzeltme çözümü ve kuru hava slaytları çıkarın. Bu noktada, -20 ° C&#39;de% 70 EtOH içinde süresiz olarak saklanabilir. % 70 EtOH çıkarıldıktan NE önce kurumaya bırakınxt adım. </li><li> PBS içinde slaytlar yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 1 saat boyunca 2.5 M HCl içinde denatüre. Bu işlem, DNA antikorlara dahil halojenlenmiş nükleobaz erişilebilir hale depurinates. </li><li> 0.4 M Tris-HCI, pH 7.4 içinde kayar nötralize. PBS içinde iki kere yıkayın /% 0.5 Tween-20 (PBST) her biri 5 dakika için. </li><li> Blok PBS içinde% 5 sığır serum albümini (BSA) ve% 10 keçi serumu ile kayar. slayt üzerine eşit bir şekilde bloke çözeltisi yayılır ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübasyona bir parafilm yavaşça slaytlar örtün. </li><li> 1 pipetleyin 100 uL: sıçan anti-bromodeoksiüridin çözümü engelleme 200 seyreltme Her bir slayt, birincil antikor (özellikle CldU tespit eder). Oda sıcaklığında 1 saat boyunca nemlendirilmiş bir odada sürgü üzerinde eşit olarak seyreltme yayılmış ve inkübasyona bir parafilm yavaşça slaytlar örtün. parafilm çıkarın ve 5 dakika her biri için slaytlar PBST üç kez yıkayın. </li><li> Her bir slayt çözüm engelleme: (1: 100) keçi anti-fare Alexa Fluor 647 seyreltilmiş pipetleyin 100 uL. KapakBir parafilm nazikçe kayar ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edilir. 5 dakika her biri için slaytlar PBST üç kez yıkayın. </li><li> 200: seyreltilmiş (1:40) fare anti-bromodeoksiüridin pipetleyin 100 uL primer antikor ile ve tavşan anti-DIG antikoru (1 (. LDU ve CldU Bu çift özgüllük sıçan inkübasyondan önce anti BrdU ile CldU bloke gerektiren tespit eder) ) her bir slayta çözüm engelleme. bir parafilm yavaşça slaytlar kapatılır ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca nemlendirilmiş bir odada kuluçkaya. 5 dakika her biri için slaytlar PBST üç kez yıkayın. </li><li> Her bir slayt çözüm engelleme keçi anti-tavşan prob (örneğin, Qdot 655) (: 1: 100), keçi anti-fare Alexa Fluor 488 andC (5.000 1) ile seyreltildi pipetleyin 100 uL. nazikçe parafilm slaytlar örtün ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edilir. 5 dakika her biri için slaytlar PBST üç kez yıkayın. </li><li> bir kağıt havlu üzerine aşırı PBST boşaltın. Her bir slayt üzerine antifade montaj orta 50 uL ekleyin ve bir lamel ile kaplayın. Görüntü veya mağaza için-20 ° C de bir fazla 48 saat. </li></ol> Floresan mikroskobu ile 4. Fiber Görüntüleme <ol><li> FITC, Cy5 ve Q Dot 655 algılama ile ekli bir tam motorlu filtre çarkı ile bir inverted mikroskop ile 63X objektif ile görüntü alımı gerçekleştirin. Uyarma filtresi 425 nm ve emisyon filtresi emisyon tepe 20 ortalanan 20 nm ile 655 nm arasındadır. </li></ol>

<ol>
	<li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Intrinsic+Fragility+of+DNA+(Nobel+Lecture).">The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture).</a> Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).</li><li>Sirbu, B. M., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response:+three+levels+of+DNA+repair+regulation.">DNA damage response: three levels of DNA repair regulation.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272 (2013).</li><li>Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+protein+dynamics+and+DNA+repair+following+generation+of+DNA+double-strand+breaks+at+defined+genomic+sites.">Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 915-922 (2008).</li><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo.">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li><li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+analysis+of+repair+processes+for+oxidative+DNA+damage+in+mammalian+cells.">In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13738-13743 (2004).</li><li>Reynolds, P., Botchway, S. W., Parker, A. W., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+dynamics+of+DNA+repair+proteins+following+laser+microbeam+induced+DNA+damage+-+when+is+a+DSB+not+a+DSB?.">Spatiotemporal dynamics of DNA repair proteins following laser microbeam induced DNA damage - when is a DSB not a DSB?.</a> Mutat. Res. 756, 14-20 (2013).</li><li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+DNA+double-strand+breaks:+production,+fidelity+of+repair,+and+induction+of+cancer.">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12871-12876 (2003).</li><li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+dose-rate+effects,+endogenous+DNA+damage,+and+signaling+resonance.">Radiation dose-rate effects, endogenous DNA damage, and signaling resonance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17874-17879 (2006).</li><li>Aguilera, A., Garcia-Muse, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+of+genome+instability.">Causes of genome instability.</a> Annu. Rev. Genet. 47, 1-32 (2013).</li><li>Swenberg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+versus+exogenous+DNA+adducts:+their+role+in+carcinogenesis,+epidemiology,+and+risk+assessment.">Endogenous versus exogenous DNA adducts: their role in carcinogenesis, epidemiology, and risk assessment.</a> Toxicol. Sci. 120 (1), S130-S145 (2011).</li><li>Eichman, B. F., Mooers, B. H., Alberti, M., Hearst, J. E., Ho, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structures+of+psoralen+cross-linked+DNAs:+drug-dependent+formation+of+holliday+junctions.">The crystal structures of psoralen cross-linked DNAs: drug-dependent formation of holliday junctions.</a> J. Mol. Biol. 308, 15-26 (2001).</li><li>Lai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+DNA+interstrand+cross-links+and+monoadducts+formed+in+human+cells+induced+by+psoralens+and+UVA+irradiation.">Quantitative analysis of DNA interstrand cross-links and monoadducts formed in human cells induced by psoralens and UVA irradiation.</a> Anal. Chem. 80, 8790-8798 (2008).</li><li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation.">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjug. Chem. 18, 431-437 (2007).</li><li>Muniandy, P. A., Thapa, D., Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+laser-localized+DNA+interstrand+cross-links+in+G1+phase+mammalian+cells.">Repair of laser-localized DNA interstrand cross-links in G1 phase mammalian cells.</a> J Biol. Chem. 284 (41), 27908-27917 (2009).</li><li>Nowsheen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+oxidatively+induced+clustered+DNA+lesions+in+human+tumor+tissues.">Accumulation of oxidatively induced clustered DNA lesions in human tumor tissues.</a> Mutat. Res. 674, 131-136 (2009).</li><li>Meyer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+DNA+damage+induces+pan-nuclear+H2AX+phosphorylation+mediated+by+ATM+and+DNA-PK.">Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK.</a> Nucl Acids Res. 41, 6109-6118 (2013).</li><li>Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+DNA+replication+in+the+vertebrate+model+system+DT40+using+the+DNA+fiber+technique.">Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique.</a> J Vis. Exp. (56), e3255 (2011).</li><li>Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+dynamic+DNA+scanning+by+nucleotide+excision+repair+proteins+investigated+by+single-+molecule+imaging+of+quantum-dot-labeled+proteins.">Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single- molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins.</a> Mol. Cell. 37 (5), 702-713 (2010).</li><li>Spielmann, H. P., Sastry, S. S., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+large-scale+synthesis+of+psoralen+furan-side+monoadducts+and+diadducts.">Methods for the large-scale synthesis of psoralen furan-side monoadducts and diadducts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (10), 4514-4518 (1992).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+translocase+FANCM/MHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks.">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Mol. Cell. 52, 434-446 (2013).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+Analysis+of+Laser+Localized+Interstrand+Crosslinks.">Single Molecule Analysis of Laser Localized Interstrand Crosslinks.</a> Front Genet. 7, 84 (2016).</li><li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+damage+response:+making+it+safe+to+play+with+knives.">The DNA damage response: making it safe to play with knives.</a> Mol. Cell. 40, 179-204 (2010).</li><li>Mori, T., Matsunaga, T., Hirose, T., Nikaido, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+monoclonal+antibody+recognizing+ultraviolet+light-induced+(6-4)+photoproducts.">Establishment of a monoclonal antibody recognizing ultraviolet light-induced (6-4) photoproducts.</a> Mutat. Res. 194, 263-270 (1988).</li><li>Poirier, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisera+specific+for+carcinogen-DNA+adducts+and+carcinogen-modified+DNA:+applications+for+detection+of+xenobiotics+in+biological+samples.">Antisera specific for carcinogen-DNA adducts and carcinogen-modified DNA: applications for detection of xenobiotics in biological samples.</a> Mutat. Res. 288, 31-38 (1993).</li><li>Henderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+G-quadruplex+DNA+in+mammalian+cells.">Detection of G-quadruplex DNA in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 42, 860-869 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Lazer lokalizasyon teknolojisi parlak alan mikroskopisi de görebilir çekirdekleri yapışan hücrelerin kullanımını gerektirmektedir. Böyle polilisin veya kolajen veya daha fazla kompleks karışımlar olarak hücre yapıştırma preparatları ile cam yüzeyine, örneğin primer lenfositler, ya da AD293 olarak gevşek bir şekilde yapışık kültürlenmiş hücreler gibi yapışmayan hücreler, takmak için çalışılmıştır. bu tedaviler yüzeye hücreleri bağlamak olsa bile, genellikle çok zor çekirdekleri içine odaklanmak için yapım yuvarlak kalmak görüyoruz. Bundan başka, hücrelerin çoğu büyüme ortamının ayrılmasından sonra ilk yıkamayı hayatta başarısız. Bununla birlikte, yapışkan hücreler için gereksinimi içinde, başarılı bu çalışmalar için standart hücre çizgilerinin geniş hem de esas hücreleri kullanılmıştır. Mikoplazma kontaminasyonu için test hücrelerine yararlıdır. Biz hücre yanıtları bu enfeksiyonların tarafından değiştirilmiş olduğunu bulmak. lazerin odak düzlemi önemlidir. Amaç etmektirÇekirdek içerisindeki ICLs yerleştirin. Çok yüksek ve foto-aktifleştirme çekirdeği üzerinde olacak; çok düşük ve cama olacak. Biz yararlı sitoplazma ve çekirdekten kesiştiği DIC görüntünün odağını netleştirmek bulabilirsiniz. Fiber tahliller zor değildir, ancak yorumlanabilir alanlar kurtarıldı önce biraz pratik gerektirir. Düzgün bu tekniği uygulamak için önemlidir. Lazer deneylerden kazanılan hücre sayısı düşüktür ve her bir örnek, bir, tek slayt üzerinde bütünüyle kullanılır. Numuneler, daha sonra analiz için saklandı alikotları ile, bölme edilemez Sonuç olarak, her bir deneyden elde edilen verimini maksimize etmek esastır. Ancak, olayların yüzlerce tek bir örnekten elde edilebilir. Prosedürün İki özellikleri merkezi öneme sahiptir. Bir slayt aşağı hücre lizatının akış oranıdır. Çok hızlı olursa, DNA&#39;nın çok slayt kapalı çalışacaktır. cam slaytların kalitesi de önemlidir. Zaman zaman Receetkisiz bir sürü ive. Sonuç olarak her yeni lot kullanımdan önce test edilmelidir. Vb ticari reaktifler-antikorları, immunoquantum noktalar güvenilirliği tüm laboratuar manipülasyonları için geçerli olduğu gibi, her zaman bir husustur. Bunlar hep stabil değildir ve deneysel başarısızlık genellikle bir ya da başka bir reaktif ile sorunlara kadar takip edilir. immunoquantum noktalar sorunludur, ve birden fazla çok kabul edilebilir bir tespit için test edilmesi gerekebilir. Etkisiz çok yüksek arkaplan sinyalleriyle işaretlenmiştir. Bu lifler ile ilişkili değildir ve herhangi bir DNA&#39;ya sahiptir sürgünün bölgelere görülecektir. O Bonner grubunun 4 ile tanıtılan bu yana yerel DNA hasarını tanıtmak lazerlerin kullanımı oldukça popüler hale gelmiştir. doğrudan DDR uyaracak şekilde olanlar ve en sonraki deneylerde lazer güç ayarlarını ayarlanır. Biz yeterince düşük suc ayarı gücünü kullanmış olanDDR aktivasyonu lazer ve psoralen hem bağlıdır h. Yukarıda ele alındığı gibi, psoralen adüktleri arasındaki ayrılma tek tek olaylara yanıt bakıyor iddia etmektedir. Endojen çapraz bağlama maddeleri ile oluşturulmaktadır ICLs sayısı bilinmemektedir birlikte, 6-8 saat (yayınlanmamış veriler) içinde psoralen ilave maddelerin kaldırmak mümkün olduğu gibi psoralen adüktlerin lokalizasyonu, hücreleri öldürmez olduğunu not edin ve mevcut ve sağlıklı, 24 saat sonra bulunmaktadır. Dolayısıyla bu yaklaşım daha az toksik çekirdek ve mitokondri içinde DNA hasarına tanıtmak ajanlara maruz gerektirir protokollere göre hücreler etmektir. lazer / psoralen kombinasyonu DDR aktive bir sarmal çarpıtan yapısını tanıtmak. Bu bağlamda, bu yaklaşım elde edilen sonuçlar, ATM / DNAPK / ATR aktivasyonundan sonra, DDR basamaklı doğası göz önüne alındığında, helezon bozan lezyonların bir dizi için geçerli olduğu, 22. kinaz.Bu bağlamda, burada açıklanan DNA elyaf yaklaşım floresan ile görüntülenebilir immünolojik veya kimyasal veya biyokimyasal yollarla saptanabilir herhangi bir DNA yapısı genişletilebilir. UV içerebilir Bu 23, hacimli alkilatörler 24, G quadruplexes 25 ve oksidatif lezyonlar 5 PHOTOPRODUCTS.

DNA, ek olarak, bu oksidatif metabolizma tarafından üretilen endojen radikal türleri tarafından saldırıya vb radyasyon, ultraviyole ışık, çevresel toksinler, yanma ürünleri gibi eksojen maddeler sürekli saldırı altındadır. Bunların hepsi, kimyasal veya fiziksel olarak DNA 1 bütünlüğünü bozmak için potansiyele sahiptir. genomunda pertübasyonlar lezyon onarımında yer alan proteinleri ve mikroRNA binlerce değilse, yüzlerce, DNA hasarına (DDR), bir işe ve post-translasyonel modifikasyonlar kaskadını aktive edebilirler, hücre döngüsü, apoptoz, yaşlanma ve inflamatuar yolların düzenlenmesi 2. DDR hakkındaki bilgilerin çoğu DSBs ile çalışmalardan gelmektedir. Bunun nedeni canlı hücreler 3&#39;te genomik DNA&#39;da, sekans spesifik sonları dahil, sonları tanıştırmak için teknolojilerin kullanılabilirliği büyük ölçüde olduğunu. Buna ek olarak, propensitsonları y immünofloresansla görüntülenebilir DDR proteinlerin odakları indükleme, kinetik ve yanıt proteinlerinin gereksinimlerini tanımlanması için yararlı olmuştur. DDR eğitimi için anahtar teknolojilerden biri canlı hücreler 4 çekirdeklerinde bir &quot;İlgi Bölgesi&quot; içinde DSBs bir şerit yönlendirmek için (YG) bir lazer ışını kullanılır Bonner ve arkadaşları tarafından tanıtıldı. Aslında, onlar DDR proteinler Immünofloresan tarafından tespit edilebilir ki uzun bir odak oluşturdu. Bu lazer maruz bırakılmış hücreler içinde fosforile histon H2AX güçlü şerit (γ-H2AX) kendi gösterilmesiyle izah edildi. O zamandan beri, lazer yaklaşım DSBs tarafından uyarılan DDR sayısız çalışmalarda kullanılmıştır. Güçlü ve popüler ve dramatik immünfloresans görüntülerin kaynağı olsa da, lezyon kimlik kaygısı olmadan, gözlemlenebilir sonuçlar üretmek üzere en deneylerinde lazer yoğunluğu ayarlanır unutulmamalıdıryoğunluk ya da aralık. Gerçekten de, tahminler yapmak zor olabilir. Böylece büyük ölçüde lazerler 5 ile DNA içine lezyonların çokluğu rağmen göz ardı edilir. Bu literatürde 6&#39;da birçok çelişkiler katkıda bulunur. DSBs aksine, DNA&#39;nın çoğu kimyasal modifikasyonlar, DDR proteinlerin ayrı kümelerle oluşumunu teşvik etmemektedir. Bu lezyon frekanslarının mevcut anlayış ışığında önemlidir. Kültürde insan hücreleri S fazında 7, 8, 9 sırasında büyük ölçüde oluşan hücre döngüsü başına 50 kadar DSBs, tabi olduğu tahmin edilmiştir. Daha az çoğalmayan hücrelerden oluşur. Bu hücre / gün 1, 10 başına binlerce olan nükleobaz kayıp veya değişiklik olaylarının sayısı ile tezat teşkil etmektedir. Böylece, en biliyorNispeten nadir bulunur ve bütünüyle çok daha yaygındır sarmal bozan lezyonlar, neden oldukları hakkında çok az olan olaylar neden olduğu DDR. Genomik DNA modifikasyonları kovalent hücresel yanıtı hakkında sorulara cevap bulmak amacıyla, biz doğal DDR indüksiyon aktivitesine sahip bir helezon bozan DNA adükt ile çalışmak istediğini. Dahası, deneysel tasarım kolaylaştırmak ve yorumlama kimin giriş zamana göre kontrol edilen ve görselleştirme edilebilir niteliktedir edilebilecek bir yapıda ilgi için. Buna göre, psoralen dayalı bir strateji geliştirdi. siteleri: AT psoralenler de 5&#39; TA lehine fotoaktif DNA araya karakterize edilir. nitrojen hardalları ve mitomisin C (MMC) uzun dalga UV (UVB) ışığa maruz sürece, DNA reaktif değildir gibi diğer çapraz bağlama maddeleri aksine. birleştirilmiş moleküller sarmal bozan içi çapraz bağlantılar üretebilme karşıt şeritler üzerindeki timin bazların (ICLs ile reaksiyona) 11. Deneylerde kullanılan trimetil psoralen ile en ürünleri oluşmadığı nispeten az monoadüktler içeren gruptan (% 10&#39;dan az) oluşturulur ICLs, 12 ve bir iplik üzerindeki bitişik bazlar arasında şerit-arası çapraz bağları olan. bunlar sis-platin ve MMC gibi replikasyon ve transkripsiyon, psoralen ve diğer çapraz bağlama maddeleri, güçlü blok için, yaygın olarak kemoterapi kullanılır. Bu nedenle, psoralen bir helis bozan yapı ile DDR aktivasyonunu takip ve aynı zamanda klinik öneme sahip bir bileşiğin hücresel tepki ilişkin bilgi temin çalışmalar sağladı. Bu trimetil psoralen digoksijenin (DIG) ile bağlantılı olduğu bir reaktif sentezlenmiş, bir bitki sterol memeli hücrelerinde bulunan ve sık sık bir immunotag olarak kullanılmaz. fotoaktivasyon şartı canlı hücrelerde çekirdek tanımlanan ROI içinde psoralen ICLs lazer ışığına (365 nm) ile konumlandırılmasına olanak vermektedir. Bunlar imm tarafından görüntülenebilirKazı etiketine karşı unofluorescence. DNA onarımı ve DDR proteinleri ICLs 13, 14 lokal lazer çizgili ortaya çıktı. DSBs üretilmesi için kullanılan yüksek lazer yoğunlukları ile aktive DDR izole edilmiş ya da kümelenmiş hasar 15, 16 nedeniyle olabilir. Sonuç olarak, bu deneyden elde edilen sonuçlar ile ilgisi doğal lezyonlar, bu çok daha düşük bir konsantrasyonda meydana için, kesin değildir. DNA psoralen adükt sıklığı ve aralığı ile ilgili benzer soruları için, DNA elyaf teknolojisi 17 ve immunoquantum noktaların yararlandı. Kuantum nokta floresan boyalar daha parlak ve ışığa maruz kalma ile ağartılmış değildir. Bu nedenle sık sık, tek molekül görüntüleme 18 için kullanılan bir uygulama olan floresan boyalar yeterince parlak. Bireysel DNA lifler g üzerinde gerilebilirkız slaytlar ve hasat hücre önce inkubasyon sırasında dahil nükleosid analogları karşı immünofloresansla görüntülenebilir. Biz Dig-psoralen ile hücreleri tedavi ve lazer mikro ışınımına yatırım getirisi teşhir etti. Elyaf immunoquantum noktalarla görüntülenebildi hücrelerin ve tek tek Dig-psoralen adüktleri hazırlanmıştır. nispeten kısa sürelerde (20-60 dakika), nükleozid analogları ile hücrelerin maruz lazer lokalize ICLs yakın çoğaltma yolları görüntü ile birlikte.

<table><tbody><tr><td>Digoxigenin NHS ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11333054001</td><td></td></tr><tr><td>Chloro-psoralen</td><td>Berry and Associates</td><td>PS 5000</td><td></td></tr><tr><td>diaminoglycol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>369519</td><td>4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Acros Organics</td><td>423550040</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4524</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5002</td><td></td></tr><tr><td>TLC plates</td><td>Analtech, Inc.</td><td>P02511</td><td></td></tr><tr><td>Flass glass column 24/40, 100 mL</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CG-1196-02</td><td></td></tr><tr><td>Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>With Volocity Software</td></tr><tr><td>Micropoint Galvo&amp;nbsp;</td><td>Andor Technologies</td><td></td><td>with a Nitrogen pulsed laser&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>dye cell</td><td>Andor Technologies</td><td>MP-2250-2-365</td><td></td></tr><tr><td>365 dye</td><td>Andor Technologies</td><td>MP-27-365-DYE</td><td></td></tr><tr><td>IdU&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17125</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10 mm glass diameter, uncoated</td><td>Matek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>microscope slides</td><td>New Comer Supply</td><td>Part # 5070</td><td>New Silane Slides</td></tr><tr><td>Mouse anti BrdU antibody (IdU)</td><td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td>1 in 40</td></tr><tr><td>Rat anti BrdU Antibody (CldU)</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>1 in 200&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rabbit anti Dig antibody</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>710019</td><td>1 in 200</td></tr><tr><td>Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q-11421MP</td><td>1 in 5,000</td></tr><tr><td>AF647- goat anti Rat IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>112-605-167</td><td>1 in 100</td></tr><tr><td>AF488-goat anti mouse IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-545-166</td><td>1 in 100</td></tr><tr><td>Zeiss epifluorescent microscope A200</td><td>Zeiss</td><td></td><td>&amp;nbsp;with Axiovision software</td></tr><tr><td>Q-dot 655 filter</td><td>Chroma</td><td>39107</td><td></td></tr></tbody></table>

single molecule analysis of laser localized psoralen adducts

DNA hasarı yanıt (DDR) yaygın olarak canlı hücreler lazer mikro ışın demeti radyasyonu ile indüklenen çift iplik kırılmaları (DSB&#39;ler) çalışmalarında karakterize edilmiştir. DDR kol içi çapraz bağlantılar DNA (ICLs) de dahil olmak üzere kovalent DNA modifikasyonları bozucu sarmalı için, hem de tanımlanmamıştır. Biz canlı hücrelerin çekirdeklerinde, immunotagged psoralenler laser fotoaktivasyon tarafından lokalize ICLs tarafından uyarılan DDR, inceledik. yaklaşımlı dağıtım ve çoğaltma çatal karşılaşmalar hakkında temel sorulara cevap bulmak amacıyla, biz iki diğer teknolojilerle lazer yerelleştirme birleştirdi. DNA, elyaf genellikle kısa darbeler sırasında eklenen nükleosit analoglarının immünofloresansla replikasyon çatalları ilerleyişini görüntülemek için kullanılır. Immunoquantum noktalar yaygın tek bir molekül görüntüleme için kullanılmıştır. yeni bir yaklaşım ise, lazer lokalize ICLs taşıyan hücreler DNA lifler mikroskop lamı üzerine yayılır. Etiketlenmiş ICLs immunoquantum noktalar ve inci ile görüntülenirE arası lezyon mesafeleri tespit edilmiştir. ICLs ile Çoğaltma çatal çarpışmalar görülebilir ve farklı karşılaşma desenler belirlendi ve miktarı belirlenir.

Lazer lokalize Dig-TMP (Şekil 1A) ICLs psoralen ile bağlantılı Dig-etiketine karşı immünofloresansla görüntülenebilir. Lazer, herhangi bir konturun bir alanda vurmaya yönelik olmasına rağmen, şeritler hücrelerde &quot;doğal&quot; biçimleri değildir ve yasal sinyalleri kolayca Primer ya da sekonder antikor ile spesifik olmayan bağlanma için eserler ayırt edilebilir. Mükemmel özgüllük daha az antikorlar kullanılırken bu özellik yararlıdır. Dig-TMP ICLs bir şerit DDR, y-H2AX iyi bilinen markeri, bir örneği Şekil 1 B &#39;de gösterilmiştir. Dig immünofloresan adüktlerin sıklığı ve aralığı herhangi bir sonuç izin vermez lazer çizgili lezyon etiketli. yapmak için bu belirleme önce hücreler ICLs tanıtılması, 24 saat boyunca CldU ile inkübe edilmiştir. th karşı boyamae CldU Dig görselleştirme uzun lifler ile ilgili lezyonlar etiketli izin verir ve bu DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol) ya da YOYO {1,1&#39; , direkt lekeleri daha net elyaf kalıpları elde edilir - (4,4,8 , 8-tetrametil-4,8-diazaundecamethylene) [4 - [(3-metil-benzo-1,3-oksazol-2-il) metiliden] -l, 4-dihydroquinolinium] bis tetraiyodid}. Lazer fotoaktivasyonu tarafından ICLs girişten sonra, lifler hedeflenen hücrelerden yayıldı. Örneğin, Şekil 2&#39;de gösterilen gibi lifler üzerinde Dig sinyallerin analizi son yayın 21 de tarif edildiği gibi arası ICL mesafeler, daha büyük 160 kb&#39;ye az 10 kb arasında değiştiğini ortaya koymuştur. kümelenmiş katkılar temin hiçbir kanıt yoktu. Böylece Kazı etiketi ve şerit DDR proteinlerinin birikimi şerit, uzatılmış DNA boyunca ölçüldüğünde en azından, iyi ayrılmış lezyonları yansıtmaktadır. 6 ile, nükleozomal diziler oluşan ICLs durumunda hücresel kromatin açısından bakıldığındauzatılmış DNA uzunluğu sıkıştırma kat, hala DNA&#39;nın yaklaşık 1.6 kb eşdeğeri ile ayrılabilecektir. Lazer neden olduğu DNA hasarına sahip Deneyler genellikle DDR indüksiyonunu takip edin. Bu deneyler nadiren DNA replikasyonu ile ilgili sorularını ilgileniyoruz. Öte yandan, bir DNA elyaf tahliller tipik olarak bir replikasyon çalışmaları için kullanılır. DNA içine dahil olarak halojenlenmiş nükleosid analogları sonuçların kısa darbeler hücrelerin maruz kalma. DNA liflerinin immünofloresan analizi son DNA sentezini temsil dahil analoglarının yolları ortaya koymaktadır. DNA replikasyonu ICL çizgili lokalize lazer meydana eğer sormak ilgi oldu ve eğer öyleyse ne ICLs civarında replikasyon desen olurdu? Hücreler, uzun liflerin bir görüntü olmasını kolaylaştırmak için CldU ile 24 saat süreyle inkübe edildi. Lazer lokalize ICLs Idu 1 saatlik puls ve ardından hücrelere dahil edilmiştir. DNA, f<html> Ibers hedef hücrelerden hazırlanan ve Dig ICLs ve görüntülenen çoğaltma yolları etiketlendi. Sonuçlar psoralen lazer aktivasyonu çoğaltma kapatmaya veya çoğaltma şekilleri sıklığını etkilemediğini göstermiştir. Kısa bir süre önce 21 gösterildiği gibi 1 çoğunluğu: çoğaltma 4 çift taraflı desenleri ile, bir tarafta meydana gelen ve aynı zamanda ICLs her iki tarafında. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55541/55541fig1.jpg" /> Şekil 1: Lazer Lokalize Dig-TMP ICLs üretilmesi. Dig-trimetil psoralen (A) yapısı. Lazer lokalize ICLs (kırmızı Dig) içeren YG γ-H2AX&#39;e (yeşil) (B) Birikim. çekirdeği DAPI (mavi) ile boyandı. aydınlık fotoğraf elmas kalemle yapılan isabetli kısmen bir hücreyi gösterir. nükleollü ve bunların dışında ROI yerleştirilmesi unutmayın.csource.jove.com/files/ftp_upload/55541/55541fig1large.jpg&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55541/55541fig2.jpg" /> Şekil 2: Lazer Lokalize Dig-TMP Sinyalleri DNA elyaflar. (A) Hücreler DNA işaretlemek için CldU ile 24 saat süreyle inkübe edildi. Daha sonra bir lazer lokalize ICLs tanıtıldı ve (B) hücreler hasat edilmiştir ve lifler yayıldı. (C, D) Dig sinyaller, bir immunoquantum nokta (kırmızı) ve immünofloresans (yeşil) ile CldU ile sergilendi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55541/55541fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts at JoVE.com

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Lazerler sıklıkla DNA hasarına hücre tepkisinin çalışmada kullanılır. Bununla birlikte, normal koşullar altında, aralık, sıklık, ve çarpışmalar çoğaltma çatal nadiren karakterize lezyonlar üretir. Burada, lazer lokalize kol içi çapraz bağlar ile bu parametrelerin belirlenmesini sağlayan bir yaklaşım açıklar.

Lazer Lokalize Psoralen adüktlerinin Tek Molekül Analizi

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

single-molecule-analysis-of-laser-localized-psoralen-adducts

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

6.6K Görüntüleme.  National Institute on Aging, National Institutes of Health.  Lazerler sıklıkla DNA hasarına hücre tepkisinin çalışmada kullanılır. Bununla birlikte, normal koşullar altında, aralık, sıklık, ve çarpışmalar çoğaltma çatal nadiren karakterize lezyonlar üretir. Burada, lazer lokalize kol içi çapraz bağlar ile bu parametrelerin belirlenmesini sağlayan bir yaklaşım açıklar. 

Video: Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular biology techniques have clarified structure, enzymatic functions, and kinetics of repair proteins, there is still a need to understand how repair is coordinated within the nucleus. Laser micro-irradiation offers a powerful tool for inducing DNA damage and monitoring the recruitment of repair proteins. Induction of DNA damage by laser micro-irradiation can occur with a range of wavelengths, and users can reliably induce single strand breaks, base lesions and double strand breaks with a range of doses. Here, laser micro-irradiation is used to examine repair of single and double strand breaks induced by two common confocal laser wavelengths, 355 nm and 405 nm. Further, proper characterization of the applied laser dose for inducing specific damage mixtures is described, so users can reproducibly perform laser micro-irradiation data acquisition and analysis.

Confocal fluorescence microscopy and laser micro-irradiation offer tools for inducing DNA damage and monitoring the response of DNA repair proteins in selected sub-nuclear areas. This technique has significantly advanced our knowledge of damage detection, signaling, and recruitment. This manuscript demonstrates these technologies to examine single and double strand break repair.

Lazer mikro-ile kullanma için tek incelenmesi ve çift Strand Break onarım memeli hücrelerinde

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Kanser Araştırmaları

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Genetik

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

Soruşturma 405 Nm lazer mikro-ile kullanarak DNA lezyonlar için Protein alımı

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in mammalian cell lines. Rather than globally assaying removal of xenobiotic-induced or spontaneous chromosomal DPC removal, this assay examines the repair of a homogeneous, chemically defined lesion specifically introduced at one site within a plasmid DNA substrate. Importantly, this approach avoids the use of radioactive materials and is not dependent on expensive or highly-specialized technology. Instead, it relies on standard recombinant DNA procedures and widely available real-time, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) instrumentation. Given the inherent flexibility of the strategy utilized, the size of the crosslinked protein, as well as the nature of the chemical linkage and the precise DNA sequence context of the attachment site can be varied to address the respective contributions of these parameters to the overall efficiency of DPC repair. Using this method, plasmids containing a site-specific DPC were transfected into cells and low molecular weight DNA recovered at various times post-transfection. Recovered DNA is then subjected to strand-specific primer extension (SSPE) using a primer complementary to the damaged strand of the plasmid. Since the DPC lesion blocks Taq DNA polymerase, the ratio of repaired to un-repaired DNA can be quantitatively assessed using qPCR. Cycle threshold (CT) values are used to calculate percent repair at various time points in the respective cell lines. This SSPE-qPCR method can also be used to quantitatively assess the repair kinetics of any DNA adduct that blocks Taq polymerase.

The goal of this protocol is to quantify the repair of defined DNA-protein crosslinks on plasmid DNA. Lesioned plasmids are transfected into recipient mammalian cell lines and low-molecular weight harvested at multiple time points post-transfection. DNA repair kinetics are quantified using strand-specific primer extension followed by qPCR.

Ölçü birimi üzerinde plazmid DNA-protein Glossar tamiri için basit, hızlı ve nicel tahlil memeli hücre içine Transfected

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of carcinogenic processes. This covalent binding, which is considered the cause of tumorigenesis, is now evaluated as a central dogma of chemical carcinogenesis. Here, methods are described employing the reactions catalyzed by cytochrome P450 and additional biotransformation enzymes to investigate the potency of chemicals or drugs for their activation to metabolites forming these DNA adducts. Procedures are presented describing the isolation of cellular fractions possessing biotransformation enzymes (microsomal and cytosolic samples with cytochromes P450 or other biotransformation enzymes, i.e., peroxidases, NADPH:cytochrome P450 oxidoreductase, NAD(P)H:quinone oxidoreductase, or xanthine oxidase). Furthermore, methods are described that can be used for the metabolic activation of analyzed chemicals by these enzymes as well as those for isolation of DNA. Further, the appropriate methods capable of detecting and quantifying chemical/drug-derived DNA adducts, i.e., different modifications of the 32P-postlabeling technique and employment of radioactive-labeled analyzed chemicals, are shown in detail.

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Evaluating the potency of environmental chemicals and drugs, to be enzymatically bioactivated to intermediates generating covalent DNA adducts, is an important field in the development of cancer and its treatment. Methods are described for compound activation to form DNA adducts, as well as techniques for their detection and quantification.

Kovalent DNA oluşumu enzimatik aktif kanserojen ve uyuşturucu Vitro ve kararlılıklarını 32P-postlabeling tarafından Adducts

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Biyokimya

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a fluorescent dye and are spotted by a photodetector following their separation. Single molecule fluorescence imaging can provide ultrasensitive protein detection with its ability for visualizing individual fluorescent molecules. However, the application of this powerful imaging method to electrophoresis assays is hampered by the lack of ways to characterize the homogeneity of fluorescent labeling of each protein species across the proteome. Here, we developed a method to evaluate the labeling homogeneity across the proteome based on a single molecule fluorescence imaging assay. In our measurement using a HeLa cell sample, the proportion of proteins labeled with at least one dye, which we termed &#8216;labeling occupancy&#8217; (LO), was determined to range from 50% to 90%, supporting the high potential of the application of single molecule imaging to sensitive and precise proteome analysis.

Here, we present a protocol to assess the labeling homogeneity for each protein species in a complex protein sample at the single molecule level.

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae

DNA damage, including DNA double-stranded breaks and inter-strand cross-links, incurred during the S and G2 phases of the cell cycle can be repaired by homologous recombination (HR). In addition, HR represents an important mechanism of replication fork rescue following stalling or collapse. The regulation of the many reversible and irreversible steps of this complex pathway promotes its fidelity. The physical analysis of the recombination intermediates formed during HR enables the characterization of these controls by various nucleoprotein factors and their interactors. Though there are well-established methods to assay specific events and intermediates in the recombination pathway, the detection of D-loop formation and extension, two critical steps in this pathway, has proved challenging until recently. Here, efficient methods for detecting key events in the HR pathway, namely DNA double-stranded break formation, D-loop formation, D-loop extension, and the formation of products via break-induced replication (BIR) in Saccharomyces cerevisiae are described. These assays detect their relevant recombination intermediates and products with high sensitivity and are independent of cellular viability. The detection of D-loops, D-loop extension, and the BIR product is based on proximity ligation. Together, these assays allow for the study of the kinetics of HR at the population level to finely address the functions of HR proteins and regulators at significant steps in the pathway.

Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae

The D-loop capture (DLC) and D-loop extension (DLE) assays utilize the principle of proximity ligation together with quantitative PCR to quantify D-loop formation, D-loop extension, and product formation at the site of an inducible double-stranded break in Saccharomyces cerevisiae.

Saccharomyces cerevisiae'de Proximity Ligation ve Kantitatif PCR ile Homolog Rekombinasyon Ara Ürünlerinin Saptanması

DNA damage, including DNA double-stranded breaks and inter-strand cross-links, incurred during the S and G2 phases of the cell cycle can be repaired by ...

Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is an emerging and promising higher order structural analysis technique that provides information on changes in protein structure, protein-protein interactions, or protein-ligand interactions. HRPF utilizes hydroxyl radicals (&#9642;OH) to irreversibly label a protein&#8217;s solvent accessible surface. The inherent complexity, cost, and hazardous nature of performing HRPF have substantially limited broad-based adoption in biopharma. These factors include: 1) the use of complicated, dangerous, and expensive lasers that demand substantial safety precautions; and 2) the irreproducibility of HRPF caused by background scavenging of &#9642;OH that limit comparative studies. This publication provides a protocol for operation of a laser-free HRPF system. This laser-free HRPF system utilizes a high energy, high-pressure plasma light source flash oxidation technology with in-line radical dosimetry. The plasma light source is safer, easier to use, and more efficient in generating hydroxyl radicals than laser-based HRPF systems, and the in-line radical dosimeter increases the reproducibility of studies. Combined, the laser-free HRPF system addresses and surmounts the mentioned shortcomings and limitations of laser-based techniques.

This protocol presents a method to use inline radical dosimetry and a plasma light source to perform flash oxidation protein footprinting. This method replaces the hazardous UV laser to simplify and improve the reproducibility of fast photochemical oxidation of protein studies.

Proteinlerin Daha Yüksek Sıralı Yapısal Analizini Gerçekleştirmek için Lazersiz Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is an emerging and promising higher order structural analysis technique that provides information on changes ...

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are electrophilic, generate reactive electrophiles upon biotransformation, or induce oxidative stress. Among the oxidized nucleobases, the most studied one is 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoGua) or 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), a biomarker of oxidatively induced base damage in DNA. Aldehydes and epoxyaldehydes resulting from the lipid peroxidation process are electrophilic molecules able to form mutagenic exocyclic DNA adducts, such as the etheno adducts 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-&#949;dGuo) and 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-&#949;dAdo), which have been suggested as potential biomarkers in the pathophysiology of inflammation. Selective and sensitive methods for their quantification in DNA are necessary for the development of preventive strategies to slow down cell mutation rates and chronic disease development (e.g., cancer, neurodegenerative diseases). Among the sensitive methods available for their detection (high performance liquid chromatography coupled to electrochemical or tandem mass spectrometry detectors, comet assay, immunoassays, 32P-postlabeling), the most selective are those based on high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS). Selectivity is an essential advantage when analyzing complex biological samples and HPLC-ESI-MS/MS evolved as the gold standard for quantification of modified nucleosides in biological matrices, such as DNA, urine, plasma and saliva. The use of isotopically labeled internal standards adds the advantage of corrections for molecule losses during the DNA hydrolysis and analyte enrichment steps, as well as for differences of the analyte ionization between samples. It also aids in the identification of the correct chromatographic peak when more than one peak is present.
We present here validated sensitive, accurate and precise HPLC-ESI-MS/MS methods that were successfully applied for the quantification of 8-oxodGuo, 1,N6-dAdo and 1,N2-dGuo in lung, liver and kidney DNA of A/J mice for the assessment of the effects of ambient PM2.5 exposure.

We describe here methods for sensitive and accurate quantification of the lesions 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-dAdo) and 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in DNA. The methods were applied to the assessment of the effects of ambient fine particulate matter (PM2.5) in tissues (lung, liver and kidney) of exposed A/J mice.

Kütle spektrometresi ile üç DNA lezyonlarının ölçülmesi ve ortam Ince partikül madde maruz fareler dokularda düzeylerinin değerlendirilmesi

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Elektron Spektroskopik Görüntüleme Kombinasyonunun miniSOG Etiketli DNA Onarım Proteinler Görselleştirme (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...