Yazarlar sivrisinek üreme için Miriam Ester teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Araştırma Merkezi Borstel in-house fon tarafından desteklenen ve Leibniz Merkezi Enfeksiyon fon katıldı.

Güvenlik Önlemleri ve Etik Beyanı Bu tarifnamede sunulan çalışmalar, insan patojen Mtb ve kemirgen sıtma paraziti Plasmodium berghei (P. berghei) ile çalışma içerir. Mtb (suş H37Rv) ve P. ile Deneyler berghei Uygun biyo-güvenlik koşullar altında gerçekleştirilmelidir. Biyogüvenlik düzeyi (BGS) 2 laboratuarlar, P. gibi kemirgen sıtma parazitleri için gerekli dolayısıyla berghei ve Mtb için BSL 3 ve bütün-enfeksiyon çalışmalar için burada tarif edildiği. NOT: Mtb ile enfekte edilen fareler hemen yakınında diğer farelerin (kendi gözlem) enfeksiyon yayılır yok. Deneyci Spread nedenle bırakılabilir ancak uygun koruyucu giysiler her zaman BSL 3 laboratuar içi giyilmelidir vardır. Bizim kurallara göre, deneyci dış bir zaman bir atılır hangi cerrahi fırçalama, saç ağları, tek solunum ve iki çift eldiven giymekrms kabineden çekilir. Yeni olanları tekrar kabine girmeden önce konur. İki kaplar,% 2 Buraton ile bir (NOT: MTB inaktive onaylanan diğer dezenfektanlar onaylı konsantrasyonda kullanılabilir), sıvı ve bulaşıcı atık malzeme ve yüzey dekontaminasyon için bir, deneyden önce hazırlanan ve kabine içine yerleştirilir. Buna ek olarak, plastik torba bulaşıcı olmayan bir katı atıklar için kullanılacaktır. Alman kurallarına göre, Mtb türetilen Mtb kültürlerin veya doku taşıma ve işleme ile ilgili tüm iş fareler bir BSL3 laboratuvar içinde bir sınıf 2 biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır bulaşmış. Mikobakterıler tutarken tedbirler her zaman aerosollerin oluşumunu önlemek için alınması gerekir. 6-8 hafta arası Erkek C57BL / 6 fareleri (Charles River), her-enfeksiyon deneyleri için kullanılan ve BSL özel bariyer koşullar altında 3 imkanları muhafaza edilmiştir. Hayvan bakımı ve deney pe edildiTarım, Çevre ve Schleswig-Holstein Eyaleti Kırsal Alanlar için Bakanlığı Hayvan Deneyleri Etik Kurulu tarafından onaylanan protokoller uyarınca rformed Sıtma sivrisinek aşamaları elde etmek için, NMRI fareler Charles River Laboratory, Sulzfeld, Almanya &#39;den satın alındı ​​ve Heidelberg Üniversitesi Hayvan imkan (IBF) içinde belirli bir patojen içermeyen koşullar altında tutuldu. Tüm hayvan deneyleri Avrupa yönetmeliklerine göre yapılır ve Baden-Württemberg&#39;de (Regierungspräsidium Karlsruhe) ve devlet yetkilileri tarafından kabul edildi. 1.. Bir Glas-Col Aerosol odacığı kullanılarak Mtb ile Farelerin enfeksiyonu Aerosol Mtb ile deney hayvanlarının aerosol enfeksiyonu standardize etmek için en iyi yolu, bilinen CFU titrelerle dondurulmuş stoklarından mikobakterıler kullanmaktır. Stok kültürleri hazırlamak, Middlebrook 7H9 broth kültürü Mtb OADC (oleik ile desteklenmişasit, albümin, dekstroz, Katalaz) zenginleştirme ortamı ve% 0.05 Tween 80, mikobakteriler için bir karbon kaynağı ve aynı zamanda bakteriyel kümeleşmeyi önlemek için ölçer. Kültürler hasat zamanında bir OD ≤ 1 olmalıdır. Yüksek OD olarak, bakteriyel topaklanma artar ve canlılığı azalır. -80 ° C&#39;de saklayın 1 ml&#39;lik eş payları % 0.5 gliserol, 1 g / L asparagin ile takviye 7H11 agar plakaları üzerinde üç bağımsız şişelerin 10 katlık seyreltileri, bir dizi kaplama ile dondurulmuş stok birim (CFU) oluşturan uygun bir koloni sayısı ve OADC belirlemek ve sonra 4 koloni saymak 37 ° C&#39;de inkübasyon hafta Aşağıda tarif edildiği gibi aerosol enfeksiyon yapın. <ol><li> Dikkatli bir şekilde çözülme Mtb bilinen CFU titresinin stokları ve bir 27 G iğne ile donatılmış bir 1 ml şırınga ile bakteri kümeleri dağıtmak için bir süspansiyon beş kez karıştırın. Aerosol üretimini önlemek. </li><li> İstenen enfeksiyon dozu bağlı olarak, içine mikobakteriyel stokunun istenen hacmi aktarmaksteril PBS içeren 50 ml&#39;lik bir tüp. Nihai hacmi, 6 ml &#39;dir. NOT: Bu süspansiyon içinde mikroorganizma sayısının değiştirilmesiyle, aerosol damlacıkları taşıyan bakteri oranı değişir. Biz genellikle akciğer (düşük doz enfeksiyon) başına 100 canlı basil bir alımı hedefliyoruz. Deneyimlerimize göre, bu 5,5 ml nebulize olmak üzere 6 ml&#39;lik bir toplam hacim içinde yaklaşık 1-2 x 10 6 Mtb / ml (aşağıya bakın). Bu enfeksiyon için ideal koşullar bulmak için bakterilerin farklı konsantrasyonları ile deneysel aerosol zorlukların bir dizi yapmak için tavsiye edilir. Kadar 5000 mikobakteriyel enfeksiyonlar yüksek dozda 5 bakteriler gibi birkaç başarılı bir aerosol ile fareleri enfekte etmek için kullanılabilir olarak, enfeksiyon işlemini hızlandırmak için yapılabilir ise. Enfeksiyon oranı genellikle% 100&#39;dür. </li><li> Inokulum titresini belirlemek için kaplama için (gerekli nihai hacme aşan hazırlanmıştır) yeterli hacmi çıkarın; genellikle teknik triplicates plaka 500 ul çıkarın. </li><li> Hayvanların koyunBir kompartman örgü dairesel aerosol odasının içinde sepet (sepet başına bir fare) ve aerosol odasının kapağını kapatın. NOT: Diğer modeller 20 fare ağırlayacak her biri beş ayrı bölmeleri, oluşan bir pasta şeklinde sepet ile donatılmıştır. </li><li> Üç paslanmaz çelik soket bağlantıları için Venturi-nebulizatör ünitesini takın. </li><li> Bir kör 18 G iğne ile donatılmış 10 ml&#39;lik bir şırınga ile 50 ml tüpten mikobakteriyel süspansiyon çıkarın ve kapalı bir taşıma kutusu içinde aerosol bölmeye şırınga taşır. </li><li> Nebulizer biriminin vidalı kapağı çıkarın ve dikkatle nebulizer içine mikobakterler süspansiyonu enjekte. Aerosollerin nesil kaçının. 2% Buraton içeren bir kesici kabın içine şırınga atın. Vidalı kapaklı nebulizatörü Seal. </li><li> Ana güç anahtarı ve UV lamba açın. Kontrol tuş takımı üzerindeki ekran &quot;Glas-Col Aparatı Co&quot; gösterir. </li><li> Program düğmesini açın. Ekran iradegöstermek &quot;nebulizatör hazır mı?&quot; &quot;sepet yerleştirilmiş mi?&quot; ne zaman hazır enter tuşuna basın. &quot; Enter tuşuna basın. </li><li> Ekranda &quot;Onceden Zaman 900 girin&quot; gösterir, bu 900 sn (egzoz havayı dekontamine) yakma fırını için ön ısıtma zamanı demektir. Enter tuşuna basın. </li><li> Göstergede &quot;nebulizing süresi 1.800 Enter&quot; olacaktır, bu spreyleme süresi varsayılan olarak 1.800 sn ayarlanır demektir. Nebulizing süresini uzatmak amacıyla, &quot;2400&quot; girin ve enter tuşuna basın. Not: nebulize edici döngüsü sırasında, basınç altında hava böylece mikobakteriler içeren küçük bir aerosol damlacıkları üreten, süspansiyon atomize. Ana hava akımı, bu damlacıklar (boyut olarak yaklaşık 2-5 um) aerosol odasına gerçekleştirilmektedir. </li><li> Ekranda &quot;CD saatler 1.800 Enter&quot; olacaktır, bu çürüme döngü 1.800 sn sürer demektir. &quot;2.400&quot; ve enter tuşuna basın ayarlayın. NOT: Bu döngü sırasında, bulut hangi u inşa edilmiştirnebulize edici döngüsü sırasında aerosol odası içinde p çürüme olabilir. Küçük damlacıklar, deney hayvanları tarafından teneffüs edilir. </li><li> Ekranda &quot;Aralık Saat 900 girin&quot; gösterecek, bu UV ışığı dekontaminasyon çevrimi 900 sn alacak demektir. Enter tuşuna basın. Makine ön ısıtma, nebulizing, bulut çürüme ve UV dekontaminasyon ile bisiklet başlayacaktır. DİKKAT: ve döngü başlar nebulizing zaman sıkıştırılmış hava akış metre 10 feet küp / saat (kontrol; buna göre hava kontrol valfi ayarlamak vakum debi ölçer (gerekirse vakum kontrol valfini ayarlamak ön ısıtma döngüsü başladığında kontrol) 60 ayak küp / saat belirtmelidir .) </li><li> Döngüsü tamamlandığında, tuş takımı &quot;Süreci Tamamlandı - Numune Kaldır&quot; gösterecektir. Program, UV ve ana güç anahtarını kapatın. </li><li> Mikobakteri süspansiyon tamamen nebulized ve değilse, dikkatli ile donatılmış uygun bir şırınga ile süspansiyon kaldırarak kalan hacmi rekor olup olmadığını kontrol edin18 G künt bir iğne. Geri kalan hacmi fazla 1 mi olmamalıdır. </li><li> Eklem nebulizatörü çıkarın ve 2 saat en az% 2 Buraton içeren bir tavada yerleştirin, genellikle dezenfeksiyon O / incelemeleri yapılır Daha sonra, taze bir tavaya nebulizatörü aktarmak ve su ile iyice durulayın. Kurumaya nebulizatörü bırakın. </li><li> Aerosol odasını açın ve kafeslerine hayvanların dönmek. Otoklav torbaları ve otoklavda çanta sepetler. . Güvenlik nedenlerinden dolayı, motorlu bir hava temizleyici respiratör Bu işlem sırasında giyilmelidir: 2% Buraton NOT aerosol odasının iç yüzeyleri silerek temizleyin. </li><li> 7H11 agar plakaları üzerinde bir teknik üç kez (3 x 100 ul), plaka 10-kat seyreltme (adım 1.3) mikobakteriyel süspansiyonun geri kalan 500 ul kullanılması. </li></ol> 2. Akciğerler İstenilen CFU Alımı doğrulayın Deney hayvanlarının aerosol enfeksiyondan bir gün sonra bakteriyel lo belirlerİstenen CFU alımını teyit etmek için belirlenen kontrol hayvanların akciğerlerinde ad. NOT: Biz genellikle günde 1 CFU belirlenmesi için 3-5 farelerin ekstra grubunu belirlemek. Zamanla Mtb enfeksiyonun seyrini izlemek için, mikobakteriyel doku yük CFU belirlenmesi için bütün organ homojenatlarının seri dilüsyonları kaplama ile incelenebilir. Akciğer tüberkülozunda hastalık tezahürü için birincil site ancak dalak, karaciğer ve lenf düğümleri genellikle buna göre analiz edilir. Kaplama olmak üzere dilüsyonlar dokuda, yanı sıra organ ve bir zaman noktasında farklı bakteri yüklere neden olur, ilk aşı (yüksek doz genel düşük doz) bağlıdır organlardaki beklenen mikobakteriyel yüke bağlıdır analiz edilebilir. Düşük dozda enfeksiyonu üzerine, akciğerde Mtb H37Rv bakteriyel yük genellikle günde 25-30 arasında bir düzlüğe ulaşır. <ol><li> CO 2 boğulma ya: ötenazi hayvanları (Ötanazi yerleştirinTerminal bir sınıf II biyogüvenlik kabini içinde bir diseksiyon gemide emici kağıt üzerinde anestezi) ve% 70 etanol ile dezenfekte fareler. NOT:% 70 alkol sadece yüzey dekontaminasyon için ve MTB öldürmez. </li><li> Karın ortasında küçük bir kesi yapmak ve başının üstünde fare derisi geri çekin. </li><li> Cerrahi makas ile karın ve göğüs kafesi açın ve akciğerler erişilebilir, böylece göğüs duvarını kaldırın. </li><li> Akciğerleri çıkarın ve homojen hale getirme tamponunda (steril su /% 1 h / h Tween 80/1% w / v albümini) ile bir 15 ml tüp içine aktarın. </li><li> Küçük bir Petri kabı içine 100 mikron elek ile 5 ml şırınga gerginlik akciğerlerin pistonu kullanarak. </li><li> Gömme elekler birkaç kez bir engel ucu ile donatılmış bir 1 ml pipet kullanılarak ve 8 agar plakaları arasında akciğer homojenatı dağıtmak (yaklaşık 250 ul / plaka;. Emin bir de kuru bir yüzeye sahip olun). </li><li> Dikkatlice% 2 içine atılan tek kullanımlık gübre kullanılarak örnekleri plakaBuraton. </li><li> Kabine içinde kurumaya agar plakaları bırakın. , Parafilm ile her bir levha mühür alüminyum folyo sarılmakta ve en az 4 hafta süreyle 37 ° C&#39;de inkübe dik. </li></ol> 3. Kaçış-proof Sivrisinek Kafesleri İnşaatı Kemirgen Plasmodium suşları insanlara zararlı değildir. Bununla birlikte, Mtb-enfekte edilmiş fareler parazit ve işin alıcıları olduğu BSL 3 koşullar altında yapılır, önlemler, kafesleri kaçmasını sivrisinek önlemek için gereklidir. Planlanan enfeksiyon rejimine bağlı olarak, otoklavlanabilir ve metal çerçeve kafesler veya kendi kendine yapılan tek kafesler yeniden kullanılabilir. Deney hayvanlarının bite enfeksiyonu ile fare başına sivrisinek tanımlanmış bir dizi ile gerçekleştirilebilir için gerekli ise, bu ikinci olanlar tavsiye edilmektedir. Self-made kafesleri gerekiyorsa, sivrisinek ve laboratuvar güvenliği sağlığı gibi tam özelliklerine kafesleri hazırlamak onların sou bağlıdırnd inşaat (Şekil 2). <ol><li> Böyle bir yarım litrelik dondurma karton veya kağıt kahve fincan (Şekil 2) gibi bir karton alın. </li><li> Kartonun yan içine, küçük bir açıklık kesin ve sivrisinekler için güvenli bir giriş oluşturmak için her bir parça kesilmiş bir yarık ile lateks bir çift tabaka ile kapatın. Not: açıklığı 2 cm x 2 cm arasında bir toplam boyut vardır, biz getirmek ve / veya almak-out sivrisinekler için kullanılan boru (aspiratör cihazı) bir vakum pompasına bağlı bir tadil edilmiş 15 ml Falcon tüpü olan ve bu nedenle olarak hizmet 1.5 cm&#39;lik bir çapa sahip bir aspiratör. </li><li> Damlar kadar emmek için kartonun iç altındaki filtre kağıt parçası bantlayın. </li><li> Netleştirme (Naylon örgü, çift katmanlı, büyüklüğü 1 mm x 1 mm) ile dondurma bardak kapatın kapatın ve bant ve elastik bant ile karton düzeltmek. </li><li> Fare başına sivrisinek sayısı tanımlanmış gerekmektedir enfeksiyon deneyleri için, enfekte olmuş 10-15 sivrisinek ile kafesleri hazırlamak, bunların her biri, ideal bir av içeren10.000 yabani tip tükürük bezi P. erage berghei sporozoites. </li><li> İdeal olarak, önce kan yemek yerine, 24 saat süre ile sivrisinekleri açlıktan. </li></ol> 4. Sivrisinek Bite Farelerde Sıtma Enfeksiyon Burada kullanılan kemirgen malarya paraziti olan P. berghei ancak ilgi duyulan herhangi bir başka kemirgen Plasmodium suşu kullanılabilir. Bulaşıcı sivrisinek elde etmek için sporozoit iletim için parazitin bütün yaşam döngüsü omurgalı bir konakçının (fare) ve sivrisinek vektör hem de muhafaza edilmektedir. Parazit bakım bir insectary gerçekleştirilir. Doğal iletim deneyler için, tükürük bezi sporozoitler başına en az sayıda en az 10,000 olmalıdır. Detaylı protokollerin parazit bakım biz Moll ve ark Sıtma Araştırma Yöntemleri bakın., 2013. <ol><li> Naif fare veya Ketamine ile Mtb ile 40 gün boyunca hayvanlar preinfected uyuşturan (100 mg / kg)intraperitoneal enjeksiyon ile (200 ul / fare) ile ve Xylazine (7 mg / kg) çözeltisi. NOT: Mtb ve Plasmodium enfeksiyonu arasındaki süre yatan araştırma sorusuna bağlı olarak ayarlanabilir. Aynı şekilde, patojen zorlukların sırası tersine çevrilebilir, yani önce fareler Mtb enfeksiyonu bulaşıcı sivrisinek ısırığı maruz olabilir. </li><li> Sivrisinek kafeslere (fare oranı olarak tanımlanır sivrisinek için sivrisinek kafes başına bir fare) ve örgü üzerine anestezi fareler yerleştirin ve sivrisinek 10-15 dakika boyunca zarın içinden beslemek için izin verir. Not: sivrisinek bağırsaklarında kan varlığı besleme ve dolayısıyla, iletim sporozoit ifade eder. </li><li> Geri kafesler içine fare aktarmak ve bunlar anestezi uyanmak kadar sürekli denetleyecek. Kağıt havlu üzerine değil, yatak (boğulma tehlikesi) yerleştirin fareler ve (yakından birlikte yer ve kağıt havlu ile organları kapsayan) sıcak tutmak: Not. </li><li> Nett ile,% 70 etanol ya da diğer dezenfektan püskürterek sivrisinek öldürmekKafesin ing. Tek olanlar kullanılmış olsaydı Otoklav kafesleri ve atın. </li></ol> 5. İzleme Parazitemi <ol><li> Delinme kuyruk çok bir iğne ile sona erdirmek ve bir slayt her sonunda bir damla kan toplamak damarlar. </li><li> Slaytın uzunluğunun yarısından bir damla kan çekmek için başka bir slayt kullanın. Ikinci smear için diğer kenarı kullanmak için dağıtıcıya ters çevirin. Kuru hava slaytlar bırakın. </li><li> Giemsa leke <ol><li> Slayt sahipleri slaytlar yerleştirin ve mutlak metanol kısa daldırma tarafından kan smear düzeltmek. NOT: cam eşya kullanımı tüm çözümler için polipropilen cuvettes kullanmak BSL 3 minimumda tutulmalıdır çünkü. </li><li> Giemsa lekesi içindeki (deiyonize su içinde 1:10) bırakın. 10 dakika sonra, fazla leke uzak durulamak için deiyonize su ile bir kaç kez doldurulmuş boyama küvetler içinde ve dışında slaytlar daldırma. </li><li> Son olarak, dik bir konumda hava kuru kayar. </li></ol></li><li> ALTERNATİF LEKE: Wright &amp; #180; s leke <ol><li> Metanol içinde 1 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyonda Wright lekesi çözülür. </li><li> Kullanmadan önce katlanmış filtre üzerinden filtre. </li><li> Boyama çözüm kan smear daldırın ve 4 dakika boyunca inkübe (NOT: boyama çözüm dayanır metanol gibi smear metanol tespit gerekli değildir). </li><li> Yukarıda tarif edildiği gibi, iyonu giderilmiş su içinde durulama slaytlar ile yıkanır ve hava ile kurumasına slaytlar bırakın. </li><li> Giemsa / Wright &#39;ın leke tamamlandıktan sonra, hafifçe bir Buraton içeren bertaraf pota kullanılan tüm reaktifler aktarın. </li></ol></li><li> Kan yayması analizi <ol><li> Yağ daldırma ile 100 misli büyütmede, ışık mikroskobu ile lekeli kan smear analiz edin. </li><li> Eritrositler, bir tek tabaka halinde düzenlenmiş kan yayma bir alanda enfekte edilmemiş ve enfekte eritrositler sayısı. </li><li> Iyi tanımlanmış bir paraziteminin elde etmek için, bir tek tabaka eritrosit gösteren görünümü, en az 10 farklı alanları sayılır. </li><li> Calculeritrositlerin sayısına göre parazitli eritrosit sayısına bölünmesi ve 100 ile çarpılması ile (% olarak) göreli paraziteminin yedi. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Mueller, A. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Transmission+of+Plasmodium+berghei+Exacerbates+Chronic+Tuberculosis+in+an+Experimental+Co-Infection+Model.">Natural Transmission of Plasmodium berghei Exacerbates Chronic Tuberculosis in an Experimental Co-Infection Model.</a> PLoS ONE. 7, e48110 (2012).</li><li>Korbel, D. S., Schneider, B. E., Schaible, U. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+in+tuberculosis:+myths+and+truth.">Innate immunity in tuberculosis: myths and truth.</a> Microbes Infect. 10, 995-1004 (2008).</li><li>Aly, A. S., Vaughan, A. M., Kappe, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+parasite+development+in+the+mosquito+and+infection+of+the+mammalian+host.">Malaria parasite development in the mosquito and infection of the mammalian host.</a> Annu. Rev. Microbiol. 63, 195-221 (2009).</li><li>Cirimotich, C. M., Dong, Y., Garver, L. S., Sim, S., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+immune+defenses+against+Plasmodium+infection.">Mosquito immune defenses against Plasmodium infection.</a> Dev. Compar. Immuno. 34, 387-395 (2010).</li><li>Page, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium-induced+potentiation+of+type+1+immune+responses+and+protection+against+malaria+are+host+specific.">Mycobacterium-induced potentiation of type 1 immune responses and protection against malaria are host specific.</a> Infect. Immun. 73, 8369-8380 (2005).</li><li>Hawkes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+exacerbates+experimental+mycobacterial+infection+in+vitro+and+in+vivo.">Malaria exacerbates experimental mycobacterial infection in vitro and in vivo.</a> Microbes Infect. 12, 864-874 (2010).</li><li>Scott, C. P., Kumar, N., Bishai, W. R., Manabe, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+report:+modulation+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection+by+Plasmodium+in+the+murine+model.">Short report: modulation of Mycobacterium tuberculosis infection by Plasmodium in the murine model.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 70, 144-148 (2004).</li><li>Hoffman, S. L., Doolan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+vaccines-targeting+infected+hepatocytes.">Malaria vaccines-targeting infected hepatocytes.</a> Nat. Med. 6, 1218-1219 (2000).</li><li>Mueller, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+attenuated+Plasmodium+berghei+liver+stages+persist+and+elicit+sterile+protection+primarily+via+CD8+T+cells.">Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells.</a> Am. J. Pathol. 171, 107-115 (2007).</li><li>Mueller, A. K., Labaied, M., Kappe, S. H., Matuschewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+Plasmodium+parasites+as+a+protective+experimental+malaria+vaccine.">Genetically modified Plasmodium parasites as a protective experimental malaria vaccine.</a> Nature. 433, 164-167 (2005).</li><li>Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+immunity+produced+by+the+injection+of+x-irradiated+sporozoites+of+plasmodium+berghei.">Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei.</a> Nature. 216, 160-162 (1967).</li><li>Vaughan, J. A., Scheller, L. F., Wirtz, R. A., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectivity+of+Plasmodium+berghei+sporozoites+delivered+by+intravenous+inoculation+versus+mosquito+bite:+implications+for+sporozoite+vaccine+trials.">Infectivity of Plasmodium berghei sporozoites delivered by intravenous inoculation versus mosquito bite: implications for sporozoite vaccine trials.</a> Infect. Immun. 67, 4285-4289 (1999).</li><li>Coleman, J., Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+midgut+and+salivary+glands+from+Ae.+aegypti+mosquitoes.">Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes.</a> J. Vis. Exp. , e228 (2007).</li><li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Plasmodium+berghei+reference+line+that+constitutively+expresses+GFP+at+a+high+level+throughout+the+complete+life+cycle.">A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).</li><li>Lin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss-of-function+analyses+defines+vital+and+redundant+functions+of+the+Plasmodium+rhomboid+protease+family.">Loss-of-function analyses defines vital and redundant functions of the Plasmodium rhomboid protease family.</a> Mol. Microbiol. 88, 318-338 (2013).</li><li>Bancroft, J. D. G., M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and Practice of Histological Techniques. , (2007).</li><li>Schneider, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+IL-18+in+protective+immunity+against+Mycobacterium+tuberculosis.">A role for IL-18 in protective immunity against Mycobacterium tuberculosis.</a> Eur. J. Immunol. 40, 396-405 (2010).</li><li>Craig, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+animal+models+for+research+on+severe+malaria.">The role of animal models for research on severe malaria.</a> PLoS Pathog. 8, e1002401 (2012).</li><li>de Souza, J. B., Hafalla, J. C., Riley, E. M., Couper, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+malaria:+why+experimental+murine+models+are+required+to+understand+the+pathogenesis+of+disease.">Cerebral malaria: why experimental murine models are required to understand the pathogenesis of disease.</a> Parasitology. 137, 755-772 (2010).</li><li>Van den Steen, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopathology+and+dexamethasone+therapy+in+a+new+model+for+malaria-associated+acute+respiratory+distress+syndrome.">Immunopathology and dexamethasone therapy in a new model for malaria-associated acute respiratory distress syndrome.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 181, 957-968 (2010).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Biz fareler verimli Mtb ve P. ile enfekte olabilir nasıl tarif Enfeksiyon doğal yolla berghei. Biz deneysel tüberküloz 13 veya sıtma 12 çalışma enfeksiyon protokolleri kurulan ve son zamanlarda fare modelinde 1 Mtb ve Plasmodium arasında Koenfeksiyonu incelemek için onları kabul uygulanır. Başarılı enfeksiyon için en kritik adımlar, istenen sayı hem de patojen iletim bulunmaktadır. Zamanla canlılığını kaybeder çünkü Mikobakteriyel stokları 2 yıldan eski olmamalı ve stokların başlangıçta belirlenen titre büyük olasılıkla artık doğru olacaktır. Bunun bir sonucu olarak, enfeksiyon dozlar beklenenden daha düşük olacaktır. Bu nedenle, stok kültürleri CFU titerleri birkaç ayda belirlenmelidir. Aynı derecede önemli ilk etapta standart yetiştirme ve Mtb stoklarının nesil. Gibi kültür koşullarıorta, ek, zaman ve hacim Mtb farklı stokları kullanılarak yapılan deneylerden elde verileri karşılaştırma yapabilmek için standardize edilmelidir. Mikobakteri bu nedenle hasat bakteri aynı büyüme aşamasında, standart kültür koşulları tutmak ve şişelemeden sırasında sık sık tekrar süspansiyon önemlidir, kültür sırasında gelme eğilimindedir. Aksi CFU titreleri ve enfeksiyon sonucu geniş bir varyasyon olabilir. Homojen enfekte sivrisinek toplu nesil bir başka önemli adımdır. Farklı sivrisinek, her bir fare doyurmaya bu yana, bir enfeksiyon deney için kullanılan sivrisinek aynı partiden gelen ve sivrisineklerin% 90&#39;ından fazlası bulaşmış yalnızca toplu kullanılması önemlidir. Mevcut model bir enfekte edilmiş bağışıklık yanıtlarına karşılaştırarak bir koinfekte konakçıda bağışıklık karşılıklarının ve bağışıklık modülasyon incelemek için kullanılabilir. Biz va uygulayabilirsinizbu tipi, immünohistokimya, immün hücre popülasyonlarının sitometri analizi ya da ilgi konusu doku ya da vücut sıvılarını sitokin ve kemokin tespiti için PCR ve ELISA gibi rious iyi kurulmuş yöntemleri. Bu tür fare modelleri bazı kısıtlamalar olduğu unutulmamalıdır. Mtb ile enfekte kişilerin çoğunluğu klinik belirtilerin hiçbir belirti ile bir latent enfeksiyon gelişir ise, fareler, ilerleyici akciğer patolojisi olan bir kronik hastalığı gelişebilir. Yine de, C57BL / 6 fareleri, Mtb çok enfeksiyona karşı dayanıklı olup, tüberküloz, insan hastalarda görülen gibi klasik granülom gelişmez. Sonuç olarak, fare, otoimmün reaksiyonların uygun şekilde de gizli, ne de aktif insan tüberküloz hastalığına yansıtmaktadır. Insan ve fare latent ve kronik hastalığı arasındaki tutarsızlık rağmen, fareler yoğun Mtb enfeksiyonu kontrol etmek ve araştırmak için değerli ve vazgeçilmez araçlardır konakçı faktörleri belirlemek ve incelemek için kullanılmıştırbulaşıcı hastalıklarda bağışıklık tepkileri. Önemli olarak, Mtb enfeksiyona karşı hassasiyet yaygın olarak kullanılan fare soylannda ve bu DBA veya C3H daha fazla duyarlı suşları arasında önemli farklılıklar ko-ve tek enfeksiyon çalışmalara dahil edilebilir. Ayrıca, dışında burada tarif edilen patojen türünden, de (örneğin, klinik izolat) herhangi bir başka Mycobacterium türleri kullanılabilir. Tek bir sıtma modeli, insan hastalık farklı fare modellerinin tüm yönleriyle çoğaltır Aynı şekilde, yakından doğal kazanılmış insan sıtma enfeksiyonu farklı yönlerini benzemektedir. Örneğin, P. berghei ANKA ve P. yoelii YM/17XL yaygın olarak P., insan (P. falciparum kaynaklı) ağır sıtma modelleri çalışılmaktadır berghei ANKA insan serebral malari s 14,15 için mükemmel bir model olarak kabul ediliyor. P. berghei NK65 hyperparasitaemia ve akut sıtma anemi için mükemmel bir model olduğunu ve son zamanlarda olmuştursıtma ilişkili akut solunum distres sendromu (ARDS MA-16) için deneysel bir modeli olarak tarif. Açıklanan koenfeksiyonuna modelini kullanarak, son zamanlarda gösteriyor ki eşzamanlı P. berghei NK65 enfeksiyonu kronik tüberküloz 1 şiddetlendirir. Apart farklı kemirgen sıtma parazitleri kullanarak, enfeksiyon olayların sırası ve zamanlaması yatan araştırma sorusuna bağlı olarak adapte edilebilir. Alanında, eşlik eden enfeksiyonların Plasmodium Mtb enfeksiyonu zamanında mevcut ya da sonradan edinilmiş olabilir. Her iki senaryoda da Mtb ve Plasmodium bağışıklık tepkileri farklı şekilde etkilenebilir. Bu nedenle, fareler önce veya Mtb sonra enfeksiyon ya Plasmodium sporozoitler ile enfekte olabilir. Dahası, fareler farklı zamanlarda itiraz edilebilir kronik karşı akut üzerinde Plasmodium-uyarılmış bağışıklık tepkisinin etkisini değerlendirmek için Mtb efeksiyonutüberküloz. Sıtma tüberküloz Koenfeksiyonu eğitim için bir sıtma paraziti seçerken önemlisi, bir bazı kemirgen Plasmodium suşları bazı fare türlerinde akut hastalığa neden ve Mtb kronik ve imünokompetan uzun süreli enfeksiyonlara neden olurken, sadece gün veya hafta içinde enfeksiyon yenik farkında olmalıdır fareler. Bu nedenle, koenfeksiyonu zamanlaması deney hayvanlarının erken ölüm önlemek için çok önemlidir. Birden fazla patojen türleri ile aynı anda bir ev sahibi enfeksiyonu ile bağışıklık modülasyonu az anlaşılmaktadır. Bir koinfekte konağın bağışıklık sistemi ile Plasmodium etkileşim ve coinfections patogenezi, hastalık sonucu, aşılama, Immunodiagnostics ve tedavisi nasıl etkilediğini anlamamıza katkıda bulunacaktır - Bizim deneysel koenfeksiyonuna modeli Mycobacterium araştırmak için güçlü bir araç sağlar.

İnsan popülasyonları nadiren tek bir patojene maruz kalmaktadır. Özellikle böyle Sahra-altı Afrika gibi enfeksiyonların insidansı yüksek olan bölgelerde, coinfections bir başbakan ama son derece hakir halk sağlığı sorunu oluşturmaktadır. Tüberküloz ve sıtma sırasıyla insanlarda, en yaygın bakteriyel ve paraziter enfeksiyonlar ve tropik yoksul toplumlarda morbidite ve mortalite nedenidir olmaya devam etmektedir. Koenfeksiyonu riski tüberküloz ve sıtma ve bireylerin çok sayıda arasındaki geniş coğrafi örtüşme olmasına rağmen, çok az eşzamanlı koinfekte bireylerde sıtma parazitlerinin ve tüberküloz basilinin karşı ortaya çeşitli ve genellikle mücadele immün düzenleyiciler ve efektörler arasındaki etkileşimleri hakkında bilinmektedir. Karışık enfeksiyonların kemirgen modelleri, böylece karşılıklı gribin ışık tutan, bir konakta farklı patojenlere karşı diferansiyel bağışıklık reaksiyonlarını karakterize izinAyrıca tedavi ve önlenmesi için yeni öneriler belirlemek yardımcı olacaktır modüle patoloji ve bireysel hastalığın klinik gidişini, farklılıklara. Biz aynı ana 1. içinde Mycobacterium tuberculosis (MTB) ile eşzamanlı enfeksiyon neden etkileri ve kemirgen Plasmodium türlerini araştırmak için bize sağlayan deneysel bir fare modeli kurduk. Önemlisi, mümkün olduğunca yakından doğal kazanılmış insan enfeksiyonları taklit etmek, bizim modeli hem patojenler tarafından kullanılan enfeksiyon doğal yolları uygular. Tüberküloz, bu nedenle esas olarak akciğerlerde gösteren bir hava enfeksiyondur. Onlar öksürme veya hapşırma sırasında bulaşıcı aerosol damlacıkları sınırdışı zaman etkeni, Mtb aerosol yolla aktif hastalığı olan kişiler tarafından iletilir. Bu nedenle, aerosol enfeksiyon doğal enfeksiyonu taklit etmek için tercih edilen bir yöntemdir. MTB içeren havadaki partiküllerin Generation kullanımı ile elde edilebilirBir inhalasyon pozlama sistemi. Bütün vücut maruz odası bulaşıcı aerosol damlacıkları enfeksiyon 2 başlatılır akciğerlerin alveollerine solunması (Şekil 1) Mtb içeren deneysel hayvanlar maruz sağlar. Öte yandan Malaria doğal bir dişi sivrisinek anopheline türü ısırması ile iletilir protozoon Apicomplexan parazit Plasmodium neden olduğu bir vektör kaynaklı bir hastalıktır. Kan yemek sırasında, enfeksiyon sporozoites konakçı deri altında yatırılır ve daha sonra, kan dolaşımı yoluyla karaciğer ulaşır. Hepatositler içinde onlar geliştirmek ve hızla karaciğer aşamalı schizontsun içine çarpın. Sonunda, olgun schizontsun delinmesine ve kırmızı hücre işgali, çoğaltma, kırmızı hücre rüptürü, ve reinvasion 3 aşamalı bir döngüsü başlatmak nerede kan akışı içine patojenik ilk-nesil merozoit binlerce bırakın. Plasmodium yaşam döngüsü pazaBazı merozoit gibi daah cinsel parazit aşamalarında, kan yemek sırasında sivrisinekler tarafından alınabilir erkek ve dişi gametositlerine, gelişir. Sivrisinek, Plasmodium sporozoites sivrisinek midgut ikamet oocystsu içinde gelişir ve sonunda başka bir konak 3,4 içine nakil için tükürük bezlerine göç. Deneysel hayvan modellerinde, aerosol ve böylece en uygun yol aracılığıyla Mtb teslim çok yaygın olsa da, sıtma-tüberküloz koenfeksiyonu 5-7 ile ilgili çalışmalar dahil olmak üzere pek çok deneysel çalışmalar kemirgen Plasmodium enfeksiyon yol açan, parazitli eritrosit ile enfekte fareler ile gerçekleştirilmiştir Klinik olarak sessiz karaciğer kademeli faz hariç tutulduğunda kan aşamalı sıtma enfeksiyonuna. Bununla birlikte, anti-karaciğer aşama plasmodial bağışıklık 8-11 için enfeksiyon ve ilgili sırasında zorunlu bir adımdır. Biz karaciğer ph dahil etmek bu nedenle önemli düşününsıtma iletim ve sırasıyla sıtma ve sıtma-tüberküloz koenfeksiyonu, her iki çalışmalarında bakım ase. Buna ek olarak, doğal olarak iletilen sporozoites yerine izole tükürük bezi türetilmiş sporozoites enjekte bite sivrisinek ile sıtma enfeksiyonu belirlemek için istenir iğne enfeksiyonlar 12 üzerinden aktarılır daha fazla bulaşıcı olduğu gösterilmiştir. Sıtma parazitlerinin doğal iletimi için bulaşıcı sivrisinek elde etmek için tek yol omurgalı bir konakçının (burada fare) ve sivrisinek vektör hem de parazitin tüm yaşam döngüsü korumaktır. Böylece, parazit bakım için bir insectary erişim lokma doğal iletimini gerçekleştirmek için kaçınılmazdır. Burada tarif Bizim protokol Plasmodium ile koenfeksiyonuna kronik tüberküloz 1 üzerindeki etkilerini Sporozoitlere nasıl araştırmak için geliştirilmiştir. Bunu yapmak için, farenin aerosol M. bulaştırılır tüberküloz ve 40 gün sonra, ne zaman M. tüberküloz enfeksiyonu fareler sıtma bulaşıcı sivrisinek maruz kalan, kronik faz ulaşmıştır. Koinfekte hayvanlarda sıtma ve tüberküloz her ikisinin de sonucu sırasıyla dokusundaki kan paraziteminin ve bakteri yükü izlenmesi ile takip edilebilir. Protokolde, biz onların doğal enfeksiyon güzergahı ve ne kadar başarılı patojen bulaşmasını teyit etmek yoluyla hem de patojenler ile fareler bulaştırmak için nasıl ayrıntılı olarak anlatacağız. Bizim ellerde, hem deneysel enfeksiyonlara sık elde enfeksiyon oranı% 100&#39;dür. Bu protokoller, en zor insan enfeksiyon hastalıklarının ikisi arasında-enfeksiyon modeli ve çalışma için bizim gibi ayrı ayrı enfeksiyonlar ya da, her iki çalışma uygulanabilir. Bu model, bu protokolde tarif edilenler dışındaki diğer Mycobacterium kemirgen ve Plasmodium türleri için de geçerlidir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="650">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Buraton</td>
			<td style="width:124px;">Sch&#252;lke</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;">active ingredients: aldehyds (formaldehyde, glutaraldehyde, oxalaldehyde, ethyl hexanal)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Middlebrook 7H9&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M0178</td>
			<td style="width:191px;">For Mtb broth cultures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Middlebrook 7H11&#160;</td>
			<td style="width:124px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">283810</td>
			<td style="width:191px;">Agar medium for Mtb culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Middlebrook OADC enrichment medium</td>
			<td style="width:124px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">212240</td>
			<td style="width:191px;">Add to 7H9 and 7H11 for Mtb culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Staining Dish</td>
			<td style="width:124px;">Science Services</td>
			<td style="width:119px;">E62542-12</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">24-Slide Holder w/Handle</td>
			<td style="width:124px;">Science Services</td>
			<td style="width:119px;">E62543-06</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Giemsas Azur-Eosin-Methylene blue solution</td>
			<td style="width:124px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">109204</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wright&#180;s stain</td>
			<td style="width:124px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">W0625</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inhalation Exposure System</td>
			<td style="width:124px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nebulizer-Venturi</td>
			<td style="width:124px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ice cream cups</td>
			<td style="width:124px;">H&#228;agen-Dazs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;">Used as mosquito cages</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Metal-frame mosquito cages</td>
			<td style="width:124px;">BioQuip Products</td>
			<td style="width:119px;">1450A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an experimental model to study tuberculosis-malaria coinfection upon natural transmission of mycobacterium tuberculosis and plasmodium berghei

Coinfections dolayı doğal patojen organizmaların farklı türlerine coğrafi üst üste meydana gelir. Eşzamanlı enfeksiyonları büyük olasılıkla her bir patojene ilgili immün yanıtı düzenleyen ve böylece patogenezi ve hastalık sonuçlarını etkileyebilir. Koinfekte hastaların aynı zamanda anti-enfektif müdahalelere farklı şekilde yanıt verebilir. Mikobakteriler ve Sahra-altı Afrika&#39;nın birçok yerinde coendemic her ikisi de sıtma paraziti Plasmodium, neden olarak tüberküloz arasındaki Koenfeksiyonu detaylı olarak çalışılmamıştır. Bilimsel ve sıtma tüberküloz koenfeksiyonuna modüle konak bağışıklık ve her hastalığın seyri, bize koinfekte konakta hem patojenlere elicited bağışıklık tepkilerini incelemek için izin veren deneysel bir fare modeli kurulmuş nasıl klinik son derece alakalı soru zor ama yaklaşmak için . Notun, en doğrusu mimik doğal kazanılmış insan enfeksiyonları için, deneysel gerçekleştirmeksırasıyla enfeksiyon doğal yolları, yani aerosol ve sivrisinek ısırığı, hem patojenler ile farelerin enfeksiyonları.

Mtb ve P. ile farelerin enfeksiyonu doğal yoldan örneğin, aerosol ve sivrisinek ısırığı, sırasıyla, her hayvan (Tablo 1) tutarlı ve tekrarlanabilir enfeksiyon sonuçları ile berghei 1. Biz başarılı enfeksiyonu ve kan sırasıyla (P. berghei parazitemisi) ve farklı organlarda Mtb yükü, başlangıçtaki oluşumu (prepatensi) ve parazitlerin sayısını belirleyerek sıtma ve tüberküloz hem ders izleyebilirsiniz. Bulaşıcı sivrisinek ısırması ile başarılı bir sıtma paraziti iletiminin bir örneği, Tablo 1 ve Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. 4-5 gün sonra (Tablo 1 ve Şekil 3A), kan-aşaması parazitlerin varlığı ile teyit edildiği gibi, her bir fare 10-sporozoit bulaşmış sivrisinek Besleme% 100 enfeksiyon oranı ile sonuçlanmıştır. Önemli bir şekilde, aynı deney gr tek tek farelerden kan içindeki parazit numaraları bulmakoup, tutarlı ve tekrarlanabilir enfeksiyon sivrisinek ısırığı sonuçlarına göre bu sporozoit iletimini göstermektedir. Mtb-koinfekte hayvanlannınki ile naif kontrol farelerinde hale gelmesinden karşılaştırarak, bu açık hale gelmesinden biraz Mtb (Tablo 1, Şekil 3B) ile preinfected edilmiş farelerde gecikir görebilirsiniz 1. Daha önce 1 rapor gibi Şekil 3B gösterildiği gibi, biz Giemsa lekeli kan lekeleriyle günlük izleme parazitemi tarafından sıtma seyrine Mtb koenfeksiyonu etkisini belirleyebilirsiniz. Farelerin bireysel (Şekil 4A) arasında göreceli olarak düşük bir değişkenlik akciğerlerdeki bakteri başarılı depozisyonunda bir solunması sistemi sonuçları kullanılmasıyla Mtb ile farelerin enfeksiyonu. Biz akciğerler ve CFU belirlenmesi ile zamanla ilgi diğer organlarda mikrobakteriyel yükleri takip edebilirsiniz. Ciğerlerinde mikobakteriyel yük için bir örnekMtb P. yokluğunda veya varlığında, C57BL / 6 fareleri enfekte berghei Şekil 4B&#39;de gösterilmiştir. Tablo 1. Prepatensi sivrisinek ısırması ile sporozoit iletiminden sonra. Tüm fareler P. doğal iletiminden sonra kan-aşamalı enfeksiyonları geliştirilen berghei sivrisinek ısırığı ile Sporozoitlere. 1 PLoS ONE, izni ile 7 (10), e48110 uyarlanmıştır. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Deney fare grubu (C57BL / 6) </td><td> 10 bulaşıcı sivrisinek ısırıkları ile meydan </td><td> Grup başına hayvan kan kademeli pozitif hayvan / No No </td><td> Ortalama prepatensi [d] </td></tr><tr><td> naif </td><td> P. berghei </td><td> 07/07 </td><td> 4,4 </td></tr><tr><td> Mtb enfekte </td><td> P. berghei </td><td> 07/07 </td><td> 5,5 </t<html> d&gt; </tr></tbody></table><img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig1.jpg" /> Şekil 1. Deneysel prosedür genel şeması. C57BL / 6 fareler, Glas-Col aerosol odasındaki Mtb içeren aerosol damlacıkları maruz kalmaktadır. Bir gün aerosol enfeksiyondan sonra, Mtb alımının akciğerin CFU analizi ile doğrulanır. (Tüberküloz enfekte farelerde kronik hale gelmiştir) Mtb meydan, hayvanlar P. maruz kalan yaklaşık 40 gün sonra berghei sivrisinek enfekte. Başarılı sporozoit iletim onaylamak ve Plasmodium enfeksiyonun seyrini takip etmek, parazitemisi sivrisinek ısırığı 3 gün sonra başlayan Giemsa lekeli kan lekeleriyle günlük takip edilmektedir. / Files/ftp_upload/50829/50829fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50829/50829fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. Bir sivrisinek kafesinin kroki. Bulaşıcı sivrisinek gibi bir yarım litrelik dondurma karton gibi bir karton içinde yer alır. Küçük bir açıklık kartonun yan kesilir ve sivrisinekler için güvenli bir giriş oluşturmak için her bir parça kesilmiş bir yarık ile lateks bir çift tabaka ile kaplanır. Filtre kağıt parçası damlaları kadar emmek için kartonun iç alt bantlanmış. Dondurma bardak bant ve elastik bant ile kartonun sabitlenmiş olduğu bir (Nylon ağ) örgü ile kapalıdır. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig3.jpg" /> Şekil 3,. Parazitli eritrosit (Ölçek bar, 20 &amp; # gösteren bir Wright `ın lekeli kan yaymasında kan parazitemisi. A) Örnek181;. Fare kanında m) B) Parazitemi günde Giemsa lekeli kan lekesi analizi ile izlenmiştir. Koinfekte farenin Plasmodium tek enfekte edilmiş farelerin (n = 10) ile karşılaştırıldığında daha düşük bir paraziteminin sahiptir; sonuçlar ± SD aracı olarak gösterilmiştir; *** p &lt;0.001. 1 PLoS ONE, izni ile 7 (10), e48110 yayımlanmaktadır. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig4.jpg" /> Şekil 4. Akciğerde Mtb tespiti. C57BL / 6 fareleri aerosol Mtb 100 CFU ile tehdit edildi ve P ile 40 gün sonra, koinfekte berghei sivrisinek ısırmasıyla. A) bir gün aerosol Mtb enfeksiyonundan sonra, istenen sayıda alım CFU belirlenmesi için bütün akciğer homojenatları kaplama ile doğrulanmıştır. B) Bakterilerkoenfeksiyonu zamanında l yükler CFU analizi (Mtb d40/d0) üzerinden 3 fareden Akciğer lizatları içinde belirlenmiştir. 12 gün koenfeksiyonu sonra, akciğer lisatlar Mtb kontrolü Plasmodium koenfeksiyonu etkisini belirlemek CFU analiz için kaplandı. Akciğerlerde Mtb P. numaraları ile birlikte-enfeksiyon sırasında arttığını, dikkat berghei NK65. X-ekseni etiketleme: koenfeksiyonu sonra Mtb -infection/time sonra zaman. 1 PLoS ONE, izni ile 7 (10), e48110 uyarlanmıştır.

Watch this Scientific Journal Video about An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei at JoVE.com

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tüberküloz ve sıtma insan ve tropik yoksul toplumlarda morbidite ve mortalitenin önemli nedenlerinden en yaygın enfeksiyonlardan ikisidir. Bu enfeksiyon, doğal yoldan hem patojenler ile yüklemeden sonra farelerde sıtmaya tüberküloz koenfeksiyonu sonucunu çalışma deneysel bir model sistemi kurulmuştur.

Doğal İletim üzerine Tüberküloz-Sıtma Koenfeksiyonu Çalışması için Deneysel Bir Model Mycobacterium tuberculosis Ve Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

an-experimental-model-to-study-tuberculosis-malaria-coinfection-upon

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

19.7K Görüntüleme.  University Hospital Heidelberg.  Tüberküloz ve sıtma insan ve tropik yoksul toplumlarda morbidite ve mortalitenin önemli nedenlerinden en yaygın enfeksiyonlardan ikisidir. Bu enfeksiyon, doğal yoldan hem patojenler ile yüklemeden sonra farelerde sıtmaya tüberküloz koenfeksiyonu sonucunu çalışma deneysel bir model sistemi kurulmuştur. 

Video: An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

Numune Hazırlama<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</emNükleer Manyetik Rezonans metabolomik Araştırmaları&gt; özler

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

Büyüme Mycobacterium tuberculosis Biyofilmler

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

Bir<em&gt; In vitro</emOkumak&gt; Co-enfeksiyon Modeli<em&gt; Plasmodium falciparum</emİnsan İlköğretim Monosit kökenli Bağışıklık Hücrelerde&gt;-HIV-1 Etkileşimleri

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Den Beyin sekestre Lökositler İzolasyonu ve Analizi<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-enfekte Fare

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

Çok ilaca dirençli Demonstrating<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Amplifikasyon Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most common microdissection technique used today. In this technique, a laser is used to focally melt a thermoplastic membrane that overlies a dehydrated tissue section1. The tissue section composite is then lifted and separated from the membrane. Although this technique can be used successfully for tissue examination, it is time consuming and expensive. Furthermore, the successful completion of procedures using this technique requires the use of a laser, thus limiting its use. A new more affordable and practical microdissection approach called mesodissection is a possible solution to the pitfalls of LCM. This technique employs the MESO-1/MeSectr system to mill the desired tissue from a slide mounted tissue sample while concurrently dispensing and aspirating fluid to recover the desired tissue sample into a consumable mill bit. Before the dissection process begins, the user aligns the formalin fixed paraffin embedded (FFPE) slide with a hematoxylin and eosin stained (H&#38;E) reference slide. Thereafter, the operator annotates the desired dissection area and proceeds to dissect the appropriate segment. The program generates an archived image of the dissection. The main advantage of mesodissection is the short duration needed to dissect a slide, taking an average of ten minutes from set up to sample generation in this experiment. Additionally, the system is significantly more cost effective and user friendly. A slight disadvantage is that it is not as precise as laser capture microscopy. In this article we demonstrate how mesodissection can be used to extract RNA from slides from FFPE granulomas caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been extensively employed for the examination of DNA, RNA, and protein within tissue. Laser capture microscopy (LCM) is the most commonly used method, but a new milling technique, mesodissection, is recently available. We demonstrate RNA extraction from mesodissected formalin fixed paraffin embedded tissue slides of Mycobacterium tuberculosis granulomas.

Kurtarma Bir Roman Mikrodiseksiyon Yaklaşımı<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</emAkciğer granülomlara Gömülü Formalinle Sabit Parafin dan&gt; Özel Transkript

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Fonksiyonel Araştırmaları 3D İnsan Akciğer Doku Modeli<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Enfeksiyon

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Hücre içi Hedefleme İnhibitörleri Etkinliği ve Sitotoksisite Taraması için sistem<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Bir Yüksek verim Uyumlu Deneyi Makrofaj, pasajlamaya karşı ilaç etkinliğini değerlendirmektir<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

Mycobacterium tüberküloz ile muhabir enzim Floresans farelerde görüntüleme

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...