Bu protokol, ilk apikal-out in-a-dish modelini tanımlar ve oral uygulama için amaçlanan potansiyel terapötiklerin in vitro modellemesini kurarken bazal lateral out enteroid in-a-dish modellerine göre kritik bir gelişmedir. Bu yöntem, enteroidlerin apikal yüzeyine erişim sağlar. Bileşikler hücre ortamına eklenebilir ve bileşikler in vivo oldukları gibi apikal olarak alınır.
Potansiyel oral terapötikleri test etmek için in vitro bir bağırsak iltihabı sistemi kurmak isteyen araştırmacılar bu tekniği özellikle yararlı bulabilirler. Farklı yaş ve türlerden elde edilen dokular daha fazla standardizasyon gerektirebilir. Bu nedenle hastalarda polarite kurulurken ters dönme süreleri gerekebilir.
3D enteroidlerin polaritesini tersine çevirmek için, yerleşik 3D bazolateral enteroidlerin 24 kuyucuklu plakasının her bir kuyucuğundan ortamı aspire edin. 24 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 500 mikrolitre beş milimolar buz soğuk, EDTA veya PBS ekleyin ve bir P 200 pipetle beş ila altı kez yukarı ve aşağı pipetle pipetleyerek bazal membran ekstraktını veya hücre dışı matris kubbesini yavaşça mekanik olarak bozun. Dört kuyucuğun içeriğini 15 mililitrelik kronik bir tüpe aktarın.
Daha sonra tüpe sekiz mililitre buz gibi soğuk EDTA kesme PBS ekleyin. Kalan 20 kuyuyu da aynı şekilde aktarın. Tüpleri dönen bir platformda bir saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin veya 330 RPM'de çalkalayın.
Kuluçkadan sonra tüpleri santrifüj edin ve süpernatantı her tüpten atın. Peletleri beş mililitre DMEM F12 ile birleştirin ve yıkayın. Daha sonra hücre süspansiyonunu santrifüj edin ve hücre peletlerinin yeniden askıya alınmasını sağlamak için tüpe 12 mililitre antibiyotiksiz ortam eklemeden önce süpernatantı çıkarın.
Pippet 500 mikrolitre enteroid süspansiyon, 24 kuyucuklu ultra düşük bağlantı plakasının her bir kuyucuğuna yerleştirilir. Plakayı iki ila beş gün boyunca veya enteroidler polariteyi tersine çevirene kadar 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Çekimser kaldığınız ilk günde, 24 kuyucuklu bir plakanın dört kuyucuğunun içeriğini 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.
İstenilen tüm kuyucuklar için ayrı bir tüpte her işlemle tekrarlayın. Tüpleri santrifüj edin ve peleti oda sıcaklığında aldehit fiksatifinden %4'lük 300 mikrolitre içinde yeniden askıya alın. 30 dakika sonra peletleri 500 mikrolitre PBS ile yıkayın.
Tüplere 500 mikrolitre% 0.1 Triton X 100 ekleyin. Tüpleri oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, tüpleri iki ila sekiz santigrat derecede 15 dakika boyunca 200 RPM'de bir rotatör veya çalkalayıcı üzerine yerleştirin.
Son inkübasyondan sonra, PBS T'ye 500 mikrolitre% 10 NDS ekleyin ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Kuluçka sırasında, birincil antikor çözeltisi hazırlayın. Ertesi gün, peletin boyutuna bağlı olarak tüplere 250 ila 500 mikrolitre PBS T ekleyin ve bunları iki ila sekiz santigrat derecede bir saat boyunca 200 RPM'de rotatöre veya çalkalayıcıya yerleştirin.
İkincil antikor çözeltisinden 200 mikrolitre ekleyin ve tüpleri karanlıkta iki ila sekiz santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, tüpleri döndürerek ve 100 mikrolitre süpernatan çıkararak lekeli apikal enteroidleri monte etmeye devam edin. Kalan 100 mikrolitre süpernatanttaki hücreleri yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu 500 mikrolitrelik tüplere aktarın.
Tüpleri 20 saniye boyunca mini bir santrifüjde santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve peletleri 100 mikrolitre oda sıcaklığında çok kırmızı nükleik asit lekesinde yeniden askıya alın. 20 dakikalık inkübasyondan sonra, hücreleri santrifüj edin ve peletleri 100 mikrolitre PBS içinde yeniden askıya alın.
İkinci yıkama ve santrifüjlemeden sonra 70 mikrolitre süpernatantı çıkarın ve peletleri kalan PBS hacminde yeniden askıya alın. Ardından hücre süspansiyonunu etiketli 24 x 60 milimetrelik bir kapak kapağına aktarın. 75 mikrolitre montaj aparatını doğrudan numunenin üzerine uygulayın ve pipet ucuyla kabarcıkları çıkarın.
Karanlıkta gece boyunca kürlendikten sonra, kapak fişlerine ince bir gliserol tabakası uygulayın, ardından kapak kapaklarını cam slaytın üzerine monte edin ve yavaşça yerine bastırın. Kapak kayması ile slayt arasındaki kabarcıkları gidermek için dokunun. Enteroidleri konfokal mikroskopla 20 kat büyütmede görüntülemeden önce kapak kaymasının karanlıkta iki saat oda sıcaklığında ayarlanmasına izin verin.
Enteroid tedaviler için, metin makalesinde açıklandığı gibi 24 saat boyunca bir çanak modelinde apikal bir nekrotizan enterokolit oluşturun. Tahlili yapmadan önce, kalan 400 mikrolitreyi bırakarak her kuyudan 100 mikrolitre ortam çıkarın. Her bir kuyucuğa 400 mikrolitre hücre canlılığı testi reaktifi ekleyin.
Hücre lizisini indüklemek için içeriği 200 RPM'de beş dakika boyunca bir plaka çalkalayıcıda kuvvetlice karıştırın. Daha sonra, 200 mikrolitreyi 96 kuyu berraklığında tabanlı bir plakanın tek bir kuyucuğuna aktarın. Kalan 600 mikrolitre için tekrarlayın ve kuyu başına dört teknik kopya oluşturun.
Lüminesans yapabilen bir plaka okuyucu kullanarak, 0,25 milisaniye entegrasyonunda değerleri kaydedin ve tedaviler arasındaki göreceli değerleri karşılaştırın. Kontrolün temsili immünofloresan boyaması, çekirdeklerin lümene doğru apikal dışarı lokalizasyonunu ve epitelin dış kenarında kötü adamın tespitini doğruladı. Kontrol ile karşılaştırıldığında, lipo polisakkarit, tümör nekroz alfa veya hipoksiye maruz kalmak, tek başına brüt hücre morfolojisi E-kadherin veya kötü adam lokalizasyonunda veya floresan yoğunluğunda açık değişikliklere neden olmamıştır.
Hipoksi ile birlikte lipo polisakkarit veya tümör nekrozu alfa ile tedavi, epitel mimarisini bozdu ve ECA işitme kaybı ve kötü adam boyama ile ortaya çıkan aderans kavşağı ve fırça sınır protein ekspresyonunda önemli bir kayıp gösterdi. Apikal çıkış hücresi canlılığı normoksik veya hipoksik koşullar altında belirlendi. Kontrol lipo polisakkarit veya tümör nekrozu alfa ile karşılaştırıldığında normoksik koşullar altında enteroidlerin hücre canlılığını önemli ölçüde etkilemedi.
Bununla birlikte, lipo polisakkarit veya tümör nekroz alfasında, hipoksi ile kombinasyon halinde, tek başına hipoksiye kıyasla canlılıkta önemli azalmalar gözlenmiştir. Apikal dışarı çanak içi modeli kurarken. EDTA'yı hücre süspansiyonunda buz gibi soğuk tutmayı unutmayın.
Bu, polaritenin tersine çevrilmesini artıracak ve tüm ECM'nin uygun şekilde sıvılaştırılmasını ve çıkarılmasını sağlayacaktır. QPCR, RNA-seq, batı lekelenmesi veya bariyer geçirgenliğinin fonksiyonel değerlendirmeleri gibi diğer aşağı akış uygulamaları, hipokside inflamatuar sinyalleşmeye yanıtı karakterize etmek için daha fazla yapılabilir.
