Bu protokol, klinik solid tümör immünoterapi modeli ve tümör hücreleri ile infiltrasyon yapan immün hücreler arasındaki ilişkiyi incelemek için bir araştırma platformu sağlar. Bu hücre bazlı tümör aşısı uygundur, kullanımı kolaydır ve daha güçlü ve yüksek tümör bağışıklığı ile sonuçlanabilecek katkı maddesi veya sinerjik etki elde etmek için kontrol noktası blokajı gibi diğer terapötik modalitelerle birleştirilebilir. Prosedürün gösterilmesine yardımcı olacak kişi, laboratuvarımdan bir araştırma teknisyeni olan Ann Balanjio olacak.
Başlamak için, IMDM'de% 10 ısı inaktif FBS, 2 milimolar glutamin, 1 milimolar sodyum piruvat, 1 milimolar MEM esansiyel olmayan amino asitler ve her biri penisilin ve streptomisin mililitre başına 100 birim içeren kültür B16-F10 melanom hücreleri. Hücre hattını% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede tutun. B16-F10 hücrelerini metin el yazmasında açıklandığı gibi tohumlayın ve hasat edin.
Kültür ortamını çıkarın ve şişeleri PBS ile bir kez yıkayın. PBS'yi aspire edin ve 5 mililitre% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin, ardından kültür şişesinin kenarına sert bir şekilde dokunun. Tripsin-EDTA'yı nötralize etmek için 15 mililitre kültür ortamı ekleyin ve şişenin içeriğini 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne dökün.
Bulaşık yüzeyini 10 mililitre PBS ile yıkayın ve aynı 50 mililitre santrifüj tüpüne dökün. Hücreleri 200 RCF'de 5 dakika santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve tüpün dibine dokunarak hücre peletini kırın.
Soğuk 10 mililitre PBS ekleyin ve hücre süspansiyonunu nazikçe pipetleyin. Ardından, bir hemositometre kullanarak hücreleri manuel olarak sayın. Enjeksiyondan önce hücreleri buz üzerinde tutun.
30 gauge iğne kullanarak, sol kanattaki 50 mikrolitre soğuk PBS'ye 500.000 hücre B16-F10 tümör hücresini intradermal olarak implante edin. İmplante edilmiş B16-F10 tümör hücrelerinin dozunun, başarılı tümör gelişimi için 50.000 ila 500.000 hücre aralığında ayarlanması gerekebilir. Uygulamadan sonra, elektronik bir dijital kumpas kullanarak tümör uzunluğunu ve genişliğini haftada üç kez ölçün.
Tümör hacmini hesaplayın ve metin yazısında açıklandığı gibi tümörler iki milimetrelik bir boyuta ulaştığında fareleri tümör aşısı ile tedavi edin. 160 kilovolt ve 25 miliamperde ayarlanmış bir x-ışını ışınlayıcısı kullanarak, hücreleri 150 gri gama ışını dozunda ışınlayın. Enjeksiyondan önce tripan mavisi boyama ile hücre canlılığını sayın ve kontrol edin.
Farelere, orijinal tümör implantasyonu ile aynı kanatta 50 mikrolitre soğuk PBS'de 1 milyon ışınlanmış B16-Flt3L hücresi ile intradermally enjekte edin. İlk hücre implantasyonundan sonraki 3, 6 ve 9. günlerde primer tümör bölgesinden yaklaşık bir santimetre. Aşı enjeksiyon bölgelerini birincil tümörden ayırt etmek için renkli bir kalemle işaretleyin.
Başlangıçta 50.000 B16-F10 hücresi implante edilmişse, aşı tedavisinin 8, 11 ve 14. günlerde yapılması önerilir. Tümörü her ötenazi fareden deri ile cerrahi olarak çıkardı ve 1 mililitre% 10 FBS RPMI 1640 orta ile 24 kuyucuklu bir plakaya koyun. Tümörleri iki mililitre sindirim tamponunda küçük parçalara ayırın ve 37 santigrat derecede 25 dakika boyunca inkübe edin.
Sindirimi durdurmak için 10 mililitre% 10 FBS RPMI 1640 orta ekleyin. 25 mililitrelik serolojik pipet kullanarak hücreleri 40 mikrometrelik bir hücre süzgecine aktarın. Daha sonra dokuları öğütmek için bir mililitrelik bir şırınganın pistonunu kullanın.
Hücreleri 500 RCF'de 4 santigrat derecede 5 dakika boyunca santrifüj edin. Pelet, 1x konsantrasyona seyreltilmiş PBS'de% 40 yoğunluk gradyanı spesifik ortamın 5 mililitresinde yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu, PBS içeren %80 yoğunluk gradyanı spesifik ortamın 5 mililitresinin üzerine yavaşça ekleyin.
Oda sıcaklığında 23 dakika boyunca düşük fren ayarı ile 325 RCF'deki hücrelere santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra, lökosit tabakasını arayüzde% 40 ila% 80 yoğunluk gradyanı spesifik ortam arasında dikkatlice toplayın ve 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin. Hücreleri 500 RCF'de 4 santigrat derecede 5 dakika boyunca santrifüj edin.
Pelet, oda sıcaklığında beş dakika boyunca iki mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponunda inkübe edin. Kuluçkadan sonra, RBC lizis tamponunu söndürmek için 10 mililitre% 10 FBS RPMI 1640 orta ekleyin. Hücreleri 400 RCF'de 4 santigrat derecede 5 dakika boyunca santrifüj edin.
Hücreleri 0.5 mililitre% 10 FBS RPMI 1640 ortamında yeniden askıya alın ve daha fazla analiz için kullanmadan önce toplam hücre sayısını sayın. Dalak veya drenaj lenf düğümlerini, akış sitometrisi analizi ile immün hücre alt kümelerinin geçit stratejisi için kontrol olarak toplayın. Metin makalesinde açıklanan hücre izolasyon yöntemini izleyin.
İmplante edilen B16-F10 hücrelerinin görünür siyah bir noktası genellikle tümör implantasyonundan yaklaşık üç gün sonra cilt yüzeyinde gözlenmiştir. Fareler, tümör nodülünün iki milimetre boyutuna ulaşmasından veya aşmasından üç, altı ve dokuz gün sonra bir tümör aşısı ile tedavi edildi. Tümör implantasyonundan yaklaşık iki hafta sonra aşılanmış fare grubunda önemli bir tümör büyümesi azalması gözlendi.
Lökosit tabakasından toplanan hücreler birçok tümör hücresi içeriyordu ve bu da lenfosit popülasyonunu kolayca tanımlamayı zorlaştırıyordu. Bu nedenle, akım sitometri analizinde intratümöral immün hücre alt gruplarının uygun geçişi için splenosit paralel olarak kullanıldı. CD103 pozitif, CD11C pozitif DC, CD8 pozitif, CD4 pozitif ve Treg'in geçiş stratejileri kompanzasyon matrisi ile birlikte çizildi.
Edinilen hesapların temsili verileri ve her popülasyonun sıklığı da sağlanmıştır. İntratümöral CD103 pozitif, aşılanmış farelerden CD11C pozitif DC, yardımcı uyarıcı ligand CD86'nın anlamlı derecede yüksek bir ekspresyonunu gösterdi. Aşılanmış fareler ayrıca CD8 pozitif ve CD4 pozitif, Foxp3 negatif hücrelere ve ayrıca CD8 pozitif granzim B pozitif ve interferon gama pozitif CTL'lere sızan tümörde bir artış gösterdi.
Primer tümör ve tümör aşısı arasında yeterli mesafeyi koruyun. Bu fiziksel ayrım, iki tümör implantı arasındaki potansiyel füzyonu önlemek için kritik öneme sahiptir.
