This work was supported in part by the NIH/NHBI (U01 HL099776-5), the NIH Director&#8217;s New Innovator Award (DP2 OD004411-2), the California Institute of Regenerative Medicine (RB3-05129), the American Heart Association (14GRNT18630016) and the Endowed Faculty Scholar Award from the Lucile Packard Foundation for Children and the Child Health Research Institute at Stanford (to SMW). We also acknowledge funding support from the American Heart Association Predoctoral Fellowship 13PRE15770000, and National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE-114747 (AS).

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm reaktifler için Satıcı bilgileri Tablo 1&#39;de listelenen olmuştur ve Malzeme Listesi. Hücrelerle temas Bütün çözeltiler ve ekipmanlar, steril olmalı ve aseptik teknik buna göre kullanılmalıdır. Aksi belirtilmediği sürece, bir nemlendirilmiş 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka tüm kültür inkubasyon yapın. Bu protokol, her farklılıklar hangi hiPSCs tohumlanmış olan, 6 oyuklu plakalar içerisinde gerçekleştirilir. Farklılaşması ve arıtılmasından sonra hücreleri kesilerek edilebilir ve aşağı doğru kullanımı için kaplandı. 1. Orta Hazırlık <ol><li> E8 ortam için, her bir orta bileşeni için bir stok çözelti (NaHCO 3, L-askorbik asit 2-fosfat, sodyum selenit, transferin, insülin, FGF2, TGFb1) bu -20 ° C&#39;de çözüm saklayın. DMEM / F12 şişesine stok çözümleri uygun miktarda ekleyin ve sterilize etmek filtre. Çözelti ConcentrHisse senedi bileşenleri ve E8 orta tirme ve reaksiyon kurulum Tablo 1&#39;de bulunabilir. </li><li> Hücre-dışı matris solüsyon için, 4 ° CO / H de (genellikle 10 mg / ml&#39;de verilir) taban membran matrisi eritin. Insan pluripotent kök hücreleri, alfa-6-p-1 integrini 9 kullanarak bu malzemeye de bağlı olabilir, çünkü Matrigel yaygın pluripotent kök hücre kültürü için kullanılmıştır. Bir kez buz soğukluğunda pipet uçları ve tüpler buz üzerinde 2.25 mg (250 | il) alikotları sağlamak ve -80 ° C&#39;de alikot saklamak çözülmüş. <ol><li> ECM&#39;li plakaları ön kaplanması yaparken, çözülme ve buz üzerinde hücre dışı matriks solüsyonu (ECMS) bölmeyin. 1 oranında ECM ve buz soğukluğunda, DMEM / F12 ortamı karıştırma: 200 buz üzerinde. Erken ECMS katılaşma önlemek için serin tutun. </li></ol></li><li> Insülin ortamı, RPMI / B27 için, RPMI ortamı, 500 ml B27 eksi İnsülin 10 mi ekleyin. </li><li> Orta (insülin) ile RPMI / B27 için, Insuli ile (B27 Supplement 10 ml ekleyinn) ve RPMI ortamı 500 ml Pen-strep antibiyotik 5 mi. </li><li> Düşük glukoz ortamı için, B27 eki 10 ml ve glikoz bulunmayan RPMI ortamı 500 ml Pen-strep antibiyotik 5 ml ilave ediniz. </li><li> : 1 oranında dondurma / dondurarak saklama ortamı, bir 9 dimetilsülfoksit (DMSO) ile birlikte fetal sığır serumu karıştırın. dondurma ortamı 4 ° C&#39;de 1 aya kadar saklanabilir. Not: Tüm ortamlar filtrelenmiş ve depolanmış 4 ° C ve, aksi belirtilmediği sürece, 2 hafta içerisinde kullanılmalıdır. Aksi belirtilmediği sürece aşağıda kullanılan tüm reaktif / çözeltisi hacimleri, 6-çukurlu plaka içindeki tek bir oyuk için tasarlanmıştır. </li></ol> 2. ECM&#39;li 6 oyuklu levhalar Ön kaplama <ol><li> Daha sonra 6-delikli plaka için her bir oyuğa taze ECMlerin 2 ml uygulanır 200: 1 lik bir oranda buz soğukluğunda DMEM / F12 ortamında (örneğin, Matrigel) bazal membran matrisi karıştırılmasıyla ECMler sağlayın. Oyuk, 6 oyuklu plaka içerisinde her bir yaklaşık olarak 90 mg ECMler alacaktır. </li><li> ECM inkübeS, 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca plakaları kaplama. Her çukurdan, aspirat DMEM / F12 çözeltisi hücreleri kaplama hemen önce. Plakalar daha sonra hücrelerin almaya hazır olacaktır. </li></ol> 3. Çözülme Dondurulmuş hiPSCs NOT: optimal kültürleme ve donma / çözülme döngüsü aşağıdaki hiPSC-CMS içine hiPSCs mansap farklılaşmasına neden olabilir yakından bu prosedürü izleyin. <ol><li> 6 gözlü bir plakanın her bir için hiPSCs bir şişe çözülme. Her bir şişeye, kaya inhibitörü (10 uM) ile, soğuk E8 ortamın 9 ml, 15 ml lik konik bir tüp hazırlanır. ROCK inhibitörü kriyopreservasyona 10 aşağıdaki hiPSCs sağkalım geliştirir. Yaklaşık 5 mm çapında buz kristali kalana kadar hücreleri çözülme için 37 ° C su banyosu içinde şişeleri tutun. </li><li> % 70 etanol ile şişelerin dış püskürtün. Steril laminer kaput onları geçmeden önce kağıt mendil ile silin şişeleri. </li><li> Hazırlanan konik tüp içine hücreleri aktarın. T durulayınO E8 ortamının 500 ul ile bir kez şişe ve aynı konik tüp çözülmüş hücreleri içeren ortam transfer. 200 x g&#39;de 4 dakika boyunca oda sıcaklığında santrifüje. </li><li> Santrifüj işleminden sonra süpernatan aspire yavaşça ROCK inhibitörü (10 uM) ile E8 ortamının 2 ml hücre pelletini. 6 yuvalı plaka ECMler ile önceden kaplanmış bir oyuğuna yeniden süspansiyon haline hücreleri aktarın. </li><li> Kültürleme 24 saat sonra ROCK inhibitörü olmadan E8 ortamı ile orta değiştirin. Hücreler bu zamana kadar yapıştırılır olmalıdır. </li></ol> HiPSCs 4. pasaj <ol><li> Tipik olarak, bir 6-yuvalı plaka içinde% 75 -80% Ortak akışkanlığa eriştikten sonra geçit hiPSCs. Kültür ortamı aspire. Hızlı bir şekilde, steril 1 ml RT PBS ile yıkayın. Aspire PBS. <ol><li> 500 0.5 mM EDTA ul ya da 1 x hücre ayırma çözeltisi (ör Accutase) ilave edilir ve oda sıcaklığında 1-7 dakika inkübe edilir. EDTA inkübasyon için uygun zaman hiPSC hattı ile değişir. Görünür kıvırma o görmek için bekliyoruzkenarlarda kolonilerin r kalınlaşma, bu o EDTA veya hücre dekolmanı çözümü gösterecektir olarak kaldırılacak hazırdır. </li></ol></li><li> EDTA veya hücre dekolmanı çözümü aspire. 10 uM KAYA inhibitörü ile takviye edilmiş E8 ortamın 1 ml ilave edilir. Tekrar tekrar yukarı ve aşağı pipetleme ve P1000 pipet ile koloniler kapalı püskürtülerek kuyudaki hiPSC kolonileri yerinden. Koloniler tamamlanmasından sonra 5-10 hücre kümeleri içine kırılmış olmalıdır. </li><li> 15 ml konik bir tüp içine ROCK inhibitörü ile E8 1 ml ortam maddesi içinde süspansiyon haline getirilmekte koloniler aktarın. </li><li> E8 orta küçük kümeleri içine büyük hücre kümeleri bozar. Hücreleri sulandırmak için hücre süspansiyonu önleyicisi ile E8 ortamın uygun bir hacim. seyreltme için eklemek için ortam hacmi hücre yoğunluğuna bağlıdır ve kuyuların sayısının numaralı seribaşı olan. İdeal olarak, hiPSCs tek,% 80 konfluent de 1:12 seyreltilmelidir. <ol><li> Ce mevcut 1 ml ROCK inhibitörü ile 11 ml E8 orta ekledaha önce zikredilen 15 ml konik bir tüp içinde ll çözelti 1:12 seyreltme elde edildi. </li></ol></li><li> Ayrıca (Her fragmanı 50-200 hücreleri iyi civarında) küçük hücreli parçalara hücre kümeleri çiğnemek. Bu hücre sağkalım azaltır kaçının aşırı triturating. </li><li> Aspire önceden kaplanmış plakalar gelen ECMS ve her kuyuya yeniden süspanse hücrelerin 2 ml ekleyin. 6-çukurlu plaka içinde çukur başına yaklaşık 100,000 hücre idealdir. Iyi merkezindeki hücrelerin kümeleme önlemek için kuyu etrafına eşit hücreleri dağıtmak hedefliyoruz. </li><li> Kültür, 24 saat sonra, ROCK inhibitör olmadan E8 ortamı ile orta yerine. Hücreler% 80 konfluent hale gelene kadar kültür ortamı, her 24 saat değiştirin. Sonra, hücreler yine geçit hazırız. Genellikle% 80 konfluent ulaşmak için ayrılmış geçitlerin arasında yer 3-6 gün sürer. </li></ol> 5. Donma hiPSCs NOT: optimal kültürleme ve kalça mansap farklılaşmasına neden olabilir yakından bu prosedürü takipHiPSC-CMS içine SC&#39;ler donma / çözülme döngüsü aşağıdaki. <ol><li> Hücre hattı adı, hücre tipi, geçit numarası ve donma tarih kriyojenik tüpler etiketleyin. Genel bir kural olarak, bir 6-çukurlu bir levhanın her çukuruna için, bir şişe kullanılır. KAYA inhibitörü (10 uM) ile E8 ortamın 9 ml ile dolu bir 15 ml&#39;lik konik bir tüp hazırlanır. % 90 FBS ve% 10 DMSO içeren ortam dondurma hazırlamak ve kullanmak için hazır olana kadar 4 ° C &#39;de orta tutun. </li><li> Kültür ortamı aspire 500 0.5 mM EDTA ul ya da 1 x hücre ayırma çözeltisi eklenmekte ve oda sıcaklığında 2-7 dakika inkübe edilir. EDTA ya da hücre ayırma çözeltisi maruz kalma süresi hücre çizgisi için hücre hattından değişir. </li><li> Aspire EDTA veya hücre dekolmanı çözümü. E8 ortamın 1 ml ilave edilir. </li><li> Yukarı ve aşağı pipetleme ve P1000 pipet ile koloniler kapalı püskürtülerek kuyudaki hiPSC kolonileri yerinden. Koloniler 100&#39;den küçük hücre kümeleri kırık olmamalıdır. E8 içeren hazırlanmış konik tüp askıya hücreleri aktarın. Ar SantrifüjT 200 x g&#39;de 4 dakika karıştırıldı. </li><li> Süpernatant aspire ve pelet soğuk dondurma orta 500 ul ekleyin. 1-2 kez pipetleme pelletini. Hücre canlılığı, iri topaklar hücreleri tutarak artırıldı. </li><li> Etiketlenmiş bir kriyojenik tüp içine yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler aktarın. Hızlı bir şekilde yavaş yavaş soğutulması için sağlayacak bir dondurma konteyneri içeren izopropanol içine şişeleri hareket eder. Daha sonra uzun süreli saklama için sıvı nitrojen hücreleri transferi, 24 saat süre ile, -80 ° C&#39;de hücrelerle tutun. </li></ol> İnsan IPSC 6. Kardiyak Farklılaşma NOT: ilave bütün ortam oda sıcaklığında en az olmalıdır. <ol><li> EDTA veya 1x hücre ayırma çözeltisi ile ayrıldıktan sonra, yaklaşık olarak 100,000 farklılaşması için ECMlerin kaplanmış 6 oyuklu kültür plakaları, insan iPSCs (hücre pasajı prosedürler ile aynı) adımlarını tohum. Hücreler% 85 confluency ulaştığında, 6 ile insülin orta olmadan RPMI / B27 orta değiştirmekuM GSK3-beta önleyicisi CHIR99021 (CHIR) ve 48 saat boyunca muhafaza edilir. </li><li> 48 saat sonra, insülin ortamı, RPMI / B27 CHIR-içeren kültür ortamı yerine ve (3. gün kadar) 24 saat süre ile, tek başına bırakın. </li><li> 3. günde, 5 mcM Wnt inhibitörü IWR1 ile insülin olmadan RPMI / B27 medya değiştirmek ve (5 gün kadar) 48 saat boyunca muhafaza edilir. Not: Daha önceki çalışmalarda 11&#39;de tarif edildiği gibi, Wnt engelleme, aynı zamanda, diğer küçük molekül bileşikleri kullanılarak denenebilir. IWR1 nedeniyle Wnt 11 sinyal önlenmesinde etkili olduğu gösterilmiş olan artmış dizi diğer küçük molekül önleyicileri, Wnt üzerinde seçildi. </li><li> 5. günde, insülin ortamı olmadan geri RPMI / B27 orta değiştirebilir ve (7 nci gün kadar) 48 saat süre ile bırakın. </li><li> 7. günde, (insülin) ile RPMI / B27 ortamı ile orta yerine ve aynı ortam her bundan 3 gün sonra orta yerine. Kardiyomiyositlerin Spontan dayak ilk günden yaklaşık günde 8 görünür olmalıdır10. </li></ol> Glikoz Açlık ile İnsan kardiyomiyositlerde 7. saflaştırılması <ol><li> 10. günde sonrası farklılaşma olarak, 6-çukurlu plaka 2 mi düşük glukoz ortamı her bir gözündeki aracını değiştirme ve (günlük 13 kadar), 3 gün boyunca bu ortamda hücreleri korumak. </li><li> Gün 13&#39;te, (insülin) ile RPMI / B27 ortamı, hücreleri döndürür. </li><li> İsteğe bağlı olarak, glukoz açlık sırasında sigara kardiyomiyositlerin kolay ayrılması için izin kültür plaka olmayan kardiyomiyositlerde gevşetmek yardımcı glukoz açlık ikinci turda önce kardiyomiyositlerde Replate. <ol><li> 13. günde, aspirat ortam içinde, bir kez PBS ile yıkanır ve 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca, hücre ayrışma enzim 500 ul kullanılarak tek tek hücreler içine hücreleri ayırmak. Özellikle, enzim işlemi, 5 dakika sonra, el ile art arda hücre ayrışma enzim çekerek ve cardiomyo karşı püskürtülerek 6-çukurlu plaka kardiyomiyositlerde ayırmak için 1000 ul pipet kullanıncyte tek tabaka. 30 pipetleme tekrar kadar tek tek hücreler içine kardiyomiyositlerde ayırmak için gerekli olabilir. </li><li> Hücreler ayrılmış ve tek hücreli bir formda olduğu sonra x g 200 ° C&#39;de 4 dakika süreyle hücre ayrışma enzimi ve santrifüj sulandırmak için insülin ile RPMI / B27 ortamı, 5 ml ile dolu bir 15 ml&#39;lik konik bir tüp içine, tüm hücreleri toplamak. Aspire ve süpernatant atın. </li><li> Yeni ECMS kaplı 6-plaka üzerine 2 ml RPMI / B27 orta ve plaka hücreleri yeniden askıya. Tipik olarak, kardiyomiyositlerinin yüksek confluency şarjı sırasında hücre sağkalım ile yardımcı olur. Şarjı sırasında optimum hayatta kalmak için yeni 6-kuyu tabak başına 2 milyon hücre Replate hedefliyoruz. </li></ol></li><li> 14. günde, ikinci bir glikoz yoksunluğu döngüsü için tekrar düşük glikoz ortamında 2 ml orta değiştirin. Kültür 3 gün daha, bu düşük glukoz halinde olan hücreler. Olmayan kardiyomiyositlerin çoğu bu düşük glikoz kültür durumda ölecek. </li><li> Günün 17 at, R orta 2 ml değiştirmekInsülin PMI / B27 ortamıdır. kalan hücreler yüksek derecede saflaştırılmış kardiyomiyositler olacaktır. Bu kardiyomiyositlerde gen ifade analizi, ilaç tarama, metabolik analizi ve çeşitli alt-tahliller için de kullanılabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiovascular+disease+modeling+and+drug+screening.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (6), 150 (2013).</li><li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes.">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108 (3), 407-414 (2001).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li><li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+optimization+of+activin/nodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).</li><li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+as+an+in+vitro+model+for+coxsackievirus+B3-induced+myocarditis+and+antiviral+drug+screening+platform.">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform.</a> Circulation Research. 115 (6), 556-566 (2014).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/beta-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (12), 127-137 (2013).</li><li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+self-renewal+of+human+pluripotent+stem+cells+on+human+recombinant+laminin-511.">Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 611-615 (2010).</li><li>Li, X., Meng, G., Krawetz, R., Liu, S., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+inhibitor+Y-27632+enhances+the+survival+rate+of+human+embryonic+stem+cells+following+cryopreservation.">The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation.</a> Stem Cells And Development. 17 (6), 1079-1085 (2008).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells:+the+matrix+sandwich+method.">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method.</a> Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li></ol>

The authors do not declare competing interests.

Yüksek ölçüde saflaştırılmış hiPSC türetilmiş kardiyomiyositlerin büyük miktarda elde temel kardiyak araştırmalar ve klinik ve çeviri uygulamalar için kritik önem taşır. Kalp farklılaşma protokolleri küçük molekül-modüle ve tek tabaka-temelli yöntemler 5 nihayet kardiyojenik büyümeyi kullanan embriyoid vücut temelli yöntemlerden geçiş, son yıllarda muazzam gelişmeler geçirmiş sandviç yöntemleri 12 matris, 2 faktörleri, ve var. Anılan protokol, bu...

Primer insan kardiyomiyositler nedeniyle invaziv kardiyak biyopsiler, çünkü kültür yoksul uzun vadeli hücre canlılığı tek hücrelere dissociating zorluk için gereğinin elde etmek zordur. Birincil insan kardiyomiyositler, hastaya özgü insan uyarılmış pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyosit bu eksikliği göz önüne alındığında (hiPSC-CM) teknolojisi temel araştırma için güçlü bir alternatif kardiyomiyosit kaynağı yanı sıra hastalık modelleme ve ilaç olarak klinik ve translasyonel uygulamaları olarak kabul edilmiştir keşif 1. Kardiyomiyositlere pluripotent kök hücrelerin ayırt Erken çabaları embriyoid organları (EBS) ile farklılaşma protokolleri istihdam, ama bir EB hücrelerin genellikle az 25 den% kardiyomiyositlerde 2,3 yenerek çünkü bu yöntem üreten kardiyomiyositlerde verimsizdir. Nispeten, A ve BMP4 aktivin sitokinler kullanarak tek tabaka-tabanlı farklılaşma protokolü EBS daha yüksek verimlilik görüntülenen, ancakBu protokol, hala nispeten verimsizdir insan pluripotent kök hücre hatları 4, sınırlı sayıda pahalı büyüme faktörleri ve tek işlevleri gerektirir. Son zamanlarda, bir yüksek verimli, hiPSC tek tabaka-tabanlı kardiyomiyosit farklılaşma protokolü Wnt / β-katenin sinyal 5 modüle tarafından geliştirilmiştir. Bunlar hiPSC-CM&#39;ler kardiyak troponin T ve alfa aktinin, kardiyomiyositlerinin 6 standart belirteçleri iki sarkomerik proteinleri ifade eder. protokol burada açıklamak bu küçük molekül tabanlı, besleyici, hücre içermeyen, tek tabaka farklılaşma yöntemi 5,7 bir uyarlamasıdır. Biz 7-10 gün (Şekil 1) sonra hiPSCs gelen kardiyomiyositlerde yenerek elde edebiliyoruz. Ancak,% 50 hücreleri yenerek sonuçlanan bir kardiyomiyosit farklılaşması takip, sürekli immün, kalp-özel troponin T ve alfa-aktinin olarak kardiyomiyosit-spesifik belirteçler için negatif olmayan kardiyomiyositlerin bir nüfusun varlığını göstermektedir. Fu içinrther kardiyomiyositlerde saflaştırılması olmayan kardiyomiyositlerde ortadan kaldırmak, heterojen farklılaşmış hücre popülasyonları birden fazla gün boyunca son derece düşük bir glikoz kültür ortamı (Şekil 2) ile muamele etmek suretiyle açlık glikoz tabi tutuldu. Bu tedavi seçici düşük glukoz ortamında 8 hayatta kalmak için birincil enerji kaynağı olarak laktat metabolize kardiyomiyositlerin yeteneği nedeniyle sigara kardiyomiyositlerde, ancak sigara kardiyomiyositler, ortadan kaldırır. Bu saflaştırma adımından sonra, sigara kardiyomi kardiyomiyositlerin oranında% 40&#39;lık bir artış (Şekil 3, Şekil 4), görülmektedir ve bu hücreler, aşağı doğru gen ifade analizi, hastalık modelleme ve ilaç tarama deneyleri için de kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="550">
	<tbody>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:207px;">Name</td>
			<td style="width:199px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog number</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Matrigel (9-12 mg/mL)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">RPMI media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11835055</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Glucose free RPMI media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11879-020</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">B27 Minus Insulin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1895601</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">B27 Supplement (w/ insulin)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Pen-strep antibiotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>BenchMark</td>
			<td>100-106</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-2650</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>688000</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">CHIR99021</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>508306</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">IWR1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0161</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Accutase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Cell lifter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-100-240</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Cryovial</td>
			<td>Fisher (NUNC tubes)</td>
			<td>375418</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">TrypLE Select Enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12563-011</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM&#39;ler) temel araştırma ve translasyonel uygulamaları için kullanılabilir birincil kardiyomiyositlerinin eksikliği gidermek için önemli bir hücre kaynağı haline gelmiştir. Kardiyomiyositlere hiPSCs ayırt etmek için, embriyoit gövdenin (EB) tabanlı türev ve büyüme faktörü indüksiyonu da dahil olmak üzere çeşitli protokoller geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu protokoller verimsiz ve saflaştırılmış kardiyomiyositlerde oluşturmak için yetenekleri açısından oldukça değişkendir. Son zamanlarda, Wnt / β-katenin sinyal, küçük bir molekül tabanlı bir protokol kullanılarak modülasyonu, yüksek verimlilik ile kardiyak farklılaşmasını teşvik ettiği gösterilmiştir. Bu protokol ile, farklılaşmış hücrelerin% 50&#39;den daha fazla -60% kardiyak troponin pozitif kardiyomiyositler sürekli gözlendi idi. Ayrıca kardiyomiyosit saflığını arttırmak için, farklılaşmış hücre spesifik, metabolik bir fark temelinde-kardiyomiyositlerde ortadan kaldırmak için açlık glikoz tabi tutuldukardiyomiyositler ve non-kardiyomiyositlere arasındaki s. Bu seçim strateji kullanarak, sürekli olarak farklılaşmış bir hücre popülasyonunda olmayan kardiyomi kardiyomiyositlerin oranında% 30&#39;dan fazla bir artış elde edilmiştir. Bu son derece saflaştırılmış kardiyomiyositlerde nitro hastalık modelleme çalışmaları ve ilaç tarama tahlillerinde İnsan iPSC tabanlı sonuçların güvenilirliğini geliştirmek gerekir.

hiPSC farklılaşma sırasında morfolojik değişimler. besleyici içermeyen plakalarda kültürlenmiştir hiPSC olarak düzlemsel ve iki boyutlu koloniler büyüdü. Yaklaşık% 85 konfluent hale geldikten sonra, hiPSCs farklılaşması (Şekil 1A) 6 uM CHIR ile muamele edilmiştir. Hücre ölümü, normal ve normal bir durum, önemli miktarda CHIR tedavi 24 saat sonra gözlenmiştir. CHIR tedavisinin iki gün sonra, hiPSCs bir mezodermal kaderi doğru ay?...

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose S

Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.

Küçük Molekül-modüle Farklılaşma ve sonraki Glikoz şiddetli açlık kullanma İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin yüksek oranda saf kardiyomiyositlerde türetilmesi

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes ...

derivation-highly-purified-cardiomyocytes-from-human-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

18.4K Görüntüleme.  Stanford University School of Medicine. Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening. 

Video: Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Gelişim Biyolojisi

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

Insan pluripotent kök hücreleri gelen melanosit besleyici içermeyen türetilmesi

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed phenotypes. Researchers interested in pursuing studies involving specific myocyte subtypes require a more directed differentiation approach. By treating mouse embryonic stem (ES) cells with Grem2, a secreted BMP antagonist that is necessary for atrial chamber formation in vivo, a large number of cardiac cells with an atrial phenotype can be generated. Use of the engineered Myh6-DSRed-Nuc pluripotent stem cell line allows for identification, selection, and purification of cardiomyocytes. In this protocol embryoid bodies are generated from Myh6-DSRed-Nuc cells using the hanging drop method and kept in suspension until differentiation day 4 (d4). At d4 cells are treated with Grem2 and plated onto gelatin coated plates. Between d8-d10 large contracting areas are observed in the cultures and continue to expand and mature through d14. Molecular, histological and electrophysiogical analyses indicate cells in Grem2-treated cells acquire atrial-like characteristics providing an in vitro model to study the biology of atrial cardiomyocytes and their response to various pharmacological agents.

Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.

BMP rakip GREM2 kullanma Pluripotent Kök Hücreleri Atriyal kardiyomiyositlerde Farklılaşma

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Oldukça Tekrarlanabilir Küçük Molekül Tabanlı Farklılaşma Protokolü kullanarak insan pluripotent kök hücreleri gelen kardiyomiyositlerde Büyük Ölçekli Üretim

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

Epizomal vektörlerin kullanılması insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

Periferal Kan Türevi İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrositlerin Farklılaşması

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) cells. Maintenance of hiPS cells on feeder cells or undefined matrices are susceptible to batch variances, pathogenic contamination and risk of immunogenicity. Utilizing the defined recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix in combination with xeno-free and defined media formulations reduces variability and allows for the consistent generation of hiPS cells. The Sendai virus (SeV) vector is a non-integrating RNA-based system, thus circumventing concerns associated with the potential disruptive effect on genome integrity integrating vectors can have. Furthermore, these vectors have demonstrated relatively high efficiency in the reprogramming of dermal fibroblasts. In addition, enzymatic single cell passaging of cells facilitates homogeneous maintenance of hiPS cells without substantial prior experience of stem cell culture. Here we describe a protocol that has been extensively tested and developed with a focus on reproducibility and ease of use, providing a robust and practical way to generate defined and xeno-free human hiPS cells from fibroblasts.

Robust derivation of human induced pluripotent stem (hiPS) cells was achieved by using non-integrating Sendai virus (SeV) vector mediated reprogramming of dermal fibroblasts. hiPS cell maintenance and clonal expansion was performed using xeno-free and chemically defined culture conditions with recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix and Essential E8 (E8) Medium.

Laminin 521 Matrisini Kullanarak İnsan Tarafından Oluşturulan Pluripotent Kök Hücrelerin Entegrasyon Serbest Türevi

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.