Bu araştırma NIH hibe SLB için GM055360 ve RGM için U54HD068157 tarafından desteklenmiştir. JMB Pennsylvania Üniversitesi (GM008216) de T32 Genetik Eğitim Grant tarafından desteklenmiştir.

STA-PUT protokol üç aşamadan oluşur: 1) cihaz ve reaktiflerin Set up, bütün testis hücre süspansiyonu 2) hazırlanması, ve 3) Hücre yükleme, sedimantasyon ve fraksiyon toplama. İki araştırmacı bir ekip tarafından gerçekleştirildiğinde, protokol ortalama sekiz saat sürer. 1.. STA-PUT Aparatı ayarlama (Şekil 1) Toplama bu yöntem tercih edilir *** STA-PUT aygıtı olup, bir 4 ° C büyük buzdolabı ya da bir kısım toplayıcısı kalabileceği soğuk bir odaya yerleştirilir. <ol><li> Önce (ya da en azından bir kaç saat önce), yöntemini gerçekleştirmek gece, tüm ekipman (özellikle cam ve boru) yıkayın ve% 70 etanol ile sterilize. Tam olarak Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, düzenek monte edilmeden önce ekipman kuru olsun. </li><li> İki 2 L silindiri (Şekil 1 B ve C) ve hücre yükleme odasının (edin <strong&gt; Şekil 1A) üst platforma ve boru kelepçeleri ile boru iki küçük parçalar ile tüm bağlayın. Kelepçe bütün tüpler kapalı. En sağdaki 2 L silindir üzerinde ağzı kapatılmalıdır. </li><li> Hücre yükleme odası içinde küçük bir karıştırma çubuğu (Şekil 1A) ve% 2 BSA içerir sol-en 2 L silindir daha büyük bir karıştırma çubuğu (Şekil 1 B) yerleştirin. </li><li> Platformu (Şekil 1D) 2 L sedimantasyon odasına yerleştirin. Doğrudan sedimantasyon odasının (Şekil 1D) altındaki açıklığın üstündeki metal bölmesini (Şekil 1F) yerleştirin. Bölme fraksiyon toplama sırasında hücre degrade sıvı ve bozulma vorteks engeller gibi bu önemlidir. Sedimantasyon odasının üst kapağı yerleştirin. </li><li> Üç yollu vana (Şekil 1G) buzlu cam eklemli vakum yağ çok az miktarda uygulandıktan sonra, se dibine musluğunu kelepçedimentation odası, vana ve sedimantasyon odasının buzlu cam eklem bağlantı. </li><li> Boru takımı ile birlikte vana doğru çıkışına hücre yükleme odası (Şekil 1A) takın. Musluğu kapatın. </li><li> Musluğu sol çıkışına hücre parçalanması boru takın. Fraksiyonlama boru açık olan ucuna bağlı bir cam Pasteur pipeti ile bir boru parçasını içerir. Daha küçük delik boru parçası cam pipet dar ucuna takılır. Dar pipet fraksiyon toplama sırasında hücre süspansiyonu akışını kısıtlar. Çok altındaki bu küçük tüp kelepçe. </li><li> 2 L Krebs hazırlayın (1x) deneyi (Tablo 1) gün tampon. Daha sonra, 1 x 550 ml Krebs 2% BSA, 1 x 550 ml Krebs% 4 BSA ve 1x Krebs 50 mi% 0.5 BSA hazırlar. Filtre edin ve 4 ° C&#39;ye kadar, bu çözüm soğuk </li><li> Doğru 2 L silindir (Şekil 1C) &#39;de% 4 BSA çözeltisi ve% 2 BSA dökünSol 2 L silindir (Şekil 1 B) çözelti. Emin bu silindirler bağlayan boru içinde hiçbir büyük baloncuklar olmadığından emin olun. </li><li> Bu degrade rahatsız olabilir gibi, hücre yükleme odasına Krebs tampon dökün ve emin hiçbir büyük kabarcıklar vardır yapma, sedimantasyon odasının bu odayı birbirine bağlayan boru doldurun. Sıkma veya boru flicking yavaşça kabarcıklarını çıkarmak için yardımcı olur. Krebs tampon her tüp içinde olup hücre odası içinde olduğundan emin olun. </li><li> Krebs tampon küçük bir miktar, sedimantasyon odasının içine akar ve daha sonra tüpün doldurulması ve herhangi bir büyük kabarcıklarını çıkarmak amacıyla hücre ayırma boru içine hemen hemen tüm tampon boşalmasına izin verin. </li><li> Doğrudan sedimantasyon odasının altında kısım toplayıcısı yerleştirin. Tüm fraksiyon tüpler yerdesiniz ve kirlenmesini önlemek için plastik örtü ile kaplı olduğundan emin olun. </li></ol> 2. Tüm Testislerin gelen spermatogenic Hücreleri Ayırma <ol&gt; <li> Ca 12 yetişkin farelerin (tercihen en az sekiz haftalık) ve oda sıcaklığında Krebs tampon yerinde herhangi bir kirlenmesine malzemeyi yıkayın Testisler ayır. Gösterilmediği Bu protokol laboratuvar farelerin kullanımını gerektirir ve Pennsylvania Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Üniversitesi kurallarına uygun idam edildi. </li><li> Eğer seminifer tübüller eklemek niyetinde hemen önce konik bir tüp içinde 50 ml Krebs tampon 45 mg kollajenaz ekleyin. Bu çözelti bir kaç dakika boyunca 33 ° C&#39;ye kadar ısınmasına izin vermeyin. Iki adet 50 ml konik tüpler içine eşit olarak bölünür. </li><li> Tunika albuginea atarak ve seminifer tübüller bırakmadan, 8 ml Krebs tampon içeren ayrı bir tabak içinde testisler açarlar. Tunika albuginea seminifer tübüller çevreleyen ince bir zardır. Tübüller kolayca tunika albuginea ayırmak gerekir. Bunu yapmak için, tunika albuginea bir kesi yapmak, bir pai ile bu membran tutunforseps r ve uzak forseps başka bir çift ile zardan dışarı tübüllerini itin. </li><li> Kolajenaz çözeltisi 25 ml içeren, her konik tüp tübülleri içeren 4 ml Krebs tamponu ilave edin ve 10 dakika boyunca 33 ° C &#39;de, çalkalama, inkübe edilir. Sonunda, tübüllerin bir &quot;spagetti-benzeri&quot; bir görünüme sahip olmalıdır. </li><li> Tübüller tüpün altına ~ 5 dakika boyunca çökmesine izin verilmektedir. Süpernatantı dökerek tübüller tüpün dibine her oturuşmaya bırakılmış, (oda sıcaklığında) 25 ml Krebs tampon maddesi içinde 2 x yıkayın. Her bir tüp içinde ~ 5 ml Krebs tamponu bırakın. </li><li> Yıkama, sen seminifer tübüller eklemek niyetinde hemen önce bir şahin tüp 50 ml Krebs tampon 30 mg tripsin eklemek iken. Bu çözelti bir kaç dakika boyunca 33 ° C&#39;ye kadar ısınmasına izin vermeyin. Iki adet 50 ml konik tüpler içine eşit olarak bölünür. </li><li> 25 ml tübülleri içeren iki tüpün her birine tripsin solüsyonu ekleyin. Hücre önlemek için her bir tüpe 3 ug DNAz (1 μg/10ml) eklemetopaklanma s. 10 dakika boyunca 33 ° C &#39;de, çalkayalarak kuluçkalayın. </li><li> Yaklaşık 10x ve onları pipetleme, tübüllerini içeren çözümü kışkırtmak için geniş bir delik pipet kullanın. Çözüm daha tek bir hücre süspansiyonu gibi aramaya başlamalıdır. </li><li> Ilave bir 10 dakika boyunca 33 ° C &#39;de, çalkayalarak kuluçkalayın. Yaklaşık 25x ve onları pipetleme, tek bir hücre süspansiyonu içine tübülleri dağıtmak için, geniş bir delik pipet kullanın. Hala tübüller veya hücre kümeleri çok görürseniz, pipet ile daha dağıtmak ve / veya her bir tüpe başka 3 ug DNAz (çift başlangıç ​​konsantrasyon) ekleyin. </li><li> Bir 100 um gözenekli bir hücre süzgecinden (30 mi hücre süspansiyonu her bir tüp için bir tane) ile tek bir hücre süspansiyonu filtre. Hücre süspansiyonları birleştirin ve hücrelerin toplam sayısı (8 ila 10 x 7-8 arası hücre olmalıdır) sayılır. *** Degrade üzerine FAZLA 800000000 hücreleri yüklemeyin. </li><li> Adım 2.10 &#39;de elde edilen hücre sayısı göre, appropr peletiate 5 dakika boyunca 450 RCF süzüldü hücre ve 30 ml Krebs tamponu ile yıkayın. Tekrarlayın. *** Genellikle 22 testisler daha 800.000.000 hücreleri verecektir, ancak bu hücre sayısından daha fazla yük yok. </li><li> Dikkatle kabarcıklar yaratmadan (hücre topaklanma derecesine bağlı olarak) DNAse ug 2.5 ile 5 içeren 25 mi% 0.5 BSA içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Hücreler kümelenir yok emin olun. 100 mikron gözenekli hücre süzgecinden tek bir hücre süspansiyonu filtre. Hücreler artık yüklemeye hazırız. Tüpü birkaç kez ters yüz edilerek yüklemeden önce iyice karıştırın. </li></ol> 3. Hücre Yükleme ve sedimantasyon <ol><li> Emin musluk kapalıdır, ancak sıvı, sedimantasyon odasının (Şekil 1D) içine hücre bölmesi (Şekil 1A) akmasını sağlayacak konumda yapın. </li><li> Düşük ayarda karıştırma çubukları sürekli hareket sağlamak için (yaklaşık 70 rpm) hem karıştırma çubuğu tabak kapatın, ama yavaş yavaş. </li><li> Hücre odası (Şekil 1A) içine hücre süspansiyonu dökün ve hücreler, 10 ml / dk (Şekil 1D) &#39;lik bir oranda, sedimantasyon odasının içine yavaş yavaş akması, böylece musluğunu açın. Musluğu kapatın. Akış hızı, sedimantasyon odasının üzerinde hacim aralıkları işaretleyerek belirlenebilir. </li><li> Hücre odasına% 0.5 BSA çözeltisi 5 ml dökün ve 10 ml / dak &#39;lık bir hızda, sedimantasyon odasının içine boşaltın. Musluğu kapatın. Bu adım, hücre odasından dışarı hücrelerini yıkar. 4x tekrarlayın. </li><li> Gradyan hazırlayın: hücre bölmesi (Şekil 1A) ve iki 2 L silindir (Şekil 1B, C) ​​arasındaki kelepçeler açın ve 40 ml / dk &#39;lık bir oranda (Şekil 1D) de sedimantasyon odasının içine sıvı drenaj başlar hemen. Bu sedimantasyon odasına BSA gradyanı yüklemek için yaklaşık 20-30 dakika sürer, böylece akış hızını ayarlayın. Üstüne yalan hücrelerin ince, rahatsız tabakaBSA degrade görünür olmalıdır. BSA en yüklendikten sonra, musluğunu kapatın ve sıvı ayırma tüpüne sedimantasyon odasından akmasını sağlayacak konuma çevirin. </li><li> Heyecan tabak kapatın. </li><li> Hücrelerin bir saat ve 45 dakika süre ile çöktürmek için izin verin. BU DÖNEMDE CİHAZI RAHATSIZ ETMEYİN. Herhangi bir mekanik ajitasyon degrade rahatsız olabilir. </li></ol> 4. Kesirler Fraksiyonu ve Analizi Eğer aşağıdaki adımları gerçekleştirmek gibi ***, degrade rahatsız etmemek için dikkatli olun. BSA degrade rahatsız edilirse, yordam çalışmaz! <ol><li> Hücreler çökeltilir sonra, yavaş yavaş 50 ml konik tüp içine sedimantasyon odasından 50 ml drenaj ve kenara. Bu fraksiyon genellikle hücreleri ve enkaz istenmeyen kümeleri içerir. </li><li> Fraksiyon toplayıcı için kesir tüp takın. *** Bu elle fraksiyonların toplanması da mümkündür, bir fraksiyon collector kullanılamaz. </li><li> Fraksiyonları toplamak: 10 ml (bir toplama tüpü doldurmak) her 45 san toplanır, böylece vana ile akış hızını ayarlayın. </li><li> Fraksiyon toplama tüpleri Cap ve 4 ° C&#39;de 450 RCF 5 dakika boyunca dönmeye , Yavaşça Süpernatantı dökün kalan sıvı süspansiyon hücrelerin, ve buz üzerinde hücre tutmak. </li><li> Tüm fraksiyonlar toplanır sonra, mikroskobik olarak farklı hücre popülasyonları için fraksiyonlar analiz. Farklı hücre tipleri, hücre boyutu ve nükleer morfolojisi 8,15 göre ayırt edilebilir. 2 (a) ve öz değişmesine ait somatik hücreleri ve spermatogonia için zenginleştirilmiş üç birleştirilmiş fraksiyonlardan için &quot;temsili sonuçlar&quot;, (b) yuvarlak spermatidler ve göstermektedir Şekil (c) uzatılması ve spermatidlerin yoğuşmalı. <ul><li> Bir spermatogonium Tip 12-14μm ca vardır. çapında ve kromatin kompozisyonunda homojen yuvarlak çekirdekleri var. </li><li> B Tipi spermatogonium 8-9μm ca vardır. çapı olan ve RounNükleer çevresi boyunca daha yoğun heterokromatine göstermek d çekirdekler. </li><li> Pre-leptoten spermatosit 7,5-8.2μm ca. çapı, B Tipi spermatogonia az sitoplazma ve B Tipi spermatogonyumlarda olanlara benzer çekirdekleri var. </li><li> Leptoten birincil spermatosit 8-10 mikron ca vardır. çapında ve ön leptoten spermatositlerin olanlara benzer, ancak nükleer membran daha yoğun kromatin kazanmak gibi çekirdekleri var. </li><li> Zigoten birincil spermatosit 10-12 mikron ca vardır. çaplı ve leptoten primer spermatositlerde kişilerce benzer çekirdeği vardır. </li><li> Pachytene spermatosit yerde 12-18 mikron ca vardır. çapı ve büyük bir çekirdeği çevreleyen sitoplazma ince bir kenar oluşur. Daha yoğun kromatin kümeleri çekirdeğinde görülebilir. </li><li> Yuvarlak Spermatidler 10 mikron ca vardır. çaplı ve ortasında bir yoğun-boyama chromocenter yuvarlak bir çekirdeği vardır. </li><li> Artıkorganları çapı 6.5 mikron, yuvarlak ve çekirdeği eksikliği ~ vardır. </li><li> Uzatma ve yoğuşmalı Spermatidler spermatidlerin yuvarlak boyutu benzer, ancak benzersiz, orak şeklinde çekirdek var. </li></ul><ol><li> Fraksiyonu 15 ile başlayın ve 85 kadar her beş kesirler analiz. Genellikle, altı 15 fraksiyonlar çok karışık ve clumpy olacak ve 85 yukarıda parçacıklar herhangi bir kullanılabilir hücrelere az içerir. </li><li> Fraksiyon toplama tüpü (hücreler, santrifüj işleminden sonra yeniden süspansiyon haline getirilmiş edilmiş bir defa) sıvının 5ul almak ve Krebs tamponu içinde% 8 formaldehit 5ul eklemek, bir fraksiyon analiz etmek. Sabit Hücreler, beş dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. </li><li> Sabit hücreleri% 0.1 Triton ve DAPI (5 μ / ml Krebs tampon) 5ul ekleyin. Hücreler, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. </li><li> , Bir slayt üzerine elde edilen solüsyon 10 ul koyun örtücü bir kılıfla kapak ve her bir fraksiyonun saflığı belirlemek için flöresanlı bir mikroskop ile analiz edin. </li><li> Mayotik ve somatik hücreler diploid, yuvarlak spermatidlerin ve uzatma / yoğuşmalı spermatidlerin: boyutu ve nükleer morfoloji benzer hücrelerin aşağıdaki popülasyonları oluşturmak için (&quot;Temsilci Sonuçları&quot; bakın) kesirler birleştirin. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wistuba, J., Stukenborg, J., Luetjens, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Spermatogenesis.">Mammalian Spermatogenesis.</a> Funct. Dev. Embryol. 1, 99-117 (2007).</li><li>Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+the+regulation+of+the+spermatogonial+stem+cell+niche.">Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche.</a> Cell Cycle. 5, 1164-1170 (2006).</li><li>Dores, C., Alpaugh, W., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+in+vitro+culture+to+in+vivo+models+to+study+testis+development+and+spermatogenesis.">From in vitro culture to in vivo models to study testis development and spermatogenesis.</a> Cell Tissue Res. 349, 691-702 (2012).</li><li>Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+mouse+germ+cell+specification+pathway+in+culture+by+pluripotent+stem+cells.">Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells.</a> Cell. 146, 519-532 (2011).</li><li>Easley, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+haploid+spermatogenic+cells.">Direct differentiation of human pluripotent stem cells into haploid spermatogenic cells.</a> Cell Rep. 2, 440-446 (2012).</li><li>Bellve, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+culture,+and+fractionation+of+spermatogenic+cells.">Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).</li><li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation.">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li><li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.+A+morphological+characterization.">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization.</a> Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).</li><li>Miller, R. G., Phillips, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+cells+by+velocity+sedimentation.">Separation of cells by velocity sedimentation.</a> J. Cell Physiol. 73, 191-201 (1969).</li><li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis.">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65, 40-49 (2005).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).</li><li>Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+elutriation:+separation+of+spermatogenic+cells+on+the+basis+of+sedimentation+velocity.">Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity.</a> J. Cell Physiol. 86, 177-189 (1975).</li><li>Meistrich, M. L., Trostle, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+testis+cells+by+equilibrium+density+centrifugation+in+renografin+gradients.">Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients.</a> Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).</li><li>Gassei, K., Ehmcke, J., Schlatt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+enrichment+of+undifferentiated+GFR+alpha+1++spermatogonia+from+immature+rat+testis+by+magnetic+activated+cell+sorting.">Efficient enrichment of undifferentiated GFR alpha 1+ spermatogonia from immature rat testis by magnetic activated cell sorting.</a> Cell Tissue Res. 337, 177-183 (2009).</li><li>Bellve, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenic+cells+of+the+prepuberal+mouse.+Isolation+and+morphological+characterization.">Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization.</a> J. Cell Biol. 74, 68-85 (1977).</li><li>Handel, M. A., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mammalian+meiosis:+regulation,+dynamics+and+impact+on+fertility.">Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 124-136 (2010).</li><li>Zhao, M., Shirley, C. R., Mounsey, S., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoprotein+transitions+during+spermiogenesis+in+mice+with+transition+nuclear+protein+Tnp1+and+Tnp2+mutations.">Nucleoprotein transitions during spermiogenesis in mice with transition nuclear protein Tnp1 and Tnp2 mutations.</a> Biol. Reprod. 71, 1016-1025 (2004).</li><li>Manku, G., Mazer, M., Culty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+testicular+gonocytes+isolation+and+processing+for+immunocytochemical+analysis.">Neonatal testicular gonocytes isolation and processing for immunocytochemical analysis.</a> Methods Mol. Biol. 825, 17-29 (2012).</li><li>Dehnugara, T., Dhar, S., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro,+short-term+culture+method+for+mammalian+haploid+round+spermatids+amenable+for+molecular+manipulation.">An in vitro, short-term culture method for mammalian haploid round spermatids amenable for molecular manipulation.</a> Mol. Reprod. Dev. 79, 19-30 (1002).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim. Gösterilmediği Bu protokol laboratuvar farelerin kullanımını içerir ve tüm ilgili kurallar, düzenlemeler ve düzenleyici kurumlar ile uyum içinde idam edildi. Bu protokolde kullanılan Hayvanlar Pennsylvania Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Üniversitesi (IACUC protokolü # 804284) rehberliği ve onayı altında tutulur.

Güvenilir bir hücre kültür sistemi henüz tüm spermatogenik hücre tiplerini 3 üretmek için yok gibi spermetogenez çalışma yapanlar, spermatojenik hücre örnekleri için hayvan modellerinde güveniyor. Spermatojenik hücreleri kolayca bütün testis toplanan rağmen, sadece karışık bir nüfus sonuçlanır. Bu tür mayotik hücreleri, yuvarlak spermatidler ve yoğuşmalı spermatidler gibi bu hücrelerin belirli alt tipleri, incelemek isteyenler için bir sorun teşkil etmektedir. Üç farklı y?...

Memeli spermatogenezis testislerin 1 seminifer tübüllerde çeşitli aşamalardan oluşan karmaşık bir farklılaşma süreçtir. Kısaca, seminifer tübül bölünmenin epiteli yakınında ikamet spermatogonium gibi-kök ve daha sonra mayozdaki bölünmeler geçmesi spermatositlerin, içine ayırt. Mayoz tamamlandıktan sonra, elde edilen haploid hücreleri ya da yuvarlak spermatid, Spermiyogenez, sitoplazma ile çekirdek kompaksiyon saçılmasını içeren bir farklılaşma sürecine tabi tutulur. Spermatidlere yavaş yavaş, sırasıyla, bir kamçılı geliştirmek ve çekirdeğin uzamasını ve yoğunlaşmasını geçmesi, uzatma ve ardından yoğuşmalı spermatidlerin üreten. Son ürünler seminiferous tübül ve sonuçta daha olgun epididimis lümeni içine salınır spermatozoa vardır. Spermatogenez süreci içinde özel hormonal ve moleküler koşullarına dayandığındantestisler, spermatogenez tüm süreç için güvenilir bir in vitro kültür sistemi henüz 2,3 geliştirilmiş değil. Kültür yöntemleri kök hücrelerden &quot;primordial germ hücresi benzeri hücreler&quot; ve haploid, &quot;yuvarlak spermatid-benzeri hücreler&quot; oluşturmak için geliştirilmiştir, ancak bu yöntemler henüz bu hücrelerin çok sayıda oluşturmak ve daha sonra spermatogenetik hücre üretmek için başarısız mümkün değildir türleri 4,5. Neyse ki, spermatojenik hücre tipleri, bir sıvı gradyanı ile ayrılması için bütün testisler elde edilen tek bir hücre süspansiyonu için izin veren, boyut olarak önemli ölçüde farklıdır. STA-PUT yöntemi, burada gösterdiği, büyüklüğü ve kitle 6-9 dayalı spermatojenik hücreleri ayırmak için bir doğrusal BSA degrade ve basit sedimantasyon kullanır. FACS ve sivili ayrıştırma 10-13: STA-PUT yöntem spermatojenik hücre tipleri ayırmak için diğer iki en yaygın olarak kullanılan yöntemlere göre bazı avantajları vardır. STA-PUT aparatı onl gerektirirözel cam y birkaç adet soğuk oda veya büyük buzdolabı monte. Bu nedenle, bir hücre ayırıcıyla ya da elutriatörü kullanarak daha az pahalıdır. Her bir hücre popülasyonunun saflığı FACS 11 ile elde edilen kadar yüksek olmasa da STA-PUT yöntem olup, hücre tipi ve karşılaştırılabilir bir zaman dilimi içinde FACS ile sıralanabilir daha testis başına hücre yüksek miktarda elde edilir. Hücre (manyetik aktif hücre sıralama, MACS) son zamanlarda başarılı bir karma testiküler hücre nüfus spermatogonyumlarda zenginleştirilmesi için istihdam edildiğini, ancak 14 işaretleyicileri uygun yüzeyinin bilgi eksikliği nedeniyle spermatositlerin veya spermatidlerin ayırmak için şu anda uygun olan manyetik boncuklar kullanarak sıralama. FACS ya da MACS fazla STA-PUT yönteminin ilave bir avantajı, FACS protokolleri aksine, herhangi bir DNA ya da boyama diğer türleri gerektirmez, çünkü daha sonra kültür için uygun olan canlı hücreleri izole etmek için yeteneğidir. L gerekli çalışmalar içinSpermatogenik hücreleri türleri arge verimleri ~% 90 saflıkta, STA-PUT ideal bir yöntemdir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="856">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">BSA</td>
			<td style="width:109px;">Affymetrix/USB</td>
			<td style="width:255px;">10857 100MG</td>
			<td style="width:183px;">Alternate can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:311px;">0.5%, 2%, and 4% BSA solutions</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively).</td>
			<td style="width:183px;">To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr height="91">
			<td height="91" style="height:91px;width:311px;">KREBS (10x)</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20</td>
			<td style="width:183px;">Autoclave/filter and store at 4 &#176;C for several months.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:311px;">KREBS (1x)</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20.</td>
			<td style="width:183px;">To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">Collagenase</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">C9891-1G</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">DNAse</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">DNEP-5MG</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">Trypsin</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">T9201-1G</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">DAPI</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Triton-X100</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Formaldehyde (~37%)</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">TABLE 2: EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Equipment</td>
			<td style="width:109px;">Company</td>
			<td style="width:255px;">Catalog #</td>
			<td style="width:183px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:311px;">Complete STA-PUT apparatus</td>
			<td style="width:109px;">ProScience Glass Shop</td>
			<td style="width:255px;">STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500)</td>
			<td style="width:183px;">Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">10 &#956;m mesh filter</td>
			<td style="width:109px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:255px;">22363549</td>
			<td style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Mouse dissection tools</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:311px;">14 ml round bottom fraction collection tubes with caps</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:547px;">Need approximately 100 tubes</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:311px;">Fraction collector</td>
			<td style="width:109px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:255px;">Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40</td>
			<td style="width:183px;">Alternate can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Microscope slides, cover glass</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Light/Fluorescent Microscope</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of spermatogenic cell types using sta-put velocity sedimentation

Memeli spermatogenezis testislerin seminifer tübüllerde çeşitli aşamalardan oluşan karmaşık bir farklılaşma süreçtir. Şu anda, in vitro spermatojenik farklılaşması için izin veren güvenilir bir hücre kültür sistemi olup, spermatojenik hücrelerin çoğunun biyolojik çalışmalar, fare ve sıçan gibi hayvan modellerinde doku hasat gerektirir. Non-spermatojenik (Leydig, sertoli, miyeloid ve epitel hücreleri) ve spermatogenetik hem (spermatogonium spermatositler, yuvarlak spermatidlerin, spermatidlerin ve sperm yoğuşmalı) - - testis sayıda hücre tiplerini içerir çünkü spermatogenezde katılan biyolojik mekanizmaların çalışmalar izolasyonu gerektiren ve bu farklı hücre tiplerinin zenginleştirme. Bu durumda, testis - - lineer gradyan BSA ile STA-PUT yöntem hücre heterojen bir popülasyonunun ayrılması sağlar. Bireysel hücre tipleri ce göre farklı çökelme hızı ile tortull büyüklüğü ve farklı hücre tipleri için zenginleştirilmiş fraksiyonlar toplanmış ve daha fazla analizlerde kullanılabilir. STA-PUT yöntem, belirli hücre ayırma yöntemleri ile elde edilebilir, örneğin hücre tipleri son derece saf fraksiyonları, neden etmese de, bu, her bir parça halinde toplam hücrelerin çok daha yüksek bir verim sağlamaktadır (7-8 x 10 8, bir başlangıç ​​hücre popülasyonundan ~ 1 x 10 8 hücre / spermatojenik hücre tipi). Bu yüksek verim yöntem yalnızca uzman cam gerektirir ve bir floresan aktif hücre ayırıcı (FACS) veya elutriatörü gibi özel ekipmana sınırlı erişimi laboratuarları için ideal bir yöntem yapma, herhangi bir soğuk oda veya büyük buzdolabı yapılabilir.

STA-PUT prosedür ideal bir sonuç hücre boyutu ve yoğunluğuna bağlı olarak testis hücrelerinin oldukça fark ayrılıktır. Testis izole hücreler BSA gradyanı ile çöktürülmesi olsa da, hücrelerin birkaç farklı bantları gözlenebilir. Hücrelerin herhangi kümeleri degrade dibine çöker ve diğer fraksiyonların kontamine olmaz eğilimindedir. Biraz daha degrade kadar büyük somatik ve mayozdaki hücreler olacaktır. Uzak degrade kadar hala küçük yuvarlak Spermatidler olacaktır. Degrade üst sperma...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation at JoVE.com

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

STA-PUT yöntem büyüklüğü ve yoğunluğuna bağlı olarak spermatojenik farklı hücre popülasyonlarının ayrılması sağlar.

STA-PUT Hız Sedimentasyon kullanma spermatogenic Hücre Tiplerinin Ayrılması

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

separation-spermatogenic-cell-types-using-sta-put-velocity

Research

JoVE Journal

Biology

25.5K Görüntüleme.  University of Pennsylvania.  STA-PUT yöntem büyüklüğü ve yoğunluğuna bağlı olarak spermatojenik farklı hücre popülasyonlarının ayrılması sağlar. 

Video: Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

Nöronlar FM Etiketleme kullanarak ölçüm ekzositoz

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Biyoloji

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Aktin Co-Sedimantasyon Testi; F-Aktin Bağlayıcı Protein Analizi

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Proteinlerin Elektrogöçer Ayırma

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and genetics because of its simple life cycle, ease of growth and manipulation for genetic analysis, genomic resources, and transformability of the nucleus and both organelles. Mating strains is a common practice when genetic approaches are used in Chlamydomonass, to create vegetative diploids for analysis of dominance, or following tetrad dissection to ascertain nuclear vs. organellar inheritance, to test allelism, to analyze epistasy, or to generate populations for the purpose of map-based cloning. Additionally, genetic crosses are routinely used to combine organellar genotypes with particular nuclear genotypes. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad separation. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas. Key parameters and trouble spots are explained. Finally, resources for further information and alternative methods are provided.

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and tetrad separation are required for genetic analysis in Chlamydomonas reinhardtii. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad dissection. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas.

Çiftleşme ve tetrad Ayırma Chlamydomonas reinhardtii Genetik Analiz

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension and microscopically visualize sperm accumulation around the pipette1. Sperm chemoattraction in vertebrates such as frogs, rodents and humans is more difficult to detect and requires quantitative assays. Such assays are of two major types - assays that quantitate sperm movement to a source of chemoattractant, so-called sperm accumulation assays, and assays that actually track the swimming trajectories of individual sperm.
Sperm accumulation assays are relatively rapid allowing tens or hundreds of assays to be done in a single day, thereby allowing dose response curves and time courses to be carried out relatively rapidly. These types of assays have been used extensively to characterize many well established chemoattraction systems - for example, neutrophil chemotaxis to bacterial peptides and sperm chemotaxis to follicular fluid. Sperm tracking assays can be more labor intensive but offer additional data on how chemoattractancts actually alter the swimming paths that sperm take. This type of assay is needed to demonstrate the orientation of sperm movement relative to the chemoattrractant gradient axis and to visualize characteristic turns or changes in orientation that bring the sperm closer to the egg.
Here we describe methods used for each of these two types of assays. The sperm accumulation assay utilized is called a "two-chamber" assay. Amphibian sperm are placed in a tissue culture plate insert with a polycarbonate filter floor having 12 &mu;m diameter pores. Inserts with sperm are placed into tissue culture plate wells containing buffer and a chemoatttractant carefully pipetted into the bottom well where the floor meets the wall (see Fig. 1). After incubation, the top insert containing the sperm reservoir is carefully removed, and sperm in the bottom chamber that have passed through the membrane are removed, pelleted and then counted by hemocytometer or flow cytometer.
The sperm tracking assay utilizes a Zigmond chamber originally developed for observing neutrophil chemotaxis and modified for observation of sperm by Giojalas and coworkers2,3. The chamber consists of a thick glass slide into which two vertical troughs have been machined. These are separated by a 1 mm wide observation platform. After application of a cover glass, sperm are loaded into one trough, the chemoattractant agent into the other and movement of individual sperm visualized by video microscopy. Video footage is then analyzed using software to identify two-dimensional cell movements in the x-y plane as a function of time (xyt data sets) that form the trajectory of each sperm.

Eggs and the extracellular coatings around eggs frequently release peptides, proteins and small molecules that communicate with sperm to guide them to the egg thereby promoting fertilization. Using frog sperm we describe and compare two classes of assays used to detect sperm chemoattraction &#x2013; sperm accumulation assays and sperm tracking assays.

İki Kurbağa Sperm Chemoattraction saptamak için Tahliller Türleri

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from the seaweed genera Gelidium and Gracilaria, and consists of repeated agarobiose (L- and D-galactose) subunits2. During gelation, agarose polymers associate non-covalently and form a network of bundles whose pore sizes determine a gel&#39;s molecular sieving properties. The use of agarose gel electrophoresis revolutionized the separation of DNA. Prior to the adoption of agarose gels, DNA was primarily separated using sucrose density gradient centrifugation, which only provided an approximation of size. To separate DNA using agarose gel electrophoresis, the DNA is loaded into pre-cast wells in the gel and a current applied. The phosphate backbone of the DNA (and RNA) molecule is negatively charged, therefore when placed in an electric field, DNA fragments will migrate to the positively charged anode. Because DNA has a uniform mass/charge ratio, DNA molecules are separated by size within an agarose gel in a pattern such that the distance traveled is inversely proportional to the log of its molecular weight3. The leading model for DNA movement through an agarose gel is &#34;biased reptation&#34;, whereby the leading edge moves forward and pulls the rest of the molecule along4. The rate of migration of a DNA molecule through a gel is determined by the following: 1) size of DNA molecule; 2) agarose concentration; 3) DNA conformation5; 4) voltage applied, 5) presence of ethidium bromide, 6) type of agarose and 7) electrophoresis buffer. After separation, the DNA molecules can be visualized under uv light after staining with an appropriate dye. By following this protocol, students should be able to: 
 
1. Understand the mechanism by which DNA fragments are separated within a gel matrix 
2. Understand how conformation of the DNA molecule will determine its mobility through a gel matrix 
3. Identify an agarose solution of appropriate concentration for their needs 
4. Prepare an agarose gel for electrophoresis of DNA samples 
5. Set up the gel electrophoresis apparatus and power supply 
6. Select an appropriate voltage for the separation of DNA fragments 
7. Understand the mechanism by which ethidium bromide allows for the visualization of DNA bands 
8. Determine the sizes of separated DNA fragments 
&#160;

A basic protocol for the separation of DNA fragments using agarose gel electrophoresis is described.

DNA kırıntıları Ayrılma Agaroz Jel Elektroforezi

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of protein-bound DNA and aligning the short reads to a reference genome. Enriched regions are revealed as peaks, which often differ dramatically in shape, depending on the target protein1. For example, transcription factors often bind in a site- and sequence-specific manner and tend to produce punctate peaks, while histone modifications are more pervasive and are characterized by broad, diffuse islands of enrichment2. Reliably identifying these regions was the focus of our work.
Algorithms for analyzing ChIPseq data have employed various methodologies, from heuristics3-5 to more rigorous statistical models, e.g. Hidden Markov Models (HMMs)6-8. We sought a solution that minimized the necessity for difficult-to-define, ad hoc parameters that often compromise resolution and lessen the intuitive usability of the tool. With respect to HMM-based methods, we aimed to curtail parameter estimation procedures and simple, finite state classifications that are often utilized.
Additionally, conventional ChIPseq data analysis involves categorization of the expected read density profiles as either punctate or diffuse followed by subsequent application of the appropriate tool. We further aimed to replace the need for these two distinct models with a single, more versatile model, which can capably address the entire spectrum of data types.
To meet these objectives, we first constructed a statistical framework that naturally modeled ChIPseq data structures using a cutting edge advance in HMMs9, which utilizes only explicit formulas-an innovation crucial to its performance advantages. More sophisticated then heuristic models, our HMM accommodates infinite hidden states through a Bayesian model. We applied it to identifying reasonable change points in read density, which further define segments of enrichment. Our analysis revealed how our Bayesian Change Point (BCP) algorithm had a reduced computational complexity-evidenced by an abridged run time and memory footprint. The BCP algorithm was successfully applied to both punctate peak and diffuse island identification with robust accuracy and limited user-defined parameters. This illustrated both its versatility and ease of use. Consequently, we believe it can be implemented readily across broad ranges of data types and end users in a manner that is easily compared and contrasted, making it a great tool for ChIPseq data analysis that can aid in collaboration and corroboration between research groups. Here, we demonstrate the application of BCP to existing transcription factor10,11 and epigenetic data12 to illustrate its usefulness.

Our Bayesian Change Point (BCP) algorithm builds on state-of-the-art advances in modeling change-points via Hidden Markov Models and applies them to chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIPseq) data analysis. BCP performs well in both broad and punctate data types, but excels in accurately identifying robust, reproducible islands of diffuse histone enrichment.

Çeşitli ChIPseq Veri Türleri Genom çapında Analizi İçin Yeni Bir Bayesian değiştir nokta Algoritması

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Orofacial clefts are the most frequent craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal facial development3. In human and mouse, initial growth and patterning of the face relies on several small buds of tissue, the facial prominences4,5. The face is derived from six main prominences: paired frontal nasal processes (FNP), maxillary prominences (MxP) and mandibular prominences (MdP). These prominences consist of swellings of mesenchyme that are encased in an overlying epithelium. Studies in multiple species have shown that signaling crosstalk between facial ectoderm and mesenchyme is critical for shaping the face6. Yet, mechanistic details concerning the genes involved in these signaling relays are lacking. One way to gain a comprehensive understanding of gene expression, transcription factor binding, and chromatin marks associated with the developing facial ectoderm and mesenchyme is to isolate and characterize the separated tissue compartments.
Here we present a method for separating facial ectoderm and mesenchyme at embryonic day (E) 10.5, a critical developmental stage in mouse facial formation that precedes fusion of the prominences. Our method is adapted from the approach we have previously used for dissecting facial prominences7. In this earlier study we had employed inbred C57BL/6 mice as this strain has become a standard for genetics, genomics and facial morphology8. Here, though, due to the more limited quantities of tissue available, we have utilized the outbred CD-1 strain that is cheaper to purchase, more robust for husbandry, and tending to produce more embryos (12-18) per litter than any inbred mouse strain8. Following embryo isolation, neutral protease Dispase II was used to treat the whole embryo. Then, the facial prominences were dissected out, and the facial ectoderm was separated from the mesenchyme. This method keeps both the facial ectoderm and mesenchyme intact. The samples obtained using this methodology can be used for techniques including protein detection, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, microarray studies, and RNA-seq.

A protocol for separation of embryo facial ectoderm and mesenchyme is described. We use Dispase II to treat whole embryos first, dissect whole facial prominences out, and then separate the facial ectoderm and mesenchyme.

Fare Embriyonik Yüz Ektoderm ve mesenchyme ayrılması

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

Bireysel Hücre Tiplerinin transkripsiyonel Profiling için bir alet olarak lazer destekli mikrodiseksiyon (LAM)

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical proteins, such as antibodies, vaccine candidates and enzymes. These must be purified from the plant biomass but chromatography steps are hindered by the high concentrations of host cell proteins (HCPs) in plant extracts. However, most HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C facilitating subsequent purification of the target protein. Here, three methods are presented to achieve the heat precipitation of tobacco HCPs in either intact leaves or extracts. The blanching of intact leaves can easily be incorporated into existing processes but may have a negative impact on subsequent filtration steps. The opposite is true for heat precipitation of leaf extracts in a stirred vessel, which can improve the performance of downstream operations albeit with major changes in process equipment design, such as homogenizer geometry. Finally, a heat exchanger setup is well characterized in terms of heat transfer conditions and easy to scale, but cleaning can be difficult and there may be a negative impact on filter capacity. The design-of-experiments approach can be used to identify the most relevant process parameters affecting HCP removal and product recovery. This facilitates the application of each method in other expression platforms and the identification of the most suitable method for a given purification strategy.

Three heat precipitation methods are presented that effectively remove more than 90% of host cell proteins (HCPs) from tobacco extracts prior to any other purification step. The plant HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C.

Bozulmamış Bitkiler Ağartma veya Ekstraktlarının Isıl İşlem tarafından Tütün Ana Hücre Proteini Temizleme Yöntemlerinin Karşılaştırılması

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...