Bu protokol, kardiyak sferoidlerin üretimi, bakımı ve optik analizi için bir iş akışını tanımlar. Bu kardiyak sferoidler, mevcut in vitro hastalık modellerindeki boşluğu doldurmak için gereklidir. Bu teknik, araştırmacıların yeni nesil, yüksek verimli tarama ve kardiyak sferoidlerin fonksiyonel depolamasını oluşturmalarını sağlar.
İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler içeren bir kültür plakasının her bir kuyucuğuna santimetre kare başına bir mililitre steril kardiyak dekolmanı çözeltisi ekleyerek başlayın. Plakayı 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Parlak alan mikroskobunun 4x büyütmesi altında beyaz ve yuvarlak şekilli hücreleri gözlemleyerek hücrelerin ayrılmasını onaylayın.
Beş mililitrelik bir pipet kullanarak, tek bir hücre süspansiyonu hazırlamak için hücreleri iki mililitre ılık bazal ortam ile yıkayarak mekanik olarak ayırın. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve 300 g'da üç dakika boyunca santrifüj yapın. Daha sonra süpernatanı aspire edin ve hücreleri bir mililitre hiPSC-CM kaplama ortamında yeniden askıya alın.
Hücre peletini ayırmak için 1.000 mikrolitrelik pipet ucu kullanın. Üç veya dört karışımdan sonra, çözelti homojen göründüğünden, hücreleri saymak için bir kasete yükleyin ve 100 mikrolitre kaplama ortamında uygun miktarda hücreyi ultra düşük bir bağlantının, yuvarlak tabanlı, 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna aktarın. Kardiyak sferoidler plakasını, 24 saat boyunca 37 santigrat derece sıcaklık,% 5 karbondioksit,% 21 oksijen ve% 90 nem ile 70 rpm'de inkübatördeki bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin.
Küresel rüptürü önlemek için, her bir kuyucuktan sadece 50 mikrolitre ortam aspire edin ve ilk 48 saat boyunca kuyu başına 100 mikrolitre RPMI artı B27 ortam ekleyin. Daha sonra, her bir kuyucuktan 100 mikrolitre ortamı aspire edin ve kuyu başına olgunlaşma ortamının 100 mikrolitresini ekleyin. Hücreleri olgunlaşma ortamında tutun ve ortamı her iki ila üç günde bir yenileyin.
Küresel plakayı, plakayı 70 g'da üç dakika boyunca santrifüj etmeden önce ön soğutma için 10 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Kuyuda 50 mikrolitre kalana kadar ortamı çıkarın. Daha sonra kuyu başına 200 mikrolitre buz gibi soğuk hiPSC dondurma ortamı ekleyin.
Plakayı bir plaka sızdırmazlık filmi ile kapatın. Silikon kalıbı hazırlamak için, silikon elastomer kitinin bileşenlerini 10'a 1 oranında karıştırın ve çözeltiyi kuyu plakasının alt kısmına ekleyin. Çözeltiyi 15 ila 20 dakika boyunca bir vakum pompası kullanarak kabarcıklarından arındırın.
Kalıbı bir fırına yerleştirin ve plakadan soyulmuş yarı esnek bir elastomer elde etmek için sekiz saat boyunca 60 santigrat derecede kürleyin. Sızdırmaz plakayı dikkatlice silikon bir kalıba yerleştirin ve kuyu plakası ile dondurucu arasında eşit ısı alışverişi sağlayın. Plakayı uzun süreli depolama için bir sıvı azot tankına veya 150 santigrat derece dondurucuya aktarmadan önce hazırlanan silikon kalıpta en az dört saat boyunca plakayı 80 santigrat derecede dondurun.
Kardiyak sferoidlerin hızlı bir şekilde çözülmesini sağlamak için, sıvı azottan bir seferde kardiyak sferoidlerle bir hücre plakası toplayın ve% 5 karbondioksit,% 21 oksijen ve% 90 nem içeren 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Sızdırmazlık filmini plakadan çıkarın ve her bir kuyucuğa 200 mikrolitre ılık bazal ortam eklemeden önce her bir kuyucuğun 150 mikrolitresini aspire edin. Plakayı üç dakika boyunca 70g'de santrifüj yapın ve ılık bazal orta yıkamayı tekrarlayın.
Tamamlandığında, ortamın 150 mikrolitresini çıkarın ve her bir kuyucuğa 200 mikrolitre kardiyomiyosit çözme ortamı ekleyin. Daha sonra, kardiyak sferoid üretimi sırasında belirtildiği gibi RPMI yıkamasını tekrarlayın, ardından hücreleri olgunlaşma ortamında tutun. Kültürden bir hafta sonra, çözülmüş kardiyak sferoidler, optik görüntülemenin kalsiyum kullanımı için idealdir.
Her bir kuyucuğun 150 mikrolitresini aspire edin. Çözülmüş kardiyak sferoidleri karanlık koşullarda kuyucuk başına 100 mikrolitre Cal-520 kalsiyum boya ortamı ile tedavi edin ve plakayı 60 dakika boyunca inkübe edin. Mikroskopa güç vererek ve çevresel kontrol seçeneğinin açık olduğundan emin olarak bir kalsiyum toplama ve analiz sistemi hazırlayın.
Arka plan alanını en aza indirmek için kamera ve çerçeve diyafram açıklığı boyutlarını ayarlayın. Kalsiyum sinyalini ölçmek için, 488 nanometrelik bir lazer kullanarak, kalsiyum salınımı sırasında kontrastı parlak yeşil bir sinyalle siyah bir arka plana ayarlayın. 10 saniye içinde 2 ila 10 tepe noktasından oluşan tutarlı bir akışa sahip bir video kaydedin.
10 saniyelik bir video kaydedin ve 96 kuyucuklu plaka boyunca tarayın, başlangıçta sola doğru hareket edin, ardından tüm plakayı kaplamak için zikzak şeklinde aşağı doğru hareket edin. Kalsiyum geçicileri edindikten sonra, floresan izleri analiz yazılımını kullanarak verileri analiz edin. Kardiyak sferoidler, tohumlama sonrası ilk güne kadar altı haftaya kadar kültürlenebilen bir 3D yapı kazandılar.
Üç haftalık kardiyak sferoidlerin çoğunluğu, alfa aktinin ve troponin T. ile düzenli sarkomer organizasyonunu ifade etti Sıfır gününde yüksek alfa aktinin seviyeleri ve üç haftalık kardiyak sferoidler, kültürleme sırasında sabit ve oldukça saf bir hücresel kompozisyona işaret etti. Kardiyak genlerin, dezmozomların ve mitokondrilerin artmış bir ekspresyonu, sferoidlerde, 90 gün boyunca 2D'de kültürlenen hiPSC-CM'lerden daha fazla gözlendi. Kardiyak sferoidlerin dayak yüzdesi, nesilden sonraki ilk üç haftada benzerdi ve kardiyak sferoidlerin bozulması nedeniyle altıncı haftada önemli ölçüde düştü.
Dayak oranı, üçüncü haftada karşılaştırıldığında önemli ölçüde azaldı ve bozulmanın bir sonucu olarak altıncı haftada düştü. Kalsiyum geçici parametreleri, ikinci haftada daha yüksek bir pik değer gösterirken, yükselme süresi, çürüme süresi ve çürümenin% 90'ındaki kalsiyum geçici süresi, üçüncü haftada önemli ölçüde artmış ve hiPSC-CM kaynaklı sferoidlerin fonksiyonel olarak optimal olduğunu göstermiştir. Küresel boyut, tohumlama için kullanılan hücre sayısı ile artmıştır.
Daha büyük boyutta, eski sferoidlerde, dayak önemli ölçüde daha yüksekti. Benzer ve önemli ölçüde daha yüksek bir dayak hızı, 2.5k sferoidlere kıyasla 5k, 10k ve 20k sferoidler tarafından gösterilmiştir. Kriyoprezervasyon, kardiyak sferoidlerdeki hücre canlılığını etkilemedi.
Çözülmüş ve taze yaş uyumlu sferoidlerde sarkomerik proteinlerin benzer ekspresyonu, kriyoprezervasyon etkinliğini göstermiştir. Çözülmüş veya taze kardiyak sferoidlerin dayak hızında anlamlı bir değişiklik yoktu. Yükselme süresinde, bozunma süresinde ve çözülmüş veya taze CS'nin CTD90'ında önemli bir değişiklik gözlenmedi. Hastalık modellemesi ve yüksek verimli ilaç taramalarının yanı sıra, bu sferoidler hücre dışı vezikül üretiminin biyoreaktörleri ve hücre dışı vezikül ile ilgili tedaviler için de kullanılabilir.
Ayrıca, bu sferoidlerin biyobankacılığı, rejeneratif stratejiler için yeni bir kardiyomiyosit kaynağı olarak kullanılabilir. Biriken kanıtlar, kistik fibroz, kanser ve kardiyak sferoidler için hasta kaynaklı kök hücre modellerinin biyobankalarının, ilaç taramaları ve kişiselleştirilmiş tıp için moleküler mekanizmaları çözme konusunda büyük potansiyele sahip olduğunu göstermektedir.
