מחקר זה נתמך על ידי GM055360 NIH מענקים לSLB וU54HD068157 לRGM. JMB נתמכה על ידי T32 הגנטיקה הדרכה גרנט באוניברסיטת פנסילבניה (GM008216).

פרוטוקול STA-PUT כרוך בשלושה שלבים: 1) הגדרה של המנגנון וחומרים כימיים, 2) הכנה של השעיה תא מכל אשכים, ו3) טעינה סלולרי, שקיעה, ואיסוף שברים. כאשר היא מבוצעת על ידי צוות של שני חוקרים, הפרוטוקול לוקח שמונה שעות בממוצע. 1. הקמת מנגנון STA-PUT (איור 1) *** מנגנון STA-PUT צריך להיות ממוקם במקרר גדול 4 ° C או חדר קר שיכול גם להכיל אספן שבריר, אם שיטה זו של אוסף היא מועדפת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלילה שלפני (או לפחות כמה שעות לפני) שתבצע את השיטה, לשטוף את כל הציוד (בעיקר כלי הזכוכית וצינורות) ולחטא עם 70% אתנול. בואו יבש ציוד לחלוטין לפני הרכבת המנגנון כפי שמודגם באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Secure שני צילינדרי 2 ליטר (איורים 1B ו-C) ותא העמסת תא ( <strאונג&gt; איור 1 א) לפלטפורמה העליונה ולחבר את כל עם שתי חתיכות קטנות של צינורות עם מהדק צינור. הצמידו כל הצינורות סגורים. חותם את הזרבובית על גליל L ​​ימני ביותר 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח בר קטן ומערבבים בתא טעינת תא (איור 1 א), ובר גדול ומערבבים בצילינדר L 2 השמאלי ביותר (איור 1) שיכיל BSA 2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את תא שקיעת 2 L על הפלטפורמה (1D איור). הנח לבלבל המתכת (איור 1F) ישירות על גבי הפתח בחלק התחתון של חדר השיקוע (1D איור). זה הוא קריטי, שכן לבלבל מונע vortexing של הנוזל ושיבוש של שיפוע התא במהלך איסוף שברים. מניחים את המכסה על החלק העליון של חדר שקיעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מריחת כמות קטנה מאוד של שומן ואקום למפרק זכוכית קרקע של הסתום המשולש (איור 1G), מהדק את ברזלים לעומקו של seקאמרי dimentation, המחבר את מפרקי זכוכית קרקע של ברזלים וחדר שקיעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את התא לתא טעינה (איור 1 א) אל השקע הימני של ברזלים עם צינורות. סגור את ברזלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את צינורות חלוקה התא לשקע שמאל של ברזלים. צינורות חלוקה כוללים חתיכת הצינור עם זכוכית פיפטה פסטר מחוברת לסוף הפתוח. חתיכת צינור שעמם קטן יותר מחוברת לקצה הצר של פיפטה מזכוכית. פיפטה הצרה מגבילה את הזרימה של ההשעיה התא באיסוף שברים. הצמד הצינור הקטן הזה בתחתית מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין 2 L קרבס (1x) חיץ היום של הניסוי (טבלת 1). לאחר מכן, להכין 550 BSA מיליליטר 2% ב1x קרבס, 550 מיליליטר BSA 4% ב1x קרבס, וארגון ה-BSA 50 מיליליטר 0.5% ב1x קרבס. לסנן ולצנן את הפתרונים הללו ל4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את פתרון 4% BSA בצילינדר תקין 2 L (איור 1 ג) וBSA 2%פתרון בצילינדר L 2 שמאלה (איור 1). ודא שאין בועות גדולות בצינור שמחבר את הגלילים אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים חיץ קרבס לתוך תא טעינת תא ולמלא את צינורות המחברים חדר זה עם חדר שקיעה, כדי לוודא שאין בועות גדולות, כמו אלה יכולים להפריע לשיפוע. לוחץ או מצליף את הצינור בעדינות מסייע להסיר את הבועות. ודא שכל של חיץ קרבס הוא בצינור ולא בתא התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר כמות קטנה של חיץ קרבס לזרום לתוך תא השיקוע ולאחר מכן לנקז כמעט את כל החיץ לתוך צינורות חלוקה תא כדי למלא את הצינור ולהסיר את כל בועות גדולות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את אספן שבריר ישירות תחת קאמרי שקיעה. ודא שכל צינורות שבריר נמצאים במקום ומכוסה בניילון הנצמד, כדי למנוע זיהום. </li></ol> 2. בידוד תאי Spermatogenic מאשכים שלמים <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח אשכים מca 12 עכברים בוגרים (רצוי לפחות שמונה שבועות) ומקום בחיץ קרבס בטמפרטורת חדר כדי לשטוף את כל חומר מזהם. פרוטוקול זה שמפגינים כרוך בשימוש בעכברי מעבדה והוצא להורג בעמידה בקווים המנחים של אוניברסיטת הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש בפנסילבניה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 45 collagenase מ&quot;ג למיליליטר 50 חיץ קרבס בצינור חרוטי ממש לפני שאתה מתכוון להוסיף tubules seminiferous. פתרון זה יאפשר לחום עד 33 מעלות צלזיוס במשך כמה דקות. לפצל באופן שווה לשני צינורות 50 חרוטי מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Decapsulate האשכים בצלחת נפרדת המכילה 8 מיליליטר חיץ קרבס, השלכת albuginea Tunica ושחרור tubules seminiferous. Albuginea Tunica הוא הקרום הדק המקיף את tubules seminiferous. Tubules צריך בקלות להתנתק מalbuginea Tunica. כדי לעשות זאת, עושה חתך בalbuginea Tunica, החזק הקרום הזה עם פאיr של מלקחיים, ולדחוף את tubules מתוך ומחוץ לקרום עם זוג נוסף של מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 מיליליטר חיץ קרבס מכיל את הצינוריות לכל צינור חרוטי המכיל 25 מיליליטר של תמיסת collagenase ודגירה, רועד, ב33 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בסוף, צריך להיות לי tubules מראה &quot;דמוי ספגטי&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר tubules להסתפק ~ 5 דקות לחלק התחתון של הצינור. יוצקים את supernatant ולשטוף 2x ב25 מיליליטר חיץ קרבס (בטמפרטורת חדר), המאפשר tubules להתיישב לחלק התחתון של הצינור בכל פעם. השאר ~ 5 מיליליטר חיץ קרבס בצינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד כביסה, להוסיף 30 טריפסין מ&quot;ג למ&quot;ל 50 חיץ קרבס בצינור בז ממש לפני שאתה מתכוון להוסיף tubules seminiferous. פתרון זה יאפשר לחום עד 33 מעלות צלזיוס במשך כמה דקות. לפצל באופן שווה לשני צינורות 50 חרוטי מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 מיליליטר פתרון טריפסין לכל אחד משני הצינורות המכילים את הצינוריות. הוסף 3 DNAse מיקרוגרם (μg/10ml 1) על צינור אחד כדי למנוע תאים מהתקבצות. דגירה, טלטולים, ב-C ° 33 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה שעם רחבה כדי להתסיס את התמיסה המכילה צינוריות, pipetting אותם פנימה והחוצה כ 10x. הפתרון צריך להתחיל להיראות יותר כמו השעיה תא בודדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה, רועד, ב33 מעלות צלזיוס במשך נוספת 10 דקות. השתמש פיפטה שעם רחבה לפזר את הצינוריות לתוך השעיה תא בודדת, pipetting אותם פנימה והחוצה כ 25x. אם אתה עדיין רואה הרבה צינוריות או גושי תא, לפזר יותר עם פיפטה ו / או להוסיף עוד DNAse 3 מיקרוגרם לצינור אחד (ריכוז כפול ראשוני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את ההשעיה התא בודדת דרך מסננת תא רשת 100 מיקרומטר (אחד לכל שפופרת של 30 השעיה תא מיליליטר). מערבבים את השעיות התא ולספור את המספר הכולל של תאים (צריך להיות בין 7-8 x 10 8 תאים). *** אין לטעון יותר מ 800,000,000 תאים על גבי השיפוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתבסס על ספירת התאים שהושגה בשלב 2.10, גלולה approprנפח iate של תאים מסוננים ב450 RCF למשך 5 דקות ולשטוף עם 30 מיליליטר חיץ קרבס. חזור על פעולה. בדרך כלל *** 22 אשכים יניבו יותר מ 800,000,000 תאים, אבל לא להעמיס יותר ממספר זה של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend תאים בזהירות ב25 BSA 0.5% מיליליטר מכיל בין 2.5 ו5 מיקרוגרם DNAse (תלוי במידת התקבצות תא) מבלי ליצור בועות. ודא שתאים לא גוש. סנן את ההשעיה התא בודדת דרך מסננת תא רשת 100 מיקרומטר. התאים מוכנים לטעון עכשיו. מערבבים היטב לפני הטעינה על ידי צינור היפוך כמה פעמים. </li></ol> 3. טוען תא ושקיעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי ברזלים סגור, אבל במצב שיאפשר לי נוזל לזרום מהתא לתא (איור 1 א) לתוך תא השיקוע (1D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את שני צלחות בר ומערבב להגדרה נמוכה (כ 70 סל&quot;ד) על מנת לאפשר לברים ומערבבים לנוע ברציפות, אבל לאט לאט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את ההשעיה התא לתוך תא התא (איור 1 א) ולפתוח את ברזלים כך שהתאים לזרום באיטיות אל תוך חדר שקיעה בשיעור של 10 מיליליטר / דקה (1D איור). סגור את ברזלים. שיעור זרימה ניתן לקבוע על ידי סימון מרווחי נפח בתא השיקוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 5 מיליליטר של .0.5% פתרון BSA לתוך תא התא ולנקז לתוך תא השיקוע בשיעור של 10 מיליליטר / דקה. סגור את ברזלים. צעד זה לשטוף את התאים מהתא לתא. חזור על 4x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את השיפוע: פתח את מהדק בין התא לתא (איור 1 א) ושני צילינדרי 2 ליטר (איור 1B ו-C), ולהתחיל לרוקן את הנוזל לתוך תא השיקוע בשיעור של 40 מיליליטר / דקה (איור 1D) באופן מיידי. התאם את קצב הזרימה ולכן זה לוקח בערך 20-30 דקות כדי לטעון את שיפוע BSA לתוך תא השיקוע. שכבה דקה, ללא הפרעה של תאים מונחת על גבישיפוע BSA צריך להיות גלוי. ברגע שרוב BSA נטען, סגור את הברז ופונה לעמדה שתאפשר לניקוז נוזלים מתא שקיעה לתוך צינור חלוקתו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את הצלחות ומערבבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר התאים למשקעים לשעה אחת ו45 דקות. לא להפריע למכשיר בתקופה זו. כל תסיסה מכאנית יכולה להפריע את השיפוע. </li></ol> 4. חלוקה וניתוח של שברים *** כפי שאתה לבצע את השלבים הבאים, יש להיזהר שלא להפריע את השיפוע. אם שיפוע BSA מופרע, ההליך לא יעבוד! <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שתאי משקעים, לנקז לאט 50 מיליליטר מתא שקיעה לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל ומניח בצד. חלק זה מכיל בדרך כלל גושים לא רצויים של תאים ופסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את צינור החלק לאספן שבריר. *** אפשר גם לאסוף את השברים ביד אם Colle שברירctor אינו זמין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף שברים: התאם את קצב הזרימה עם ברזלים כך ש10 מיליליטר (מילוי צינור איסוף אחד) נאסף כל שניות 45. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את צינורות איסוף שבריר ספין 5 דקות ב450 RCF ב 4 ° C. יוצקים את supernatant בעדינות, resuspend תאים בנוזל שנותר, ולשמור את התאים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכל השברים נאספים, מיקרוסקופי לנתח את השברים לאוכלוסיות תאים שונים. ניתן להבחין בין סוגי תאים שונים המבוססים על גודל תא ומורפולוגיה גרעינית 8,15. איור 2 מדגים &quot;תוצאות נציג&quot; לשלושת שברים ונקוו שמועשרים לתאים וspermatogonia () גופניים וmeiotic, (ב) spermatids העגול, ו (ג) מתארך ועיבוי spermatids. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלד spermatogonia הם ca 12 14μm. קוטרו ויש לי גרעינים עגולים שהם הומוגני בהרכב הכרומטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוג B spermatogonia הוא ca 8-9μm. קוטרו ויש לי לפהגרעיני ד המראים heterochromatin צפוף יותר לאורך הפריפריה הגרעינית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> spermatocytes טרום leptotene הוא ca 7.5-8.2μm. קוטרו, יש להם פחות מ ציטופלסמה סוג B spermatogonia, ויש להם גרעינים שנראים דומה לאלה בB spermatogonia סוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> spermatocytes העיקרי Leptotene הוא 8-10 ca מיקרומטר. בקוטר יש גרעינים שנראים דומה לאלה של spermatocytes מראש leptotene, אבל נראה שכדי לזכות בהכרומטין צפוף יותר בקרום הגרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Zygotene spermatocytes העיקרי הוא 10-12 ca מיקרומטר. בקוטר יש גרעינים שנראים דומה לאלה של spermatocytes העיקרי leptotene. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> spermatocytes Pachytene הם בכל מקום בין 12-18 ca מיקרומטר. קוטר ומורכב של שפה דקה של ציטופלסמה סביב גרעין גדול. יותר גושים של הכרומטין צפוף ניתן לראות בגרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> spermatids העגול 10 ca מיקרומטר. בקוטר יש גרעין עגול עם chromocenter צפוף מכתים באמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שרידיםגופים הם ~ 6.5 מיקרומטר בקוטר, הם עגולים, וחסרי גרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> spermatids מתארך והעיבוי דומה בגודלן לעגל spermatids, אבל יש גרעין ייחודי, בצורת מגל. </li></ul><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל עם חלק 15 ולנתח כל חמישה שברים עד 85. בדרך כלל, שברים מתחת 15 יהיו מעורבים וגבשושיים מדי, ושברים מעל 85 יכילו כמה לתאים לא שמישים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח כל חלק, לקחת 5ul של נוזל מצינור איסוף שבריר (פעם תאים כבר resuspended לאחר צנטריפוגה) ולהוסיף ל5ul של פורמלדהיד 8% בחיץ קרבס. אפשר התאים הקבועים לשבת בטמפרטורת חדר למשך חמש דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 5ul של .0.1% טריטון וDAPI (5 μ / מיליליטר חיץ קרבס) לתאים הקבועים. אפשר התאים לשבת בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 10 μl של הפתרון שהתקבל לשקופית, מכסה בלהחליק את מכסה, ולנתח באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לקבוע את טוהר של כל חלק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב את השברים הדומים בגודלם ומורפולוגיה גרעינית (ראו &quot;נציג תוצאות&quot;) כדי ליצור האוכלוסיות של תאים הבאים: תאי דיפלואידי meiotic וסומטיים, spermatids העגול, וspermatids עיבוי / מתארך. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wistuba, J., Stukenborg, J., Luetjens, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Spermatogenesis.">Mammalian Spermatogenesis.</a> Funct. Dev. Embryol. 1, 99-117 (2007).</li><li>Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+the+regulation+of+the+spermatogonial+stem+cell+niche.">Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche.</a> Cell Cycle. 5, 1164-1170 (2006).</li><li>Dores, C., Alpaugh, W., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+in+vitro+culture+to+in+vivo+models+to+study+testis+development+and+spermatogenesis.">From in vitro culture to in vivo models to study testis development and spermatogenesis.</a> Cell Tissue Res. 349, 691-702 (2012).</li><li>Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+mouse+germ+cell+specification+pathway+in+culture+by+pluripotent+stem+cells.">Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells.</a> Cell. 146, 519-532 (2011).</li><li>Easley, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+haploid+spermatogenic+cells.">Direct differentiation of human pluripotent stem cells into haploid spermatogenic cells.</a> Cell Rep. 2, 440-446 (2012).</li><li>Bellve, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+culture,+and+fractionation+of+spermatogenic+cells.">Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).</li><li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation.">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li><li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.+A+morphological+characterization.">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization.</a> Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).</li><li>Miller, R. G., Phillips, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+cells+by+velocity+sedimentation.">Separation of cells by velocity sedimentation.</a> J. Cell Physiol. 73, 191-201 (1969).</li><li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis.">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65, 40-49 (2005).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).</li><li>Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+elutriation:+separation+of+spermatogenic+cells+on+the+basis+of+sedimentation+velocity.">Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity.</a> J. Cell Physiol. 86, 177-189 (1975).</li><li>Meistrich, M. L., Trostle, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+testis+cells+by+equilibrium+density+centrifugation+in+renografin+gradients.">Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients.</a> Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).</li><li>Gassei, K., Ehmcke, J., Schlatt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+enrichment+of+undifferentiated+GFR+alpha+1++spermatogonia+from+immature+rat+testis+by+magnetic+activated+cell+sorting.">Efficient enrichment of undifferentiated GFR alpha 1+ spermatogonia from immature rat testis by magnetic activated cell sorting.</a> Cell Tissue Res. 337, 177-183 (2009).</li><li>Bellve, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenic+cells+of+the+prepuberal+mouse.+Isolation+and+morphological+characterization.">Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization.</a> J. Cell Biol. 74, 68-85 (1977).</li><li>Handel, M. A., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mammalian+meiosis:+regulation,+dynamics+and+impact+on+fertility.">Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 124-136 (2010).</li><li>Zhao, M., Shirley, C. R., Mounsey, S., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoprotein+transitions+during+spermiogenesis+in+mice+with+transition+nuclear+protein+Tnp1+and+Tnp2+mutations.">Nucleoprotein transitions during spermiogenesis in mice with transition nuclear protein Tnp1 and Tnp2 mutations.</a> Biol. Reprod. 71, 1016-1025 (2004).</li><li>Manku, G., Mazer, M., Culty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+testicular+gonocytes+isolation+and+processing+for+immunocytochemical+analysis.">Neonatal testicular gonocytes isolation and processing for immunocytochemical analysis.</a> Methods Mol. Biol. 825, 17-29 (2012).</li><li>Dehnugara, T., Dhar, S., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro,+short-term+culture+method+for+mammalian+haploid+round+spermatids+amenable+for+molecular+manipulation.">An in vitro, short-term culture method for mammalian haploid round spermatids amenable for molecular manipulation.</a> Mol. Reprod. Dev. 79, 19-30 (1002).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים. פרוטוקול זה שמפגינים כרוך בשימוש בעכברי מעבדה ובוצע בהתאם לכל הנחיות הרלוונטיות, תקנות ורשויות רגולטוריות. בעלי חיים המשמשים בפרוטוקול זה נשמרים תחת הדרכתו ואישור מאוניברסיטת ועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש המוסדי פנסילבניה (פרוטוקול # IACUC 804,284).

אלה שלומדים spermatogenesis להסתמך על מודלים של בעלי חיים לדגימות תאי spermatogenic, כמערכת תרבית תאים אמינה עדיין לא קיימת ליצירה כל סוגי תאי spermatogenic 3. למרות שתאי spermatogenic נאספים בקלות מכל אשכים, רק אוכלוסיית תוצאות מעורבת. זה מהווה בעיה למי שרוצה ללמוד תתי סוגים מסוימים של תאים אלה, כגון תאי meiotic, spermatids העגול, וspermatids עיבוי. שלוש שיטות שונות משמשות כיום להפריד בין תתי סוגים של תאי spermatogenic הבאים: STA-PUT, FACS, וelutriation 6-13. שתי השיטות האחרונות דורשות גישה לחלקים יקרים של ציוד: סדרן תא וelutriator, בהתאמה. למרות ששיטת FACS תשואות אוכלוסיות טהורות ביותר של סוגי תאי spermatogenic השונים, התהליך לוקח שש שעות ומניב רק 0.5-2.0 x 10 6 תאים לכל סוג תא ל02:58 אשכים 11. Elutriation, כמו ספיד PUT-STAOD, מפריד את התאים בהתבסס על גודל וצפיפות, אבל דורש גישה לelutriator, שהוא יקר יותר ממנגנוני STA-PUT. הליך STA-PUT משתמש בשיפוע BSA פשוט להפריד תאי spermatogenic בגדלים שונים עם תשואה גבוהה למדי (~ 10 8 תאים / אוכלוסייה ל~ 22 אשכים). יחסית לשיטות FACS, הליך STA-PUT מניב יותר תאים / אשך ולוקח הרבה פחות זמן להפריד בין סוגי תאים. בהשוואה לFACS וelutriation, הליך STA-PUT הוא יחסית פשוט וזול. STA-PUT דורש רק חדר קר או מקרר גדול וסט של כלי זכוכית מיוחדים, מה שהופך את שיטה אידיאלית למעבדות ללא גישה לסדרן תא או elutriator. כאשר מבוצע כראוי, STA-PUT יכול לספק כ 90% מאוכלוסייה טהורה של spermatids העגול או spermatids עיבוי. שיטת STA-PUT היא מאוד שימושית, אבל דורשת אופטימיזציה במספר שלבים שונים, במיוחד שלedimentation. הפרדה תת אופטימלית של סוגי תאים יכולה להיגרם על ידי מספר נושאים שונים, רוב הנוגעים לשיפוע BSA. כדי להפוך את שיפוע נכון, להפעיל את הברים ומערבבים בתא טעינת תא וצילינדר 2 ליטר מחזיק BSA 2% בזמן שאתה יוצר את השיפוע. גם לנקות את כל צינורות של בועות ולשים לבלבל במקום בתא השיקוע לפני טעינת התאים. הפחתת קצב הזרימה של BSA לתוך או מחוץ לתא השיקוע עשויה לעזור. והכי חשוב, מנגנון STA-PUT לא צריך להיות מופרע במהלך יצירת השיפוע, שקיעה, או אוסף שבריר. תת אופטימלית תשואות תא יכולות להיות התוצאה של מספר / גודל מספק של אשכים, הפרדת תאים לקויה במהלך טיפול collagenase / טריפסין, ויצירת גושים של תאים. אם אחד הוא לא מצליח להשיג את המספר המתאים של תאים לפרוטוקול STA-PUT וזאת בשל השימוש בעכברים או גנוטיפים יילודים שמייצרים מספר קטן של cel spermatogenicls, ייתכן שיהיה צורך להשתמש יותר חיות לכל STA-PUT או להזמין ערכת PUT-STA זכוכית מותאמת לכמויות ומספרי תא קטנות יותר (זמינה מProScience) 18. כדי להשיג מספר אופטימלי של תאים (700-800 מ&#39;), השתמש לפחות 11 עכברי זכרים בגיל פריון, באופן אידיאלי לפחות 8-9 שבועות. עם זאת, צריכים להיות טעונים לא יותר מ 800 מיליון תאים לתוך אחד STA-PUT. אם תאים לא ניתקו לתוך השעיה תא בודדת לאחר טריפסין טיפול, ריכוז DNAse ניתן להגדיל עד לפתרון 1 מיקרוגרם / 5 מיליליטר. DNAse הוא רגיש לחזור על מחזורים של הקפאה / הפשרה, ובאמצעות DNAse הטרי בכל פעם תגרום לפיזור יעיל יותר של צינוריות לתוך השעיה תא בודדת. אפשר להשתמש פיפטה שעמם רחבה כדי לעזור להתפרק גושי תא לפני הסינון דרך רשת. היבט אחד של שיטת STA-PUT שתדרוש אופטימיזציה הוא כמות הזמן שהתאים מותר משקעים דרך שיפוע BSA. שעה אחתו45 דקות בדרך כלל עובדת היטב, אבל הפעם יכול להיות שונות ממעבדה למעבדה. בדרך כלל, שכבות שונות של תאים שניתן לראות מבחינה ויזואלית לאורך שיפוע BSA. אם יש כמה תאים ב20 השברים הראשונים נאספו ושפע של תאים שבברים 80 +, זמן שקיעה ייתכן שיהיה הצורך להאריך. אם יש יותר מדי תאים ב20 השברים הראשונים נאספו ויש הפרדה מספיקה של סוגי תאים, זמן שקיעה ייתכן שיצטרך להיות מושפל. התאים שנרכשו בהליך STA-PUT יכולים לשמש לסוגים רבים ושונים של ניסויים. STA-PUT מספק חומר רב לניתוח כתם מערבי, immunofluorescence, וניתוח RNA, למרות שניסויים ביוכימיה בקנה מידה גדולה עשויים לדרוש שילוב של חומרים מכמה ריצות STA-PUT שונים. כשנפרד מסוגי תאים אחרים, יכול להיות מתורבת spermatids הפלואידים ונתון במבחנה המניפולציה מולקולרית לתקופה של עד שלושה ימים, אשר יכול להיות קלה יותר מאשר <em&gt; In vivo טיפול או יצירת של בעלי חיים בנוקאאוט 19. תאים שהושגו עם פרוטוקול STA-PUT שתואר כבר בתרבית למשך יום אחד ללא סימנים ברורים של זיהום, אבל אם תאים שישמשו לניסויי תרבית תאים רבים יותר, ציוד צריך להיות מעוקר עם אתנול, כל הפתרונות צריכים להיות מעוקר מסנן, וכל צעדים לפני טעינה סלולרי ולאחר איסוף שבריר צריכים להתבצע במכסת מנוע בתרבית רקמה. בנוסף, יש להשתמש בתקשורת והתרבות המכילה אנטיביוטיקה. העובדה ששיטת STA-PUT אינה דורשת קיבוע תא עושה את זה הליך אידיאלי לניסויים הדורשים תאי קיימא.

תאי זרע של יונקים הוא תהליך התמיינות מורכב המתרחש במספר שלבים בtubules seminiferous של האשכים 1. בקצרה, הגזע דמוי spermatogonia שמתגורר בסמוך לאפיתל של מתרס אבובית seminiferous ולהתמיין לspermatocytes, אשר לאחר מכן יעבור חטיבות meiotic. לאחר מיוזה היא מוחלטת, וכתוצאה מכך התאים הפלואידים, או spermatids העגול, עוברים spermiogenesis, תהליך בידול המערב את שפיכת הציטופלסמה והדחיסה של הגרעין. Spermatids לפתח בהדרגה השוטון ועובר התארכות והתעבות של הגרעין, הפקת spermatids מתארך ולאחר מכן עיבוי, בהתאמה. מוצרי הקצה הם תאי זרע, המשתחררים ללומן של אבובית seminiferous וסופו של דבר ליותרת האשך שבו הם בוגרים יותר. בגלל התהליך של spermatogenesis מסתמך על תנאים הורמונליים ומולקולריים מיוחדים בהאשכים, מערכת תרבות אמינה במבחנה לכל התהליך של תאי זרע עדיין לא פותחו 2,3. שיטות תרבות פותחו ליצירה &quot;תאי נבט קדמוני דמוי תא&quot; ו &quot;תאים עגולים כמו spermatid-&quot; הפלואידים, מתאי גזע, אך שיטות אלה עדיין לא מסוגלים לייצר כמויות גדולות של תאים אלה ולא מצליחים לייצר תא spermatogenic מאוחר יותר סוגי 4,5. למרבה המזל, סוגי spermatogenic התא שונים באופן משמעותי בגודלם, המאפשר להשעית תא בודד המתקבלת מכל אשכים להיות מופרדים עם שיפוע נוזלי. שיטת STA-PUT, הפגין כאן, משתמשת בשיפוע BSA ליניארי ושקיעה פשוט להפריד תאי spermatogenic מבוסס על גודל והמסה 6-9. יש שיטת STA-PUT מספר יתרונות על פני שתי שיטות נפוצות ביותר האחרות כדי להפריד בין סוגי spermatogenic תא: FACS וelutriation 10-13. מנגנון STA-PUT דורש onlכמה חתיכות y של כלי זכוכית מתמחה התאספו בחדר קר או מקרר גדול. לכן, זה פחות יקר מאשר באמצעות סדרן תא או elutriator. שיטת STA-PUT מניבה כמויות גדולות יותר של תאים לכל סוג תא ואשך מאשר ניתן למיין על ידי FACS במסגרת זמן דומה, אם כי טוהר של כל אוכלוסיית תא הוא לא גבוה כמו אלו שהושגו עם 11 FACS. מיון תא ניצול חרוזים מגנטיים (מיון מגנטי מופעל סלולרי, מחשבי מקינטוש) לאחרונה מועסק בהצלחה להעשרת spermatogonia מאוכלוסיית תאי אשכים מעורבת, אבל זה כרגע לא מתאים להפרדת spermatocytes או spermatids בשל חוסר ידע של שטח מתאים סמני 14. יתרון נוסף של שיטת STA-PUT על FACS או MACS הוא היכולת לבודד תאי קיימא מתאימים לתרבות שלאחר מכן, כי, בניגוד לרוב פרוטוקולי FACS, היא אינה דורשת כל ה-DNA או סוגים אחרים של מכתים. למחקרים שדורשים lתשואות arge של סוגי תאי spermatogenic ב ~ טוהר 90%, STA-PUT היא שיטה אידיאלית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="856">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">BSA</td>
			<td style="width:109px;">Affymetrix/USB</td>
			<td style="width:255px;">10857 100MG</td>
			<td style="width:183px;">Alternate can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:311px;">0.5%, 2%, and 4% BSA solutions</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively).</td>
			<td style="width:183px;">To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr height="91">
			<td height="91" style="height:91px;width:311px;">KREBS (10x)</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20</td>
			<td style="width:183px;">Autoclave/filter and store at 4 &#176;C for several months.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:311px;">KREBS (1x)</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20.</td>
			<td style="width:183px;">To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">Collagenase</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">C9891-1G</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">DNAse</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">DNEP-5MG</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">Trypsin</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">T9201-1G</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">DAPI</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Triton-X100</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Formaldehyde (~37%)</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">TABLE 2: EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Equipment</td>
			<td style="width:109px;">Company</td>
			<td style="width:255px;">Catalog #</td>
			<td style="width:183px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:311px;">Complete STA-PUT apparatus</td>
			<td style="width:109px;">ProScience Glass Shop</td>
			<td style="width:255px;">STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500)</td>
			<td style="width:183px;">Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">10 &#956;m mesh filter</td>
			<td style="width:109px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:255px;">22363549</td>
			<td style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Mouse dissection tools</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:311px;">14 ml round bottom fraction collection tubes with caps</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:547px;">Need approximately 100 tubes</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:311px;">Fraction collector</td>
			<td style="width:109px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:255px;">Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40</td>
			<td style="width:183px;">Alternate can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Microscope slides, cover glass</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Light/Fluorescent Microscope</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of spermatogenic cell types using sta-put velocity sedimentation

תאי זרע של יונקים הוא תהליך התמיינות מורכב המתרחש במספר שלבים בtubules seminiferous של האשכים. נכון לעכשיו, אין מערכת תרבית תאים אמינה המאפשרת בידול spermatogenic במבחנה, ורוב המחקרים ביולוגיים של תאי spermatogenic דורשים קציר רקמות ממודלים של בעלי חיים כמו העכבר והחולדה. בגלל האשך מכיל סוגים רבים של תאים - גם הלא spermatogenic (יידיג, Sertoli, מיאלואידית, ותאי אפיתל) וspermatogenic (spermatogonia, spermatocytes, spermatids העגול, עיבוי spermatids ותאי זרע) - מחקרים של המנגנונים הביולוגיים המעורבים בתאי זרע דורש הבידוד והעשרה של תאים מסוגים שונים. שיטת STA-PUT מאפשרת להפרדת אוכלוסייה הטרוגנית של תאים - במקרה זה, מהאשכים - דרך שיפוע BSA ליניארי. סוגי תאים בודדים משקעים עם מהירות שקיעה שונה בהתאם לספירהגודל ll, והשברים מועשרים לתאים מסוגים שונים יכולים להיות שנאספו ומנוצלים בניתוחים נוספים. בעוד שיטת STA-PUT לא לגרום לשברים טהורים מאוד של סוגי תאים, למשל כמו ניתן להשיג עם שיטות מיון תא מסוימות, הוא מספק תשואה גבוהה בהרבה של תאים הכולל בכל שבריר (~ 1 x 10 8 תאים / סוג spermatogenic תא מאוכלוסייה התחלתי של 7-8 x 10 8 תאים). שיטת תשואה גבוהה זה דורשת רק כלי זכוכית מתמחה ויכולה להתבצע בכל חדר קר או מקרר גדול, מה שהופך את שיטה אידיאלית למעבדות שיש להם גישה מוגבלת לציוד מיוחד כמו סדרן הקרינה הופעלה תאים (FACS) או elutriator.

התוצאה האידיאלית מהליך STA-PUT היא הפרדה די בולטת של תאים מהאשכים המבוססים על גודל תא וצפיפות. בעוד התאים מבודדים מאשכי סדימנטציה דרך שיפוע BSA, כמה להקות שונות של תאים יכולות להיות שנצפו. כל גושים של תאים נוטים לשקוע בתחתית של השיפוע ולא לזהם את השברים האחרים. עוד קצת במעלה השיפוע יהיה גופני הגדול ותאי meiotic. במעלה השיפוע עדיין יהיה spermatids העגול קטן יותר. בחלק העליון של השיפוע יהיה מרוכז spermatids, זרע, ומזהם תאי דם אדומים (מופיעים אלה להיות תאים עגולים קטנים ללא גרעין). ניתן לנתח שברים במהירות באמצעות שילוב של אור ומיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2) 15. Meiotic, spermatogonial, ותאים סומטיים דיפלואידי הם התאים הגדולים ביותר שנמצאו באשכים ויכיל גרעינים גדולים שrelati הכתםvely הומוגנית עם DAPI. spermatids העגול הם תאים קטנים עם גרעינים עגולים קטנים יותר, בדרך כלל עם chromocenter מכתים במאור פנים. spermatids עיבוי / מתארך הם תאים קטנים שלעתים קרובות נראים מלבני, כאילו זנב קטן ויוצר. תאים אלה גרעינים קטנים יותר, קומפקטיים שכתם בהיר עם DAPI והם בצורת מגל. ברגע שברי תאים משולבים, טוהר ניתן לקבוע עוד יותר על ידי ניתוח כתם המערבי של lysates התא (איור 3). סמנים נפוצים של תאי meiotic הם 1 החלבונים המורכבים synaptonemal Scp1 וSycp2 16. סמנים נפוצים של עיבוי spermatids הם חלבוני מעבר (למשל TP1) או protamines 17. למרות כל ריצה PUT-STA יכולה להיות שונה, תאים בדרך כלל meiotic, spermatogonia ותאים סומטיים דיפלואידי יהיו למצוא בברים ca. 25-40, spermatids סיבוב בברי ca. 55-65, ועיבוי / מתארכים spermatids בשברי ca.65-75 בשל הבדל קטן בגודל בין תאים סומטיים / meiotic וspermatids העגול, ca. לעתים קרובות יש שברי 45-50 אפילו אחוז התאים סומטיים / meiotic וspermatids העגול. צביעה עם DAPI תעזור להבחין בין שתי אוכלוסיות של תאים אלה. יש פחות חפיפה של spermatid העגול ועיבוי / מתארך שברים spermatid בשל ההבדל הגדול בגודל בין שתי אוכלוסיות של תאים אלה. בדרך כלל, שברים מתחת 15 יכילו הרבה גושים גדולים של תאים ושברים מעל 85 יכיל מספר תאים וגופים רבים שיורי, או ציטופלסמה קרום הנכנס שנשפכה על ידי spermatids. בדרך כלל, כאשר תאים מ~ 22 אשכים הם מופרדים עם הליך STA-PUT, זה מניב CA. 10 8 תאים / סוג spermatogenic תאים (תאים סומטיים דיפלואידי / meiotic, spermatids העגול, וspermatids עיבוי / מתארך). שברים שמשולבים ליצור האוכלוסייה הסופית של תאים צריכים להיות לפחות80% טהורים לסוג של תא בשאלה. אם אתה לא רואה את התואר הזה של טוהר או גבוה יותר, ייתכן שיש בעיה עם הפרדת תא או שיפוע BSA. כמו כן, אם יש מעט תאים ב20 השברים הראשונים ושפע של תאים שבברים 80 +, או אם יש שפע של תאים ב20 השברים הראשונים וכמעט ולא בשברים 70 +, זמן שקיעה צריך להיות עוד יותר אופטימיזציה. אנא ראה את הדיון להצעות כיצד לירות צרה. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50648/50648fig1.jpg" width="450px" /> איור 1. הקמת מנגנון STA-PUT: תמונה סכמטית ובפועל של מנגנון STA-PUT מוצג. כל הזכוכית מחוברת על ידי צינורות פלסטיק, כוללים הצינור שמחבר את המכשיר לאספן שבריר. חצים מצביעים על מיקומו של מהדק. א) חדר טעינה סלולרי, מכיל בר ומערבב; B) צילינדר 2 ליטר<html> לBSA 2%, מכיל בר ומערבב; גליל C) 2 L לBSA 4%; ד &#39;) קאמרי שקיעה; E צלחות מערבבים); F) הטיות;. G) ברזלים <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50648/50648fig1highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50648/50648fig2.jpg" width="450px" /> איור 2. אוכלוסיות תאים המתקבלות מSTA-PUT: שברים אוחדו לשלוש אוכלוסיות נפרדות של תאים: תאי meiotic וסומטיים, spermatids עגול, ועיבוי ומתארך spermatids. כל אוכלוסייה מוכתמת עם DAPI להראות הבדלים בגודל גרעיני ומורפולוגיה. הדמיה בניגוד שלב מעבירה הבדלים בגודל תא וצורה. בר לבן מייצג 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50648/50648fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> _content &quot;עבור: together.within-לשמור על עמודים =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 3" fo:content-height="6in" src="/files/ftp_upload/50648/50648fig3.jpg" width="450px" /> איור 3. סמנים של אוכלוסיות תאים שונות המתקבלות מSTA-PUT: תמציות תא כולו היו עשויים מאוכלוסיית תא שמוצגת באיור 1 וניתוח כתם מערבי בוצע כדי להראות הבדלי ביטוי חלבון לכל אוכלוסייה.. חלבון Synaptonemal המורכב 1 (Scp1) הוא חלבון מתבטא באופן בלעדי במהלך המיוזה, והוא נמצא מועשר שבברי meiotic, תוך שבריר spermatid עיבוי מועשר לחלבון מעבר 1 (TP1), חלבון לידי ביטוי בשלב מאוחר בspermiogenesis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50648/50648fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה גדולה יותר תמונה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation at JoVE.com

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

שיטת STA-PUT מאפשרת הפרדה של אוכלוסיות שונות של תאי spermatogenic בהתבסס על גודל וצפיפות.

הפרדה של סוגי תאי Spermatogenic שימוש בשקיעה מהירות STA-PUT

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

separation-spermatogenic-cell-types-using-sta-put-velocity

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

25.6K Views.  University of Pennsylvania.  שיטת STA-PUT מאפשרת הפרדה של אוכלוסיות שונות של תאי spermatogenic בהתבסס על גודל וצפיפות. 

Video: Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

אקטין Co-Assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-F-אקטין

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

ההפרדה Electrophoretic של חלבונים

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension and microscopically visualize sperm accumulation around the pipette1. Sperm chemoattraction in vertebrates such as frogs, rodents and humans is more difficult to detect and requires quantitative assays. Such assays are of two major types - assays that quantitate sperm movement to a source of chemoattractant, so-called sperm accumulation assays, and assays that actually track the swimming trajectories of individual sperm.
Sperm accumulation assays are relatively rapid allowing tens or hundreds of assays to be done in a single day, thereby allowing dose response curves and time courses to be carried out relatively rapidly. These types of assays have been used extensively to characterize many well established chemoattraction systems - for example, neutrophil chemotaxis to bacterial peptides and sperm chemotaxis to follicular fluid. Sperm tracking assays can be more labor intensive but offer additional data on how chemoattractancts actually alter the swimming paths that sperm take. This type of assay is needed to demonstrate the orientation of sperm movement relative to the chemoattrractant gradient axis and to visualize characteristic turns or changes in orientation that bring the sperm closer to the egg.
Here we describe methods used for each of these two types of assays. The sperm accumulation assay utilized is called a "two-chamber" assay. Amphibian sperm are placed in a tissue culture plate insert with a polycarbonate filter floor having 12 &mu;m diameter pores. Inserts with sperm are placed into tissue culture plate wells containing buffer and a chemoatttractant carefully pipetted into the bottom well where the floor meets the wall (see Fig. 1). After incubation, the top insert containing the sperm reservoir is carefully removed, and sperm in the bottom chamber that have passed through the membrane are removed, pelleted and then counted by hemocytometer or flow cytometer.
The sperm tracking assay utilizes a Zigmond chamber originally developed for observing neutrophil chemotaxis and modified for observation of sperm by Giojalas and coworkers2,3. The chamber consists of a thick glass slide into which two vertical troughs have been machined. These are separated by a 1 mm wide observation platform. After application of a cover glass, sperm are loaded into one trough, the chemoattractant agent into the other and movement of individual sperm visualized by video microscopy. Video footage is then analyzed using software to identify two-dimensional cell movements in the x-y plane as a function of time (xyt data sets) that form the trajectory of each sperm.

Eggs and the extracellular coatings around eggs frequently release peptides, proteins and small molecules that communicate with sperm to guide them to the egg thereby promoting fertilization. Using frog sperm we describe and compare two classes of assays used to detect sperm chemoattraction &#x2013; sperm accumulation assays and sperm tracking assays.

שני סוגים של מבחני עבור Chemoattraction גילוי זרע צפרדע

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from the seaweed genera Gelidium and Gracilaria, and consists of repeated agarobiose (L- and D-galactose) subunits2. During gelation, agarose polymers associate non-covalently and form a network of bundles whose pore sizes determine a gel&#39;s molecular sieving properties. The use of agarose gel electrophoresis revolutionized the separation of DNA. Prior to the adoption of agarose gels, DNA was primarily separated using sucrose density gradient centrifugation, which only provided an approximation of size. To separate DNA using agarose gel electrophoresis, the DNA is loaded into pre-cast wells in the gel and a current applied. The phosphate backbone of the DNA (and RNA) molecule is negatively charged, therefore when placed in an electric field, DNA fragments will migrate to the positively charged anode. Because DNA has a uniform mass/charge ratio, DNA molecules are separated by size within an agarose gel in a pattern such that the distance traveled is inversely proportional to the log of its molecular weight3. The leading model for DNA movement through an agarose gel is &#34;biased reptation&#34;, whereby the leading edge moves forward and pulls the rest of the molecule along4. The rate of migration of a DNA molecule through a gel is determined by the following: 1) size of DNA molecule; 2) agarose concentration; 3) DNA conformation5; 4) voltage applied, 5) presence of ethidium bromide, 6) type of agarose and 7) electrophoresis buffer. After separation, the DNA molecules can be visualized under uv light after staining with an appropriate dye. By following this protocol, students should be able to: 
 
1. Understand the mechanism by which DNA fragments are separated within a gel matrix 
2. Understand how conformation of the DNA molecule will determine its mobility through a gel matrix 
3. Identify an agarose solution of appropriate concentration for their needs 
4. Prepare an agarose gel for electrophoresis of DNA samples 
5. Set up the gel electrophoresis apparatus and power supply 
6. Select an appropriate voltage for the separation of DNA fragments 
7. Understand the mechanism by which ethidium bromide allows for the visualization of DNA bands 
8. Determine the sizes of separated DNA fragments 
&#160;

A basic protocol for the separation of DNA fragments using agarose gel electrophoresis is described.

ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose להפריד את קטעי ה-DNA

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of protein-bound DNA and aligning the short reads to a reference genome. Enriched regions are revealed as peaks, which often differ dramatically in shape, depending on the target protein1. For example, transcription factors often bind in a site- and sequence-specific manner and tend to produce punctate peaks, while histone modifications are more pervasive and are characterized by broad, diffuse islands of enrichment2. Reliably identifying these regions was the focus of our work.
Algorithms for analyzing ChIPseq data have employed various methodologies, from heuristics3-5 to more rigorous statistical models, e.g. Hidden Markov Models (HMMs)6-8. We sought a solution that minimized the necessity for difficult-to-define, ad hoc parameters that often compromise resolution and lessen the intuitive usability of the tool. With respect to HMM-based methods, we aimed to curtail parameter estimation procedures and simple, finite state classifications that are often utilized.
Additionally, conventional ChIPseq data analysis involves categorization of the expected read density profiles as either punctate or diffuse followed by subsequent application of the appropriate tool. We further aimed to replace the need for these two distinct models with a single, more versatile model, which can capably address the entire spectrum of data types.
To meet these objectives, we first constructed a statistical framework that naturally modeled ChIPseq data structures using a cutting edge advance in HMMs9, which utilizes only explicit formulas-an innovation crucial to its performance advantages. More sophisticated then heuristic models, our HMM accommodates infinite hidden states through a Bayesian model. We applied it to identifying reasonable change points in read density, which further define segments of enrichment. Our analysis revealed how our Bayesian Change Point (BCP) algorithm had a reduced computational complexity-evidenced by an abridged run time and memory footprint. The BCP algorithm was successfully applied to both punctate peak and diffuse island identification with robust accuracy and limited user-defined parameters. This illustrated both its versatility and ease of use. Consequently, we believe it can be implemented readily across broad ranges of data types and end users in a manner that is easily compared and contrasted, making it a great tool for ChIPseq data analysis that can aid in collaboration and corroboration between research groups. Here, we demonstrate the application of BCP to existing transcription factor10,11 and epigenetic data12 to illustrate its usefulness.

Our Bayesian Change Point (BCP) algorithm builds on state-of-the-art advances in modeling change-points via Hidden Markov Models and applies them to chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIPseq) data analysis. BCP performs well in both broad and punctate data types, but excels in accurately identifying robust, reproducible islands of diffuse histone enrichment.

אלגוריתם רומן ייס שינוי נקודות לניתוח הגנום רחב, של סוגי נתוני ChIPseq מגוונים

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Orofacial clefts are the most frequent craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal facial development3. In human and mouse, initial growth and patterning of the face relies on several small buds of tissue, the facial prominences4,5. The face is derived from six main prominences: paired frontal nasal processes (FNP), maxillary prominences (MxP) and mandibular prominences (MdP). These prominences consist of swellings of mesenchyme that are encased in an overlying epithelium. Studies in multiple species have shown that signaling crosstalk between facial ectoderm and mesenchyme is critical for shaping the face6. Yet, mechanistic details concerning the genes involved in these signaling relays are lacking. One way to gain a comprehensive understanding of gene expression, transcription factor binding, and chromatin marks associated with the developing facial ectoderm and mesenchyme is to isolate and characterize the separated tissue compartments.
Here we present a method for separating facial ectoderm and mesenchyme at embryonic day (E) 10.5, a critical developmental stage in mouse facial formation that precedes fusion of the prominences. Our method is adapted from the approach we have previously used for dissecting facial prominences7. In this earlier study we had employed inbred C57BL/6 mice as this strain has become a standard for genetics, genomics and facial morphology8. Here, though, due to the more limited quantities of tissue available, we have utilized the outbred CD-1 strain that is cheaper to purchase, more robust for husbandry, and tending to produce more embryos (12-18) per litter than any inbred mouse strain8. Following embryo isolation, neutral protease Dispase II was used to treat the whole embryo. Then, the facial prominences were dissected out, and the facial ectoderm was separated from the mesenchyme. This method keeps both the facial ectoderm and mesenchyme intact. The samples obtained using this methodology can be used for techniques including protein detection, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, microarray studies, and RNA-seq.

A protocol for separation of embryo facial ectoderm and mesenchyme is described. We use Dispase II to treat whole embryos first, dissect whole facial prominences out, and then separate the facial ectoderm and mesenchyme.

הפרדת אקטודרם עכבר העוברי פן וmesenchyme

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

Microdissection לייזר בסיוע (LAM) ככלי פרופיל תעתיק של סוגי תאים בודדים

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical proteins, such as antibodies, vaccine candidates and enzymes. These must be purified from the plant biomass but chromatography steps are hindered by the high concentrations of host cell proteins (HCPs) in plant extracts. However, most HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C facilitating subsequent purification of the target protein. Here, three methods are presented to achieve the heat precipitation of tobacco HCPs in either intact leaves or extracts. The blanching of intact leaves can easily be incorporated into existing processes but may have a negative impact on subsequent filtration steps. The opposite is true for heat precipitation of leaf extracts in a stirred vessel, which can improve the performance of downstream operations albeit with major changes in process equipment design, such as homogenizer geometry. Finally, a heat exchanger setup is well characterized in terms of heat transfer conditions and easy to scale, but cleaning can be difficult and there may be a negative impact on filter capacity. The design-of-experiments approach can be used to identify the most relevant process parameters affecting HCP removal and product recovery. This facilitates the application of each method in other expression platforms and the identification of the most suitable method for a given purification strategy.

Three heat precipitation methods are presented that effectively remove more than 90% of host cell proteins (HCPs) from tobacco extracts prior to any other purification step. The plant HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C.

השוואת שיטות להסרת Cell חלבון מארח טבק ידי לבנת צמחים שלמים או על ידי טיפול בחום של תמציות

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

פיתוח של מערכת כנס עמית התרבות שני סוגים סלולריים בהעדר לתקשר Cell-Cell

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or fluorescence activated cell sorting (FACS) applied to the viral population. However, when the viruses in the mixture have similar morphologic properties and one of the viruses multiplies slowly, the presence of two viruses is discovered at the stage of genome assembly and the viruses cannot be separated for further characterization. To solve this problem, we developed a single cell micro-aspiration procedure that allows for separation and cloning of highly similar viruses. In the present work, we present how this alternative strategy allowed us to separate the small viral subpopulations of Clandestinovirus ST1 and Usurpativirus LCD7, giant viruses that grow slowly and do not lead to amoebal lysis compared to the lytic and fast-growing Faustovirus. Purity control was assessed by specific gene amplification and viruses were produced for further characterization.

Here, we describe a single cell micro-aspiration method for the separation of infected amoebae. In order to separate viral subpopulations in Vermamoeba vermiformis infected by Faustoviruses and unknown giant viruses, we developed the protocol detailed below and demonstrated its ability to separate two low-abundance novel giant viruses.

תא בודד מיקרו-שאיפה כאסטרטגיה חלופית מיון תאים פלואורסצנטית מופעל עבור הפרדה וירוס ענק תערובת

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...