Biz mükemmel teknik yardım için Bayan Christine A. Winters teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NINDS İntramural Araştırma Programı, NIH (Z01 NS002610) Temel Nörobilim Programı tarafından desteklenmiştir.

Burada açıklanan yaklaşım özel araçlar, araçlar ve yazılımlar kullanarak geliştirilmiştir. Laboratuvarları, aynı deney düzeneği kullanarak olmayacak çünkü yaklaşım mümkün jeneralize. 1.. Hızlı Dondurma Bu dondurma anda canlı hücrelerde olduğu gibi nicel yayılabilir doku bileşenleri ve kimyasal elementlerin dağılımını koruyan bir şekilde hücreler ya da dokuların 1) &quot;cryofixation&quot;: tarif edilecek olan analitik yöntem için kriyojenik yaklaşımlar kesinlikle bağlıdır ve 2) ultra ince hazırlanması bir TEM görüntüleme ve analiz için uygun cryosections. Bu teknikler kısaca burada açıklanan, ancak diğer laboratuvarlarda bu prosedürleri yeniden üretimi için gerekli ayrıntıları bu yazının kapsamı dışındadır vardır. İlgilenen okuyucular mükemmel yeni makaleler 9,14 adlandırılır. Dikkat: Bu bölüm, Sıvı sabun kullanımını tarif ederson derece yanıcı ve potansiyel olarak patlayıcı olan efied etan; uygun önlemler alınmalıdır. Operatör ayrıca sıvı azot aşina olması gerekir (LN 2) koruyucu laboratuvar önlüğü, gözlük ve eldiven gibi cryoresistant güvenlik önlemleri. Not: Burada ve genelinde, tüm aletleri (forseps, vb) dondurulmuş örnekler yanlışlıkla çözülme önlemek için kullanmadan önce LN 2 precooled olmalıdır işlemek için kullanılır. Lamelleri kültürlü hücrelerin <ol><li> LN 2-soğutmalı orta kuyuda -160 ° C&#39;de gaz etan yoğunlaştırarak bir dalma dondurma cihazını hazırlayın. Işaretine kadar doldurun ve dönebilen alüminyum kapak kullanılmadığı ile kuyu kapağı. </li><li> Ince bir sulu film deneysel olarak uygun koşullar altında hücrelerin kültüre plastik lamelleri leke filtre kağıdı kama, kullanma. Doku dokunmamak şekilde kenarından Blot, deneme-yanılma ile belirlenen ideal kalan film, mümkün olduğu kadar ince ama çok th değildoku yüzeyinin kurumasını buharlaşması ve izin verecek şekilde de. </li><li> Sıkma forseps ile kenarından lamel tutarak, hızlı bir şekilde elle veya yerçekimi çalışan pistonu kullanarak, sıvı etan batırmayın. </li><li> Uzun süreli saklama kapları içine lamelleri istenilen sayıda işlemek için yeterince büyük LN 2 yakındaki bir strafor kase, donmuş lamel yerleştirin. LN 2 altında kaçırmamak yok alüminyum vidalı kapaklı kutu tavsiye edilir. </li></ol> Kültürlü beyin dilimleri hızlı dondurma <ol start="5"><li> Diseksiyon mikroskop, görünüm ve şark rahatsız ve hala kültür membran eklemek bağlı bir organotipik hipokampal dilim altında. Siyah Sharpie-tipi kalem ve fotoğraf ile dilimin kenarına yakın membran fiducial işaretlerini yerleştirin. </li><li> Hala mikroskop altında, yaklaşık kesip. Karelere merkezli bireysel dilimleri ile 5 x 5 mm zar kareler. Dilim dokunarak veya zarı eğilmemesie. </li><li> (Aşağıda açıklanan) bir cryoultramicrotome uygun yapılan bir özel tasarlanmış alüminyum disk üzerinde çap agar yastığa ¼ tarafından yastıklı bir membran destekli dilim, montaj. Hızla pnömatik özelleştirilmiş bir &quot;slam dondurma&quot; cihaz vasıtasıyla bir LN 2-soğutmalı safir bloğuna karşı iten tarafından dilim dondurma. </li><li> Kültürlenmiş hücreler için tarif edildiği gibi depolama taşı. </li></ol> 2. Cryosectioning CAVEAT: basit ve mantıklı, eğitim, sabır ve önemli pratik gerektirir iken Başarıyla ultra ince kesitlerin kuru kesim kurdeleler üreten. <ol><li> -135 ° C&#39;ye bir cryoattachment ve serin ile donatılmış bir cryoultramicrotome dışarı pişirin </li><li> Yaklaşık içine donmuş lamelleri kesin. Keskin, soğutulmuş neşter kullanılarak 3 x 3 mm kareler. Kültürler Standart 3 üzerinde, bir viskoz sıvı &quot;cryoglue&quot; in (bir etanol 01:06 karışımı ve 2-propanol 11) yukarı bakacak parçaları gömmikrotom numune aynasını uyacak şekilde tasarlanmış mm çaplı alüminyum pimleri. Kültür yüzeye cryoglue sızıntı kaçının. -160 ° C ≤ için cryobox sıcaklığını düşürerek cryoglue katılaşmaya <ul class="lalpha"><li> Dondurulmuş beyin dilimleri için, güvenli bir vida yaka vasıtasıyla bir ısmarlama numune aynada doğrudan diskler takın. </li></ul></li><li> Bir yakl - dilim lamel parçaları veya belirlenen alanlarda örneğin hücre açısından zengin alanlar - dondurulmuş örneklerin seçili alanlarını kesin. Bir elmas kesme aracı kullanarak 250 x 250 mikron blok yüz ve ~ 100 mikron derinlik. </li><li> Ca ince kesit Kuru kesilmiş şeritler. 35 ° elmas cryoknife kullanılarak -160 ° C, Referencs 4, 9 anlatıldığı esas olarak. Kesme hızı ve bıçak boşluk açısı ampirik olarak belirlenir; iyi bir başlangıç ​​noktası 9 ° 0.4-0.6 mm / sn &#39;dir. Hidratlı bölümlerin anma kalınlığı, yani numune avans, ibölümler esas olarak, sıkıştırma nedeniyle, aslında 1.5-2.0x daha kalın olmakla birlikte, tipik olarak 80 nm s. Tatmin edici kesit, bir antistatik cihaz gereklidir. Bıçak kenarından aygıt 0.5-1 cm&#39;lik iyonize ucu yerleştirin ve bölme tatmin edici şeritleri üretilir kadar çıkış gücü ayarlamak. </li><li> Ahşap aplikatör sopalarla (epoksi) kirpik yapıştırma tarafından kirpik sondaları hazırlayın. Böyle bir sonda kullanılarak, pick up ve bıçak arkasından transfer kısımlarına 100-örgü katlama bakır döküm ızgaralar üzerinde parlayan taburcu, karbon kaplı pioloform destek filmleri üzerine ve arkasında bir çalışma rafta yarım katlanmış indiyum folyo zarfın üzerine oturtulmuş bıçak. Soğuk presleme aracı ile ızgara ve zarfın üst yarısını, basın üzerinde katlayın. </li><li> Bir alüminyum uygun bir ızgara kutusu ve mağaza transfer sarılı ızgaralar gibi adım 1.4 &#39;de tarif edebilirsiniz. </li></ol> 3. Elektron Mikroskop için Örneklerinin Cryotransfer EPMA için temel araçBu laboratuarda 120 kV işletilen ve kriyomikroskopisi için donanımlı, yani temiz bir vakum, numune alan anticontaminator, bir 2k x 2k yüksek hassasiyetli dijital kamera ve cryotransfer numune tutucu ile tasarlanmış analitik bir elektron mikroskobu. Hem de düşük ve yüksek büyütme modlarında mikroskop uyum ve çalışma koşullarını önceden kontrol ve ideal ≤ 10 -7 Torr, tatmin edici bir sütun vakum onaylayın. Gerekli ayar kadar. <ol><li> Cryoholder bir Dewar bileşeninin vakum yalıtım tatminkar olduğunu doğrulayın. Gerektiğinde Pompa. </li><li> Kendi kontrol kutusuna tutucu bağlantı kablosunu ayırmak, mikroskop aşamasının içinde yüksek vakum altında ise, minimum sıcaklık, en az -160 ° C, cryoholder soğutun. Operatör ve mikroskop yüzeylere dökülüp LN 2 en aza indirmek için yuvasından çıkarmadan önce açıölçer 45 ° saat yönünde eğin. </li><li> İntegral izole soğutma benchtop cryoworkstation hazırlayın160 ° C ≤ d cup </li><li> Transferi (quickly!) mikroskop soğutmalı cryoholder iş istasyonu kriyo için. Sahibinin don kalkanını geri çekin. </li><li> LN 2 cryoworkstation çalışma masanın üzerinde depolama ve yerden bir ızgara sandviç altında almak. Sahibinin örnek kuyu için bir tutma halkası da masaya yerleştirilir. </li><li> Indiyum zarfı açın ve cryoholder bir örnek çukuruna kapalı katlama ızgara taşıyın. Anahtar aracı sağlanan ve don kalkan kapatmak kullanarak tespit halkasını ile ızgara sabitleyin. </li><li> Çabuk cryoworkstation gelen cryoholder çıkarın ve mikroskop hava kilidi takın ve mümkün olduğunca çabuk pompalama dizisi geçmesi. Ekleme, sütun vakum minimum bozulma olmalıdır. </li><li> 0 ° eğim açıölçer dönün. Bağlayın ve kontrol kutusu reenergize ve numune sıcaklığı 150 ° C&#39;yi ≤ olduğunu teyit </li><li> Bir Dewar dolduruntutucu numune ve vakum ve sıcaklık tamamen kurtarmak için izin verir. </li></ol> 4. Bölümler Görsel Anketi <ol><li> Örnek ortaya çıkarmak ve elektron ışın açmak için sahibinin don kalkanını geri çekin. </li><li> Görme düşük büyütme, tipik 250X ve düşük aydınlatmada örneği değerlendirmek. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, bölümler, ince ve pürüzsüz, katlanmamış veya üst üste gelen, düz ve iyi destek filminin bağlanmış olabilir ve genellikle ızgara çubukları tarafından gizlenmiş olmamalıdır. </li><li> İsteğe bağlı olarak seçilen bölümleri fotoğraflamak. (NOT: dondurulmuş sulu bölümler ışın kaynaklı hasarlara karşı çok duyarlı olduğundan, ışın maruziyeti en aza indirin.) Seçilmiş bölümlerin koordinatlarını saklamak için otomatik dijital açıölçer sahne kullanın. </li></ol> 5. Bölümler dondurarak kurutma <ol><li> Dondurarak-kurutma bölümleri için ca tutucu sıcaklığının artırılması ile. ~ 30 dakika boyunca 100 ° C. </li><li> Aşağıda -160 ° C veya tutucu recool. </li><li&gt; görüntüleme önce, nedeniyle termal bisiklet ve / veya titreşim pikap görüntü kaymasını önlemek için cryoholder kontrol ünitesi ve fiziksel ayırma kontrolör kablosu kapatılabilir. </li></ol> 6. Hücreler ve Organellerin görüntüleme Dondurularak kurutulmuş bölümlerin yapısal görüntüleri ca elde edilir. -160 ° C gibi düşük doz, uygun yazılımı tarafından kontrol 2k x 2k yavaş tarama CCD kamera kullanarak dijital kaydedilen sıfır kayıp görüntüler. <ol><li> Hi-mag modunda EM etkinleştirin. </li><li> Seç ve görüntü ~ 2,000 X de (TIFF olarak, bakınız Şekil 2) Seçilen hücreler ve yerleri önceden kaydedilmiş depolanmıştır yüksek kaliteli bölümlerinde ilgi hücre içi alanları. (NOT: kurutulmuş bölümleri artık önemli ölçüde daha az kırılgan ve elektron ışın hasar daha az duyarlıdır. </li><li> X-ışını analizi için ilgi alanları (ROI) seçmek için görüntüleri değerlendirin. Bu adım, isteğe göre off-line bir şekilde ifa, EM açık olabilir ve bu durumda olabilirkapalı ve oda sıcaklığına kadar ısınmaya bırakıldı numune. </li></ol> 7. X-ray Spectra kazanılması X-ışını spektrumları herhangi biri kullanılarak kaydedilebilir birkaç ticari veya özel tasarlanmış X-ışını minimal bir enerji dağılımlı X-ışını (EDX) dedektörü, ilişkili darbe işlemcili elektronik ve uyumlu edinimi ve görüntüleme yazılımının oluşan analiz sistemleri. (Bu laboratuvarda kullanılan sistem, Tablo 1 &#39;de tarif edilmektedir.) <ol><li> , Sütunun (gerekirse) içine EDX detektörü sokulması amacı diyafram çekilmesi ve herhangi bir kaçak radyasyon deliklere sokulması ve merkezleme ile X-ışını edinimi için EM yapılandırma. Numunenin donma kirlenmesi önlenir olan en düşük sıcaklığa cryoholder ayarlayın, ancak en az -100 ° C altında </li><li> Sahibine dedektörün doğru 20 ° eğin. </li><li> Geniş alan görüntüleme koşulları altında ve bir bir individua matrisini analiz niyetinde varsayarakl mitokondri, analiz için mitokondriden seçtiğiniz alanın merkezine doğru hareket ettirin ve odaklanır. </li><li> (Bazı mikroskoplar sadece ikinci kondansatör odağını kullanarak ışın yakınsama) nokta moduna gidin ve 100 nm noktaya (bir Faraday fincan veya benzeri ile ölçüldüğü gibi). 3 nA ca ışın akımını arttırmak. </li><li> Spektrum toplama yazılımı başlatın ve ekran monitör üzerinde canlı zaman izlenebilir 100 sn satın almalar, başlar. Kaydedilen spektrumu (Şekil 2) kaydedin. Endüstri standardı EMSA biçimi tercih edilmektedir. </li><li> EM kapatın ve (çevrimdışı) analizi iş istasyonu birden spektrumları dosya (lar) aktarmak. </li></ol> 8. X-ray Spectra Analizi Kalitatif analiz Bir EDX spektrumu (Şekil 2, ek), esas olarak, enerji vs X-ışını yoğunluğunun bir xy grafiğidir. Spectra t elementel kompozisyon ilgili niceliksel ve niteliksel bilgileri içerirBir tepe &quot;karakteristik&quot; enerji yoğunluğu o elementin miktarını yansıtır ederken zirveye sebebiyet veren elemanını tanımlayan o, hacim analiz. Karakteristik tepe noktaları, yavaş değişen bir arka plan, &quot;süreklilik&quot; üstüne binmek. (Şekil 2 &#39;ye gösterge ayrıca EDX spektrumu belirgin bilgilerini ele almaktadır.) Tüm periyodik tablonun için zirve manifoldların enerji elemanlarının iyi bilinen elektronik yapısı, otomatik bileşenlerini tanıtan bir veritabanına böylece tüm EDX yazılım bağlantıları ile tanımlanır Bir analit. Fizyolojik bağlamda, EDX analizi için de uygundur genel ilgi elemanları Na (1.04 keV da K α), P (2.01 keV), K (3.31 keV) ve Ca (3.69 keV) içerir. <ol><li> Spektrasındaki önemli unsurları tanımlamak için mevcut yazılım veritabanı ve zirve eşleşen rutinleri yararlanın. Biyolojik bir örnekte Na, Mg, P, S, Cl, K, ve Ca için zirveleri bulmak için bekliyoruz. (DİKKAT:Son iki unsur örtüşüyor!) </li></ol> Kantitatif analiz EDX spektrumlarının kantitatif analiz ile piklerin entegre alanını ekstre edilmesi ve bir konsantrasyona kadar, bu değer dönüştürme oluşur. Biyolojik analiz için, kurulu bir yaklaşım (yukarıda ve Şekil 2&#39;de tanımlanan) süreklilik yoğunluğu analiz hacminin kuru kütlesine bağlı olarak orantılı olduğu gerçeğinden yararlanır Hall tepe / sürekli yöntem 4,7,10, olup . Bilinen bileşimin standartları spektrumları aynı oran ile karşılaştırıldığında Böylece, pik alanı / sürekli alanının oranı, hedeflenen hücre bölmesine konsantrasyonunu belirtir. Bu yaklaşım, genellikle mmol / kg kuru ağırlığı olarak ifade edilen ağırlık başına mol birimlerinde konsantrasyonlarını içerir unutmayın. Bu birim, sıra dışı ve yorumlanması için EL tarif edildiği gibi, örneğin, mmol / L veya ıslak ağırlık mmol / mg protein, ek dönüştürme gerektirebilir4,10 sewhere. <ol start="2"><li> Z = 10-20 arasında biyolojik elemanları (0,5-4,0 keV) &#39;in doruk alanlarının (ve hata tahminleri) ekstrakte örneğin, Na, Mg, P, S, Cl, K, Ca, analiz yerleşik fitingin rutinleri birini kullanarak yazılım (özellikle 4 dipnot, Tablo 1). Bu laboratuvar Simplex veya çok az kareler uydurma kullanır. Bu uydurma K ve Ca zirveleri arasındaki örtüşme (bkz. Şekil 2) çözümünde dikkat gerektirdiğini unutmayın. </li><li> 1,45-1,61 keV arasındaki süreklilik içinde kaynaştıran. Alternatif parazitsiz bölgeleri kullanılabilir. </li><li> Standartlara kıyasla daha sonra pik / süreklilik oranları ve konsantrasyonları hesaplayın. Analiz boyunca hataları yaymak. </li><li> Biyolojik farklılıkları yansıtmaktadır ortalamalarını tahmin standart istatistiksel yazılım ve formülleri kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Aronova, M. A., Kim, Y. C., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+EFTEM+mapping+of+near+physiological+calcium+concentrations+in+biological+specimens.">Quantitative EFTEM mapping of near physiological calcium concentrations in biological specimens.</a> Ultramicroscopy. 109, 201-212 (2009).</li><li>Aronova, M. A., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+mapping+by+electron+energy+loss+spectroscopy+in+biology.">Elemental mapping by electron energy loss spectroscopy in biology.</a> Methods Mol. Biol. 950, 209-226 (2013).</li><li>Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+neurodegenerative+diseases.">Calcium signaling and neurodegenerative diseases.</a> Trends Mol. Med. 15, 89-100 (2009).</li><li>Fernandez-Segura, E., Warley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+probe+X-ray+microanalysis+for+the+study+of+cell+physiology.">Electron probe X-ray microanalysis for the study of cell physiology.</a> Methods Cell Biol. 88, 19-43 (2008).</li><li>Gibson, G. E., Starkov, A., Blass, J. P., Ratan, R. R., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cause+and+consequence:+Mitochondrial+dysfunction+initiates+and+propagates+neuronal+dysfunction,+neuronal+death+and+behavioral+abnormalities+in+age-associated+neurodegenerative+diseases.">Cause and consequence: Mitochondrial dysfunction initiates and propagates neuronal dysfunction, neuronal death and behavioral abnormalities in age-associated neurodegenerative diseases.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 122-134 (2010).</li><li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+techniques+in+electron+microscopy.">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li><li>LeFurgey, A., Bond, M., Ingram, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frontiers+in+electron+probe+microanalysis:+application+to+cell+physiology.">Frontiers in electron probe microanalysis: application to cell physiology.</a> Ultramicroscopy. 24, 185-219 (1988).</li><li>Newbury, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+X-ray+mapping:+X-ray+spectrum+imaging+above+100+kHz+output+count+rate+with+the+silicon+drift+detector.">The new X-ray mapping: X-ray spectrum imaging above 100 kHz output count rate with the silicon drift detector.</a> Microsc. Microanal. 12, 26-35 (2006).</li><li>Pierson, J., Vos, M., McIntosh, J. R., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+electron+cryotomography+of+vitreous+cryo-sections.">Perspectives on electron cryotomography of vitreous cryo-sections.</a> J. Electron Microsc. 60, S93-S100 (2011).</li><li>Pivovarova, N. B., Hongpaisan, J., Andrews, S. B., Friel, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depolarization-induced+mitochondrial+Ca+accumulation+in+sympathetic+neurons:+spatial+and+temporal+characteristics.">Depolarization-induced mitochondrial Ca accumulation in sympathetic neurons: spatial and temporal characteristics.</a> J. Neurosci. 19, 6372-6384 (1999).</li><li>Pivovarova, N. B., Nguyen, H. V., Winters, C. A., Brantner, C. A., Smith, C. L., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+calcium+overload+in+a+subpopulation+of+mitochondria+triggers+delayed+death+in+hippocampal+neurons.">Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. 24, 5611-5622 (2004).</li><li>Ritchie, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+simulation+in+DTSA-II.">Spectrum simulation in DTSA-II.</a> Microsc. Microanal. 15, 454-468 (2009).</li><li>Stanika, R. I., Winters, C. A., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+NMDA+receptor-dependent+calcium+loading+and+mitochondrial+dysfunction+in+CA1+vs.+CA3+hippocampal+neurons.">Differential NMDA receptor-dependent calcium loading and mitochondrial dysfunction in CA1 vs. CA3 hippocampal neurons.</a> Neurobiol. Dis. 37, 403-411 (2010).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+hemotaxis+receptor+Tsr.">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the hemotaxis receptor Tsr.</a> J. Microsc. 216, 76-83 (2004).</li></ol>

Yazarlar Çıkar çatışması rapor.

Elektron mikroskobu tabanlı bir analitik yöntem, burada sunulan saptama, tanımlama ve Na, K, P, Ca ve özellikle de dahil olmak üzere biyolojik ilgi çeşitli elemanları, miktar tayini için olanak sağlar. Bu analizler, hücre içi de gerçekleştirilebilir, yani, intra-organel, hızlı bir şekilde dondurulmuş numuneler hazırlanmış kriyo seksiyonlarda yüksek kaliteli görüntüler ilgi yapıları bulmak ve tespit etmek yeteneği sayesinde çözünürlük. Boyanma dokusu elemanlarının yer nicel ola...

Kalsiyum iyonları sinaptik iletimi ve gen ifadesi olarak çeşitli normal süreçlerde önemli bir rol oynuyor, belki biyolojideki en önemli ve çok yönlü hücre sinyal varlık vardır. Öte yandan, kalsiyum hücre ölümünde de eşit derecede önemlidir. Özellikle, kalsiyum serbestleşme inme nöronal yaralanmaya önemli bir faktördür, Parkinson hastalığı, Alzheimer ve diğer nörodejeneratif hastalıklar 3,5. Böylece, kalsiyum hücre içinde nasıl dağıtıldığı kantitatif anlamak için son derece önemlidir ve nasıl bu fizyolojik veya patofizyolojik uyaranlara aşağıdaki değiştirir. Çözelti içinde serbest veya bir substrata bağlanmış - - ve hücresel kalsiyum konsantrasyonları stimülasyon bir sonucu olarak, birkaç büyüklük içinde değişebilir, bu amaç, kalsiyum dinamik olarak iki fiziksel durumlar arasında dağıtılır gerçeği ile karmaşıktır. Fr analizi için çeşitli yöntemler gelişmiş olsa da,hücre içi kalsiyum ee, tanımlanmış hücre içi bölümlerinde toplam kalsiyum konsantrasyonları belirlenmesi gerçekçi bir yaklaşımda, yani elektron probu mikroanaliz (EPMA) ile sınırlıdır. EPMA bu çiftler, bir transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile bir X-ışını spektrometresi bir tekniktir. TEM elektron tabancası ilgi ve elektron bombardımanı sonucunda yayılan eleman özgü X-ışınları bir alt hücresel bölgede sabit, Mikronaltı elektron prob odaklanır (ayrıntılı teknik değerlendirmeleri için başvurular 7, 4&#39;e bakın) toplanır ve analiz edilir. EPMA Avantajları tek organel düzeyinde çözünürlüğe ve submillimolar hassasiyet vardır. Ancak uygulamada, EPMA numune hazırlanması ve analizi için özel cryotechniques ve aletleri gerektirir. Burada, araçlar, teknikler ve EPMA kullanılarak hücre içi kalsiyum ölçümleri için uygun araçlar açıklanmıştır. Intramitokondriyal kalsiyum özel i olankritik rol nedeniyle nterest bu nörodejeneratif hastalıklarda mitokondriyal kalsiyum aşırı çalış.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS/MATERIALS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermanox plastic coverslips</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>72280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>For 6-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryopins</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>16701952</td>
			<td>Grooved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood applicators</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>72300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folding EM grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>4GC100/100</td>
			<td>100 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium foil</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>13982</td>
			<td>0.25 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing device</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>KF-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slam freezing device</td>
			<td>LifeCell</td>
			<td>CF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>UC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoattachment for microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>FC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond cryotrimming tool</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Cryotrim 45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond cryoknife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Cryo 35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antistatic device</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Hauf Static Line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo electron microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>EM912 Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM cryo specimen holder</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>CT3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-scan CCD camera, 2k x 2k</td>
			<td>Troendle (TRS)</td>
			<td>Sharpeye</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Olympus SIS</td>
			<td>iTEM suite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ED x-ray detector</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Linksystem Pentafet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse Processor</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>XP-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCI backplane card</td>
			<td>4pi Systems</td>
			<td>Spectral Engine II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Any OS9-compatible model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray analysis software</td>
			<td>NIST</td>
			<td>DTSA, DTSA II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<ol>
				<li>The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line.</li>
				<li>A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at <a href="http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4" target="_blank">http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4</a>.</li>
				<li>The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online.</li>
				<li>The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (<a href="http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm" target="_blank">http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm</a>)</li>
			</ol>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of total calcium in neurons by electron probe x-ray microanalysis

Bu yazıda Electron Probe Micro (EPMA) olarak bilinen teknik kullanılarak araçlar, teknikler ve hücre içi element içeriği nicel ölçümü için uygun bir alet açıklanmaktadır. Intramitokondriyal kalsiyum nedeniyle mitokondriyal kalsiyum aşırı nörodejeneratif hastalıklarda oynadığı kritik rolü belli bir odak noktasıdır. Yöntem, X-ışınları analizi örnek ile bir elektron ışını etkileşimi ile bir elektron mikroskobu (EM) oluşturulur dayanmaktadır. Elektron mikroskobu örneklerinde yayılabilir elemanlarının yerel bir dağılımının muhafaza edilmesi için, ultra ince EPMA cryosections hazırlanması ve ardından doku &quot;cryofixation&quot; gerektirir. Kültürlenmiş hücreler ya da Organotipik dilim kültürlerinin hızlı dondurma sırasıyla soğuk metal bloğun karşı sıvı etan veya çarpma dondurma ile dondurma dalma ile gerçekleştirilir. Kriyokesitler nominal kalınlığında 80 nm ca bir elmas bıçakla kuru kesilir. -16076, C, karbon / pioloform kaplı bakır ızgaralar üzerine monte edilmiş ve özel bir cryospecimen tutucu kullanarak cryo-EM içine cryotransferred. C ve düşük elektron doz ≤ ° -160 görsel ve diğer yer haritalama sonra, dondurulmuş hidratlanmış cryosections dondurularak kurutuldu, ~ 30 dakika boyunca 100 ° C altındadır. Kuru cryosections of organel düzey görsel yavaş tarama CCD kamera ve analiz için seçilen ilgi hücre içi bölgeleri ile, aynı zamanda, düşük bir dozda, kaydedilir. Bir sabit, odaklanmış, yüksek yoğunluklu elektron probu ile ROI yayılan X-ışınları, bir enerji dağıtıcı X-ray (EDX) ilişkili elektroniği tarafından işlenir spektrometresi, ve bir X-ışını spektrumu olarak sunulan toplanır, yani, bir enerji vs X-ışını yoğunluğu arsa. Ek yazılım kolaylaştırır: onların &quot;karakteristik&quot; pik enerjileri ve parmak izi ile elemental bileşenlerin 1) kimlik ve pik alanları / arka plan çıkarma 2) kantitatif analizi. Bu kağıt tipik gösteren iki örnek ile sona eriyorMitokondriyal kalsiyum analizi iskemi direncinin temelini ortaya eksitotoksik yaralanmalara ve diğerinin mekanizmaları önemli bir fikir temin edilen bir hangi EPMA uygulamaları.

Beyin hücreleri tipik olarak işemik koşulları altında ortaya çıkar ve patolojik sinir-iletici salıverilmesinde bir sonucu olarak eksitotoksik incinme. EPMA kalsiyum büyük miktarda ayırmak için nöronal mitokondri yeteneği yaralanma mekanizmasının temelini nasıl keşfetmek için kritik oldu. Şekil 3&#39;teki elektron mikrografı hızlı bir eksitotoksik uyarıcı (100 uM NMDA) ile 30 dakika maruz kaldıktan sonra dondurulabilir kültürlenmiş hipokampal nöronlar dondurularak kurutulmu?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis at JoVE.com

Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

Bu kağıt fizyolojik tanımlanan biyolojik numunelerde subselüler çözünürlükte toplam kalsiyum içeriği ve dağılımı kantitatif ölçümüne cryoanalytical elektron mikroskobu uygulamasını açıklar.

Elektron Probe X-ışını Mikroanaliz tarafından Nöronlar Toplam Kalsiyum Ölçümü

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

measurement-total-calcium-neurons-electron-probe-x-ray

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K Görüntüleme.  National Institutes of Health.  Bu kağıt fizyolojik tanımlanan biyolojik numunelerde subselüler çözünürlükte toplam kalsiyum içeriği ve dağılımı kantitatif ölçümüne cryoanalytical elektron mikroskobu uygulamasını açıklar. 

Video: Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nörobilim

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

Kemirgenler davranmak yılında Hareketli Silikon Problar tarafından Nöronlar Büyük ölçekli Kaydı

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

Belirlenen Nöronlar ve Beslenme Davranışı Kalsiyum sinyaller aynı anda kayıt Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Hipotalamik Fare Beyin Dilimleri GFP etiketli Nöronlar in Görüntüleme Kalsiyum Cevapları

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the structure of neurites is critical to understanding how these processes move materials and signals that support synaptic communication. Electron microscopy (EM) has been traditionally used to assess the ultrastructural features within neurites; however, the exposure to organic solvent during dehydration and resin embedding can distort structures. An important unmet goal is the formulation of procedures that allow for structural evaluations not impacted by such artifacts.
Here, we have established a detailed and reproducible protocol for growing and flash-freezing whole neurites of different primary neurons on electron microscopy grids followed by their examination with cryo-electron tomography (cryo-ET). This technique allows for 3-D visualization of frozen, hydrated neurites at nanometer resolution, facilitating assessment of their morphological differences. Our protocol yields an unprecedented view of dorsal root ganglion (DRG) neurites, and a visualization of hippocampal neurites in their near-native state. As such, these methods create a foundation for future studies on neurites of both normal neurons and those impacted by neurological disorders.

To preserve neuronal processes for ultrastructural analysis, we describe a protocol for plating of primary neurons on electron microscopy grids followed by flash freezing, yielding samples suspended in a layer of vitreous ice. These samples can be examined with a cryo-electron microscope to visualize structures at the nanometer scale.

Cryo-Elektron Tomografi kullanma Frozen-hidratlı Devlette neurites görselleştirme İlköğretim Nöronlar hazırlanması

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve Suprakiazmatik Nucleus Nöronlar Kalsiyum Görüntüleme

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Primer hipokampal nöronlar kalsiyum fosfat transfeksiyonu

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Ratiometric kalsiyum görüntüleme Caenorhabditis Elegans davranışlar içinde bireysel nöronların

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional abnormalities of LC impact several brain regions including cortex, hippocampus, and cerebellum and may contribute to depression, bipolar disorder, anxiety, as well as Parkinson disease and Alzheimer disease. These disorders are often associated with metal misbalance, but the role of metals in LC is only partially understood. Morphologic and functional studies of LC are needed to better understand the human pathologies and contribution of metals. Mice are a widely used experimental model, but the mouse LC is small (~0.3 mm diameter) and hard to identify for a non-expert. Here, we describe a step-by-step immunohistochemistry-based protocol to localize the LC in the mouse brain. Dopamine-&#946;-hydroxylase (DBH), and alternatively, tyrosine hydroxylase (TH), both enzymes highly expressed in the LC, are used as immunohistochemical markers in brain slices. Sections adjacent to LC-containing sections can be used for further analysis, including histology for morphological studies, metabolic testing, as well as metal imaging by X-ray fluorescence microscopy (XFM).

The locus coeruleus is a small cluster of neurons involved in a variety of physiological processes. Here, we describe a protocol to prepare mouse brain sections for studies of proteins and metals in this nucleus.

Fare beynindeki Locus Coeruleus lokalizasyonu

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.