Birkaç kişi bu yazıda anlatılan çalışmalarına katkıda. CVG deney düzeneği inşa ve LS, SHC ve CVG deneyleri yapılmaktadır. CVG ve SHC yazması yazdı. Tüm yazarlar sonrasında revizyon sürecinde yer aldı ve yazının son onaylı kopyası. Biz GCaMP suşu için Paul Sternberg ederim. Bu çalışmada kullanılan bazı nematod suşları Araştırma Kaynakları için NIH Ulusal Merkezi (NCRR) tarafından finanse edilmektedir Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC) tarafından sağlandı. MATLAB görüntü analiz programı 18&#39;de kullanılan uyarlanmıştır. Yazarlar Boston Üniversitesi ve Massachusetts Yaşam Bilimleri Merkezi tarafından desteklenmiştir.

1. Optik Kurulumu <ol><li> Epifloresans görüntüleme yetenekleri ile standart bir bileşik mikroskop kullanın. Biz bir Intensilight HG Aydınlatıcı bir Nikon Eclipse Ti-U inverted mikroskop kullanın. </li><li> En iyi görüntü ve sinyal kalitesi için yüksek bir büyütme, yüksek sayısal diyafram objektif kullanın. Biz tipik bir Nikon X60 1.4 NA yağ immersiyon objektif kullanın. Bazı durumlarda, florofor ve sinyal gücünü ifade seviyesine bağlı olarak (X40, X20) alt büyütme kullanmak mümkündür. </li><li> Örneğin görüntü hassasiyetini maksimize ve arka plan gürültüsünü en aza indirgeyen bir Andor Clara Kamera gibi, CCD kamera soğutmalı yüksek hassasiyet kullanın. </li><li> Tek renk floroforlar fluorofor belirli dalga boyu için tasarlanmış belirlenen standart mikroskop floresan filtre kullanın. GCaMP kullanmak için standart bir GFP filtresi 525 nm 488 nm ve emisyon eksitasyon için optimize ayarlayın. Daha başka optik değişiklikler gereklidir. </li><li&gt; Gibi Cameleon gibi rasyometrik floroforlar için, aynı görüntüleri aynı anda iki ayrı dalga boylarında yakalanabilir böyle bir çift görüntüleme sistemi kullanın. Bu fotoğraf makinesi üzerine ikili görüntü yan yana çıkıntı ile gerçekleştirilir. Bir optik dereceli breadboard temel optik bileşenlerini kullanarak, bunu gerçekleştirmek için basit kurulum, Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Bu oluşur: <ol class="ualpha"><li> 440 ± 20 nm eksitasyon filtresi ve 455 nm ile ayarlanan bir mikroskop filtre uzun dikroik ayna geçmektedir. </li><li> Hemen mikroskop görüntüleme portu (kamera CCD sensör genellikle oturup nerede) dışında ilk görüntü düzlemi yerleştirilen bir görüntü maskesi. Bu kamera sensörü sadece yarısını dolduracak böyle görüş alanını kısıtlar. İki fotoğrafı yan yana öngörülen keskin görüntü sınırları içinde ilk görüntü düzlemi sonuçları ve hiçbir çakışma bu maske yerleştirme. </li><li> İlk röle lensleri t bir odak uzunluğunu ayarlamako ışık collimates böyle ilk görüntü düzlemi. </li><li> (&lt;515 nm, camgöbeği) diğer iletim sırasında tek renk (&gt; 515 nm, sarı) yansıtan iki ayrı görüntüleme dalga veya kanallar içine ışık bölünmeler dikroik ayna. </li><li> Daha da spesifik bir görüntüleme dalga boyunda (485 azından göbeği 535 ± 40 nm ve sarı ± 30 nm): için geçen ışık yayma kısıtlayan filtreler (bant-geçişli filtreler), </li><li> Bu CCD kamera ikinci bir görüntü düzlemine ışık yeniden odaklayan bu tür ışın yolları yerleştirilen ikinci röleye lensleri (Her kanal için bir tane). </li><li> Aynalar ve ikinci bir dikroik ayna bir çift iki görüntünün yeniden birleştirilmesi, bu gibi huzme yolu yönlendirir ve CCD kamera sensörünün üzerine yan yana tahmin edilmektedir. Şekil 4A elde edilen görüntünün bir örneğini göstermektedir. </li></ol></li><li> İlk Optik Hizalama: Yüksek kontrast imag ile optik kurulumu ve hizalaması başlatındüşük bir büyütme merceği ve bulaşan geniş alana ışık aydınlatması (bir mikroskop lamı üzerine çizilmiş siyah bir sharpie iyi çalışır) kullanarak e. Mikroskop Okülerin yoluyla odaklanmak görüntü getirin ve daha sonra kullanılmak üzere mikroskop noktasına geçti. Ile yüksek ışık aydınlatma başlangıç ​​odak düzlemi (mikroskop liman dışında birkaç cm) bir dizin kartı üzerindeki görüntü. Işın yolu ilk röle lens (C) yerleştirin bunu ilk odak düzlemi bir odak mesafesine ve ışın yolu (yani doğrudan ışın yolu ortalanır) saptırma değilken ışığı collimates böyle. Görüş yarı sahadan kısıtlamak ve görüntüde keskin bir yatılı üretmek için ayarlanabilir ilk odak düzlemi, de maske yerleştirin. Şekil 1B &#39;de gösterildiği gibi ışın yolu, tablo yüzeyine paralel kalır ve iki paralel yol yan yana çalışan böyle bir ayna ve filtrelerin (D, E, G) yerleştirin. Merkezi ikinci röleye kendi ışın yolları lensler (F) veKamera CCD sensör olacak idi yerleştirilen bir dizin kartı üzerinde bir odak görüntüleri getirmek için yollar boyunca ileri geri hareket ettirin. Doğru şekilde yapılırsa, iki görüntü mikroskop oküler ve diğer kamera portu ile parfocal olmalıdır. Nihayet konumdaki kameranın yerleştirin ve hizalamayı ince ayar. </li><li> İnce Ayar Optik Hizalama: ince ayar optik hizalama için CCD kamera tarafından görüntülenen çift görüntü kullanın. Yüksek kontrastlı bir resim kullanın ve nihai hizalama için yüksek büyütme geçiş, düşük büyütme ile başlar. Yansıyan görüntü (Şekil 1B sarı kanalı) alanın diğer yarısını kapsayacak şekilde X ve Y. Pozisyonu kamera hareket ettirerek görüş kamera görüş alanının yarısını kapsayacak şekilde iletilen görüntü (Şekil 1B camgöbeği kanalı) konumlandırın kendi ışın yolunda son iki aynalar (G) ayarlayarak görüntüleyebilirsiniz. Işın yolu boyunca ileri geri her kanal için ikinci röleye objektif hareket ettirerek odaklanmak optimize edin. Bırakılırsadeğiştirilmemiş optik kurulum kararlı olmalı ve yalnızca nadir ince ayar ayar gerektirir. </li></ol> 2. Numune Hazırlama ve Veri Toplama. <ol><li> Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC) ya da diğer kaynaklardan ilgi nöron bir kalsiyum duyarlı fluorofor ifade hayvanlar edinin. Alternatif olarak transgenik hayvanlar standart C kullanılarak inşa edilebilir elegans teknikleri. Tek hücre ifade (ve bazen de arzu edilmez çoklu nöronlar araştırılması için ise, 12) görüntü ve birden fazla hücre ölçümleri, kolayca ayrılabilir sürece gerekli değildir. Florofor transgen genomunun içine bütünleşik hale değilse, ifade önemli değişiklik hayvandan hayvana oluşabilir. Bu durumda, bir flüoresan mikroskop kullanarak yüksek ifade seviyeleri ile hayvanlar preselecting sinyal-gürültü oranını arttırır ve ölçümler artırır. Florofor ifade seviyelerini neekolayca deneme tarafından gerekli tedarik parametreleri altında kamera ile görüntülenmek üzere yeterli olması d. </li><li> Laboratuvar bant iki parça tarafından aralıklı iki cam slaytlar arasındaki erimiş agaroz küçük bir damla basarak istediğiniz immobilizasyon tekniği (aşağıya bakınız 2.3) için gerekli agaroz pedleri olun. Eğer gerekirse, agaroz pedler hayvanlar monte edilmeden önce bir cam kapak slipi transfer edilebilir. Şekil 2&#39;ye bakınız. </li><li> C. hareketsiz aşağıdaki tekniklerden birini kullanarak görüntüleme için elegans: <ol class="ualpha"><li> Farmakolojik Paralyzation:% 2 agaroz pedleri (2.2 yastıkları yapmadan önce erimiş agaroz içine karıştırarak) 0.05% Levamizol ekleyin. Ped üzerine 5-10 hayvanlar Pick up ve bir kapak kayma ile kaplayın. Bu konumda tutmak için kapak kayma köşelerine sıcak balmumu karışımı küçük miktarlarda (% 50 parafin ve% 50 vazelin) sürün. B etkisi ve hayvan almak Levamizol için 5-10 dk bekleyintamamen hareketsiz ecome. </li><li> Stiff Agaroz İmmobilizasyon: C. elegans fiziksel sert% 10 agaroz pedleri ve 0.05 mikron çaplı polistiren nanopartiküller kullanılarak immobilize edilebilir. 2.2 gibi% 10 agaroz pedleri (ağırlıkça NGM tamponunda 10% agaroz) olun. Ped üst boncuk çözeltisi ~ 3 ul (hacimce NGM içinde 1:10 oranında polistiren mikro kürecikler) ekleyin. Çabuk, 5-10 C almak pad üzerinde boncuk çözüm havuza ve yavaşça elegans bir kapak kayma ile kaplayın. Bu konumda tutmak için kapak kayma köşelerinde uygulanan erimiş balmumu kullanın. (Bu tekniği hakkında ek ayrıntılar için de bir önceki vallahi Madde 8 olarak 7&#39;ye bakınız) </li><li> Yapıştırma: C. elegans hayvan bir tarafına uygulanır veteriner derece yapışkan küçük miktarlarda kullanarak yerine yapıştırılabilir. </li><li> Mikroakışkan Cihazlar: Sayısız mikroakışkan cihazlar fiziksel C. tutmak için dizayn edilmiştir görüntüleme için yerinde elegans. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Mikroskop hazırlanmış slayt yerleştirin ve istenilen nöron odaklanmak. Bu C. bulmak için en kolay yolu aydınlık alan aydınlatması ve düşük büyütme kullanarak elegans. Sonra yüksek büyütme ve bulmak ve belirli bir nöron odaklanmak floresan görüntüleme geçiş. </li><li> Uyarıcı: Belirli bir uyarıcı, bir nöronal tepkisi (ışık, elektrik alanı, tat ve koku ipuçları, sıcaklık vs) istenirse, uyarı cihazları o da hayvanlara tatbik edilebilir, öyle ki mikroskop kurulumu, uygun şekilde dizayn edilmelidir görüntüleme sırasında numune hazırlama. </li><li> Mikroskop CCD kamera kullanarak görüntü elde edin. Pozlama süreleri ve uyarma ışık seviyesi konkordan az zaman çözünürlüğü ile uzun pozlama süreleri gerektiren zayıf sinyallerle, temel sinyal ve fluorofor ifadesi düzeyine bağlı olacaktır. Biz genellikle ~ 300 milisaniye pozlama süreleri kullanın. </li><li> Bireysel veya bir ti olarak görüntüleri Edinmefilm beni-lapse. Çünkü C. elegans nöronlar genellikle yavaş aktivasyon dinamikleri (yani sodyum bazlı aksiyon potansiyelleri eksikliği) görüntülemek, ~ 1 sn nispeten yavaş kare hızları genellikle nöron dinamiklerini ölçmek için yeterlidir. Toplama oranları kadar ~ bu zayıf floresan için gerekli entegral süre ile sınırlı olabilir ancak saniyede 90 kare kullanılmıştır. Immobilizasyon hazırlık istikrarlı ve kare hızı nispeten yavaş eğer tek bir nöronun Bireysel filmleri kolayca birkaç dakika (~ 5-10 dk) veya daha uzun süre uzatabilir. </li></ol> 3. Veri Analizi <ol><li> ImageJ ve NIS-Elements gibi dinamik ve rasyometrik analiz yetenekleri ile mevcut farklı floresan görüntüleme yazılım paketleri bir dizi vardır. Biz bir ilgi seçilen bölge üzerinde ortalama floresan sinyal ölçen basit bir özel MATLAB programı kullanın. </li><li> Görüntüleri tek tek (veya kalır time-lapse film içinkıpırdamadan) görüntülü nöron ve arka ölçüm için ayrı bir yakındaki bölgede faiz (ROI) bir bölge seçin. Ikili görüntülerin her biri için benzer YG ve arka plan seçin bölgeleri rasyometrik görüntüler için. </li><li> Time-lapse film içinde görüntülü nöronların küçük bir hareketi otomatik olarak çok sayıda nesne izleme düzenleri kullanılarak yapılabilir her çerçeve içinde ROI seçmek için ek bir analiz gerektirir. Bizim program bir kaba sınırı (tüm çerçeveler içinde çıkarların nesneyi kapsayan) elle seçilmiş ve bağımsız bir arka plan bölgesi seçildiği filmde tüm görüntüleri bir sıkıştırılmış görüntüler. İlk çerçeve için bir ROI el ile sınır bölgesi içinde arasından seçilir. Sonraki her çerçeve için, programın doğru boyutu (yani manuel ilk kare ROI olarak piksel aynı sayıda) bir yatırım getirisi oluşturmak için sınır bölgede en parlak piksel seçer. Görüntüler için nereye objecçıkarlarının t bu protokol her kare için makul bir yatırım getirisi seçer sınır bölgede çevreleyen arka planı sonra yeteri kadar parlaktır. </li><li> Her çerçeve için floresan sinyal, F, YG ortalama piksel yoğunluğu eksi arka bölgedeki ortalama yoğunluğu olarak hesaplanır. Oranlı metrik değerler -0.65 / iki sinyal oranı (YFP-YFP arka plan) (CFP-CFP arka plan) olarak hesaplanır. 0.65 faktör floroforlar bağlı olarak (bu değer genellikle Cameleon kurulumları için ~ 0.6) kullanılan belirli bir filtre grubu olacak YFP kanalı içine CFP kanalının akmasını dengeler. </li><li> , Hızındaki / F = (F (t)-F o) / F: o her çerçeve için göreceli kalsiyum seviyesi ilk karesi (veya çerçeve serisi) itibaren ölçülen ilk bazal değere normalize yoğunluğu yüzde değişim olarak hesaplanmıştır F (t) zaman t ve F o da floresans neredeİlk taban değeridir. </li><li> Hücre gövdesi seçilmesi İB güçlü en güçlü sinyaller üretir fakat sinir süreçleri boyunca bir ROI gelen sinyal seçmek ve ölçmek için de mümkündür. </li></ol> 4. Problem Çözme <ol><li> Bleaching: uyarma ışığa maruz fluorofor ağartma ve maruziyet düzeyleri bağlıdır sinyal sürekli bir azalma ile işaretlenmiş neden olabilir. Oranlı metrik ölçümler bunu telafi etmek için yardımcı olur. Bir dalga boyu ağartma Ancak seçici hala (hızlı sonra genellikle CFP ağartıcılar YFP) oluşabilir. Ağartma pozlama süreleri ve / veya uyarma yoğunluğu (aydınlatma yolağındaki nötral yoğunluk filtreleri ile) azaltarak ışığa maruz kalma seviyesini azaltmak oluşursa. Eğer gerekirse, bir sahte denemeler çalıştırma (tahrik maruz kalma aynı fakat hiçbir nöronal uyarıcı ile) ve sinyal çürüme zaman sabitini ölçülmesi ile ağartma telafi edebilir. </li><li><strong&gt; immobilizasyon: basit bir görüntü analiz için hayvan kayıt dönemi boyunca nispeten hala kalır önemlidir burada açıklanan C.. elegans kayıt sırasında hareket ettirmek için en olası hale ışığa maruz kalma ve deneysel uyaranlara yanıt verir. Akson süreçlerinden ölçüm özellikle hafif hareketi ölçüme önemli paraziti üretebilir. Rasyometrik analizi hücre gövdesinden bir ölçüde ve ölçümlerde daha sağlam bu etkileri azaltmaya yardımcı olur. Dikkatli yürütme ve immobilizasyon prosedürlerin arıtma tamamen hareketsiz hayvanlarda neden olacaktır. </li><li> Arka plan Seçimi: bir arka plan bölgenin dikkatli seçimi başarılı bir görüntü analiz için gereklidir. Arkaplan bölgelerde makul üniforma ve görüntülü nöron sonra daha koyu olmalıdır. Bu yeterince görüntülü nöron gelen dağınık ışık (ve böylece alıcı bir sinyal) önlemek için kaldırılmalıdır. Biz bir üniforma bölge 20-5 bulabilirsinizROI, 0 mikron çoğu durumda iyi çalışır. </li><li> Rasyometrik Optik: görüntüsüz optikler Doğru uyum net bir çift görüntü üretmek için önemlidir. Rasyometrik görüntüleme için Ticari mikroskop ekleri mevcuttur. Alternatif bir teknik her biri için ayrı görüntüleri kaydederken hızla emisyon dalga boylarında arasında geçiş yapmak için hızlı bir filtre tekerleği kullanılarak hızlı sıralı görüntüleme istihdam etmektir. </li><li> Rasyometrik Analiz: analiz Burada anlatılan bir yatırım getirisi üzerinden ortalama sayesinde güçlü sinyaller üretir nispeten basit bir tekniktir. Bu ROI seçmek için tanınabilir parlak bir nesne gerektirir. Daha sofistike rasyometrik analizi tam floresan oranı piksel piksel hesaplanabilir böyle ikili görüntüleri hizalayarak ve haritalama ile mümkündür. </li></ol>

<ol>
	<li>Miyawaki, A., Llopis, J., Heim, R., McCaffery, J. M., Adams, J. A., Ikura, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li><li>Kerr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+activity+of+neurons+and+muscles.">Imaging the activity of neurons and muscles.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875 (2009).</li><li>Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies.">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li><li>Rand, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine.">Acetylcholine.</a> WormBook. , (2005).</li><li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+using+nanoparticle-mediated+immobilization.">Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization.</a> PLoS ONE. 8 (1), e53419 (2013).</li><li>Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Laser+Axotomy+in+C.+elegans.">In vivo Laser Axotomy in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (51), e2707 (2011).</li><li>Kerr, R., Lev-Ram, V., Baird, G., Vincent, P., Tsien, R. Y., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+calcium+transients+in+neurons+and+pharyngeal+muscle+of+C.+elegans.">Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans.</a> Neuron. 26, 583-594 (2000).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).</li><li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfabricated+array+of+clamps+for+immobilizing+and+imaging+C.+elegans.">A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans.</a> Lab. Chip. 7, 1515-1523 (2007).</li><li>Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuits+mediate+electrosensory+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 27, 7586-7596 (2007).</li><li>Pinan-Lucarre, B., Gabel, C. V., Reina, C. P., Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Slone, R. D., Xue, J., Qiao, Y., Weisberg, S., Roodhouse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Core+Apoptotic+Executioner+Proteins+CED-3+and+CED-4+Promote+Initiation+of+Neuronal+Regeneration+in+Caenorhabditis+elegans.">The Core Apoptotic Executioner Proteins CED-3 and CED-4 Promote Initiation of Neuronal Regeneration in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biol. 10, e1001331 (2012).</li><li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation.">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neurosci. 7, 30 (2006).</li><li>Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+dynamic+range+of+fluorescent+indicators+for+Ca(2+)+by+circularly+permuted+yellow+fluorescent+proteins.">Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10554-10559 (2004).</li><li>Kindt, K. S., Quast, K. B., Giles, A. C., De, S., Hendrey, D., Nicastro, I., Rankin, C. H., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+mediates+context-dependent+modulation+of+sensory+plasticity+in+C.+elegans.">Dopamine mediates context-dependent modulation of sensory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 55, 662-676 (2007).</li><li>Chalasani, S. H., Chronis, N., Tsunozaki, M., Gray, J. M., Ramot, D., Goodman, M. B., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+a+circuit+for+olfactory+behaviour+in+Caenorhabditis+elegans.">Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 450, 63-70 (2007).</li><li>Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+activity+patterns+in+thermosensory+neurons+of+freely+moving+Caenorhabditis+elegans+encode+spatial+thermal+gradients.">Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients.</a> J. Neurosci. 27, 6083-6090 (2007).</li><li>Biron, D., Shibuya, M., Gabel, C., Wasserman, S. M., Clark, D. A., Brown, A., Sengupta, P., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+diacylglycerol+kinase+modulates+long-term+thermotactic+behavioral+plasticity+in+C.+elegans.">A diacylglycerol kinase modulates long-term thermotactic behavioral plasticity in C. elegans.</a> Nat. Neurosci. 9, 1499-1505 (2006).</li><li>Ghosh-Roy, A., Wu, Z. L., Goncharov, A., Jin, Y. S., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+Cyclic+AMP+Promote+Axonal+Regeneration+in+Caenorhabditis+elegans+and+Require+DLK-1+Kinase.">Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase.</a> Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).</li><li>Bianchi, L., Gerstbrein, B., Frokjaer-Jensen, C., Royal, D. C., Mukherjee, G., Royal, M. A., Xue, J., Schafer, W. R., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxic+MEC-4(d)+DEG/ENaC+sodium+channel+conducts+calcium:+implications+for+necrosis+initiation.">The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation.</a> Nat. Neurosci. 7, 1337-1344 (2004).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri yaygın C. kullanılmıştır elegans nörobiyoloji. Birçok grup bir elektrik alanına ASJ yanıtı burada gösterildiği gibi dış uyaranlara primer duyu nöronlarının yanıt incelemek için bu teknikler istihdam var. Tanınmış örnekler mekanik dokunma hissi, özel kimyasallar, sıcaklık ve elektrik alan 12, 16-19 içerir. Interneuron ve kas hücrelerinin aktivitesi uyarıcıya tepki olarak ve hayvan davranışı kontrol hem de izlen...

Burada C. vivo kalsiyum görüntüleme için pratik yöntemler sunmak elegans nöronlar. Yüksek sinyal-gürültü oranına sahip genetik olarak kodlanmış kalsiyum duyarlı floroforlar gelişimi C. yapar nörofizyoloji ve aktivite ölçümü için nispeten basit ve maliyet etkin sistemi elegans. Bizim görüntüleme yaygın olarak kullanılabilir floroforlar geniş-alan floresan görüntüleme kullanarak standart bir bileşik mikroskop ile yapılır. Biz her birinin güçlü ve zayıf tartışarak, çeşitli floroforlar ve farklı numune hazırlama istihdam çeşitli teknikler mevcut. Veriler daha sonra, iki örnek deneyler sunulmuştur. Burada açıklanan teknikleri üzerine mükemmel bir ek kaynak WormBook, &quot;Görüntüleme nöronlar ve kas aktivitesi&quot; R. Kerr, (bulunabilir <a href="http://www.wormbook.org" target="_blank">http://www.wormbook.org</a> ) 3. Geneti iki ana sınıflarıCally kodlanmış floresan kalsiyum muhabir yaygın olarak kullanılan C. elegans: tek kanallı GCaMP ve FRET tabanlı Cameleon. Biz yöntemleri açıklamak ve her tarafından oluşturulan veriler için örnekler göstereceğiz. GCaMP çevreleyen kalsiyum konsantrasyonu ile duyarlı olan değiştirilmiş bir yeşil floresan proteini (GFP) esas alınmaktadır. Bu, kalmodulin tarafından kalsiyum bağlayıcı etkili bir floresan teyit 2 içine GFP molekül getirir, öyle ki GFP füzyon ve kalsiyum yüksek afinite protein kalmodulin ile gerçekleştirilmektedir. Bu floroforlar yılında son gelişmeler bir kalsiyum düzeylerinin fizyolojik aralığı ve ~ 95 msn yükselme zamanı ve ~ 650 msn bozunma süresi 4 makul hızlı kinetiği üzerinde floresan yoğunluğu% 500&#39;e varan artış ile olağanüstü sinyal boyutunu oluşturur. Nispeten kısa sürelerle (dakika) içinde, bu büyük sinyalleri düşük çözünürlüklü görüntüleme için izin (düşük büyütme) ve iyi huylu init verilen edebilirsinizial Bazal ölçüm, sürekli bazal veya karşılaştırmalı ölçümler için gerekliliğini inkâr. Cameleon iki bağımsız kanal ya da dalgaboyu 1 ile karşılaştıran bir rasyometrik ölçümü üreten bir FRET tabanlı bir florofor olma avantajına sahiptir. Bir kalmodulin proteini ile bağlantılı iki ayrı floroforlar (mavi ve sarı-yayan floresan proteinleri, CFP ve YFP) oluşmaktadır. Karmaşık CFP heyecanlandıran mavi ışık (440 nm) ile aydınlatılır. Kalsiyum bağlama YFP (alıcı) için CFP (donör) floresan rezonans enerji transferi (FRET) artırılması ve CFP emisyon (480 nm) azaltmak ve YFP emisyon (535 nm) artırmak için neden birbirlerine daha yakın floroforlar getiriyor . Göreli kalsiyum seviyeleri YFP / CFP yoğunluk oranı olarak ölçülmüştür. Cameleon kinetiği ~ 1 sn yükselme zamanı ve ~ 3 sn 5 bir çürüme zaman için in vivo ölçülen GCaMP, bu daha yavaştır. Bununla birlikte,zıt hareket eden sinyallerin oran sinyali boyutunu artırır ve nedeniyle florofor konsantrasyon, hareket veya odak kayması ve ağartma değişiklikler mümkündür eşya bir sayı için dengeler. Genetik olarak kodlanmış floresan gazetecilere Eksojen probları ve C ile birlikte gerekli numune hazırlama çok inkâr elegans küçük şeffaf gövde basit geniş bir alan floresan kullanarak sağlam hayvanın içinde görüntüleme sağlar. Numune hazırlamada temel teknik zorluk güvenle hayvanların hareketsiz taşımaktadır. Farklı sık kullanılan teknikler avantaj ve dezavantajları ile her biri bir dizi vardır. Hayvanlar felç bir farmakolojik ajan kullanarak uygulamak kolaydır ve izin (Levamizol, ele geçirmek için kas dokusu sebep genellikle 6 kullanılan bir kolinerjik agonist) bir hazırlık birden hayvanların montaj. C. elegans da fiziksel olarak onları monte edilerek immobilize edilebilirsert% 10 agaroz 7, 8. Hayvan fizyolojisi üzerindeki bu etkisi en aza indirir, uzun süreli görüntüleme (saat) ve çoklu hayvan kurtarma sağlar ama daha teknik olarak zordur. Bu tekniklerin her ikisi hayvan (olan bir kapak slipi altında) için fiziksel erişimi kısıtlamak ve bu nedenle sadece belirli deneysel uyaranlara (örneğin ışık, ısı, elektrik alanı lazer ya da hasar gibi) ile birlikte kullanılabilir. Bu tür kimyasallar touch veya yönetim gibi fiziksel erişimi gereklidir uyaranlar için, birçok çalışma başarıyla C. yapıştırılmış yerde elegans (veterinerlik notu tutkal kullanarak) 9. Bu teknik olarak daha zordur, tek bir hayvan, hazırlık ve hayvan kurtarma izin vermez. Son olarak, çok sayıda mikroakışkan cihazlar fiziksel C. dizginlemek olduğu istihdam edilmiştir elegans, hayvan fizyolojisi koruyarak uyaranlara (cihazın tasarımına bağlı) birçoğuna maruz izin ve hayvanların hızlı değişim ve iyileşme sağlayabilir <sup&gt; 10, 11. Ancak ve arayüz tasarımı, imalat ve uygulanmasında ek teknik beceri ve yetenekleri gerektirir. Sabitlenmiş hayvanlar aktivite ve uyaran olarak tepki genellikle duyusal ve internöron ölçülebilir. Motor nöronların Aktivite hareketli hayvanlarda görüntüleme için daha sofistike teknikler gerektirir. Burada farmakolojik paralyzation ve sert agaroz ile immobilizasyon iki en basit teknikler kullanılarak detaylı yöntemleri sunacak. Burada sunulan yöntemler C. nöronal aktivite ve hücre fizyolojisi ölçmek için kullanılabilir elegans. Her bir örnek vereyim: bir dış elektrik alan için ASJ nöronun duyu yanıtı ölçmek için GCaMP kullanarak ve bir nöronun lazer hasara fizyolojik kalsiyum yanıtı ölçmek için Cameleon kullanarak. Bu örnekler floroforlar iki tip yararları ve sakıncaları göstermek ve sistem ile nelerin mümkün olduğunu göstermektedir.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eclipse Ti-U inverted 
 microscope</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Intensilight HG Illuminator</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>C-HGFI</td>
 <td>Fluorescent light source</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CFI Plan Apo VC 60X Oil</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical table or 3'X3' optical 
 grade breadboard</td>
 <td>Thor Labs</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>If an optical table is not used an 
 optical grade breadboard on a 
 solid laboratory bench should 
 suffice.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clara Interline Camera</td>
 <td>Andor 
 Technology</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>High-sensitivity CCD camera</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>wtGFP Longpass Emission</td>
 <td>Chroma Technology 
 Corp.</td>
 <td>41015</td>
 <td>GFP filter set for imaging GCaMP</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter 440 +/- 10 nm</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>D440/20x EX</td>
 <td>excitation filter for cameleon</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dichroic mirror &gt; 455 nm 
 longpass</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>455DCLP BS</td>
 <td>microscope dichroic for cameleon 
 imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dichroic mirror &gt; 515 nm 
 longpass</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>515DCLP BS</td>
 <td>dichroic mirror for cameleon 
 imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter 535 +/- 15 nm</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>D535/30m EM</td>
 <td>YFP emission filter</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter 480 +/- 20 nm</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>D485/40m EM</td>
 <td>CFP emission filter</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lens, 200 mm, Achromat</td>
 <td>Thor Labs</td>
 <td>AC508-200-A1</td>
 <td>Relay lens for FRET optics (3)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silver broadband mirror</td>
 <td>Thor Labs</td>
 <td>ME2S-P01</td>
 <td>FRET optics (2)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NGM buffer</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Levamisole</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polybead Microspheres</td>
 <td>Polysciences, Inc.</td>
 <td>08691-10, 2.5% by 
 volume, 50 nm 
 diameter</td>
 <td>polystyrene nanoparticles for C. 
 elegans immobilization</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Transgenic strain, Strain 
 gpa-9::GCaMP3(in pha-1; 
 him-5 bkg) </td>
 <td>Sternberg Lab</td>
 <td>Strain PS6388</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Transgenic strain, mec- 
 4::YC3.60</td>
 <td>Gabel Lab</td>
 <td>Strain CG1B</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

in vivo neuronal calcium imaging in c. elegans

Nematod solucanı C. elegans in vivo nispeten basit, düşük maliyetli nöronal görüntüleme için ideal bir model organizmadır. Onun küçük şeffaf gövdeli ve basit, iyi karakterize sinir sistemi sağlam hayvan içindeki kimlik ve herhangi bir nöronun floresan görüntüleme sağlar. Hayvan fizyolojisi üzerinde minimal etkisi ile basit immobilizasyon teknikleri uzun time-lapse görüntüleme sağlar. Böyle Cameleon 1 ve GCaMP 2 olarak genetik olarak kodlanmış kalsiyuma duyarlı floroforlar gelişimi hücre fizyolojisi ve nöronal aktivite hem ilgili nöronal kalsiyum in vivo görüntüleme sağlar. Spesifik nöronlarda bu floroforlar eksprese eden transjenik suşların çok sayıda hazır olan veya iyi bilinen teknikler kullanılarak oluşturulabilir. Burada, GCaMP ve Cameleon ikisini de kullanarak in vivo bir nöronun içinde kalsiyum dinamikleri ölçülmesi için detaylı prosedürler açıklanmaktadır. Biz avantajları ve disadvant tartışmakHer iki yaş hem de numune hazırlama (hayvan immobilizasyon) ve görüntü analizi çeşitli yöntemleri. Travmatik lazer hasarı bir nöronun fizyolojik kalsiyum yanıtı ölçmek için Cameleon kullanarak harici bir elektrik alanı ve 2 belirli bir nöronun duyusal yanıt) ölçmek için GCaMP kullanma) 1: Sonunda, iki deney sonuçları sunmak. Bu gibi Kalsiyum görüntüleme teknikleri C. yaygın olarak kullanılmaktadır elegans ve genetik geçmişleri boyunca serbestçe hareket hayvanlar, aynı anda birden fazla nöron ve karşılaştırma ölçümleri için genişletilmiş edilmiştir. C. elegans teknik basitlik ve maliyet diğer model sistemler üzerinde avantaj ile in vivo nöron görüntüleme için güçlü ve esnek bir sistem sunar.

Burada iki ayrı deney sonuçlarını sunmak. İlk floresan kalsiyum gazetecilere optik bozulmadan C. nöronal etkinliği izlemek için nasıl kullanılabileceğini iyi bir örnek vererek, tanımlı bir dış uyarana belirli bir duyusal nöronun yanıtı ölçmek için GCaMP istihdam elegans. İkinci Cameleon geçici hücre içi kalsiyum böylece kalsiyum fizyoloji in vivo olarak, tek bir hücre içinde ölçülebilir nasıl çalıştığını gösteren, spesifik lazer hasara yanıt olarak bir...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans at JoVE.com

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

Onun küçük şeffaf gövde, iyi belgelenmiş nöroanatomi ve müsait genetik teknikler ve reaktiflerin bir dizi ile,<em&gt; C. elegans</em&gt; Için ideal bir model organizma yapar<em&gt; In vivo</emNispeten basit, düşük maliyetli teknikler kullanılarak&gt; nöronal görüntüleme. Burada genetik olarak kodlanmış floresan kalsiyum göstergeleri kullanarak sağlam bir yetişkin hayvanların içinde tek bir nöron görüntüleme açıklamak.

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

in-vivo-neuronal-calcium-imaging-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

24.7K Görüntüleme.  Boston University School of Medicine. Onun küçük şeffaf gövde, iyi belgelenmiş nöroanatomi ve müsait genetik teknikler ve reaktiflerin bir dizi ile, C. elegans Için ideal bir model organizma yapar In vivo nöronal görüntüleme. Burada genetik olarak kodlanmış floresan kalsiyum göstergeleri kullanarak sağlam bir yetişkin hayvanların içinde tek bir nöron görüntüleme açıklamak.