Esta investigación fue apoyada por el NIH subvenciones GM055360 a SLB y U54HD068157 de RGM. JMB fue apoyado por la Subvención de Entrenamiento T32 Genética de la Universidad de Pennsylvania (GM008216).

El protocolo de STA-PUT implica tres etapas: 1) Puesta en marcha de los aparatos y reactivos, 2) Preparación de la suspensión de células de testículos enteros, y 3) la carga de la célula, la sedimentación y la recogida de fracciones. Cuando es realizada por un equipo de dos investigadores, el protocolo de toma ocho horas en promedio. 1. Configuración del Aparato STA-PUT (Figura 1) *** Aparato de STA-PUT debe ser colocado en un refrigerador grande 4 ° C o una habitación fría que también puede acomodar un colector de fracciones, si se prefiere que el método de colección. <ol><li> La noche antes (o al menos unas horas antes) de llevar a cabo el método, lavar todo el equipo (sobre todo el material de vidrio y tubos) y esterilizar con etanol al 70%. Deje equipo seco completamente antes de montar el aparato como se ilustra en la Figura 1. </li><li> Asegure los dos cilindros de 2 L (Figuras 1B y C) y la cámara de carga de células ( <strong&gt; Figura 1A) a la plataforma superior y conectar todo con dos pequeñas piezas de tubo con abrazaderas de tubo. Fijar todos los tubos cerrados. Selle el surtidor en la L cilindro más a la derecha 2. </li><li> Coloque una pequeña barra de agitación en la cámara de carga de células (Figura 1A) y una barra de agitación más grande en el 2 L cilindro más a la izquierda (Figura 1B) que contendrá la BSA 2%. </li><li> Coloque la cámara de sedimentación 2 L en la plataforma (Figura 1D). Coloque el deflector de metal (Figura 1F) directamente en la parte superior de la abertura en la parte inferior de la cámara de sedimentación (Figura 1D). Esto es crítico, ya que el deflector impide agitación con vórtex del líquido y la interrupción del gradiente de células durante la recogida de la fracción. Coloque la tapa en la parte superior de la cámara de sedimentación. </li><li> Después de la aplicación de una muy pequeña cantidad de grasa de vacío a la junta de vidrio esmerilado de la llave de tres vías (Figura 1G), sujetar la llave de paso a la parte inferior de la SEcámara dimentation, conectando las juntas de vidrio esmerilado de la llave de paso y la cámara de sedimentación. </li><li> Conectar la cámara de la celda de carga (Figura 1A) a la salida derecha de la llave de paso con un tubo. Cierre la llave de paso. </li><li> Conecte el tubo de fraccionamiento de la célula a la salida izquierda de la llave de paso. El tubo de fraccionamiento comprende un trozo de tubo con una pipeta Pasteur de vidrio conectado al extremo abierto. Un trozo de tubo de diámetro más pequeño se une al extremo estrecho de la pipeta de vidrio. La pipeta estrecha restringe el flujo de la suspensión de células durante la recolección de fracciones. Fije este pequeño tubo en la parte inferior. </li><li> Preparar 2 L de Krebs (1x) tamponar el día del experimento (Tabla 1). Entonces, preparar 550 ml de 2% de BSA en 1x de Krebs, 550 ml de 4% de BSA en 1x de Krebs, y 50 ml de 0,5% de BSA en 1x de Krebs. Filtrar y dejar enfriar estas soluciones a 4 ° C. </li><li> Verter la solución de BSA al 4% en el cilindro derecho L 2 (Figura 1C) y la BSA 2%solución en la izquierda 2 L de cilindro (Figura 1B). Asegúrese de que no hay grandes burbujas en el tubo que conecta estos cilindros. </li><li> Vierta tampón Krebs en la cámara de carga celular y llenar el tubo que conecta la cámara con la cámara de sedimentación, asegurándome de que no hay burbujas grandes, ya que podrían alterar el gradiente. Exprimir o chasquear la tubería ayuda suavemente para eliminar las burbujas. Asegúrese de que todo el tampón de Krebs es en el tubo y no en la cámara de la celda. </li><li> Permitir que una pequeña cantidad de tampón de Krebs fluya dentro de la cámara de sedimentación y luego drenar casi todo el tampón en el tubo de fraccionamiento de la célula con el fin de llenar el tubo y eliminar cualquier burbuja grande. </li><li> Coloque el colector de fracciones directamente debajo de la cámara de sedimentación. Asegúrese de que todos los tubos de fracción están en su lugar y se cubren con una envoltura de plástico para evitar la contaminación. </li></ol> 2. Aislar las células de espermatogénesis de testículos enteros <ol&gt; <li> Diseccionar testículos de ca 12 ratones adultos (de preferencia por lo menos ocho semanas de edad) y el lugar en tampón Krebs a ​​temperatura ambiente para lavar cualquier material contaminante. Este protocolo está demostrado implica el uso de ratones de laboratorio y fue ejecutado en cumplimiento de los lineamientos de la Universidad de Comité de Cuidado de Animales institucional y Uso Pennsylvania. </li><li> Añadir 45 mg de colagenasa a 50 ml de tampón de Krebs en un tubo cónico de la derecha antes de que la intención de añadir los túbulos seminíferos. Permitir que esta solución se caliente a 33 ° C durante unos pocos minutos. Dividir equitativamente en dos tubos de 50 ml cónicos. </li><li> Decapsulate los testículos en una placa separada que contiene 8 ml de tampón de Krebs, descartando la túnica albugínea y la liberación de los túbulos seminíferos. La túnica albugínea es la membrana delgada que rodea los túbulos seminíferos. Los túbulos deben separarse fácilmente de la túnica albugínea. Para ello, realizará una incisión en la túnica albugínea, mantenga esta membrana con un pair de fórceps, y empujar los túbulos fuera y lejos de la membrana con otro par de pinzas. </li><li> Añadir 4 ml de tampón de Krebs que contiene los túbulos a cada tubo cónico que contenía 25 ml de solución de colagenasa y se incuba, sacudimiento, a 33 ° C durante 10 min. Al final, los túbulos deben tener una apariencia &quot;spaghetti-como&quot;. </li><li> Permitir que los túbulos se asienten durante ~ 5 min a la parte inferior del tubo. Verter el sobrenadante y lavar 2x en 25 ml de tampón de Krebs (a temperatura ambiente), lo que permite a los túbulos se depositan en el fondo del tubo cada vez. Deja ~ 5 ml de tampón de Krebs en cada tubo. </li><li> Mientras que el lavado, agregar 30 mg de tripsina a 50 ml de tampón de Krebs en un tubo Falcon de la derecha antes de que la intención de añadir los túbulos seminíferos. Permitir que esta solución se caliente a 33 ° C durante unos pocos minutos. Dividir equitativamente en dos tubos de 50 ml cónicos. </li><li> Añadir 25 ml de solución de tripsina a cada uno de los dos tubos que contienen los túbulos. Añadir 3 g de DNasa (1 μg/10ml) a cada tubo para prevenir la células se apelmace. Incubar, temblando, a 33 º C durante 10 min. </li><li> Utilice una amplia pipeta de orificio para agitar la solución que contiene los túbulos, el pipeteado de ellos dentro y fuera de aproximadamente 10x. La solución debe comenzar a parecerse más a una suspensión de células individuales. </li><li> Incubar, temblando, a 33 º C durante otros 10 min. Utilice una amplia pipeta de orificio para dispersar los túbulos en una única suspensión de células, el pipeteado de ellos dentro y fuera de aproximadamente 25x. Si se sigue mostrando una gran cantidad de túbulos o grupos de células, se dispersan más con la pipeta y / o añadir otro 3 mg DNAsa a cada tubo (concentración inicial doble). </li><li> Se filtra la suspensión de células individuales a través de un filtro de células de malla de 100 micras (una para cada tubo de 30 ml de suspensión de células). Combine las suspensiones celulares y contar el número total de células (debe ser entre 7-8 x 10 8 células). EL *** NO coloque más de 800 millones de células en el gradiente. </li><li> Basándose en el recuento de células obtenida en la etapa 2.10, sedimentar el parámetro adecuadoIATE volumen de las células filtradas a 450 rcf durante 5 min y se lava con 30 ml de tampón de Krebs. Repita. *** Por lo general, 22 testículos producirán más de 800 millones de células, pero no cargue más de este número de células. </li><li> Resuspender cuidadosamente las células en 25 ml de 0,5% de BSA que contiene entre 2,5 y 5 mg de ADNasa (dependiendo del grado de aglutinación de células) sin crear burbujas. Asegúrese de que las células no se agrupan. Se filtra la suspensión de células individuales a través de un filtro de células de malla de 100 micras. Las células están ahora listos para cargar. Mezclar bien antes de la carga invirtiendo el tubo varias veces. </li></ol> 3. Móvil Carga y Sedimentación <ol><li> Asegúrese de que la llave de paso está cerrado, pero en la posición que permita que el líquido fluya desde la cámara de la celda (Figura 1A) en la cámara de sedimentación (Figura 1D). </li><li> Gire ambas placas barra de agitación a una temperatura baja (aproximadamente 70 rpm) para permitir que las barras de agitación se mueven sin cesar, pero lentamente. </li><li> Se vierte la suspensión de células en la cámara celular (Figura 1A) y abrir la llave de paso de modo que las células fluyen lentamente en la cámara de sedimentación a una velocidad de 10 ml / min (Figura 1D). Cierre la llave de paso. Tasa de flujo puede determinarse mediante el marcado de intervalos de volumen en la cámara de sedimentación. </li><li> Vierta 5 ml de solución de BSA al 0,5% en la cámara celular y drenar en la cámara de sedimentación a una velocidad de 10 ml / min. Cierre la llave de paso. Este paso se lavan las células fuera de la cámara de la celda. Repetir 4x. </li><li> Preparar el gradiente: Abra las abrazaderas entre la cámara de la celda (Figura 1A) y los dos cilindros 2 L (Figura 1B y C), y comenzar a drenar el líquido en la cámara de sedimentación a una velocidad de 40 ml / min (Figura 1D) inmediatamente. Ajuste la velocidad de flujo por lo que toma aproximadamente 20 a 30 min para cargar el gradiente de BSA en la cámara de sedimentación. Una capa delgada, sin molestias de las células que está encima de laBSA gradiente debe ser visible. Una vez que la mayor parte de la BSA se carga, cierre la llave de paso y girar a la posición que va a permitir que el líquido salga de la cámara de sedimentación en el tubo de fraccionamiento. </li><li> Apague las placas revuelo. </li><li> Permitir que las células se separen por sedimentación durante una hora y 45 minutos. NO MOLESTAR EL APARATO DURANTE ESTE TIEMPO. Cualquier agitación mecánica podría perturbar el gradiente. </li></ol> 4. Fraccionamiento y Análisis de las fracciones *** A medida que realiza los pasos siguientes, tenga cuidado de no alterar el gradiente. Si se altera el gradiente de BSA, el procedimiento no va a funcionar! <ol><li> Una vez que las células hayan sedimentado, escurrir lentamente 50 ml de la cámara de sedimentación en un tubo cónico de 50 ml y reservar. Esta fracción contiene generalmente grupos no deseados de células y los desechos. </li><li> Fije el tubo de la fracción con el colector de fracciones. *** También es posible recoger las fracciones a mano si un Colle fracciónHéctor no está disponible. </li><li> Reunir las fracciones: Ajuste el caudal con la llave de paso de modo que 10 ml (llenado un tubo de recogida) se recogieron cada 45 seg. </li><li> Tape los tubos de recogida de fracción y girar durante 5 minutos a 450 RCF a 4 ° C. Verter el sobrenadante con cuidado, volver a suspender las células en el líquido restante y mantener las células en hielo. </li><li> Una vez recogidas todas las fracciones, analizar microscópicamente las fracciones de diferentes poblaciones de células. Diferentes tipos de células se pueden distinguir basándose en el tamaño celular y la morfología nuclear 8,15. La Figura 2 ilustra los resultados representativos &quot;&quot; para las tres fracciones reunidas que están enriquecidas en células y espermatogonias (a) somáticas y meióticas, (B), y espermátidas redondas (c) el alargamiento y la condensación espermátidas. <ul><li> Tipo A espermatogonias son 12-14μm ca. de diámetro y tienen núcleos redondos que son homogéneos en la composición de la cromatina. </li><li> Tipo B espermatogonias, que 8-9μm ca. de diámetro y han round núcleos que muestran la heterocromatina más densa a lo largo de la periferia nuclear. </li><li> Espermatocitos Pre-leptotene son 7.5-8.2μm ca. de diámetro, tienen menos citoplasma de espermatogonias tipo B, y tienen núcleos que se parecen a los de tipo B espermatogonias. </li><li> Espermatocitos primarios Leptoteno son 8-10 micras aprox. de diámetro y tienen núcleos que parecen similares a los de espermatocitos de pre-leptotene, pero parecen aumentar de peso cromatina más densa en la membrana nuclear. </li><li> Zygotene espermatocitos primarios son 10-12 micras aprox. de diámetro y tienen núcleos que parecen similares a los de los espermatocitos primarios leptotene. </li><li> Pachytene son en cualquier lugar 12 a 18 micras aprox. de diámetro y consisten en un borde delgado de citoplasma que rodea a un núcleo grande. Más grumos de cromatina densa se pueden ver en el núcleo. </li><li> Espermátidas redondas son 10 m aprox. de diámetro y tienen un núcleo redondo con un chromocenter densamente-tinción en el medio. </li><li> Residualcuerpos son ~ 6,5 m de diámetro, son redondos, y carecen de un núcleo. </li><li> Alargándose espermátidas y condensación son similares en tamaño a redondear espermátidas, pero tienen un núcleo en forma de hoz único. </li></ul><ol><li> Comience con la fracción 15 y analizar cada cinco fracciones de hasta 85. Por lo general, las fracciones inferiores a 15 serán demasiado mezclados y grumoso, y las fracciones superiores a 85 contienen pocos o ningún células utilizables. </li><li> Para analizar una fracción, tomar 5UL de líquido desde el tubo de recogida de la fracción (una vez que las células se han resuspendido después de la centrifugación) y añadir a 5UL de 8% de formaldehído en tampón de Krebs. Permita que las células fijadas para sentarse a temperatura ambiente durante cinco minutos. </li><li> Añadir 5 ul de 0,1% de Triton y DAPI (5 μ / ml de tampón de Krebs) a las células fijas. Permita que las células en reposo a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Ponga 10 l de la solución resultante en un portaobjetos, cubra con un cubreobjetos, y analizar con un microscopio de fluorescencia para determinar la pureza de cada fracción. </li><li> Se combinan las fracciones que son similares en tamaño y morfología nuclear (véase &quot;Los resultados representativos&quot;) para crear las siguientes poblaciones de células: células diploides meióticos y somáticos, espermátidas redondas y condensación / alargándose espermátidas. </li></ol></li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia. Este protocolo está demostrado implica el uso de ratones de laboratorio y fue ejecutado en cumplimiento de todas las directrices, reglamentos y organismos reguladores. Los animales utilizados en este protocolo se mantienen bajo la guía y la aprobación de la Universidad de Comité de Cuidado de Animales y el empleo Institucional Pennsylvania (protocolo de IACUC # 804284).

Los que estudian la espermatogénesis se basan en modelos animales para muestras de células de espermatogénesis, como sistema fiable de cultivo celular todavía no existe para generar todos los tipos celulares de espermatogénesis 3. Aunque las células de espermatogénesis se recogen fácilmente de testículos enteros, sólo una población mixta resultante. Esto plantea un problema para aquellos que desean estudiar los subtipos específicos de estas células, como las células meióticas, espermátidas red...

La espermatogénesis en mamíferos es un complejo proceso de diferenciación que se produce en varias etapas en los túbulos seminíferos de los testículos 1. Brevemente, el vástago-como espermatogonias que residen cerca del epitelio de la brecha de los túbulos seminíferos y diferenciarse en espermatocitos, que luego se someten a divisiones meióticas. Después de la meiosis es completa, las células haploides resultantes, o espermátidas redondas, se someten a la espermiogénesis, un proceso de diferenciación que implica el derramamiento de citoplasma y compactación del núcleo. Espermátidas desarrollan gradualmente un flagelo y se someten a la elongación y la condensación del núcleo, produciendo alargándose y luego condensación espermátidas, respectivamente. Los productos finales son los espermatozoides, que son liberados en el lumen del túbulo seminífero y en última instancia en el epidídimo donde maduran más. Debido a que el proceso de la espermatogénesis depende de las condiciones hormonales y moleculares especiales enlos testículos, un sistema fiable de cultivo in vitro para todo el proceso de la espermatogénesis todavía no se ha desarrollado 2,3. Los métodos de cultivo se han desarrollado para la creación de &quot;células similares a las células germinales primordiales&quot; y &quot;células-spermatid como redondas&quot; haploides a partir de células madre, pero estos métodos no son capaces de generar un gran número de estas células y dejar de producir células espermatogénica más tarde tipos 4,5. Afortunadamente, los tipos de células de espermatogénesis difieren significativamente en tamaño, lo que permite una suspensión de una sola célula obtenida de testículos enteros para ser separadas con un gradiente líquido. El método STA-PUT, se ha demostrado aquí, utiliza un gradiente lineal BSA y simple de sedimentación para separar las células de espermatogénesis en función del tamaño y la masa de 6-9. El método STA-PUT tiene varias ventajas con respecto a los otros dos métodos más utilizados para separar los tipos de células de espermatogénesis: FACS y decantación 10-13. El aparato STA-PUT requiere onlY varias piezas de cristalería especializada reunieron en una habitación fría o un refrigerador grande. Por lo tanto, es menos caro que el uso de un clasificador de células o un elutriador. El método STA-PUT produce mayores cantidades de células por tipo de célula y los testículos que puede ser ordenada por FACS en un plazo de tiempo similar, aunque la pureza de cada población celular no es tan alta como los obtenidos con FACS 11. Clasificación de células utilizando perlas magnéticas (magnética clasificación de células activadas, MACS) se ha empleado recientemente con éxito para el enriquecimiento de las espermatogonias de una población de células testiculares mixto, pero en este momento no aptos para separar espermatocitos o espermátidas debido a la falta de conocimiento de la superficie apropiada marcadores 14. Una ventaja adicional del método STA-PUT sobre FACS o MACS es la capacidad de aislar las células viables adecuadas para cultivo posterior, ya que, en contraste con la mayoría de los protocolos de FACS, que no requiere ningún ADN o otros tipos de tinción. Para los estudios que requieren lrendimientos arge de tipos de células de espermatogénesis en el ~ 90% de pureza, el STA-PUT es un método ideal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="856">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">BSA</td>
			<td style="width:109px;">Affymetrix/USB</td>
			<td style="width:255px;">10857 100MG</td>
			<td style="width:183px;">Alternate can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:311px;">0.5%, 2%, and 4% BSA solutions</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively).</td>
			<td style="width:183px;">To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr height="91">
			<td height="91" style="height:91px;width:311px;">KREBS (10x)</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20</td>
			<td style="width:183px;">Autoclave/filter and store at 4 &#176;C for several months.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:311px;">KREBS (1x)</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20.</td>
			<td style="width:183px;">To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">Collagenase</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">C9891-1G</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">DNAse</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">DNEP-5MG</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">Trypsin</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">T9201-1G</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">DAPI</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Triton-X100</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Formaldehyde (~37%)</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">TABLE 2: EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Equipment</td>
			<td style="width:109px;">Company</td>
			<td style="width:255px;">Catalog #</td>
			<td style="width:183px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:311px;">Complete STA-PUT apparatus</td>
			<td style="width:109px;">ProScience Glass Shop</td>
			<td style="width:255px;">STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500)</td>
			<td style="width:183px;">Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">10 &#956;m mesh filter</td>
			<td style="width:109px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:255px;">22363549</td>
			<td style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Mouse dissection tools</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:311px;">14 ml round bottom fraction collection tubes with caps</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:547px;">Need approximately 100 tubes</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:311px;">Fraction collector</td>
			<td style="width:109px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:255px;">Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40</td>
			<td style="width:183px;">Alternate can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Microscope slides, cover glass</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Light/Fluorescent Microscope</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of spermatogenic cell types using sta-put velocity sedimentation

La espermatogénesis en mamíferos es un complejo proceso de diferenciación que se produce en varias etapas en los túbulos seminíferos de los testículos. Actualmente, no existe un sistema de cultivo celular fiable que permite la diferenciación espermatogénica in vitro, y la mayoría de los estudios biológicos de las células de espermatogénesis requiere la cosecha de tejidos de los modelos animales como el ratón y la rata. Debido a que el testículo contiene numerosos tipos de células - a la vez no espermatogénesis (de Leydig, de Sertoli, mieloides y células epiteliales) y de espermatogénesis (espermatogonias, espermatocitos, espermátidas redondas, condensación espermátidas y espermatozoides) - estudios de los mecanismos biológicos que intervienen en la espermatogénesis requerir el aislamiento y el enriquecimiento de estos diferentes tipos de células. El método STA-PUT permite la separación de una población heterogénea de células - en este caso, de los testículos - a través de un gradiente de BSA lineal. Tipos de células individuales sedimentan con diferente velocidad de sedimentación según la cetamaño LL, y fracciones enriquecidas para diferentes tipos de células pueden ser recogidos y utilizados en otros análisis. Mientras que el método STA-PUT no da lugar a fracciones altamente puras de tipos de células, por ejemplo, como se puede obtener con ciertos métodos de clasificación de células, proporciona un rendimiento mucho más alto del total de células en cada fracción (~ 1 x 10 8 células / tipo de células espermatogénica de una población a partir de 7-8 x 10 8 células). Este método de alto rendimiento requiere sólo la cristalería especializada y se puede realizar en cualquier habitación fría o un refrigerador grande, por lo que es un método ideal para los laboratorios que tienen acceso limitado a los equipos especializados como un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) o elutriador.

El resultado ideal el procedimiento STA-PUT es una separación bastante notable de las células de los testículos basado en el tamaño celular y la densidad. Mientras que las células aisladas de los testículos se sedimentan a través de la gradiente de BSA, varias bandas distintas de células pueden ser observados. Cualquier grupos de células tienden a hundirse hasta el fondo del gradiente y no contaminar las otras fracciones. Un poco más arriba el gradiente será el gran somáticas y células meióticas. Más arri...

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Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

El método STA-PUT permite la separación de las diferentes poblaciones de células espermatogénica basado en el tamaño y la densidad.

La separación de los tipos de células de espermatogénesis Usando STA-PUT Sedimentación Velocity

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

separation-spermatogenic-cell-types-using-sta-put-velocity

Research

JoVE Journal

Biology

25.5K vistas.  University of Pennsylvania.  El método STA-PUT permite la separación de las diferentes poblaciones de células espermatogénica basado en el tamaño y la densidad. 

Video: Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Actina Co-sedimentación de ensayo, pues el análisis de proteína de unión a la F-actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Investigación

Biología

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Separación electroforética de las proteínas

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and genetics because of its simple life cycle, ease of growth and manipulation for genetic analysis, genomic resources, and transformability of the nucleus and both organelles. Mating strains is a common practice when genetic approaches are used in Chlamydomonass, to create vegetative diploids for analysis of dominance, or following tetrad dissection to ascertain nuclear vs. organellar inheritance, to test allelism, to analyze epistasy, or to generate populations for the purpose of map-based cloning. Additionally, genetic crosses are routinely used to combine organellar genotypes with particular nuclear genotypes. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad separation. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas. Key parameters and trouble spots are explained. Finally, resources for further information and alternative methods are provided.

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and tetrad separation are required for genetic analysis in Chlamydomonas reinhardtii. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad dissection. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas.

El apareamiento y la separación de la Tétrada Chlamydomonas reinhardtii Para el análisis genético

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension and microscopically visualize sperm accumulation around the pipette1. Sperm chemoattraction in vertebrates such as frogs, rodents and humans is more difficult to detect and requires quantitative assays. Such assays are of two major types - assays that quantitate sperm movement to a source of chemoattractant, so-called sperm accumulation assays, and assays that actually track the swimming trajectories of individual sperm.
Sperm accumulation assays are relatively rapid allowing tens or hundreds of assays to be done in a single day, thereby allowing dose response curves and time courses to be carried out relatively rapidly. These types of assays have been used extensively to characterize many well established chemoattraction systems - for example, neutrophil chemotaxis to bacterial peptides and sperm chemotaxis to follicular fluid. Sperm tracking assays can be more labor intensive but offer additional data on how chemoattractancts actually alter the swimming paths that sperm take. This type of assay is needed to demonstrate the orientation of sperm movement relative to the chemoattrractant gradient axis and to visualize characteristic turns or changes in orientation that bring the sperm closer to the egg.
Here we describe methods used for each of these two types of assays. The sperm accumulation assay utilized is called a "two-chamber" assay. Amphibian sperm are placed in a tissue culture plate insert with a polycarbonate filter floor having 12 &mu;m diameter pores. Inserts with sperm are placed into tissue culture plate wells containing buffer and a chemoatttractant carefully pipetted into the bottom well where the floor meets the wall (see Fig. 1). After incubation, the top insert containing the sperm reservoir is carefully removed, and sperm in the bottom chamber that have passed through the membrane are removed, pelleted and then counted by hemocytometer or flow cytometer.
The sperm tracking assay utilizes a Zigmond chamber originally developed for observing neutrophil chemotaxis and modified for observation of sperm by Giojalas and coworkers2,3. The chamber consists of a thick glass slide into which two vertical troughs have been machined. These are separated by a 1 mm wide observation platform. After application of a cover glass, sperm are loaded into one trough, the chemoattractant agent into the other and movement of individual sperm visualized by video microscopy. Video footage is then analyzed using software to identify two-dimensional cell movements in the x-y plane as a function of time (xyt data sets) that form the trajectory of each sperm.

Eggs and the extracellular coatings around eggs frequently release peptides, proteins and small molecules that communicate with sperm to guide them to the egg thereby promoting fertilization. Using frog sperm we describe and compare two classes of assays used to detect sperm chemoattraction &#x2013; sperm accumulation assays and sperm tracking assays.

Dos tipos de ensayos para la detección de espermatozoides quimioatracción rana

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from the seaweed genera Gelidium and Gracilaria, and consists of repeated agarobiose (L- and D-galactose) subunits2. During gelation, agarose polymers associate non-covalently and form a network of bundles whose pore sizes determine a gel&#39;s molecular sieving properties. The use of agarose gel electrophoresis revolutionized the separation of DNA. Prior to the adoption of agarose gels, DNA was primarily separated using sucrose density gradient centrifugation, which only provided an approximation of size. To separate DNA using agarose gel electrophoresis, the DNA is loaded into pre-cast wells in the gel and a current applied. The phosphate backbone of the DNA (and RNA) molecule is negatively charged, therefore when placed in an electric field, DNA fragments will migrate to the positively charged anode. Because DNA has a uniform mass/charge ratio, DNA molecules are separated by size within an agarose gel in a pattern such that the distance traveled is inversely proportional to the log of its molecular weight3. The leading model for DNA movement through an agarose gel is &#34;biased reptation&#34;, whereby the leading edge moves forward and pulls the rest of the molecule along4. The rate of migration of a DNA molecule through a gel is determined by the following: 1) size of DNA molecule; 2) agarose concentration; 3) DNA conformation5; 4) voltage applied, 5) presence of ethidium bromide, 6) type of agarose and 7) electrophoresis buffer. After separation, the DNA molecules can be visualized under uv light after staining with an appropriate dye. By following this protocol, students should be able to: 
 
1. Understand the mechanism by which DNA fragments are separated within a gel matrix 
2. Understand how conformation of the DNA molecule will determine its mobility through a gel matrix 
3. Identify an agarose solution of appropriate concentration for their needs 
4. Prepare an agarose gel for electrophoresis of DNA samples 
5. Set up the gel electrophoresis apparatus and power supply 
6. Select an appropriate voltage for the separation of DNA fragments 
7. Understand the mechanism by which ethidium bromide allows for the visualization of DNA bands 
8. Determine the sizes of separated DNA fragments 
&#160;

A basic protocol for the separation of DNA fragments using agarose gel electrophoresis is described.

Electroforesis en gel de agarosa para la separación de los fragmentos de ADN

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of protein-bound DNA and aligning the short reads to a reference genome. Enriched regions are revealed as peaks, which often differ dramatically in shape, depending on the target protein1. For example, transcription factors often bind in a site- and sequence-specific manner and tend to produce punctate peaks, while histone modifications are more pervasive and are characterized by broad, diffuse islands of enrichment2. Reliably identifying these regions was the focus of our work.
Algorithms for analyzing ChIPseq data have employed various methodologies, from heuristics3-5 to more rigorous statistical models, e.g. Hidden Markov Models (HMMs)6-8. We sought a solution that minimized the necessity for difficult-to-define, ad hoc parameters that often compromise resolution and lessen the intuitive usability of the tool. With respect to HMM-based methods, we aimed to curtail parameter estimation procedures and simple, finite state classifications that are often utilized.
Additionally, conventional ChIPseq data analysis involves categorization of the expected read density profiles as either punctate or diffuse followed by subsequent application of the appropriate tool. We further aimed to replace the need for these two distinct models with a single, more versatile model, which can capably address the entire spectrum of data types.
To meet these objectives, we first constructed a statistical framework that naturally modeled ChIPseq data structures using a cutting edge advance in HMMs9, which utilizes only explicit formulas-an innovation crucial to its performance advantages. More sophisticated then heuristic models, our HMM accommodates infinite hidden states through a Bayesian model. We applied it to identifying reasonable change points in read density, which further define segments of enrichment. Our analysis revealed how our Bayesian Change Point (BCP) algorithm had a reduced computational complexity-evidenced by an abridged run time and memory footprint. The BCP algorithm was successfully applied to both punctate peak and diffuse island identification with robust accuracy and limited user-defined parameters. This illustrated both its versatility and ease of use. Consequently, we believe it can be implemented readily across broad ranges of data types and end users in a manner that is easily compared and contrasted, making it a great tool for ChIPseq data analysis that can aid in collaboration and corroboration between research groups. Here, we demonstrate the application of BCP to existing transcription factor10,11 and epigenetic data12 to illustrate its usefulness.

Our Bayesian Change Point (BCP) algorithm builds on state-of-the-art advances in modeling change-points via Hidden Markov Models and applies them to chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIPseq) data analysis. BCP performs well in both broad and punctate data types, but excels in accurately identifying robust, reproducible islands of diffuse histone enrichment.

Un bayesiano novela Cambio de punto Algoritmo para el Genoma en todo el análisis de diversos tipos de datos ChIPseq

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Orofacial clefts are the most frequent craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal facial development3. In human and mouse, initial growth and patterning of the face relies on several small buds of tissue, the facial prominences4,5. The face is derived from six main prominences: paired frontal nasal processes (FNP), maxillary prominences (MxP) and mandibular prominences (MdP). These prominences consist of swellings of mesenchyme that are encased in an overlying epithelium. Studies in multiple species have shown that signaling crosstalk between facial ectoderm and mesenchyme is critical for shaping the face6. Yet, mechanistic details concerning the genes involved in these signaling relays are lacking. One way to gain a comprehensive understanding of gene expression, transcription factor binding, and chromatin marks associated with the developing facial ectoderm and mesenchyme is to isolate and characterize the separated tissue compartments.
Here we present a method for separating facial ectoderm and mesenchyme at embryonic day (E) 10.5, a critical developmental stage in mouse facial formation that precedes fusion of the prominences. Our method is adapted from the approach we have previously used for dissecting facial prominences7. In this earlier study we had employed inbred C57BL/6 mice as this strain has become a standard for genetics, genomics and facial morphology8. Here, though, due to the more limited quantities of tissue available, we have utilized the outbred CD-1 strain that is cheaper to purchase, more robust for husbandry, and tending to produce more embryos (12-18) per litter than any inbred mouse strain8. Following embryo isolation, neutral protease Dispase II was used to treat the whole embryo. Then, the facial prominences were dissected out, and the facial ectoderm was separated from the mesenchyme. This method keeps both the facial ectoderm and mesenchyme intact. The samples obtained using this methodology can be used for techniques including protein detection, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, microarray studies, and RNA-seq.

A protocol for separation of embryo facial ectoderm and mesenchyme is described. We use Dispase II to treat whole embryos first, dissect whole facial prominences out, and then separate the facial ectoderm and mesenchyme.

La separación de Ratón Facial ectodermo embrionario y mesénquima

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

Asistida por láser microdisección (LAM) como herramienta para la transcripción de perfiles de distintos tipos de células

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical proteins, such as antibodies, vaccine candidates and enzymes. These must be purified from the plant biomass but chromatography steps are hindered by the high concentrations of host cell proteins (HCPs) in plant extracts. However, most HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C facilitating subsequent purification of the target protein. Here, three methods are presented to achieve the heat precipitation of tobacco HCPs in either intact leaves or extracts. The blanching of intact leaves can easily be incorporated into existing processes but may have a negative impact on subsequent filtration steps. The opposite is true for heat precipitation of leaf extracts in a stirred vessel, which can improve the performance of downstream operations albeit with major changes in process equipment design, such as homogenizer geometry. Finally, a heat exchanger setup is well characterized in terms of heat transfer conditions and easy to scale, but cleaning can be difficult and there may be a negative impact on filter capacity. The design-of-experiments approach can be used to identify the most relevant process parameters affecting HCP removal and product recovery. This facilitates the application of each method in other expression platforms and the identification of the most suitable method for a given purification strategy.

Three heat precipitation methods are presented that effectively remove more than 90% of host cell proteins (HCPs) from tobacco extracts prior to any other purification step. The plant HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C.

Comparación de los métodos de tabaco Protein Removal célula huésped mediante escaldado plantas intactas o por tratamiento térmico de los extractos

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Desarrollo de un Sistema de inserción Co-cultivo de dos tipos celulares en ausencia de la célula-célula Contacto

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...