XHP, Ulusal Sağlık (NIH), Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (NIHK01AG024496) ve Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü (NIHR21HD056530) hibe Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.

1. Çözüm ve Medya Hazırlık <ol><li> Jelatin kaplama çözümü:% 0.1 (w / v) 4 GKD 2 O, otoklava jelatin ve mağaza ° C </li><li> Matrigel kaplama çözümleri. Stok çözelti: 4 ° C gecede, 10 ml buz DMEM veya DMEM/F12 ekleyin, iyice karıştırın ve kısım 1 ml / tüp, steril doku kültürü kaputu altında -20 mağaza ° C. yavaş çözülme Matrigel (10 ml) Çalışma çözüm: yavaş çözülme 1 ml Matrigel kısım, 4 ° C 14 ml soğutulmuş DMEM veya DMEM/F12 1-2 saat, transferi ve kaplama hemen önce steril doku kültürü başlık altında iyice karıştırın. </li><li> İnsan laminin kaplama çözümü: seyreltik 1 ml insan laminin çözüm buz DMEM veya DMEM/F12 için (Tris 0.5 mg / ml -80 mağaza, NaCl Tamponlu ° C, 1-2 saat 4 ° C yavaş çözülme) 12.5 ml çalışma solüsyonu (40 mg / ml) steril doku kültürü başlık altında yer kaplama hemen önce. </li><li> Büyüme faktörü stok solüsyonları (500-1000X): 10 mg büyüme faktörü çözülürSteril tampon / ml (% 0.5 BSA, 1.0 mM DTT,% 10 gliserol, 1XPBS) ve -80 ° C 50-100 ul / tüp alikotları olarak depolamak </li><li> HESC medya: DMEM/F12 veya KO-DMEM (% 80), KO, serum değişimi (% 20), L-alanyl-L-gln &#39;ya da L-gln (2 mM), MEM aminoasitlerin (MNAA 1X) ve β-mercaptoethanol (100 mcM), filtre edilmiş ve 4 mağaza ° C, kullanmadan önce 20 ng / ml bFGF ile desteklenebilir. Veya tanımlanmış bileşenleri ile &quot;KO serum yerine&quot; yerine: DMEM/F12 veya KO-DMEM (% 100), L-alanyl-L-gln &#39;ya da L-gln (2 mM), MNAA (1X), MEM, esansiyel amino asitler (MEAA 1X) ve β-mercaptoethanol (100 mcM), filtre edilmiş ve 4 mağaza bFGF (20 ng / ml) ile desteklenmiş ° C, insan insülini (20 mg / ml), askorbik asit (50 mg / ml), insan aktivin A (50 ng / ml), insan albümin / Albumax (10 mg / ml), ve insan transferrin (8 mg / ml) Kullanmadan önce. </li><li> HESC kalp farklılaşma medya: DMEM/F12 (% 90), tanımlanan FBS (% 10) ve L-alanyl-L-gln &#39;ya da L-gln (2 mM). </li><li> Medya içeren nikotinamid (NAM): add NHESC medya veya 10 mM son konsantrasyon, 4 filtre, mağaza ° C ve 2 hafta içinde hazırlık kullanın. HESC kalp farklılaşma medya AM </li></ol> 2. Plakası Kaplama <ol><li> Coat tabak-jelatin: add ml / 6 kuyucuğu jelatin çözüm 2.5 ve 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör bir gece inkübe edin. </li><li> Coat laminin plakalar: chill jelatin kaplı plakalar ve jelatin kaldırmak, 2.5 ml / pre-soğuk, iyi Matrigel ya da insan laminin kaplama çalışma çözeltisi 4 ° C gecede 6 kuyucuğu ve inkübe jelatinize. </li></ol> 3. Tanımlanmış koşullar altında ayrım yapılmamış hESC Pasajlanması ve Yayımlamak <ol><li> HESC kolonileri 5-7 gün eski büyümesine olanak ve diseksiyon mikroskobu (önceden sıcak sahne diseksiyon 37 ° C) sterilize kaput diseksiyon altında hESC kültür plaka almak. </li><li> HESC koloniler bölünebilir seçin. Morfolojik, bu koloniler (sm&gt;% 75 farklılaşmamış hESC olmalıdırgenellikle hafif opak kenarı ile diseksiyon mikroskobu altında tanımlanan tüm kompakt hücreleri), (beyaz tüylü-up hücreleri, açık diferansiye hücreler). Dikkatle seçilen koloniler anahat ve P2 steril pipet ucu kenarı ile koloni veya cam kapiller çekti (varsa) koloni çevreleyen farklılaştırılmış fibroblast tabakası ve tüm farklılaşmış parçaları kaldırmak. </li><li> Aspire kayan müstakil farklılaşmış hücre içeren eski medya çıkarın. Bir kez hESC medya (bFGF olmadan) ile yıkayın. Ekle / 3 ml 20 ng / ml bFGF içeren taze hESC medya. </li><li> Farklılaşmamış hESC koloniler küçük parçalar halinde kesin, ve steril pipet veya kapiller çekti cam ile ayırmak. </li><li> 50 ml konik boru birlikte müstakil koloni parçaları içeren medya Havuzu. 1 ml / birlikte 20 ng / ml bFGF ve havuz içeren iyi hESC medya plaka ile bir kez yıkayın. </li><li> Taze kaplı plakalar Matrigel veya insan laminin çözüm aspire. Kısım 4 ml / h6 plaka koloni parçaları içeren ESC medya. Hafifçe sallayarak inkübatör plaka transfer ve% 5 CO2 atmosferi ile nemlendirilmiş bir 37 ° C inkübatör bozmadan koloni adet tohum gecede izin. </li></ol> 4. Nikotinamid ile Tanımlı Kültür Sistem altında hESC Kardiyak İndüksiyon <ol><li> Tohumlama sonra 3. günde, plakanın her kuyudan en eski medya kaldırmak ve hESC koloniler (hESC dışarı kuru asla izin) sokulmasına izin verecek kadar medya bırakın. 20 ng / ml bFGF ve 10 mM nikotinamid (NAM) içeren 4 / ml taze hESC medya ile değiştirin. </li><li> 20 ng / ml bFGF ve 10 mM NAM her gün taze hESC içeren medya eski medya değiştirin ve kalp-kaynaklı hESC koloniler gün 8-10 büyümesine olanak. NAM maruz üzerine, koloninin içindeki tüm hücreleri çoğalmaya devam edecek büyük bir farklılaşmış hücre morfoloji değişiklikleri uğrayacaktır. Koloniler, boyutu ve günde 8-10 oranında artacakd hücreleri bazı alanlarda koloniler yığmak başlayacak. </li></ol> 5. Süspansiyon Kültürü Sürekli Kardiyak Farklılaşma <ol><li> HESC kültür plakasına diseksiyon sterilize kaput altında mikroskop diseksiyon (ön-sıcak sahne diseksiyon 37 ° C) alın. Koloniler dikkatle anahat ve P2 steril pipet ucu kenarı ile koloni çevreleyen fibroblast tabakası (farklılaşmış hücrelerin koloni göç) kaldırmak veya cam kapiller çekti. </li><li> Aspire kayan müstakil fibroblast hücreleri içeren eski medya çıkarın. Bir kez hESC medya (bFGF olmadan) ile yıkayın. 3 ml / iyi taze hESC medya (bFGF olmadan) ekleyin. </li><li> Kalp-kaynaklı hESC koloniler küçük parçalar halinde kesin, ve steril pipet veya kapiller çekti cam ile ayırmak. </li><li> 50 ml konik boru birlikte müstakil koloni parçaları içeren medya Havuzu. Plaka birlikte 1 ml / iyi hESC medya (bFGF olmadan) ve yüzme havuzu ile bir kez yıkayın. </li><li> Kısım 4 ml / 37 6-kuyu, ultra eklenti plaka ve inkübe koloni adet içeren serum serbest hESC medya ° C inkübatör yüzen hücre kümeleri (cardioblasts), 4-5 gün için form izin nemlendirilmelidir. </li></ol> 6. Yapıştırıcı Kültür kardiyomiyosit Fenotip Olgunlaşma Dayak <ol><li> 50 ml konik bir tüp içinde yüzen cardioblasts bir arada içeren medya Havuzu. 1400 devirde 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Mümkün olduğu kadar çok eski medya aspire ve 10 mM NAM içeren taze hESC kalp farklılaşma medya eşit miktarda ekleyebilirsiniz. </li><li> 4 ml / 6 kuyucuğu kayan cardioblasts ve kısım karıştırmak için pipet ve aşağı yukarı. 37 plakalar transfer ° C nemlendirilmiş inkübatör cardioblasts gecede takmak için izin verecek. </li><li> HESC kalp farklılaşma medya içeren 10 mM NAM her gün değiştirin. </li><li> 8 gün, NAM olmadan hESC kalp farklılaşma medya ile değiştirin ve hESC kalp farklılaşma medya e değiştirmeye devam ediyorçok başka bir gün. Dayak kardiyomiyositlerde NAM çekilmesinden sonra sürekli ekiminin yaklaşık 1-2 hafta içinde görünür ve zamanla sayıları artış başlayacak ve 3 ay boyunca güçlü ve ritmik kasılmaları korumak olabilir. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: Nikotinamid (NAM), özel bir cardiomesodermal fenotip (Şekil 2B) pluripotency geçiş için belirlenen kültür sistemi muhafaza hESC neden için yeterli oluşturulur . NAM için farklılaşmamış hESC maruz kalması üzerine, koloninin içindeki tüm hücreleri Ekim-4 ifadesi aşağı düzenler ve kalp spesifik transkripsiyon faktörü (Csx) Nkx2.5 ve α-ifade etmeye başlayacak bu büyük farklılaşmış hücre morfoloji değişiklikleri uğrayacaktır aktinin, bir cardiomesoderm fenotip (Şekil 2B) ile uyumlu. Bu farklılaşmış hücreler çoğalmaya devam edecek ve koloniler boyutu artırmak. Nkx2.5, Artan yoğunluğugenellikle hücreler (Şekil 2B) yığmak başlayan koloniler alanlarda gözlenebilir. Müstakil sonra, NAM-tedavi hESC kalp farklılaşma sürecine devam etmek için bir süspansiyon kültürü yüzen hücre kümeleri (cardioblasts) oluşturacaktır. Cardioblasts takmak için izin ve NAM ile 1 hafta boyunca tedavi devam ettikten sonra, dayak kardiyomiyositlerde kendiliğinden çok-dizi farklılaşma ile karşılaştırıldığında ciddi bir verimlilik artışı ile NAM çekilmesinden sonra sürekli ekiminin yaklaşık 1-2 hafta içinde görünmeye başlayacaktır aynı zaman diliminde (Şekil 2C) üzerinden tedavi olmadan hESC. Dayak kardiyomiyosit kümeler içinde hücreler, Nkx2.5 ve α-aktinin (Şekil 2C) de dahil olmak üzere kardiyomiyositlerinin karakteristik belirteçleri , ifade edecektir. Dayak kardiyomiyositlerde kasılmaları p anımsatan düzenli dürtüleri ile, güçlü, ritmik, iyi koordine edilmiş ve iyi sürüklenen elektrik profilleri tarafından teyit edildi-QRS-T-kompleksleri klinik elektrokardiyogram vücut yüzey elektrotları (Şekil 2C, aynı zamanda Video bakınız) . Kardiyomiyositlerde 3 ay boyunca güçlü kontraktilite elinde tutabilirdi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig1.jpg" /> Şekil 1. Özel fonksiyonel hücrelerine karşı insan pluripotent kök hücreleri farklılaşma için küçük molekül-indüksiyon yaklaşımı karşısında geleneksel yaklaşım, genel şemaları. (A) spontan germ tabakası farklılaşma ile insan pluripotent kök hücreleri çok soyundan eğim kullanılarak geleneksel yaklaşım şematik. (B) insan pluripotent kök hücrelerin sadece küçük moleküllerin basit bir hükmün belirli bir klinik ile ilgili soy iyi kontrollü verimli indüksiyon şematik . <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig2.jpg" /> Şekil 2. Nikotinamid ve kardiyomiyositlerde yenerek doğru ilerlemesi tanımlanmış koşullar altında pluripotency doğrudan kalp soy özellikleri neden olur. (A) hESC yönlendirilmiş kalp farklılaşma protokol zaman çizgisi resmeden şematik. (B) farklılaşmamış hESC tanımlanan kültür sistemi altında Nikotinamid (NAM) maruz kalma üzerine büyük farklılaştırılmış Eki-4 koloni içinde (kırmızı) negatif hücrelerin kontrol mock-tedavi (DMSO) hESC göre ortaya çıkmaya başladı. NAM-uyarılan Ekim-4-negatif hücrelerin erken kalp farklılaşma ile tutarlı ifade Nkx2.5 (yeşil) ve α-aktinin (kırmızı), başladı. Nkx2.5, aşamalı artan yoğunluğu, genellikle hücrelerin yığmak başladı koloninin alanlarda gözlendi. Tüm hücreler kendi çekirdeğinin DAPI boyama (mavi) ile gösterilir. (C) NAM bağlı kalp-taahhüt hESC hücre clus tarafından değerlendirilir, verimlilikte ciddi bir artış ile yenerek kardiyomiyositlerde verdiritmik kasılmalar (bkz. elektrofizyolojik profili ve Videolar) ve Nkx2.5 (yeşil) ve α-aktinin (kırmızı) immünopozitif görüntülenir ters. Kalp kasları sözleşme temsilcisi temsilcisi büyük dayak kardiyomiyosit kümeleri ve yüksek güç görüntüler Faz görüntüleri (ilgili videoları görmek) gösterilmiştir. Oklar elektrofizyolojik kayıt için kullanılan büyük bir dayak kardiyomiyosit küme gösterir. Elektrofizyolojik profil atan kardiyomiyositlerde klinik elektrokardiyogram görülen p-QRS-T-kompleksleri anımsatan Düzenli, sürüklenen, ritmik dürtülerini gösterir. Ölçek çubuklar: 0.1 mm. Videolar: NAM-indüklenen hESC ayırt kardiyomiyositlerde Akit. Videolar 1 ve 2 gösterisi temsilcisi büyük eklenti sonra 1 ve 3 ay içinde kardiyomiyosit kümeleri yenerek Video 3 ve 4 göstermek temsilcisi yüksek güçte kalp kaslarının sözleşme Video 5 typica gösterirl küçük dayak kardiyomiyosit küme kendiliğinden kontrol olarak NAM tedavi olmadan hESC ayırt. <a href="/files/ftp_upload/3274/3274video1.avi">Video 1 izlemek için tıklayınız.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video2.avi">Video 2 izlemek için buraya tıklayın.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video3.avi">Video 3 izlemek için tıklayınız.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video4.avi">Video 4 izlemek için tıklayınız.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video5.avi">Video 5 izlemek için buraya tıklayın.</a>

<ol>
	<li>Jawad, H., Ali, N. N., Lyon, A. R., Chen, Q. Z., Harding, S. E., Boccaccini, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+tissue+engineering:+a+review.">Myocardial tissue engineering: a review.</a> J. Tissue. Eng. Regen. Med. 1, 327-342 (2007).</li><li>Passier, P., van Laake, L. W., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-based+therapy+and+lessons+from+the+heart.">Stem-cell-based therapy and lessons from the heart.</a> Nature. 453, 322-329 (2008).</li><li>Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+and+cardiac+repair.">Human embryonic stem cells and cardiac repair.</a> Transplant Rev. 23, 53-68 (2009).</li><li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+precautions+when+deriving+patient-specific+neural+elements+from+pluripotent+cells.">Important precautions when deriving patient-specific neural elements from pluripotent cells.</a> Cytotherapy. 11, 815-824 (2009).</li><li>J, J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. , 282-1145 (1998).</li><li>Aubry, L., Bugi, A., Lefort, N., Rousseau, F., Peschanski, M., Perrier, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+progenitors+derived+from+human+ES+cells+mature+into+DARPP32+neurons+in+vitro+and+in+quinolinic+acid-lesioned+rats.">Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16707-16712 (2008).</li><li>Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+engraftment+of+human+ES+cell-derived+dopaminergic+neurons+enriched+by+coculture+with+telomerase-immortalized+midbrain+astrocytes.">Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes.</a> Nature Medicine. 12, 1259-1268 (2006).</li><li>Wernig, M., Zhao, J. P., Pruszak, J., Hedlund, E., Fu, D., Soldner, F., Broccoli, V., Constantine-Paton, M., Isacson, O., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derived+from+reprogrammed+fibroblasts+functionally+integrate+into+the+fetal+brain+and+improve+symptoms+of+rats+with+Parkinson's+disease.">Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5856-5861 (2008).</li><li>Richards, M., Fong, C., Chan, W., Wong, P., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+feeders+support+prolonged+undifferentiated+growth+of+human+inner+cell+masses+and+embryonic+stem+cells.">Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells.</a> Nature. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).</li><li>Xu, C., Inokuma, M. S., Denham, J., Golds, K., Kundu, P., Gold, J. D., Carpenter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li><li>Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+FGF+and+suppression+of+BMP+signaling+sustain+undifferentiated+proliferation+of+human+ES+cells.">Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells.</a> Nature Methods. 2, 185-190 (2005).</li><li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Moore, D. A., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patents+on+technologies+of+human+tissue+and+organ+regeneration+from+pluripotent+human+embryonic+stem+cells.">Patents on technologies of human tissue and organ regeneration from pluripotent human embryonic stem cells.</a> Recent Patents on Regenerative Medicine. 1, 142-163 (2011).</li><li>Kehat, I., Khimovich, L., Caspi, O., Gepstein, A., Shofti, R., Arbel, G., Huber, I., Satin, J., Itskovitz-Eldor, J., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electromechanical+integration+of+cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1282-1289 (2004).</li><li>Laflamme, M. A., Chen, K. Y., Naumova, A. V., Muskheli, V., Fugate, J. A., Dupras, S. K., Reinecke, H., Xu, C., Hassanipour, M., Police, S., O'Sullivan, C., Collins, L., Chen, Y., Minami, E., Gill, E. A., Ueno, S., Yuan, C., Gold, J., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infracted+rat+hearts.">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infracted rat hearts.</a> Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).</li><li>Caspi, O., Huber, I., Kehat, I., Habib, M., Arbel, G., Gepstein, A., Yankelson, L., Aronson, D., Beyar, R., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+improves+myocardial+performance+in+infarcted+rat+hearts.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes improves myocardial performance in infarcted rat hearts.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 50, 1884-1893 (2007).</li><li>Akazawa, H., Komuro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+transcription+factor+Csx/Nkx2-5:+Its+role+in+cardiac+development+and+diseases.">Cardiac transcription factor Csx/Nkx2-5: Its role in cardiac development and diseases.</a> Pharmacol. Ther. 107, 252-268 (2005).</li><li>Leda, M., Fu, J. D., Delgado-Olguin, P., Vedantham, V., Hayashi, Y., Bruneau, B. G., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142, 375-386 (2010).</li><li>Efe, J. A., Hilcove, S., Kim, J., Zhou, H., Ouyang, K., Wang, G., Chen, J., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+mouse+fibroblasts+into+cardiomyocytes+using+a+direct+reprogramming+strategy.">Conversion of mouse fibroblasts into cardiomyocytes using a direct reprogramming strategy.</a> Nat. Cell. Biol. 13, 215-222 (2011).</li><li>Kim, K., Doi, A., Wen, B., Ng, K., Zhao, R., Cahan, P., Kim, J., Aryee, M. J., Ji, H., Ehrlich, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467, 285-290 (2010).</li><li>Gore, A., Li, Z., Fung, H. L., Young, J. E., Agarwal, S., Antosiewicz-Bourget, J., Canto, I., Giorgetti, A., Israel, M. A., Kiskinis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+coding+mutations+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471, 63-67 (2011).</li><li>Feng, Q., Lu, S. J., Klimanskaya, I., Gomes, I., Kim, D., Chung, Y., Honig, G. R., Kim, K. S., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemangioblastic+derivatives+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+exhibit+limited+expansion+and+early+senescence.">Hemangioblastic derivatives from human induced pluripotent stem cells exhibit limited expansion and early senescence.</a> Stem Cells. 28, 704-712 (2010).</li><li>Klimanskaya, I., Chung, Y., Becker, S., Lu, S. -. J., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+from+single+blastomeres.">Derivation of human embryonic stem cells from single blastomeres.</a> Nat. Protocols. 2, 1963-1972 (2007).</li><li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li></ol>

Yazarlar, çatışan çıkarlar beyan ederim. XHP Xcelthera kurucusu. XHP ve EYS hESC ile ilgili fikri mülkiyet var.

Gelişimsel çalışma ve klinik çeviri için en büyük zorluklardan biri, verimli ve öngörülebilir bir insan pluripotent kök hücrelerinin istenen bir fenotip geniş bir farklılaşma potansiyeli nasıl kanal olmuştur. Bu hücrelerde, bir multi-dizi toplama aşamasında giderek tüm germ hücrelerine in vitro kendiliğinden ayırt rağmen hESC elde edilen sadece çok soyundan agrega (embriyoid organları), hücreler çok küçük bir fraksiyonu (&lt;% 2) kendiliğinden kardiyomiyositlerde 13-15 (Şekil 1A) farklılaşırlar. Aşağıdaki immunoselection kardiyomiyositlerinin zenginleştirilmiş popülasyonları hayvan modellerinde 13 kalp içine enjeksiyonunu takiben, mekanik ve elektronik hasarlı miyokard fonksiyonu kurtarmak için biyolojik kalp pili olarak çalışması için başardık . Kemirgen enfarkte modelleri, engrafted hESC elde edilen kardiyak yavrularıyla hayatta ve 12 hafta kadar olgun ve kısmen remuscularyaralı kalp kasılma fonksiyonu 14,15 ize ve geliştirmek. Ancak, çok soyundan pluripotent hücreler farklılaşma ve Tümör Gelişimi aşağıdaki nakli yüksek risk ile insan kalp-taahhüt hücreleri üreten verimsizlik, ileri klinik çeviri engellemiştir. Sadece kalp fenotip ve öngörülebilir pluripotent hESC geniş bir farklılaşma potansiyeli kanal stratejileri geliştirme harnessing kalp alanında hESC biyoloji güç için hayati önem taşımaktadır. Belirli bir soydan insan pluripotent kök hücrelerinin düzgün bir dönüşüm elde etmek için, biz, sadece klinik olarak ilgili soy belirli bir pluripotent hESC iyi kontrollü verimli indüksiyonu için koşulları tanımlamak için farklılaşmamış hESC yayılması sigortalanması yeteneğine tanımlanmış bir kültür sistemi istihdam küçük moleküllerin basit bir hüküm (Şekil 1B) . Biz doğrudan p o nikotinamid bağlı kalp-dizi taahhüdüdaha yüksek verimlilik (Şekil 2) kardiyomiyositlerde yenerek ilerledikçe belirlenen kültür altında luripotent hESC. Nkx2.5 insan konjenital kalp hastalığı (KKH), en yaygın insan doğuştan gelen bir kusur 16 ile ilişkili olan genin normal kalp gelişimi ve mutasyonlar için vazgeçilmez bir evolutionally korunmuş homeobox transkripsiyon faktörü. Şimdiye kadar incelenen tüm omurgalıların İfadesi Nkx2.5 kalp habercisi hücreler için erken işaretleyici ve uygun kalp septasyon ve oluşumu / elektrik iletim sisteminin 16 olgunlaşması için gereklidir. Omurgalılarda, erken Nkx2.5 ifade başlangıçlı ve desen kabaca erken embriyogenez kalp şartname zamanlaması ve alanı ile örtüşmektedir ve Nkx2.5 gen kalp 16 geliştirilmesi yoluyla ifade edilmesi devam eder. HESC modeli, NAM, kalp-özel transcri ifade teşvik ederek pluripotent hESC doğrudan kalp indüksiyon tetiklemek için ortaya çıktıption faktör Nkx2.5 insan embriyonik cardiogenesis pluripotent epiblast cardiomesoderm özellikleri taklit edebilecek bir süreç. Gelecek çalışmalar, alternatif olarak rejeneratif tedaviler için klinik ile ilgili soy kaynaklanan küçük molekül aracılı hESC pluripotent kaderini doğrudan kontrolü ve modülasyon için önünü hangi insan kalp gelişiminde genetik ve epigenetik kontrol moleküller ortaya koyacaktır. NAM tedaviye gerek kalmadan, &lt;% 2 hESC kardiyomiyositlerde 12-15 yenerek kendiliğinden farklılaşma uğrayacaktır. NAM tedavi ile, insan embriyonik kalp gelişimi 12 taklit edebilecek bir süreç tanımlamak kültürün etkisi altında muhafaza hESC&gt;% 95&gt;% 50 embriyonik kalp öncüleri ve dayak kardiyomiyositlerde oluşturmak mümkün olmuştur. Son zamanlarda, bilinen kalp-kaderini belirleyen genlerin &lt;0.5% 17, 18 gibi düşük bir verimlilik ile doğum sonrası dayak kardiyomiyositlerde içine fare fibroblastlar transdifferentiate kullanılmıştır &lt;/&gt; Destek. Ancak, reprogrammed somatik hücre tarihsel anormal gen ekspresyonu ve engelli terapötik yarar 19-21 ile hızlandırılmış yaşlanması ile ilişkili olmuştur. Son olarak, burada kurulan protokol, iç hücre kütlesinden (ICM) veya 4,5 insan blastosist epiblast elde edilen pluripotent hESC sınırlıdır önceki morula elde edilen hayvansal kaynaklı EKH, EKH dahil olmak üzere diğer pluripotent hücreler için geçerli olmayabilir (sekiz-cell)-dönem embriyoların 22, ve yapay reprogrammed hücreler 23.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifi Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Jelâtin </td><td> Sigma </td><td> G1890 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> Biyobilim BD </td><td> 356231 </td><td> Düşük büyüme faktörü </td></tr><tr><td> İnsan laminin </td><td> Sigma </td><td> L6274 </td><td></td></tr><tr><td> Nikotinamid </td><td> Sigma </td><td> N0636 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565042 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053036 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM-KO </td><td> Invitrogen </td><td> 10829018 </td><td></td></tr><tr><td> Knock-out serum değiştirme </td><td> Invitrogen </td><td> 10828028 </td><td></td></tr><tr><td> MEM gerekli olmayan amino asit solüsyonu (MNAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> MEM amino asitler çözümü (MEAA, 100X) </td&gt; <td> Invitrogen </td><td> 11130050 </td><td></td></tr><tr><td> ß-mercaptoethanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985023 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax </td><td> Invitrogen </td><td> 11020021 </td><td></td></tr><tr><td> Askorbik asit </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan transferrin </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan bFGF </td><td> PeproTech </td><td> AF-100-18B </td><td></td></tr><tr><td> Insan insülini </td><td> Invitrogen </td><td> 12585014 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan aktivin A </td><td> PeproTech </td><td> 120-14E </td><td></td></tr><tr><td> Tanımlı FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30073-03 </td><td></td></tr><tr><td> 6-sıra, ultra eklenti plaka </td><td> Corning </td><td> 3471 </td><td></td></tr><tr><td> 6-plaka </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td></td></tr></tbody></table>

efficient derivation of human cardiac precursors and cardiomyocytes from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction

Bugüne kadar, uygun bir insan kalp hücresi kaynağı eksikliği, ya da hücre tabanlı nakli veya kalp doku mühendisliği 1-3, yenileyici insan miyokardın en büyük gerileme olmuştur . Kardiyomiyositlerde doğumdan kısa süre sonra ölümcül diferansiye olur ve tomurcuklanmaya yeteneğini kaybeder. , Kemik iliği veya kordon kanı diğer kaynaklardan elde edilen kök / progenitör hücreler, kalp içine 1-3 nakli sonrası kontraktil kalp kası hücreleri yol açmaları mümkün olduğunu, hiçbir kanıt yoktur. Hasar gören kalp kası yeniden veya onarım ihtiyacı, yetişkin kök hücre tedavisi, ya endojen veya 1-3 hücre teslim yoluyla karşılanmaktadır olmamıştır . Genetik istikrarlı bir insan embriyonik kök hücreleri (hESC) pluripotent, ihtiyaç soy sınırlı olan insan somatik hücre büyük malzemeleri, in vitro türetme için bir rezervuar proffering, sınırsız genişleme yeteneği ve sınırsız plastisiteonarım ve yenilenme 4,5. Donör organların sıkıntısı, dünya çapında ve akut kardiyovasküler hastalık yaygınlığı nedeniyle, alternatif bir yaklaşım olarak gelişmekte olan hESC tabanlı tedaviler yoğun ilgi var. Ancak, istenen bir fenotip pluripotent hESC geniş bir farklılaşma potansiyelinin verimli ve öngörülebilir bir kanal nasıl gelişim çalışma ve klinik çeviri için önemli bir sorun olmuştur. Geleneksel yaklaşımlar genellikle fenotipik heterojenite ve istikrarsızlık, dolayısıyla Tümör Gelişimi 6-8 riski yüksek (bkz. şematik bir takip verimsiz ve kontrol edilemeyen bir soy-taahhüt, pluripotent hücrelerin spontan germ tabakası farklılaşma ile çok soyundan eğim güveniyor Şekil 1A). Buna ek olarak, tanımsız / yabancı hayvan biyolojik takviyeleri ve / veya izolasyon, genişlemesi ve hESC farklılaşma için genellikle kullanılan besleyiciler doğrudan kullanımı gibi hücre-speciali yapabilir9-11 sorunlu hastalarda zed greft. Bu engellerin üstesinden gelebilmek için, biz de novo klinik uygun hESC türetme için bir platform olarak hizmet hESC epiblast pluripotence sürdürülmesi için gerekli ve yeterli tanımlanmış bir kültür sistemi unsurlarının çözülmesi ve etkili bir klinik ile ilgili soy doğru düzgün gibi hESC yönetmenlik var küçük moleküller tarafından 12 (Şekil şematik bir bakın. 1B). Küçük moleküller ve büyüme faktörleri çok çeşitli tarama sonra, söz konusu tanımlanmış koşullar nikotinamid (NAM) (Şekil 2, daha yüksek verimlilik ile üretilen insan yenerek kardiyomiyositlerde cardioblasts ilerledi pluripotent hESC doğrudan cardiomesoderm özellikleri ikna etmek için yeterli hale bulundu .) Biz bir iyi-kontrollü verimli türetme sağlayan, bir çok soyundan embriyoid vücut sahne olmadan doğrudan cardioblasts pluripotent hESC indüksiyonu için koşullar tanımlananhücre tabanlı tedavi için gelişim evreleri yelpazesinde insan kalp hücrelerinin büyük kaynağı.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction at JoVE.com

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Biz büyük bir tedarik kardiyovasküler onarım için insan kalp atalarıdır ve fonksiyonel kardiyomiyositlerde türetilmesi sağlayan küçük moleküller ile tanımlanmış koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan cardioblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

efficient-derivation-human-cardiac-precursors-cardiomyocytes-from

Research

JoVE Journal

Biology

19.3K Görüntüleme.  San Diego Regenerative Medicine Institute. Biz büyük bir tedarik kardiyovasküler onarım için insan kalp atalarıdır ve fonksiyonel kardiyomiyositlerde türetilmesi sağlayan küçük moleküller ile tanımlanmış koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan cardioblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Video: Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Biyoloji

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Immunosurgery İnsan Embriyonik Kök Hücreleri türetilmesi

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kromatin Immunoprecipitation

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

İnsan Embriyonik Kök Hücreler Donma ve Çözülme

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Fare Embriyonik Germinal Hücreleri İzolasyon ve türetilmesi

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Embriyonik Kök Hücreler farklılaşma oligodendrosit Öncüleri

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücreler transfekte ve Nucleofecting

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Kültürleme İnsan Embriyonik ve Bağlı Pluripotent Kök Hücrelerinin için uygundur Fare embriyonik fibroblast hücreleri hazırlanması

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are multistep procedures involving the isolation and expansion of neural precursor cells, prior to terminal differentiation. In comparison to these time-consuming approaches, we have recently found that combined inhibition of three signaling pathways, TGF&beta;/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK, promotes rapid induction of neuroectoderm from hPSCs, followed by immediate differentiation into functional neurons. Here, we have adapted our procedure to a novel multititre plate format, to further enhance its reproducibility and to make it compatible with mid-throughput applications. It comprises four days of neuroectoderm formation in floating spheres (embryoid bodies), followed by a further four days of differentiation into neurons under adherent conditions. Most cells obtained with this protocol appear to be bipolar sensory neurons. Moreover, the procedure is highly efficient, does not require particular expert skills, and is based on a simple chemically defined medium with cost-efficient small molecules. Due to these features, the procedure may serve as a useful platform for further functional investigation as well as for cell-based screening approaches requiring human sensory neurons or neurons of any type.

Protocols for neuronal differentiation of pluripotent human stem cells (hPSCs) are often time-consuming and require substantial cell culture skills. Here, we have adapted a small molecule-based differentiation procedure to a multititre plate format, allowing simple, rapid, and efficient generation of human neurons in a controlled manner.

Bir Multititre Plaka Biçimi İnsan Pluripotent Kök Hücreler Nöron Hızlı ve Verimli Üretim

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

İnsan kardiyomiyositleri Üretimi: Besleyici-ücretsiz İnsan Bağlı Pluripotent Kök Hücre A Farklılaşma Protokolü

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...