Bu çalışma Michigan Üniversitesi Kapsamlı Kanser Merkezi'nin Will ve Jeanne Caldwell Endowed Araştırma Fonu ve kısmen NIH grant CA82529 ve Gillson Longenbaugh Vakfı tarafından desteklendi.

1. ALDEFLUOR Boyama
<ol><li>Hücre örneği hazırlama: Kültürlü tümör hücrelerinden veya yeni hasat edilmiş tümör örneklerinden tümör hücrelerinin tek hücreli süspansiyonu hazırlayın. Hücreleri sayın ve hücre süspansiyonu ALDEFLUOR Tahlil Tamponunda 1 x10 6 hücre/ml konsantrasyona ayarlayın.</li>
	<li>Dört adet 12 mm x 75 mm polistiren test tüpünü kontrol tüpleri olarak şu şekilde etiketle: #1: Lekesiz, #2: ALDEFLUOR, #3: ALDEFLUOR artı DEAB ve #4: 7AAD.</li>
	<li>Bu kontrol tüpleri için, 1ml hücre süspansiyonu #1 ve #4, ancak 2 ml tüp #2 yerleştirin. Tüp #3 5 μl DEAB (ALDH inhibitörü) ekleyin ve buzda tutun. Daha sonra tüp #2 10 μl aktif ALDEFLUOR substrat ekleyin, karıştırın ve karışımın 1 ml'yi hemen tüp #3 aktarın.</li>
	<li>Aynı zamanda, ALDEFLUOR Test Tamponunda 1 x 10 6 hücre/ml'de de hücrelerin geri kalanına (örnek tüpler) milyon hücre başına2 μl aktif ALDEFLUOR substratı ekleyin.</li>
	<li>37 °C su banyosunda hem 4 kontrol tüpünü hem de numune tüplerini 30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Kuluçkadan sonra, kontrol tüpüne #4 5 μl 7AAD ve numune tüpüne 1 μl 7AAD 1 x10 6 hücre ekleyin. 4 °C'de 10 dk kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Tüm tüpleri 250 x g'da 5 dakika santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın.</li>
	<li>ALDEFLUOR Test Arabelleği'ndeki hücreleri yeniden başlatın.</li>
	<li>Akış sitometri tabanlı sıralama gerçekleştirin.</li>
	<li>DEAB ile negatif kontrol olarak tedavi edilen ALDEFLUOR lekeli hücreleri ve canlılık kontrolü için propidium iyodür (PI) 7AAD lekeli hücreleri kullanarak sıralama kapılarını ayarlayın. Bu kontrollere dayanarak, ALDEFLUOR+/ALDHyüksek,D5 ve SCC7 hücrelerini ayırt etmek için bir kapı kuruldu. Bu kapılar daha sonra ALDEFLUOR+/ALDHyüksek D5 ve SCC7 hücreleri için yukarıda hazırlanan tüm örnek hücreleri sıralamak için kullanılacaktır.</li>
</ol>2. Kanser Kök HücreLi Lisate-nabız Dendritik Hücre (CSC-TPDC) Aşısının Hazırlanması
<ol><li>Fareleri (sırasıyla singeneik B6 ve C3H) CO2 kullanarak ötenazi ve femur ve kaval kemiğini izole edin.</li>
	<li>Kemikleri oda sıcaklığında 1 dakika boyunca% 75 etanol içine koyun. Daha sonra HBSS kullanarak kemikleri yıkayın.</li>
	<li>Kemikleri kesin ve hücreleri bir tabağa itmek için 21 G iğne ve 10 ml şırınga kullanın.</li>
	<li>Tek hücre süspansiyonu yapmak için şırınna kullanarak hücreleri aspire edin ve üfleyin.</li>
	<li>5 dakika boyunca 1.500 rpm'de santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın. Daha sonra 37 °C su banyosunda 1 dakika boyunca RBC'yi lizize etmek için 5 ml RBC liziz tamponu ekleyin.</li>
	<li>Hücre sayısını sayın ve hücre süspansiyonu 10 ng/ml GM-CSF ve 10 ng/ml IL-4 içeren tam orta (CM) olarak 1 milyon hücre/ml konsantrasyonuna ayarlayın.</li>
	<li>Hücreleri kültüre edin ve 3 gün sonra CM artı IL-4 ve GM-CSF'yi telafi edin.</li>
	<li>5. günde, olgunlaşmamış dendritik hücreleri (DC'ler) hasat edin ve 4,2 ml çözelti C artı 1 ml OptiPrep yoğunluk gradyan ortamı içeren DC izolasyon ortamını hazırlayın.</li>
	<li>Hücre peletlerini 5 ml CM olarak askıya alın Hücre süspansiyonu izolasyon ortamına yavaşça ekleyin. Oda sıcaklığında 2,000 rpm'de santrifüj.</li>
	<li>CM ve yalıtım ortamı arasındaki DC'leri toplayın. Hücre sayısını sayın ve hücre süspansiyonu 10 ng/ml GM-CSF ve 10 ng/ml IL-4 içeren kültür ortamında 1 milyon hücre/ml konsantrasyonuna ayarlayın.</li>
	<li>Kültür ortamında ALDHyüksek veya sıralanmamış D5 veya SCC7 hücrelerini askıya alarak ve dört kez hızlı donma-çözülme maruziyetine maruz kalarak tümör lysates hazırlayın ve ardından lysates'in membran kısmını toplamak için 5 dakika boyunca 100 x g ∼ dönüş yaparak.</li>
	<li>CSC-TPDC hazırlamak için, otolog ALDHyüksek hücrelerinin lysate ile darbe DC'leri. H-TPDC hazırlamak için, sıralanmamış heterojen tümör hücre lisat ile nabız DC'leri. DC'nin tümör hücre lisat oranı aynıdır.</li>
</ol>3. Etkinliğin Aşılanması ve Değerlendirilmesi
<ol><li>Normal B6 farelerini sırasıyla 2.500 D5 CSC-TPDC veya D5 H-TPDC tümör hücresi ile deri altı (s.c.) ile aşılayın. Normal C3H hayvanları s.c.</li>
	<li>Aşılamadan sonra, B6 farelerini heterojen D5 tümör hücreleriyle meydan oku, yani 20 gün sonra CO2 kullanarak fareleri ötenazi edin. Akciğerleri topla ve akciğer metastazlarını numaralandırır.</li>
	<li>SCC7 modelinde, DC aşısının karşı tarafında sıralanmamış SCC7 tümör hücreleri s.c ile C3H farelerine meydan oku. Tümör boyutunu izleyin.</li>
	<li>Deneylerin sonunda CO2kullanarak B6 ve C3H farelerini ötenazi yapın. İlk aşıdan sonraki 34. günde, fareleri CO2ile ötenazi ve aynı zamanda aseptik bir prosedürle her grubun dalağını toplayın.</li>
	<li>Immobilize anti-CD3 artı hrIL-2 veya LPS içeren CM'de anti-CD28 mAbs artı anti-CD40 (FGK45) mAb assitleri ile dalak T ve/veya B hücrelerini etkinleştirin.</li>
	<li>Etkinleştirmeden sonra, süpernatantları toplayın ve ELISA tahlilleri için kullanın.</li>
	<li>ELISA testi için, IFNφ, GM-CSF ve IgG için antikor içeren kaplama plakaları 4 °C O/N'de.</li>
	<li>Engelleme tamponu uygulamasından sonra, numuneler ve standartlar ekleyin ve oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Plakayı yıkayın ve inkübasyon için HRP algılama antikor ve TMB substrat ekleyin.</li>
	<li>Reaksiyonu durdurduktan sonra 30 dakika içinde 450 nm'de bir ELISA plaka okuyucusunda emiciliği ölçün.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shafee, N., Smith, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+contribute+to+cisplatin+resistance+in+Brca1/p53-mediated+mouse+mammary+tumors.">Cancer stem cells contribute to cisplatin resistance in Brca1/p53-mediated mouse mammary tumors.</a> Cancer Res. 68, 3243-3250 (2008).</li><li>Nandi, S., Ulasov, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-dose+radiation+enhances+survivin-mediated+virotherapy+against+malignant+glioma+stem+cells.">Low-dose radiation enhances survivin-mediated virotherapy against malignant glioma stem cells.</a> Cancer Res. 68, 5778-5784 (2008).</li><li>Dallas, N. A., Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoresistant+colorectal+cancer+cells,+the+cancer+stem+cell+phenotype,+and+increased+sensitivity+to+insulin-like+growth+factor-I+receptor+inhibition.">Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition.</a> Cancer Res. 69, 1951-1957 (2009).</li><li>Yamauchi, K., Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cancer+metastasis+by+cyclophosphamide+pretreatment+of+host+mice:+an+opposite+effect+of+chemotherapy.">Induction of cancer metastasis by cyclophosphamide pretreatment of host mice: an opposite effect of chemotherapy.</a> Cancer Res. 68, 516-520 (2008).</li><li>Chang, A. E., Redman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+tumor+lysate-pulsed+dendritic+cells+in+the+treatment+of+advanced+cancer.">A phase I trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer.</a> Clin. Cancer Res. 8, 1021-1032 (2002).</li><li>Ito, F., Li, Q., Shreiner, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CD137+monoclonal+antibody+administration+augments+the+antitumor+efficacy+of+dendritic+cell-based+vaccines.">Anti-CD137 monoclonal antibody administration augments the antitumor efficacy of dendritic cell-based vaccines.</a> Cancer Res. 64, 8411-8419 (2004).</li><li>Kirk, C. J., Hartigan-O'Connor, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell-dependent+antitumor+immunity+mediated+by+secondary+lymphoid+tissue+chemokine:+augmentation+of+dendritic+cell-based+immunotherapy.">T cell-dependent antitumor immunity mediated by secondary lymphoid tissue chemokine: augmentation of dendritic cell-based immunotherapy.</a> Cancer Res. 61, 2062-2070 (2001).</li><li>Ning, N., Pan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cell+vaccination+confers+significant+antitumor+immunity.">Cancer stem cell vaccination confers significant antitumor immunity.</a> Cancer Res. 72, 1853-1864 (2012).</li><li>Ginestier, C., Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR1+blockade+selectively+targets+human+breast+cancer+stem+cells+in+vitro+and+in+xenografts.">CXCR1 blockade selectively targets human breast cancer stem cells in vitro and in xenografts.</a> J. Clin. Invest. 120, 485-497 (2010).</li><li>Carpentino, J. E., Hynes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase-expressing+colon+stem+cells+contribute+to+tumorigenesis+in+the+transition+from+colitis+to+cancer.">Aldehyde dehydrogenase-expressing colon stem cells contribute to tumorigenesis in the transition from colitis to cancer.</a> Cancer Res. 69, 8208-8215 (2009).</li><li>Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+cell+lines+contain+functional+cancer+stem+cells+with+metastatic+capacity+and+a+distinct+molecular+signature.">Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature.</a> Cancer Res. 69, 1302-1313 (2009).</li></ol>

STEMCELL Technologies, Açık Erişim yayın ücretlerini desteklemiştir.

SCID fareleri gibi bağışıklık sistemi baskılanmış konaklar, konakçılarda adaptif bağışıklık eksikliği nedeniyle CSC'lerin immünolojik değerlendirmelerini önler. Bu çalışmada, hasta ayarlarını daha yakından taklit edebilecek, immün yetmeseent konakçılarda KSS'lerin immünojenikliğini değerlendirdik. Zenginleştirilmiş CSC'ler immünojeniktir ve lysates'leri seçilmemiş tümör hücresi lisat darbeli PCC'lere kıyasla aşı olarak DC'lere yüklendiğinde daha etkili tümör koruyucu bağışıklığa neden olabilir.  Mekanistik olarak, koruma, CSC-reaktif antikorların ve T hücrelerinin8'in seçici indüksiyonunun yanı sıra IFNφ ve GM-CSF gibi tip 1 sitokin üretimi ile sağlandı.
Dendritik hücre bazlı aşılar ve benimsenen T hücre transferi de dahil olmak üzere mevcut immünoterapilerin çoğu tümör farklılaşmış antijenleri hedeflemek için tasarlanmıştır. Bu farklılaştırılmış antijenleri ifade edemeyen CSC'ler bu immünolojik hedeflemeden kaçabilir. Buna karşılık, özellikle kanser kök hücrelerini hedeflemek için tasarlanan CSC aşısı, kanser hücrelerinin bu özel popülasyonunu yok edebilir ve böylece tümörün nüks ve metastazını önleyerek aşının terapötik etkinliğini artırabilir.
Hem kültürlü tümör hücrelerinde hem de taze hasat edilen tümörlerde, yüksek aldehit dehidrogenaz aktivitesine dayalı akış sitometrisi ile CSC ile zenginleştirilmiş popülasyon belirledik. Bu tür ALDHyüksek hücreleri, CSC-TPDC'leri oluşturmak için DC'yi nabızlamak için bir antijen kaynağı olarak kullanılacak akış sıralama ile izole edilebilir. Kültürlü tümör hücrelerinden izole edilen ALDHyüksek hücrelerinin ve yeni hasat edilen tümörlerin karşılaştırılmasının, anti-CSC bağışıklığının indüksiyonu açısından önemli bir fark göstermedi8. Bu sonuçlar, kültürlü tümör hücrelerinden veya klinik uygulama için yeni hasat edilmiş tümörlerden izole edilmiş CSC'leri kullanma potansiyelini ortaya koydu.
Klinik olarak alakalı olması için, bir aşının terapötik bir ortamda incelenmesi gerekir. Bu deneyler şu anda laboratuvarımızda yapılmaktadır.

Kanser kök hücreleri geleneksel kemoterapi ve radyoterapiye nispeten dirençlidir1,2. Öte yandan, bu hücre popülasyonu, geleneksel kanser tedavilerinden sonra kanserlerin nüks etmesinden ve ilerlemesinden sorumlu hücreler olabilir1-4. Farklılaştırılmış tümör antijenlerinin kanser kök hücreleri üzerinde ifade eksikliği nedeniyle, kanser kök hücreleri, çoğunlukla farklılaştırılmış tümör hücreleri üzerindeki antijenleri hedeflemek için tasarlanmış olan kanser tedavisinin mevcut immünolojik müdahalelerinden kaçabilir. Bu nedenle, özellikle kanser kök hücrelerini hedef alan ve yok eden yeni stratejilerin geliştirilmesi, mevcut kanser tedavisinin terapötik etkinliğini artırmaya yönelik sözler verebilir. Bu amaçla, iki hayvan tümöründen (melanom D5 ve skuamöz hücreli kanser SCC7) kanser kök hücre (CSC) zenginleştirilmiş popülasyonları izole ettik ve CSC-TPDC aşısını hazırlamak için antijen sunum hücrelerini (dendritik hücreler, DC) nabızlamak için bir antijen kaynağı olarak kullandık. Daha sonra CSC-TPDC aşısının indüklediği antitümör bağışıklığı sırasıyla singeneik immün yetmetik konakçılarda, B6 farelerde ve C3H farelerinde değerlendirdik. CSC-TPDC kaynaklı antitümör etkinliği, daha önce grubumuz5,6tarafından kullanılan sıralanmamış heterojen tümör hücrelerinden (H-TPDC) ve diğer araştırmacılar tarafından hem klinik öncesi çalışmalarda hem de klinik çalışmalarda7 ile atımlı geleneksel DC aşısı ile karşılaştırıldı.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1022">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">ALDHEFLOUR KIT</td>
			<td style="width:399px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:219px;">1700</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Murine IL-4</td>
			<td style="width:399px;">Pepro Tech</td>
			<td style="width:219px;">214-14</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Murine GM-CSF</td>
			<td style="width:399px;">Pepro Tech</td>
			<td style="width:219px;">315-03</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Mouse IFN-&#611; ELISA KIT</td>
			<td style="width:399px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:219px;">555138</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Mouse GM-CSF ELISA KIT</td>
			<td style="width:399px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:219px;">555167</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td style="width:399px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">D1556</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">BD OptEIA TMB Substrated Reagent Set</td>
			<td style="width:399px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:219px;">555214</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;"></td>
			<td style="width:399px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Equipment</td>
			<td style="width:399px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">BD FACS Aria Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>336834</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Kcjunior</td>
			<td style="width:399px;">Bio-Tek Instruments</td>
			<td style="width:219px;">176058</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a novel dendritic-cell vaccine using melanoma and squamous cancer stem cells

Murine melanom D5 syngeneic'ten C57BL/6 farelere ve Skuamöz kanser SCC7 singenetiğinden C3H farelerine kadar kanser kök hücre (CSC) ile zenginleştirilmiş popülasyonları aldefluor/ALDH'yi belirteç olarak kullanarak belirledik ve hücre lisatını dendritik hücreleri (DC) nabızlamak için antijen kaynağı olarak kullanarak immünojenikliklerini test ettik. ALDHyüksek CSClyazlarla nabız atan DC'ler, her iki modelde ve akciğer metastaz ayarında ve s.c'de sıralanmamış tüm tümör hücresi lysates'lerinin lysates'i ile nabız atan DC'lere göre önemli ölçüde daha yüksek koruyucu antitümör bağışıklığına neden oldu. sırasıyla tümör büyüme ayarı. Bu fenomen, CSC aşısı kaynaklı humoral ve hücresel anti-CSC yanıtlarından kaynaklandı. Özellikle, CSC-DC aşısına maruz kalan konakçıdan izole edilen splenositler, sıralanmamış tümör hücresi kalsat darbeli-DC aşısına maruz kalan konakçıdan izole edilen splenositlerden önemli ölçüde daha yüksek miktarda IFNφ ve GM-CSF üretti. Bu sonuçlar, adjuvan bir ortamda klinik kullanım için otolog CSC tabanlı terapötik aşı geliştirme çabalarını desteklemektadır.

ALDEFLUOR/ALDH,8-11multipl malignitelerde kök hücreleri izole etmek için tek bir belirteç olarak kullanılmıştır. ALDEFLUOR'u belirteç olarak kullanarak D5 ve SCC7 olmak üzere iki tümör modelinde kanser kök hücre ile zenginleştirilmiş popülasyonları belirledik. Murine melanom B16-D5 ve skuamöz hücreli kanser SCC7'de ALDEFLUOR+ hücreleri saptandı. ALDEFLUOR+ hücrelerinin kültürlü D5 ve SCC7 tümör hücre hatlarında sırasıyla yaklaşık %0,5 ve %5,2 katkıda bulunduğunu tespit ettik (Şekil 1). Kurulan tümörlerden yeni hasat edilen tümör hücreleri, ALDEFLUOR+ hücrelerinin varlığını doğrulamak için analiz edilmiştir. Şekil 1'dede gösterildiği gibi in vivo kurulan D5 ve SCC7 tümörlerinden ALDEFLUOR+ hücrelerinin sırasıyla %2,5'i ve %4,2'si vardı. Bu sıralanmış D5 ve SCC7 ALDEFLUOR+/ALDHyüksek popülasyonlarının tümörojenliği ve kendini yenileme kapasitesi, sırasıyla C57BL/6 ve C3H fareleri olan singeneik immün yetmezlik konağındadeğerlendirildi.
Hem hayvan çalışmalarında hem de klinik çalışmalarda nabız DC'lerine (H-TPDC) heterojen sıralanmamış tümör hücresi lysate kullandık5,6. CSC'lerin immünojenikliğini incelemek için, ALDHyüksek CSC ve darbeli DC'yi CSC-TPDC(Şekil 2)oluşturmak için CSC'lerin kalsatıyla izole ettik ve CSC-TPDC'nin tümör büyümesini önlemede yararlı bir etkisi olup olmadığını test etmek için H-TPDC'yi geleneksel bir kanser aşısı kontrolü olarak kullandık.
CSC-TPDC'nin neden olduğu koruyucu antitümör bağışıklığı inceleyerek CSC'lerin immünojenikliğini değerlendirdik. D5 modelinde, naif immün yetmecen fareler CSC-TPDC veya H-TPDC (aynı lisate: DC oranında) ile s.c aşılandı. Kontrol grupları salin (PBS) aldı. Son aşıdan bir hafta sonra, farelere intravenöz olarak(yani)sıralanmamış D5 tümör hücreleri ile meydan okundu ve akciğer metastazlarını numaralandırmak için akciğerler 3 hafta sonra hasat edildi. Tablo 1'degösterildiği gibi, PBS grubu ile karşılaştırıldığında, H-TPDC ile tedavi edilen fareler daha az akciğer metastazı geliştirdi. Daha da önemlisi, CSC-TPDC ile tedavi edilen fareler, yapılan her iki deneyde H-TPDC aşı grubuna göre önemli ölçüde daha az akciğer metastazlarına sahipti. SCC7 modelinde, normal C3H hayvanları sağ kanatta sırasıyla SCC7 CSC-TPDC veya H-TPDC ile s.c aşılandı ve ardından sol kanada sıralanmamış SCC7 tümör hücreleri s.c ile meydan okudu. PBS grubu ile karşılaştırıldığında, H-TPDC tümör büyümesine karşı mütevazı anti-tümör bağışıklığına neden oldu. Bununla birlikte, hem kontrol grubu hem de H-TPDC grubu ile karşılaştırıldığında CSC-TPDC ile tedavi edilen farelerde tümör büyümesinin önemli inhibisyonu vardı (p<0.05, Şekil 3). Bu sonuçlar, CSC'lerin tümör hücrelerinin zorluğuna karşı koruyucu bağışıklığı teşvik etmek için geleneksel sıralanmamış tümör hücrelerinden daha etkili bir antijen kaynağı olarak kullanılabileceğini göstermektedir.
Gözlemlenen CSC kaynaklı koruyucu antitümör bağışıklığının altında kalan mekanizmaları daha iyi anlamak için, deneylerin sonunda DC aşılarına maruz kalan hayvanlardan dalakları topladık. Dalak hücreleri daha sonra anti-CD3/CD28/IL-2 veya anti-CD3/CD28/IL-2 + LPS/anti-CD40 ile aktive edildi. Daha sonra sitokinlerin ve antikorların ekspresyonunun tespiti için kültür süpernatantları toplandı.  D5 CSC-TPDC veya SCC7 CSC-TPDC ile aşılanan hayvanlardan dalak hücreleri tarafından IFNφ ve GM-CSF'nin önemli ölçüde daha yüksek üretimleri vardı (Şekil 4). Ayrıca, D5 CSC-TPDC veya SCC7 CSC-TPDC ile aşılanan hayvanlardan toplanan LPS/anti-CD40 aktif dalak hücreleri ile D5 H-TPDC veya SCC7 H-TPDC ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde (p<0.05) daha yüksek IgG üretimi vardı. Bu antikorların sırasıyla D5 ve SCC7 CSC'lere bağlanarak yapıldığı tespit edildi ve bu tür bir bağlama, tamamlayıcı8varlığında CSC lizizine neden olabilir.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1.jpg"> Şekil 1. Kültürlü ve yeni hasat edilmiş taze murine D5 melanom ve SCC7 skuamöz hücreli tümörlerde ALDHFLUOR+/ALDHyüksek popülasyonları saptanmıştır. Negatif kontrol olarak spesifik bir ALDH inhibitörü olan 50 mmol/L DEAB ile tedavi edilen tümör hücreleri kullanıldı.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a> 
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2.jpg"> Şekil 2. Dendritik hücre bazlı kanser kök hücre aşılarının üretimi. CSC-TPDC ve H-TPDC'nin hazırlanması için kemik iliği türevi dendritik hücreler sırasıyla ALDHyüksek veya sıralanmamış tümör hücrelyatları ile nabızlandı.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a> 
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3.jpg"> Şekil 3. CSC lysate pulsed DC (CSC-TPDC) aşısı s.c daha etkili koruyucu antitümör bağışıklığına neden olabilir. SCC7 tümör modeli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a> 

<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4.jpg"> Şekil 4. CSC-TPDC ile aşılanan immün yetmsiz konakta daha güçlü sistemik hücresel yanıtlar.  Dalaklar H-TPDC veya CSC-TPDC aşısına tabi tutulan hayvanlardan hasat edildi ve belirtildiği gibi aktive edildi. Kültür süpernatantları daha sonra ELISA kullanılarak sitokin tespiti için toplandı.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells at JoVE.com

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Singeneik immün yetmetik konakçılarda değerlendirilen kanser kök hücre (KSS) bazlı dendritik hücre (DC) aşısı, heterojen dökme tümör hücreleri ile nabızlanan geleneksel DC aşılarına göre önemli ölçüde daha yüksek antitümör bağışıklık göstermiştir.

Melanom ve Skuamöz Kanser Kök Hücreleri Kullanılarak Yeni Bir Dendritik Hücre aşısının Üretilmesi

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

generation-novel-dendritic-cell-vaccine-using-melanoma-squamous

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.2K Görüntüleme.  University of Michigan. Singeneik immün yetmetik konakçılarda değerlendirilen kanser kök hücre (KSS) bazlı dendritik hücre (DC) aşısı, heterojen dökme tümör hücreleri ile nabızlanan geleneksel DC aşılarına göre önemli ölçüde daha yüksek antitümör bağışıklık göstermiştir.

Video: Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in peripheral tissues in steady state; however in response to antigen stimulation, DCs take up the antigen and rapidly migrate to the draining lymph nodes where they initiate T cell response against the antigen1,2. Additionally, DCs also play a key role in initiating autoimmune as well as allergic immune response3.
DCs play an essential role in both initiation of immune response and induction of tolerance in the setting of lung environment4. Lung environment is largely tolerogenic, owing to the exposure to vast array of environmental antigens5. However, in some individuals there is a break in tolerance, which leads to induction of allergy and asthma. In this study, we describe a strategy, which can be used to monitor airway DC maturation and migration in response to the antigen used for sensitization. The measurement of airway DC maturation and migration allows for assessment of the kinetics of immune response during airway allergic inflammation and also assists in understanding the magnitude of the subsequent immune response along with the underlying mechanisms.
Our strategy is based on the use of ovalbumin as a sensitizing agent. Ovalbumin-induced allergic asthma is a widely used model to reproduce the airway eosinophilia, pulmonary inflammation and elevated IgE levels found during asthma6,7. After sensitization, mice are challenged by intranasal delivery of FITC labeled ovalbumin, which allows for specific labeling of airway DCs which uptake ovalbumin. Next, using several DC specific markers, we can assess the maturation of these DCs and can also assess their migration to the draining lymph nodes by employing flow cytometry.

We describe a strategy to monitor maturation and migration of pulmonary dendritic cells in response to ovalbumin in the setting of ovalbumin induced allergic airway inflammation. This strategy can be modified to assess migration of pulmonary dendritic cells in settings of infection.

Alerjik Havayolu Enflamasyon sırasındaki solunum Dendritik Hücre olgunlaşması ve Göç Analizi

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes such as embryonic development, signal transduction, and immune receptor recognition1-2. They contain complex sugar moieties in the form of isomers, and lipid moieties with variations including fatty acyl chain length, unsaturation, and hydroxylation. Both carbohydrate and ceramide portions may be basis of biological significance. For example, tri-hexosylceramides include globotriaosylceramide (Gal&alpha;4Gal&beta;4Glc&beta;1Cer) and isoglobotriaosylceramide (Gal&alpha;3Gal&beta;4Glc&beta;1Cer), which have identical molecular masses but distinct sugar linkages of carbohydrate moiety, responsible for completely different biological functions3-4. In another example, it has been demonstrated that modification of the ceramide part of alpha-galactosylceramide, a potent agonist ligand for invariant NKT cells, changes their cytokine secretion profiles and function in animal models of cancer and auto-immune diseases5. The difficulty in performing a structural analysis of isomers in immune organs and cells serve as a barrier for determining many biological functions6.
Here, we present a visualized version of a method for relatively simple, rapid, and sensitive analysis of glycosphingolipid profiles in immune cells7-9. This method is based on extraction and chemical modification (permethylation, see below Figure 5A, all OH groups of hexose were replaced by MeO after permethylation reaction) of glycosphingolipids10-15, followed by subsequent analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS) and ion trap mass spectrometry. This method requires 50 million immune cells for a complete analysis. The experiments can be completed within a week. The relative abundance of the various glycosphingolipids can be delineated by comparison to synthetic standards. This method has a sensitivity of measuring 1% iGb3 among Gb3 isomers, when 2 fmol of total iGb3/Gb3 mixture is present9.
Ion trap mass spectrometry can be used to analyze isomers. For example, to analyze the presence of globotriaosylceramide and isoglobtriaosylceramide in the same sample, one can use the fragmentation of glycosphingolipid molecules to structurally discriminate between the two (see below Figure 5). Furthermore, chemical modification of the sugar moieties (through a permethylation reaction) improves the ionization and fragmentation efficiencies for higher sensitivity and specificity, and increases the stability of sialic acid residues. The extraction and chemical modification of glycosphingolipids can be performed in a classic certified chemical hood, and the mass spectrometry can be performed by core facilities with ion trap MS instruments.

A specific and sensitive method to gain insight into the expression profile of glycosphingolipid antigens in immune organs and cells is described. The method takes advantage of the ion trap mass spectrometry allowing step-wise fragmentation of glycosphingolipid molecules for structural analysis in comparison to chemically synthesized standards.

Glycosphingolipid Antijenler Kütle Spektrometrik Analizi

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many advantages for ease and standardization of immunological assessments, but detrimental effects of this process have been observed on some cell subsets, such as granulocytes, B cells, and dendritic cells 1-3. Assaying fresh leukocytes gives a more accurate picture of the in vivo state of the cells, but is often difficult to perform in the context of large clinical trials. Fresh cell assays are dependent upon volunteer commitments and timeframes and, if time-consuming, their application can be impractical due to the working hours required of laboratory personnel. In addition, when trials are conducted at multiple centers, laboratories with the resources and training necessary to perform the assays may not be located in sufficient proximity to clinical sites. To address these issues, we have developed an 11-color antibody staining panel that can be used with Trucount tubes (Becton Dickinson; San Jose, CA) to phenotype and enumerate the major leukocyte populations within the peripheral blood, yielding more robust cell-type specific information than assays such as a complete blood count (CBC) or assays with commercially-available panels designed for Trucount tubes that stain for only a few cell types. The staining procedure is simple, requires only 100 &mu;l of fresh whole blood, and takes approximately 45 minutes, making it feasible for standard blood-processing labs to perform. It is adapted from the BD Trucount tube technical data sheet (<a href="http://www.bdbiosciences.com/external_files/is/doc/tds/Package_Inserts_CE/live/web_enabled/23-3483-06_PI_Trucount tubes_CE_EN.pdf" target="_blank">version 8/2010</a>). The staining antibody cocktail can be prepared in advance in bulk at a central assay laboratory and shipped to the site processing labs. Stained tubes can be fixed and frozen for shipment to the central assay laboratory for multicolor flow cytometry analysis. The data generated from this staining panel can be used to track changes in leukocyte concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific cell types of interest. In this report, we demonstrate the procedure used by blood-processing lab technicians to perform staining on fresh whole blood and the steps to analyze these stained samples at a central assay laboratory supporting a multicenter clinical trial. The video details the procedure as it is performed in the context of a clinical trial blood draw in the HIV Vaccine Trials Network (HVTN).

In this report, we demonstrate the staining and analysis steps of a phenotyping assay performed on fresh whole blood to enumerate major innate and adaptive leukocyte populations. We emphasize considerations for performing these procedures in the context of a multicenter clinical trial.

Bir Tam Kan fenotipleme Testi Kullanarak Çok Merkezli Klinik Araştırmalar için Binbaşı Periferik Kan Lökosit Populasyonlarının Numaralama

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

Kullanarak İzleme Dendritik Hücre Göç<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Manyetik Rezonans Görüntüleme

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field 4. The use of cell-based arenavirus minigenome systems together with the ability to generate recombinant infectious arenaviruses with predetermined mutations in their genomes has facilitated the investigation of the contribution of viral determinants to the different steps of the arenavirus life cycle, as well as virus-host interactions and mechanisms of arenavirus pathogenesis 1, 3, 11 . In addition, the development of trisegmented arenaviruses has permitted the use of the arenavirus genome to express additional foreign genes of interest, thus opening the possibility of arenavirus-based vaccine vector applications 5 . Likewise, the development of single-cycle infectious arenaviruses capable of expressing reporter genes provides a new experimental tool to improve the safety of research involving highly pathogenic human arenaviruses 16 . The generation of recombinant arenaviruses using plasmid-based reverse genetics techniques has so far relied on the use of rodent cell lines 7,19 , which poses some barriers for the development of Food and Drug Administration (FDA)-licensed vaccine or vaccine vectors. To overcome this obstacle, we describe here the efficient generation of recombinant arenaviruses in FDA-approved Vero cells.

Rescue of recombinant arenaviruses from cloned cDNAs, an approach referred to as reverse genetics, allows researchers to investigate the role of specific viral gene products, as well as the contribution of their different specific domains and residues, to many different aspects of the biology of arenavirus. Likewise, reverse genetics techniques in FDA-approved cell lines (Vero) for vaccine development provides novel possibilities for the generation of effective and safe vaccines to combat human pathogenic arenaviruses.

FDA onaylı Vero hücrelerinde Aşı Geliştirme için bir araya getiren Arenavirus üretimi

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

Saf Hematopoetik kök / progenitör hücrelerin DNA mutasyonları belirlenmesi

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

Ana-Hücre RNA sentezi üzerinde Viral Enfeksiyon Etkisi Tedbir tıklayın Kimya Kullanımı

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

Sitokin yakalama Sistemi kullanılarak Klinik Uygulamalar için Sitomegalovirüs özgü otomatik Hücre Zenginleştirme T hücreleri

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

Vivo Tahlil antijen spesifik T-hücre Cytolytic işlevi bir aşı modeli kullanılarak tespiti için

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

Çok sayıda miyeloid ataları ve dendritik hücre öncüleri fare kemik iliği strateji sıralama bir roman hücre kullanarak gelen nesil

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...