Birkaç kişi bu yazıda anlatılan çalışmalarına katkıda. CVG deney düzeneği inşa ve LS, SHC ve CVG deneyleri yapılmaktadır. CVG ve SHC yazması yazdı. Tüm yazarlar sonrasında revizyon sürecinde yer aldı ve yazının son onaylı kopyası. Biz GCaMP suşu için Paul Sternberg ederim. Bu çalışmada kullanılan bazı nematod suşları Araştırma Kaynakları için NIH Ulusal Merkezi (NCRR) tarafından finanse edilmektedir Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC) tarafından sağlandı. MATLAB görüntü analiz programı 18&#39;de kullanılan uyarlanmıştır. Yazarlar Boston Üniversitesi ve Massachusetts Yaşam Bilimleri Merkezi tarafından desteklenmiştir.

1. Optik Kurulumu <ol><li> Epifloresans görüntüleme yetenekleri ile standart bir bileşik mikroskop kullanın. Biz bir Intensilight HG Aydınlatıcı bir Nikon Eclipse Ti-U inverted mikroskop kullanın. </li><li> En iyi görüntü ve sinyal kalitesi için yüksek bir büyütme, yüksek sayısal diyafram objektif kullanın. Biz tipik bir Nikon X60 1.4 NA yağ immersiyon objektif kullanın. Bazı durumlarda, florofor ve sinyal gücünü ifade seviyesine bağlı olarak (X40, X20) alt büyütme kullanmak mümkündür. </li><li> Örneğin görüntü hassasiyetini maksimize ve arka plan gürültüsünü en aza indirgeyen bir Andor Clara Kamera gibi, CCD kamera soğutmalı yüksek hassasiyet kullanın. </li><li> Tek renk floroforlar fluorofor belirli dalga boyu için tasarlanmış belirlenen standart mikroskop floresan filtre kullanın. GCaMP kullanmak için standart bir GFP filtresi 525 nm 488 nm ve emisyon eksitasyon için optimize ayarlayın. Daha başka optik değişiklikler gereklidir. </li><li&gt; Gibi Cameleon gibi rasyometrik floroforlar için, aynı görüntüleri aynı anda iki ayrı dalga boylarında yakalanabilir böyle bir çift görüntüleme sistemi kullanın. Bu fotoğraf makinesi üzerine ikili görüntü yan yana çıkıntı ile gerçekleştirilir. Bir optik dereceli breadboard temel optik bileşenlerini kullanarak, bunu gerçekleştirmek için basit kurulum, Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Bu oluşur: <ol class="ualpha"><li> 440 ± 20 nm eksitasyon filtresi ve 455 nm ile ayarlanan bir mikroskop filtre uzun dikroik ayna geçmektedir. </li><li> Hemen mikroskop görüntüleme portu (kamera CCD sensör genellikle oturup nerede) dışında ilk görüntü düzlemi yerleştirilen bir görüntü maskesi. Bu kamera sensörü sadece yarısını dolduracak böyle görüş alanını kısıtlar. İki fotoğrafı yan yana öngörülen keskin görüntü sınırları içinde ilk görüntü düzlemi sonuçları ve hiçbir çakışma bu maske yerleştirme. </li><li> İlk röle lensleri t bir odak uzunluğunu ayarlamako ışık collimates böyle ilk görüntü düzlemi. </li><li> (&lt;515 nm, camgöbeği) diğer iletim sırasında tek renk (&gt; 515 nm, sarı) yansıtan iki ayrı görüntüleme dalga veya kanallar içine ışık bölünmeler dikroik ayna. </li><li> Daha da spesifik bir görüntüleme dalga boyunda (485 azından göbeği 535 ± 40 nm ve sarı ± 30 nm): için geçen ışık yayma kısıtlayan filtreler (bant-geçişli filtreler), </li><li> Bu CCD kamera ikinci bir görüntü düzlemine ışık yeniden odaklayan bu tür ışın yolları yerleştirilen ikinci röleye lensleri (Her kanal için bir tane). </li><li> Aynalar ve ikinci bir dikroik ayna bir çift iki görüntünün yeniden birleştirilmesi, bu gibi huzme yolu yönlendirir ve CCD kamera sensörünün üzerine yan yana tahmin edilmektedir. Şekil 4A elde edilen görüntünün bir örneğini göstermektedir. </li></ol></li><li> İlk Optik Hizalama: Yüksek kontrast imag ile optik kurulumu ve hizalaması başlatındüşük bir büyütme merceği ve bulaşan geniş alana ışık aydınlatması (bir mikroskop lamı üzerine çizilmiş siyah bir sharpie iyi çalışır) kullanarak e. Mikroskop Okülerin yoluyla odaklanmak görüntü getirin ve daha sonra kullanılmak üzere mikroskop noktasına geçti. Ile yüksek ışık aydınlatma başlangıç ​​odak düzlemi (mikroskop liman dışında birkaç cm) bir dizin kartı üzerindeki görüntü. Işın yolu ilk röle lens (C) yerleştirin bunu ilk odak düzlemi bir odak mesafesine ve ışın yolu (yani doğrudan ışın yolu ortalanır) saptırma değilken ışığı collimates böyle. Görüş yarı sahadan kısıtlamak ve görüntüde keskin bir yatılı üretmek için ayarlanabilir ilk odak düzlemi, de maske yerleştirin. Şekil 1B &#39;de gösterildiği gibi ışın yolu, tablo yüzeyine paralel kalır ve iki paralel yol yan yana çalışan böyle bir ayna ve filtrelerin (D, E, G) yerleştirin. Merkezi ikinci röleye kendi ışın yolları lensler (F) veKamera CCD sensör olacak idi yerleştirilen bir dizin kartı üzerinde bir odak görüntüleri getirmek için yollar boyunca ileri geri hareket ettirin. Doğru şekilde yapılırsa, iki görüntü mikroskop oküler ve diğer kamera portu ile parfocal olmalıdır. Nihayet konumdaki kameranın yerleştirin ve hizalamayı ince ayar. </li><li> İnce Ayar Optik Hizalama: ince ayar optik hizalama için CCD kamera tarafından görüntülenen çift görüntü kullanın. Yüksek kontrastlı bir resim kullanın ve nihai hizalama için yüksek büyütme geçiş, düşük büyütme ile başlar. Yansıyan görüntü (Şekil 1B sarı kanalı) alanın diğer yarısını kapsayacak şekilde X ve Y. Pozisyonu kamera hareket ettirerek görüş kamera görüş alanının yarısını kapsayacak şekilde iletilen görüntü (Şekil 1B camgöbeği kanalı) konumlandırın kendi ışın yolunda son iki aynalar (G) ayarlayarak görüntüleyebilirsiniz. Işın yolu boyunca ileri geri her kanal için ikinci röleye objektif hareket ettirerek odaklanmak optimize edin. Bırakılırsadeğiştirilmemiş optik kurulum kararlı olmalı ve yalnızca nadir ince ayar ayar gerektirir. </li></ol> 2. Numune Hazırlama ve Veri Toplama. <ol><li> Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC) ya da diğer kaynaklardan ilgi nöron bir kalsiyum duyarlı fluorofor ifade hayvanlar edinin. Alternatif olarak transgenik hayvanlar standart C kullanılarak inşa edilebilir elegans teknikleri. Tek hücre ifade (ve bazen de arzu edilmez çoklu nöronlar araştırılması için ise, 12) görüntü ve birden fazla hücre ölçümleri, kolayca ayrılabilir sürece gerekli değildir. Florofor transgen genomunun içine bütünleşik hale değilse, ifade önemli değişiklik hayvandan hayvana oluşabilir. Bu durumda, bir flüoresan mikroskop kullanarak yüksek ifade seviyeleri ile hayvanlar preselecting sinyal-gürültü oranını arttırır ve ölçümler artırır. Florofor ifade seviyelerini neekolayca deneme tarafından gerekli tedarik parametreleri altında kamera ile görüntülenmek üzere yeterli olması d. </li><li> Laboratuvar bant iki parça tarafından aralıklı iki cam slaytlar arasındaki erimiş agaroz küçük bir damla basarak istediğiniz immobilizasyon tekniği (aşağıya bakınız 2.3) için gerekli agaroz pedleri olun. Eğer gerekirse, agaroz pedler hayvanlar monte edilmeden önce bir cam kapak slipi transfer edilebilir. Şekil 2&#39;ye bakınız. </li><li> C. hareketsiz aşağıdaki tekniklerden birini kullanarak görüntüleme için elegans: <ol class="ualpha"><li> Farmakolojik Paralyzation:% 2 agaroz pedleri (2.2 yastıkları yapmadan önce erimiş agaroz içine karıştırarak) 0.05% Levamizol ekleyin. Ped üzerine 5-10 hayvanlar Pick up ve bir kapak kayma ile kaplayın. Bu konumda tutmak için kapak kayma köşelerine sıcak balmumu karışımı küçük miktarlarda (% 50 parafin ve% 50 vazelin) sürün. B etkisi ve hayvan almak Levamizol için 5-10 dk bekleyintamamen hareketsiz ecome. </li><li> Stiff Agaroz İmmobilizasyon: C. elegans fiziksel sert% 10 agaroz pedleri ve 0.05 mikron çaplı polistiren nanopartiküller kullanılarak immobilize edilebilir. 2.2 gibi% 10 agaroz pedleri (ağırlıkça NGM tamponunda 10% agaroz) olun. Ped üst boncuk çözeltisi ~ 3 ul (hacimce NGM içinde 1:10 oranında polistiren mikro kürecikler) ekleyin. Çabuk, 5-10 C almak pad üzerinde boncuk çözüm havuza ve yavaşça elegans bir kapak kayma ile kaplayın. Bu konumda tutmak için kapak kayma köşelerinde uygulanan erimiş balmumu kullanın. (Bu tekniği hakkında ek ayrıntılar için de bir önceki vallahi Madde 8 olarak 7&#39;ye bakınız) </li><li> Yapıştırma: C. elegans hayvan bir tarafına uygulanır veteriner derece yapışkan küçük miktarlarda kullanarak yerine yapıştırılabilir. </li><li> Mikroakışkan Cihazlar: Sayısız mikroakışkan cihazlar fiziksel C. tutmak için dizayn edilmiştir görüntüleme için yerinde elegans. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Mikroskop hazırlanmış slayt yerleştirin ve istenilen nöron odaklanmak. Bu C. bulmak için en kolay yolu aydınlık alan aydınlatması ve düşük büyütme kullanarak elegans. Sonra yüksek büyütme ve bulmak ve belirli bir nöron odaklanmak floresan görüntüleme geçiş. </li><li> Uyarıcı: Belirli bir uyarıcı, bir nöronal tepkisi (ışık, elektrik alanı, tat ve koku ipuçları, sıcaklık vs) istenirse, uyarı cihazları o da hayvanlara tatbik edilebilir, öyle ki mikroskop kurulumu, uygun şekilde dizayn edilmelidir görüntüleme sırasında numune hazırlama. </li><li> Mikroskop CCD kamera kullanarak görüntü elde edin. Pozlama süreleri ve uyarma ışık seviyesi konkordan az zaman çözünürlüğü ile uzun pozlama süreleri gerektiren zayıf sinyallerle, temel sinyal ve fluorofor ifadesi düzeyine bağlı olacaktır. Biz genellikle ~ 300 milisaniye pozlama süreleri kullanın. </li><li> Bireysel veya bir ti olarak görüntüleri Edinmefilm beni-lapse. Çünkü C. elegans nöronlar genellikle yavaş aktivasyon dinamikleri (yani sodyum bazlı aksiyon potansiyelleri eksikliği) görüntülemek, ~ 1 sn nispeten yavaş kare hızları genellikle nöron dinamiklerini ölçmek için yeterlidir. Toplama oranları kadar ~ bu zayıf floresan için gerekli entegral süre ile sınırlı olabilir ancak saniyede 90 kare kullanılmıştır. Immobilizasyon hazırlık istikrarlı ve kare hızı nispeten yavaş eğer tek bir nöronun Bireysel filmleri kolayca birkaç dakika (~ 5-10 dk) veya daha uzun süre uzatabilir. </li></ol> 3. Veri Analizi <ol><li> ImageJ ve NIS-Elements gibi dinamik ve rasyometrik analiz yetenekleri ile mevcut farklı floresan görüntüleme yazılım paketleri bir dizi vardır. Biz bir ilgi seçilen bölge üzerinde ortalama floresan sinyal ölçen basit bir özel MATLAB programı kullanın. </li><li> Görüntüleri tek tek (veya kalır time-lapse film içinkıpırdamadan) görüntülü nöron ve arka ölçüm için ayrı bir yakındaki bölgede faiz (ROI) bir bölge seçin. Ikili görüntülerin her biri için benzer YG ve arka plan seçin bölgeleri rasyometrik görüntüler için. </li><li> Time-lapse film içinde görüntülü nöronların küçük bir hareketi otomatik olarak çok sayıda nesne izleme düzenleri kullanılarak yapılabilir her çerçeve içinde ROI seçmek için ek bir analiz gerektirir. Bizim program bir kaba sınırı (tüm çerçeveler içinde çıkarların nesneyi kapsayan) elle seçilmiş ve bağımsız bir arka plan bölgesi seçildiği filmde tüm görüntüleri bir sıkıştırılmış görüntüler. İlk çerçeve için bir ROI el ile sınır bölgesi içinde arasından seçilir. Sonraki her çerçeve için, programın doğru boyutu (yani manuel ilk kare ROI olarak piksel aynı sayıda) bir yatırım getirisi oluşturmak için sınır bölgede en parlak piksel seçer. Görüntüler için nereye objecçıkarlarının t bu protokol her kare için makul bir yatırım getirisi seçer sınır bölgede çevreleyen arka planı sonra yeteri kadar parlaktır. </li><li> Her çerçeve için floresan sinyal, F, YG ortalama piksel yoğunluğu eksi arka bölgedeki ortalama yoğunluğu olarak hesaplanır. Oranlı metrik değerler -0.65 / iki sinyal oranı (YFP-YFP arka plan) (CFP-CFP arka plan) olarak hesaplanır. 0.65 faktör floroforlar bağlı olarak (bu değer genellikle Cameleon kurulumları için ~ 0.6) kullanılan belirli bir filtre grubu olacak YFP kanalı içine CFP kanalının akmasını dengeler. </li><li> , Hızındaki / F = (F (t)-F o) / F: o her çerçeve için göreceli kalsiyum seviyesi ilk karesi (veya çerçeve serisi) itibaren ölçülen ilk bazal değere normalize yoğunluğu yüzde değişim olarak hesaplanmıştır F (t) zaman t ve F o da floresans neredeİlk taban değeridir. </li><li> Hücre gövdesi seçilmesi İB güçlü en güçlü sinyaller üretir fakat sinir süreçleri boyunca bir ROI gelen sinyal seçmek ve ölçmek için de mümkündür. </li></ol> 4. Problem Çözme <ol><li> Bleaching: uyarma ışığa maruz fluorofor ağartma ve maruziyet düzeyleri bağlıdır sinyal sürekli bir azalma ile işaretlenmiş neden olabilir. Oranlı metrik ölçümler bunu telafi etmek için yardımcı olur. Bir dalga boyu ağartma Ancak seçici hala (hızlı sonra genellikle CFP ağartıcılar YFP) oluşabilir. Ağartma pozlama süreleri ve / veya uyarma yoğunluğu (aydınlatma yolağındaki nötral yoğunluk filtreleri ile) azaltarak ışığa maruz kalma seviyesini azaltmak oluşursa. Eğer gerekirse, bir sahte denemeler çalıştırma (tahrik maruz kalma aynı fakat hiçbir nöronal uyarıcı ile) ve sinyal çürüme zaman sabitini ölçülmesi ile ağartma telafi edebilir. </li><li><strong&gt; immobilizasyon: basit bir görüntü analiz için hayvan kayıt dönemi boyunca nispeten hala kalır önemlidir burada açıklanan C.. elegans kayıt sırasında hareket ettirmek için en olası hale ışığa maruz kalma ve deneysel uyaranlara yanıt verir. Akson süreçlerinden ölçüm özellikle hafif hareketi ölçüme önemli paraziti üretebilir. Rasyometrik analizi hücre gövdesinden bir ölçüde ve ölçümlerde daha sağlam bu etkileri azaltmaya yardımcı olur. Dikkatli yürütme ve immobilizasyon prosedürlerin arıtma tamamen hareketsiz hayvanlarda neden olacaktır. </li><li> Arka plan Seçimi: bir arka plan bölgenin dikkatli seçimi başarılı bir görüntü analiz için gereklidir. Arkaplan bölgelerde makul üniforma ve görüntülü nöron sonra daha koyu olmalıdır. Bu yeterince görüntülü nöron gelen dağınık ışık (ve böylece alıcı bir sinyal) önlemek için kaldırılmalıdır. Biz bir üniforma bölge 20-5 bulabilirsinizROI, 0 mikron çoğu durumda iyi çalışır. </li><li> Rasyometrik Optik: görüntüsüz optikler Doğru uyum net bir çift görüntü üretmek için önemlidir. Rasyometrik görüntüleme için Ticari mikroskop ekleri mevcuttur. Alternatif bir teknik her biri için ayrı görüntüleri kaydederken hızla emisyon dalga boylarında arasında geçiş yapmak için hızlı bir filtre tekerleği kullanılarak hızlı sıralı görüntüleme istihdam etmektir. </li><li> Rasyometrik Analiz: analiz Burada anlatılan bir yatırım getirisi üzerinden ortalama sayesinde güçlü sinyaller üretir nispeten basit bir tekniktir. Bu ROI seçmek için tanınabilir parlak bir nesne gerektirir. Daha sofistike rasyometrik analizi tam floresan oranı piksel piksel hesaplanabilir böyle ikili görüntüleri hizalayarak ve haritalama ile mümkündür. </li></ol>

<ol>
	<li>Miyawaki, A., Llopis, J., Heim, R., McCaffery, J. M., Adams, J. A., Ikura, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li><li>Kerr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+activity+of+neurons+and+muscles.">Imaging the activity of neurons and muscles.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875 (2009).</li><li>Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies.">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li><li>Rand, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine.">Acetylcholine.</a> WormBook. , (2005).</li><li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+using+nanoparticle-mediated+immobilization.">Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization.</a> PLoS ONE. 8 (1), e53419 (2013).</li><li>Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Laser+Axotomy+in+C.+elegans.">In vivo Laser Axotomy in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (51), e2707 (2011).</li><li>Kerr, R., Lev-Ram, V., Baird, G., Vincent, P., Tsien, R. Y., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+calcium+transients+in+neurons+and+pharyngeal+muscle+of+C.+elegans.">Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans.</a> Neuron. 26, 583-594 (2000).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).</li><li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfabricated+array+of+clamps+for+immobilizing+and+imaging+C.+elegans.">A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans.</a> Lab. Chip. 7, 1515-1523 (2007).</li><li>Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuits+mediate+electrosensory+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 27, 7586-7596 (2007).</li><li>Pinan-Lucarre, B., Gabel, C. V., Reina, C. P., Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Slone, R. D., Xue, J., Qiao, Y., Weisberg, S., Roodhouse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Core+Apoptotic+Executioner+Proteins+CED-3+and+CED-4+Promote+Initiation+of+Neuronal+Regeneration+in+Caenorhabditis+elegans.">The Core Apoptotic Executioner Proteins CED-3 and CED-4 Promote Initiation of Neuronal Regeneration in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biol. 10, e1001331 (2012).</li><li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation.">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neurosci. 7, 30 (2006).</li><li>Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+dynamic+range+of+fluorescent+indicators+for+Ca(2+)+by+circularly+permuted+yellow+fluorescent+proteins.">Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10554-10559 (2004).</li><li>Kindt, K. S., Quast, K. B., Giles, A. C., De, S., Hendrey, D., Nicastro, I., Rankin, C. H., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+mediates+context-dependent+modulation+of+sensory+plasticity+in+C.+elegans.">Dopamine mediates context-dependent modulation of sensory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 55, 662-676 (2007).</li><li>Chalasani, S. H., Chronis, N., Tsunozaki, M., Gray, J. M., Ramot, D., Goodman, M. B., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+a+circuit+for+olfactory+behaviour+in+Caenorhabditis+elegans.">Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 450, 63-70 (2007).</li><li>Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+activity+patterns+in+thermosensory+neurons+of+freely+moving+Caenorhabditis+elegans+encode+spatial+thermal+gradients.">Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients.</a> J. Neurosci. 27, 6083-6090 (2007).</li><li>Biron, D., Shibuya, M., Gabel, C., Wasserman, S. M., Clark, D. A., Brown, A., Sengupta, P., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+diacylglycerol+kinase+modulates+long-term+thermotactic+behavioral+plasticity+in+C.+elegans.">A diacylglycerol kinase modulates long-term thermotactic behavioral plasticity in C. elegans.</a> Nat. Neurosci. 9, 1499-1505 (2006).</li><li>Ghosh-Roy, A., Wu, Z. L., Goncharov, A., Jin, Y. S., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+Cyclic+AMP+Promote+Axonal+Regeneration+in+Caenorhabditis+elegans+and+Require+DLK-1+Kinase.">Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase.</a> Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).</li><li>Bianchi, L., Gerstbrein, B., Frokjaer-Jensen, C., Royal, D. C., Mukherjee, G., Royal, M. A., Xue, J., Schafer, W. R., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxic+MEC-4(d)+DEG/ENaC+sodium+channel+conducts+calcium:+implications+for+necrosis+initiation.">The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation.</a> Nat. Neurosci. 7, 1337-1344 (2004).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri yaygın C. kullanılmıştır elegans nörobiyoloji. Birçok grup bir elektrik alanına ASJ yanıtı burada gösterildiği gibi dış uyaranlara primer duyu nöronlarının yanıt incelemek için bu teknikler istihdam var. Tanınmış örnekler mekanik dokunma hissi, özel kimyasallar, sıcaklık ve elektrik alan 12, 16-19 içerir. Interneuron ve kas hücrelerinin aktivitesi uyarıcıya tepki olarak ve hayvan davranışı kontrol hem de izlen...

Burada C. vivo kalsiyum görüntüleme için pratik yöntemler sunmak elegans nöronlar. Yüksek sinyal-gürültü oranına sahip genetik olarak kodlanmış kalsiyum duyarlı floroforlar gelişimi C. yapar nörofizyoloji ve aktivite ölçümü için nispeten basit ve maliyet etkin sistemi elegans. Bizim görüntüleme yaygın olarak kullanılabilir floroforlar geniş-alan floresan görüntüleme kullanarak standart bir bileşik mikroskop ile yapılır. Biz her birinin güçlü ve zayıf tartışarak, çeşitli floroforlar ve farklı numune hazırlama istihdam çeşitli teknikler mevcut. Veriler daha sonra, iki örnek deneyler sunulmuştur. Burada açıklanan teknikleri üzerine mükemmel bir ek kaynak WormBook, &quot;Görüntüleme nöronlar ve kas aktivitesi&quot; R. Kerr, (bulunabilir <a href="http://www.wormbook.org" target="_blank">http://www.wormbook.org</a> ) 3. Geneti iki ana sınıflarıCally kodlanmış floresan kalsiyum muhabir yaygın olarak kullanılan C. elegans: tek kanallı GCaMP ve FRET tabanlı Cameleon. Biz yöntemleri açıklamak ve her tarafından oluşturulan veriler için örnekler göstereceğiz. GCaMP çevreleyen kalsiyum konsantrasyonu ile duyarlı olan değiştirilmiş bir yeşil floresan proteini (GFP) esas alınmaktadır. Bu, kalmodulin tarafından kalsiyum bağlayıcı etkili bir floresan teyit 2 içine GFP molekül getirir, öyle ki GFP füzyon ve kalsiyum yüksek afinite protein kalmodulin ile gerçekleştirilmektedir. Bu floroforlar yılında son gelişmeler bir kalsiyum düzeylerinin fizyolojik aralığı ve ~ 95 msn yükselme zamanı ve ~ 650 msn bozunma süresi 4 makul hızlı kinetiği üzerinde floresan yoğunluğu% 500&#39;e varan artış ile olağanüstü sinyal boyutunu oluşturur. Nispeten kısa sürelerle (dakika) içinde, bu büyük sinyalleri düşük çözünürlüklü görüntüleme için izin (düşük büyütme) ve iyi huylu init verilen edebilirsinizial Bazal ölçüm, sürekli bazal veya karşılaştırmalı ölçümler için gerekliliğini inkâr. Cameleon iki bağımsız kanal ya da dalgaboyu 1 ile karşılaştıran bir rasyometrik ölçümü üreten bir FRET tabanlı bir florofor olma avantajına sahiptir. Bir kalmodulin proteini ile bağlantılı iki ayrı floroforlar (mavi ve sarı-yayan floresan proteinleri, CFP ve YFP) oluşmaktadır. Karmaşık CFP heyecanlandıran mavi ışık (440 nm) ile aydınlatılır. Kalsiyum bağlama YFP (alıcı) için CFP (donör) floresan rezonans enerji transferi (FRET) artırılması ve CFP emisyon (480 nm) azaltmak ve YFP emisyon (535 nm) artırmak için neden birbirlerine daha yakın floroforlar getiriyor . Göreli kalsiyum seviyeleri YFP / CFP yoğunluk oranı olarak ölçülmüştür. Cameleon kinetiği ~ 1 sn yükselme zamanı ve ~ 3 sn 5 bir çürüme zaman için in vivo ölçülen GCaMP, bu daha yavaştır. Bununla birlikte,zıt hareket eden sinyallerin oran sinyali boyutunu artırır ve nedeniyle florofor konsantrasyon, hareket veya odak kayması ve ağartma değişiklikler mümkündür eşya bir sayı için dengeler. Genetik olarak kodlanmış floresan gazetecilere Eksojen probları ve C ile birlikte gerekli numune hazırlama çok inkâr elegans küçük şeffaf gövde basit geniş bir alan floresan kullanarak sağlam hayvanın içinde görüntüleme sağlar. Numune hazırlamada temel teknik zorluk güvenle hayvanların hareketsiz taşımaktadır. Farklı sık kullanılan teknikler avantaj ve dezavantajları ile her biri bir dizi vardır. Hayvanlar felç bir farmakolojik ajan kullanarak uygulamak kolaydır ve izin (Levamizol, ele geçirmek için kas dokusu sebep genellikle 6 kullanılan bir kolinerjik agonist) bir hazırlık birden hayvanların montaj. C. elegans da fiziksel olarak onları monte edilerek immobilize edilebilirsert% 10 agaroz 7, 8. Hayvan fizyolojisi üzerindeki bu etkisi en aza indirir, uzun süreli görüntüleme (saat) ve çoklu hayvan kurtarma sağlar ama daha teknik olarak zordur. Bu tekniklerin her ikisi hayvan (olan bir kapak slipi altında) için fiziksel erişimi kısıtlamak ve bu nedenle sadece belirli deneysel uyaranlara (örneğin ışık, ısı, elektrik alanı lazer ya da hasar gibi) ile birlikte kullanılabilir. Bu tür kimyasallar touch veya yönetim gibi fiziksel erişimi gereklidir uyaranlar için, birçok çalışma başarıyla C. yapıştırılmış yerde elegans (veterinerlik notu tutkal kullanarak) 9. Bu teknik olarak daha zordur, tek bir hayvan, hazırlık ve hayvan kurtarma izin vermez. Son olarak, çok sayıda mikroakışkan cihazlar fiziksel C. dizginlemek olduğu istihdam edilmiştir elegans, hayvan fizyolojisi koruyarak uyaranlara (cihazın tasarımına bağlı) birçoğuna maruz izin ve hayvanların hızlı değişim ve iyileşme sağlayabilir <sup&gt; 10, 11. Ancak ve arayüz tasarımı, imalat ve uygulanmasında ek teknik beceri ve yetenekleri gerektirir. Sabitlenmiş hayvanlar aktivite ve uyaran olarak tepki genellikle duyusal ve internöron ölçülebilir. Motor nöronların Aktivite hareketli hayvanlarda görüntüleme için daha sofistike teknikler gerektirir. Burada farmakolojik paralyzation ve sert agaroz ile immobilizasyon iki en basit teknikler kullanılarak detaylı yöntemleri sunacak. Burada sunulan yöntemler C. nöronal aktivite ve hücre fizyolojisi ölçmek için kullanılabilir elegans. Her bir örnek vereyim: bir dış elektrik alan için ASJ nöronun duyu yanıtı ölçmek için GCaMP kullanarak ve bir nöronun lazer hasara fizyolojik kalsiyum yanıtı ölçmek için Cameleon kullanarak. Bu örnekler floroforlar iki tip yararları ve sakıncaları göstermek ve sistem ile nelerin mümkün olduğunu göstermektedir.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eclipse Ti-U inverted 
 microscope</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Intensilight HG Illuminator</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>C-HGFI</td>
 <td>Fluorescent light source</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CFI Plan Apo VC 60X Oil</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical table or 3'X3' optical 
 grade breadboard</td>
 <td>Thor Labs</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>If an optical table is not used an 
 optical grade breadboard on a 
 solid laboratory bench should 
 suffice.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clara Interline Camera</td>
 <td>Andor 
 Technology</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>High-sensitivity CCD camera</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>wtGFP Longpass Emission</td>
 <td>Chroma Technology 
 Corp.</td>
 <td>41015</td>
 <td>GFP filter set for imaging GCaMP</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter 440 +/- 10 nm</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>D440/20x EX</td>
 <td>excitation filter for cameleon</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dichroic mirror &gt; 455 nm 
 longpass</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>455DCLP BS</td>
 <td>microscope dichroic for cameleon 
 imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dichroic mirror &gt; 515 nm 
 longpass</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>515DCLP BS</td>
 <td>dichroic mirror for cameleon 
 imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter 535 +/- 15 nm</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>D535/30m EM</td>
 <td>YFP emission filter</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter 480 +/- 20 nm</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>D485/40m EM</td>
 <td>CFP emission filter</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lens, 200 mm, Achromat</td>
 <td>Thor Labs</td>
 <td>AC508-200-A1</td>
 <td>Relay lens for FRET optics (3)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silver broadband mirror</td>
 <td>Thor Labs</td>
 <td>ME2S-P01</td>
 <td>FRET optics (2)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NGM buffer</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Levamisole</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polybead Microspheres</td>
 <td>Polysciences, Inc.</td>
 <td>08691-10, 2.5% by 
 volume, 50 nm 
 diameter</td>
 <td>polystyrene nanoparticles for C. 
 elegans immobilization</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Transgenic strain, Strain 
 gpa-9::GCaMP3(in pha-1; 
 him-5 bkg) </td>
 <td>Sternberg Lab</td>
 <td>Strain PS6388</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Transgenic strain, mec- 
 4::YC3.60</td>
 <td>Gabel Lab</td>
 <td>Strain CG1B</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

in vivo neuronal calcium imaging in c. elegans

Nematod solucanı C. elegans in vivo nispeten basit, düşük maliyetli nöronal görüntüleme için ideal bir model organizmadır. Onun küçük şeffaf gövdeli ve basit, iyi karakterize sinir sistemi sağlam hayvan içindeki kimlik ve herhangi bir nöronun floresan görüntüleme sağlar. Hayvan fizyolojisi üzerinde minimal etkisi ile basit immobilizasyon teknikleri uzun time-lapse görüntüleme sağlar. Böyle Cameleon 1 ve GCaMP 2 olarak genetik olarak kodlanmış kalsiyuma duyarlı floroforlar gelişimi hücre fizyolojisi ve nöronal aktivite hem ilgili nöronal kalsiyum in vivo görüntüleme sağlar. Spesifik nöronlarda bu floroforlar eksprese eden transjenik suşların çok sayıda hazır olan veya iyi bilinen teknikler kullanılarak oluşturulabilir. Burada, GCaMP ve Cameleon ikisini de kullanarak in vivo bir nöronun içinde kalsiyum dinamikleri ölçülmesi için detaylı prosedürler açıklanmaktadır. Biz avantajları ve disadvant tartışmakHer iki yaş hem de numune hazırlama (hayvan immobilizasyon) ve görüntü analizi çeşitli yöntemleri. Travmatik lazer hasarı bir nöronun fizyolojik kalsiyum yanıtı ölçmek için Cameleon kullanarak harici bir elektrik alanı ve 2 belirli bir nöronun duyusal yanıt) ölçmek için GCaMP kullanma) 1: Sonunda, iki deney sonuçları sunmak. Bu gibi Kalsiyum görüntüleme teknikleri C. yaygın olarak kullanılmaktadır elegans ve genetik geçmişleri boyunca serbestçe hareket hayvanlar, aynı anda birden fazla nöron ve karşılaştırma ölçümleri için genişletilmiş edilmiştir. C. elegans teknik basitlik ve maliyet diğer model sistemler üzerinde avantaj ile in vivo nöron görüntüleme için güçlü ve esnek bir sistem sunar.

Burada iki ayrı deney sonuçlarını sunmak. İlk floresan kalsiyum gazetecilere optik bozulmadan C. nöronal etkinliği izlemek için nasıl kullanılabileceğini iyi bir örnek vererek, tanımlı bir dış uyarana belirli bir duyusal nöronun yanıtı ölçmek için GCaMP istihdam elegans. İkinci Cameleon geçici hücre içi kalsiyum böylece kalsiyum fizyoloji in vivo olarak, tek bir hücre içinde ölçülebilir nasıl çalıştığını gösteren, spesifik lazer hasara yanıt olarak bir...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans at JoVE.com

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

Onun küçük şeffaf gövde, iyi belgelenmiş nöroanatomi ve müsait genetik teknikler ve reaktiflerin bir dizi ile,<em&gt; C. elegans</em&gt; Için ideal bir model organizma yapar<em&gt; In vivo</emNispeten basit, düşük maliyetli teknikler kullanılarak&gt; nöronal görüntüleme. Burada genetik olarak kodlanmış floresan kalsiyum göstergeleri kullanarak sağlam bir yetişkin hayvanların içinde tek bir nöron görüntüleme açıklamak.

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

in-vivo-neuronal-calcium-imaging-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

24.8K Görüntüleme.  Boston University School of Medicine. Onun küçük şeffaf gövde, iyi belgelenmiş nöroanatomi ve müsait genetik teknikler ve reaktiflerin bir dizi ile, C. elegans Için ideal bir model organizma yapar In vivo nöronal görüntüleme. Burada genetik olarak kodlanmış floresan kalsiyum göstergeleri kullanarak sağlam bir yetişkin hayvanların içinde tek bir nöron görüntüleme açıklamak.

Video: In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Nörobilim

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

C in vivo Lazer Axotomy elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Görüntüleme Nöronal cevaplar Vomeronasal Organ Dilim hazırlıklar Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensör ifade

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and medical applications. Strengths of fluorescence include its sensitivity, specificity, and compatibility with live imaging. Unfortunately, conventional forms of fluorescence microscopy suffer from one major weakness, diffraction-limited resolution in the imaging plane, which hampers studies of structures with dimensions smaller than ~250 nm. Recently, this limitation has been overcome with the introduction of super-resolution fluorescence microscopy techniques, such as photoactivated localization microscopy (PALM). Unlike its conventional counterparts, PALM can produce images with a lateral resolution of tens of nanometers. It is thus now possible to use fluorescence, with its myriad strengths, to elucidate a spectrum of previously inaccessible attributes of cellular structure and organization.
Unfortunately, PALM is not trivial to implement, and successful strategies often must be tailored to the type of system under study. In this article, we show how to implement single-color PALM studies of vesicular structures in fixed, cultured neurons. PALM is ideally suited to the study of vesicles, which have dimensions that typically range from ~50-250 nm. Key steps in our approach include labeling neurons with photoconvertible (green to red) chimeras of vesicle cargo, collecting sparsely sampled raw images with a super-resolution microscopy system, and processing the raw images to produce a high-resolution PALM image. We also demonstrate the efficacy of our approach by presenting exceptionally well-resolved images of dense-core vesicles (DCVs) in cultured hippocampal neurons, which refute the hypothesis that extrasynaptic trafficking of DCVs is mediated largely by DCV clusters.

We describe how to implement photoactivated localization microscopy (PALM)-based studies of vesicles in fixed, cultured neurons. Key components of our protocol include labeling vesicles with photoconvertible chimeras, collecting sparsely sampled raw images with a super-resolution microscopy system, and processing the raw images to produce a super-resolution image.

Nöronal Yoğun çekirdekli Keseciklerinde süper çözünürlüklü Görüntüleme

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

C. Dauer-spesifik nöronal Yaptırma Vivo Görüntülemede elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

Bioluminescent Kalsiyum Göstergesi GFP-aequorin dayanarak Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşım

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its completely mapped nervous system and transparent anatomy, presents an ideal model for understanding real-time neural dynamics using calcium indicators. In combination with microfluidic technologies and experimental designs, calcium-imaging studies using these indicators are performed in both free-moving and trapped animals. However, most previous studies utilizing trapping devices, such as the olfactory chip described in Chronis et al., have devices designed for use in the more common hermaphrodite, as the less common male is both morphologically and structurally dissimilar. An adapted olfactory chip was designed and fabricated for increased efficiency in male neuronal imaging with using young adult animals. A turn was incorporated into the worm loading port to rotate the animals and to allow for the separation of the individual neurons within a bilateral pair in 2D imaging. Worms are exposed to a controlled flow of odorant within the microfluidic device, as described in previous hermaphrodite studies. Calcium transients are then analyzed using the open-source software ImageJ. The procedure described herein should allow for an increased amount of male-based C. elegans calcium imaging studies, deepening our understanding of the mechanisms of sex-specific neuronal signaling.

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of an adapted &#34;olfactory chip&#34; for the efficient calcium imaging of C. elegans males is described here. Studies of male exposure to glycerol and a pheromone are also shown.

Yanıt olarak erkek C. Elegans baş nöronlar Feromonlar nöronal aktivite görüntüleme için adapte mikrosıvısal koku kozu kullanımı

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Ratiometric kalsiyum görüntüleme Caenorhabditis Elegans davranışlar içinde bireysel nöronların

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and neurodegenerative disease across species. Although these neurotoxic challenges have long been considered to be cell-intrinsic, considerable evidence now supports that misfolded human disease proteins originating in one neuron can appear in neighboring cells, a phenomenon proposed to promote pathology spread in human neurodegenerative disease.
C. elegans adult neurons that express aggregating proteins can extrude large (~4 &#181;m) membrane-surrounded vesicles that can include the aggregated protein, mitochondria, and lysosomes. These large vesicles are called &#8220;exophers&#8221; and are distinct from exosomes (which are about 100x smaller and have different biogenesis). Throwing out cellular debris in exophers may occur by a conserved mechanism that constitutes a fundamental, but formerly unrecognized, branch of neuronal proteostasis and mitochondrial quality control, relevant to processes by which aggregates spread in human neurodegenerative diseases.
While exophers have been mostly studied in animals that express high copy transgenic mCherry within touch neurons, these protocols are equally useful in the study of exophergenesis using fluorescently tagged organelles or other proteins of interest in various classes of neurons.
Described here are the physical features of C. elegans exophers, strategies for their detection, identification criteria, optimal timing for quantitation, and animal growth protocols that control for stresses that can modulate exopher production levels. Together, details of protocols outlined here should serve to establish a standard for quantitative analysis of exophers across laboratories. This document seeks to serve as a resource in the field for laboratories seeking to elaborate molecular mechanisms by which exophers are produced and by which exophers are reacted to by neighboring and distant cells.

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

This protocol describes approaches for detection and quantitation of large aggregate and/or organelle extrusions (~4 &#181;m) produced by C. elegans cells in the form of membrane-bound exophers. We describe strains, growth conditions, scoring criteria, timing, and microscopy considerations needed to facilitate dissection of this debris expulsion mechanism.