המחברים מבקשים להודות למרים אסתר לגידול יתושים. עבודה זו נתמכה על ידי מימון בבית מBorstel מרכז המחקר והצטרפה מימון על ידי זיהום לייבניץ המרכז.

<ol>
	<li>Mueller, A. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Transmission+of+Plasmodium+berghei+Exacerbates+Chronic+Tuberculosis+in+an+Experimental+Co-Infection+Model.">Natural Transmission of Plasmodium berghei Exacerbates Chronic Tuberculosis in an Experimental Co-Infection Model.</a> PLoS ONE. 7, e48110 (2012).</li><li>Korbel, D. S., Schneider, B. E., Schaible, U. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+in+tuberculosis:+myths+and+truth.">Innate immunity in tuberculosis: myths and truth.</a> Microbes Infect. 10, 995-1004 (2008).</li><li>Aly, A. S., Vaughan, A. M., Kappe, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+parasite+development+in+the+mosquito+and+infection+of+the+mammalian+host.">Malaria parasite development in the mosquito and infection of the mammalian host.</a> Annu. Rev. Microbiol. 63, 195-221 (2009).</li><li>Cirimotich, C. M., Dong, Y., Garver, L. S., Sim, S., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+immune+defenses+against+Plasmodium+infection.">Mosquito immune defenses against Plasmodium infection.</a> Dev. Compar. Immuno. 34, 387-395 (2010).</li><li>Page, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium-induced+potentiation+of+type+1+immune+responses+and+protection+against+malaria+are+host+specific.">Mycobacterium-induced potentiation of type 1 immune responses and protection against malaria are host specific.</a> Infect. Immun. 73, 8369-8380 (2005).</li><li>Hawkes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+exacerbates+experimental+mycobacterial+infection+in+vitro+and+in+vivo.">Malaria exacerbates experimental mycobacterial infection in vitro and in vivo.</a> Microbes Infect. 12, 864-874 (2010).</li><li>Scott, C. P., Kumar, N., Bishai, W. R., Manabe, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+report:+modulation+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection+by+Plasmodium+in+the+murine+model.">Short report: modulation of Mycobacterium tuberculosis infection by Plasmodium in the murine model.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 70, 144-148 (2004).</li><li>Hoffman, S. L., Doolan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+vaccines-targeting+infected+hepatocytes.">Malaria vaccines-targeting infected hepatocytes.</a> Nat. Med. 6, 1218-1219 (2000).</li><li>Mueller, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+attenuated+Plasmodium+berghei+liver+stages+persist+and+elicit+sterile+protection+primarily+via+CD8+T+cells.">Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells.</a> Am. J. Pathol. 171, 107-115 (2007).</li><li>Mueller, A. K., Labaied, M., Kappe, S. H., Matuschewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+Plasmodium+parasites+as+a+protective+experimental+malaria+vaccine.">Genetically modified Plasmodium parasites as a protective experimental malaria vaccine.</a> Nature. 433, 164-167 (2005).</li><li>Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+immunity+produced+by+the+injection+of+x-irradiated+sporozoites+of+plasmodium+berghei.">Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei.</a> Nature. 216, 160-162 (1967).</li><li>Vaughan, J. A., Scheller, L. F., Wirtz, R. A., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectivity+of+Plasmodium+berghei+sporozoites+delivered+by+intravenous+inoculation+versus+mosquito+bite:+implications+for+sporozoite+vaccine+trials.">Infectivity of Plasmodium berghei sporozoites delivered by intravenous inoculation versus mosquito bite: implications for sporozoite vaccine trials.</a> Infect. Immun. 67, 4285-4289 (1999).</li><li>Coleman, J., Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+midgut+and+salivary+glands+from+Ae.+aegypti+mosquitoes.">Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes.</a> J. Vis. Exp. , e228 (2007).</li><li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Plasmodium+berghei+reference+line+that+constitutively+expresses+GFP+at+a+high+level+throughout+the+complete+life+cycle.">A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).</li><li>Lin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss-of-function+analyses+defines+vital+and+redundant+functions+of+the+Plasmodium+rhomboid+protease+family.">Loss-of-function analyses defines vital and redundant functions of the Plasmodium rhomboid protease family.</a> Mol. Microbiol. 88, 318-338 (2013).</li><li>Bancroft, J. D. G., M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and Practice of Histological Techniques. , (2007).</li><li>Schneider, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+IL-18+in+protective+immunity+against+Mycobacterium+tuberculosis.">A role for IL-18 in protective immunity against Mycobacterium tuberculosis.</a> Eur. J. Immunol. 40, 396-405 (2010).</li><li>Craig, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+animal+models+for+research+on+severe+malaria.">The role of animal models for research on severe malaria.</a> PLoS Pathog. 8, e1002401 (2012).</li><li>de Souza, J. B., Hafalla, J. C., Riley, E. M., Couper, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+malaria:+why+experimental+murine+models+are+required+to+understand+the+pathogenesis+of+disease.">Cerebral malaria: why experimental murine models are required to understand the pathogenesis of disease.</a> Parasitology. 137, 755-772 (2010).</li><li>Van den Steen, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopathology+and+dexamethasone+therapy+in+a+new+model+for+malaria-associated+acute+respiratory+distress+syndrome.">Immunopathology and dexamethasone therapy in a new model for malaria-associated acute respiratory distress syndrome.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 181, 957-968 (2010).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

אנחנו תיארתי כיצד עכברים יכולים להיות נגועים באופן פרודוקטיבי עם MTB ופ berghei דרך נתיביהם הטבעיים של זיהום. אנחנו מיישמים הוקמו פרוטוקולי זיהום ללמוד ניסיונית שחפת 13 או מלריה 12 ולאחרונה אימצנו אותם ללמוד coinfection בין MTB וPlasmodium במודל העכבר 1. השלבים הקריטיים ביותר לזיהומים מוצלחים הם השידור של שני פתוגנים במספרים הרצויים. מניות mycobacterial לא צריכים להיות מבוגרות יותר מ 2 שנים, כי הם יאבדו את יכולת קיום לאורך זמן, וכיילו במקור הנחוש של המניות סבירות להניח שכבר לא יהיו מדויק. כתוצאה מכך, מינוני זיהום יהיו נמוכים בהרבה מהצפוי. לכן, כותרות CFU של תרבויות המניה צריכה להיקבע בכל כמה חודשים. לא פחות חשוב הוא הטיפוח הסטנדרטי והדור של מניות MTB במקום הראשון. תנאי תרבות כגוןבינוני, תוספי מזון, זמן, ונפח צריכים להיות אחידים כדי שתוכל להשוות נתונים מניסויים באמצעות מניות שונות של MTB. Mycobacteria נוטה גוש בתרבות, ולכן חשוב לשמור על תנאי תרבות טופל, חיידקי קציר באותו שלב הצמיחה וresuspend לעתים קרובות במהלך aliquoting. אחרת לא יכולה להיות וריאציה רחבה של כותרות CFU ותוצאת זיהום. הדור של קבוצות יתושים נגועים הומוגנית הוא עוד שלב קריטי. מאז יתושים שונים יהיה להאכיל על כל עכבר בודד, חשוב שכל היתושים המשמשים לניסוי זיהום אחד באים מאותו אצווה וכי רק אלה קבוצות שבו יותר מ -90% מיתושים נגועים נמצאות בשימוש. המודל הנוכחי יכול לשמש כדי לנתח את תגובה חיסונית ומודולציות חיסוניים במארח נישאים ידי השוואתה לתגובה החיסונית במארחים נגועים אחד. אנחנו יכולים ליישם את vaמתודולוגיות מבוססות היטב rious כגון היסטולוגיה, אימונוהיסטוכימיה, cytometry הניתוח של אוכלוסיות תאים חיסוניים, או PCR וELISA לציטוקינים וזיהוי chemokine לנוזלים ברקמות גוף או של עניין. יש לציין, שיש להם מודלים עכבר כזה מגבלות מסוימות. ואילו הרוב המכריע של אנשים שנדבקו בMTB לפתח זיהום סמוי ללא סימנים של תסמינים קליניים, עכברים לפתח מחלה כרונית עם הפתולוגיה ריאות מתקדמת. ובכל זאת, עכברי C57BL / 6 הם עמידים יחסית לזיהום MTB ולא לפתח גרנולומות הקלסית כפי שנצפו בחולי שחפת אדם. כתוצאה מכך, תגובות immunopathological בעכבר משקפות לא מחלת שחפת אדם רדומה ולא פעילה כראוי. למרות הפער בין מחלה הסמויה וכרונית באדם ובעכבר, עכברים נעשו שימוש נרחב כדי לזהות וללמוד גורמי מארח ששולטים זיהום MTB והם כלים חשובים והכרחיים כדי לחקורתגובה חיסונית במחלות זיהומיות. חשוב מכך, רגישות לזיהום MTB משתנה במידה ניכרת בין זנים נפוצים טהורים עכבר וזנים רגישים יותר כגון DBA או C3H יכול להיכלל במחקרים משותפים וחד זיהום. יתר על כן, מלבד מיני פתוגן שתוארו במסמך זה, יכול לשמש לכל מיני Mycobacterium אחרים בעלי עניין (למשל קליני מבודד). כמו כן, בזמן שאין מודל מלריה אחד משכפל את כל ההיבטים של דגמי עכבר שונים מחלה אנושית שדומים היבטים שונים של הידבקות במלריה אנושית שנרכשה באופן טבעי. למשל, פ berghei אנקה ופ yoelii YM/17XL נלמדים בהרחבה מודלים של מלריה חמורה אנושית (מושרה פ falciparum), עם פ berghei אנקה להיחשב כמודל מצוין לאדם malari של מוחין 14,15. פ berghei NK65 הוא מודל מצוין לhyperparasitaemia ואנמיה מלריה חריפה, וכבר מזמןתואר כמודל ניסיוני לתסמונת הקשורים מלריה מצוקה נשימתית חריפה (ARDS MA-16). שימוש במודל coinfection תאר, שנוכל לאחרונה מראה כי פ &#39;במקביל זיהום berghei NK65 מחריף חפת כרונית 1. מלבד שימוש טפילי מלריה מכרסם שונים, הסדר והתזמון של אירועי זיהום עלול להיות מותאם בהתאם לשאלת המחקר הבסיסית. בתחום, זיהומי Plasmodium נלווים עשויים להיות נוכחים בזמן זיהום MTB או נרכש לאחר מכן. בשני תרחישי התגובה החיסונית לMTB וPlasmodium עשויה להיות מושפעת באופן שונה. לכן, יכולים להיות נגועים בעכברים עם sporozoites Plasmodium לפני או אחרי זיהום MTB. יתר על כן, ניתן לערער עכברים בזמנים שונים לאחר זיהום MTB כדי להעריך את ההשפעה של התגובה החיסונית הנגרם על Plasmodium אקוטי מול כרונישחפת. חשוב מכך, בעת בחירת טפיל מלריה ללימוד coinfection מלריה שחפת, אחד צריך להיות מודע לכך שכמה זני Plasmodium מכרסמים לגרום למחלה חריפה בזני עכבר מסוימים ונכנעים לזיהום בתוך ימים או שבועות בלבד ואילו MTB גורם כרוני וזיהומים ארוכים טווח במערכת חיסון עכברים. לפיכך, עיתוי coinfection הוא קריטי על מנת למנוע מוות בטרם עת של חיות ניסוי. האפנון של חסינות מארח על ידי זיהום בו זמנית עם מיני הפתוגן מרובים נשאר הבין היטב. מודל coinfection הניסיוני שלנו מספק כלי רב עוצמה כדי לחקור Mycobacterium - האינטראקציה Plasmodium עם המערכת החיסונית של מארח נישאים ויתרמו להבנה שלנו איך coinfections יכול להשפיע על פתוגנזה, תוצאות מחלה, חיסון, immunodiagnostics, וטיפול.

אוכלוסיות אנושיות לעתים רחוקות נחשפות לפתוגן אחד בלבד. במיוחד באזורים עם שכיחות גבוהה של זיהומים כגון אפריקה שמדרום לסהרה, coinfections מייצג בעיה של בריאות ציבור ראש אבל מעריכים מאוד. שחפת ומלריה הן הזיהומים חיידקיים וטפילים הנפוצים ביותר בבני אדם, בהתאמה, ותמשיך להיות גורמים עיקריים לתחלואה ותמותה באוכלוסיות עניות באזורים הטרופיים. למרות החפיפה הגיאוגרפית הרחב בין שחפת והמלריה והמספר הגדול של אנשים בסיכון של coinfection, מעט מאוד ידוע על האינטראקציות בין הרגולטורים השונים, ולעתים קרובות מנטרלים חיסוניים וeffectors שהושרו בו זמנית נגד טפילי מלריה וחיידקים גבשושית בנישאים. מודלים של מכרסמים של מעורבים זיהומים לאפשר אפיון תגובות חיסוניים ההפרש נגד פתוגנים שונים במארח אחד, ובכך לשפוך אור על influ ההדדיences הפתולוגיה ויסות ותוצאות קליניות של המחלה בודדת, אשר תסייע גם לזהות המלצות חדשות לטיפול ומניעה. הקמנו מודל עכבר ניסיוני המאפשר לנו לחקור את ההשלכות נגרמות על ידי זיהום במקביל עם שחפת Mycobacterium (MTB) ומיני Plasmodium המכרסם בתוך אותו המארח 1. חשוב לציין, לחקות זיהומים אנושיים שנרכשו באופן טבעי ככל האפשר, המודל שלנו מיישם את המסלולים הטבעיים של זיהום בשימוש על ידי שני גורמי המחלה. שחפת היא מחלה עוברת באוויר, שכן בראש ובראשונה באה לידי ביטוי בתוך הריאות. הסוכן סיבתי, MTB מועבר על ידי אנשים עם מחלה פעילה דרך מסלול התרסיס כאשר הם לגרש טיפות תרסיס זיהומיות במהלך שיעול או התעטשות. לכן, זיהום אירוסול הוא שיטת הבחירה לחקות זיהום טבעי. דור של חלקיקים הנישאים באוויר המכילים MTB יכול להיות מושגת על ידי השימוששל מערכת חשיפת משאיפת. תא חשיפת כל גוף זה מאפשר לחשוף חיות מעבדה לMTB המכיל טיפות תרסיס זיהומיות (איור 1) שבו הם נשאפים לתוך alveoli של הריאות שבו זיהום הוא יזם 2. מלריה ומצד שני היא מחלה וקטור נישא הנגרמת על ידי protozoan, Plasmodium טפיל apicomplexan אשר מועבר על ידי עקיצת יתוש Anopheline נשי באופן טבעי. במהלך ארוחת דם, sporozoites זיהומיות מופקדים מתחת לעור המארח ולאחר מכן להגיע לכבד דרך זרם הדם. בתוך הפטוציטים שהם מפתחים במהירות ולהתרבות לschizonts כבד השלבים. סופו של הדבר, schizonts הבוגר הקרע ולשחרר אלפי merozoites הדור הראשון פתוגניים לתוך זרם הדם שם הם ליזום מחזור מתקדם של פלישה אדומה תא, שכפול, קרע תא אדום, וreinvasion 3. Contin מחזור החיים PlasmodiumUES כמו כמה merozoites להתפתח לשלבי הטפיל המיניים, gametocytes הזכר והנקבה, אשר יכול להיות נלקח על ידי יתושים במהלך ארוחות דם. ביתושים, sporozoites Plasmodium להתפתח בתוך ביצים המתגוררות בmidgut היתושים וסופו של דבר להגר לבלוטות הרוק להעברה הלאה ל3,4 מארח אחר. בעוד במודלים של בעלי חיים ניסיוני המשלוח של MTB באמצעות התרסיס ומסלול ובכך הרלוונטי ביותר הוא נפוץ מאוד, מחקרים רבים זיהום ניסיון Plasmodium המכרסמים כוללים מחקרים על coinfection מלריה שחפת 5-7 בוצעו על ידי הדבקה של עכברים עם אריתרוציטים parasitized, והוליד להידבקות במלריה בדם בשלב תוך הדרת שלב כבד בשלב הקלינית השקט. עם זאת, בשלב הכבד הוא צעד הכרחי במהלך זיהום ורלוונטי לחסינות נגד plasmodial 8-11. אנחנו רואים את זה ולכן חשוב לכלול את ה-pH בכבדASE של שידור מלריה ותחזוקה בלימודים של שניהם מלריה וcoinfection מלריה שחפת, בהתאמה. בנוסף, זה כבר הראה כי sporozoites מועבר באופן טבעי יותר זיהומיות מאלה מועברים באמצעות מחט 12 זיהומים, שגרמו לנו להקים את ההידבקות במלריה על ידי עקיצת יתוש במקום הזרקת sporozoites נגזר בלוטת רוק מבודדת. הדרך היחידה להשיג יתושים זיהומיות לשידור טבעי של טפילי מלריה היא לשמור על כל מחזור החיים של הטפיל בשני מארח החוליות (כאן בעכבר) ווקטור היתוש. לפיכך, גישה לinsectary לתחזוקת הטפיל היא בלתי נמנעת על מנת לבצע העברת טבעית על ידי נשיכה. הפרוטוקול שלנו שיתואר בהמשך פותח כדי לחקור כיצד coinfection עם Plasmodium sporozoites משפיע על שחפת כרונית 1. לשם כך, עכברים נגועים בתרסיס עם מ &#39; שחפת ו40 ימים לאחר מכן, כאשר מ &#39; זיהום השחפת הגיע לשלב הכרוני, עכברים שנחשפו ליתושי מלריה מדבקת. תוצאתם של שתי מלריה ושחפת בבעלי החיים הנישאים יכולה להיות מלווה ניטור parasitemia דם ועומס חיידקים ברקמות, בהתאמה. בפרוטוקול שלנו, נתאר בפירוט כיצד להדביק עכברים עם שני פתוגנים דרך כביש הזיהום הטבעי שלהם וכיצד לאשר העברת הפתוגן מוצלחת. בידיים שלנו, שיעור הזיהום הנפוץ השיג עבור שני הזיהומים הניסיוניים הוא 100%. יכולים להיות מיושמים על פרוטוקולים אלה ללמוד שני זיהומים בנפרד או, כפי שאנו עושים, למודל וללמוד coinfection בין שתי המחלות זיהומיות האדם המאתגרות ביותר. מודל זה ישים למינים Mycobacterium וPlasmodium מכרסמים אחרים מעבר לאלה שתוארו בפרוטוקול זה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="650">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Buraton</td>
			<td style="width:124px;">Sch&#252;lke</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;">active ingredients: aldehyds (formaldehyde, glutaraldehyde, oxalaldehyde, ethyl hexanal)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Middlebrook 7H9&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M0178</td>
			<td style="width:191px;">For Mtb broth cultures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Middlebrook 7H11&#160;</td>
			<td style="width:124px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">283810</td>
			<td style="width:191px;">Agar medium for Mtb culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Middlebrook OADC enrichment medium</td>
			<td style="width:124px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">212240</td>
			<td style="width:191px;">Add to 7H9 and 7H11 for Mtb culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Staining Dish</td>
			<td style="width:124px;">Science Services</td>
			<td style="width:119px;">E62542-12</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">24-Slide Holder w/Handle</td>
			<td style="width:124px;">Science Services</td>
			<td style="width:119px;">E62543-06</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Giemsas Azur-Eosin-Methylene blue solution</td>
			<td style="width:124px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">109204</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wright&#180;s stain</td>
			<td style="width:124px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">W0625</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inhalation Exposure System</td>
			<td style="width:124px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nebulizer-Venturi</td>
			<td style="width:124px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ice cream cups</td>
			<td style="width:124px;">H&#228;agen-Dazs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;">Used as mosquito cages</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Metal-frame mosquito cages</td>
			<td style="width:124px;">BioQuip Products</td>
			<td style="width:119px;">1450A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an experimental model to study tuberculosis-malaria coinfection upon natural transmission of mycobacterium tuberculosis and plasmodium berghei

Coinfections מתרחש באופן טבעי עקב החפיפה הגיאוגרפית של סוגים שונים של אורגניזמים פתוגניים. זיהומים במקביל סביר ביותר לווסת את התגובה החיסונית המתאימה לכל פתוגן היחיד ועשויים ובכך משפיעים על הפתוגנזה ותוצאות מחלה. חולי נישאים עשויים גם להגיב באופן דיפרנציאלי להתערבויות אנטי זיהומיות. Coinfection בין שחפת שנגרם על ידי mycobacteria וטפיל המלריה Plasmodium, אשר שניהם coendemic בחלקים רבים של אפריקה שמדרום לסהרה, לא נחקר בפירוט. כדי להתקרב המאתגר אבל מבחינה מדעית וקליני שאלה רלוונטית מאוד איך חסינות מארח לווסת coinfection מלריה שחפת וכמובן של כל מחלה, הקמנו מודל עכבר ניסיוני המאפשר לנו לנתח את התגובה החיסונית שהושרו לשני פתוגנים במארח הנישאים . ראוי לציין, על מנת שרוב הזיהומים אנושיים שנרכשו באופן טבעי בדיוק לחקות, אנו מבצעים ניסויזיהומים של עכברים עם שני פתוגנים על ידי מסלוליהם הטבעיים של זיהום, כלומר בתרסיס ועקיצת יתוש, בהתאמה.

זיהום של עכברים עם MTB ופ berghei דרך התוואי הטבעי, כלומר בתרסיס ועקיצת יתוש, בהתאמה, בתוצאות זיהום של כל בעלי החיים (טבלת 1) עקבי לשחזור 1. אנחנו יכולים לפקח על זיהום מוצלח וכמובן של שניהם מלריה ושחפת על ידי קביעת ההתרחשות הראשונית (prepatency) ומספר הטפילים בדם (parasitemia פ berghei) ואת הנטל של MTB באיברים שונים, בהתאמה. דוגמא להעברת טפיל מלריה מוצלחת על ידי עקיצת יתוש זיהומיות מוצגת בטבלה 1 ואיור 3. האכלה של 10 יתושים נגועים sporozoite על כל עכבר הביאה לשיעור זיהום 100% כפי שאושרה על ידי הנוכחות של טפילי דם בשלב 4-5 ימים מאוחר יותר (טבלת 1 ואיור 3 א). חשוב מכך, אנו מוצאים מספרי טפיל דומים בדמם של עכברים בודדים של אותו גר ניסיוניOUP, המציין כי העברת sporozoite ידי תוצאות עקיצת יתוש בזיהום עקבי ושחזור. על ידי השוואת prepatency בעכברי שליטה נאיביות עם זה בחיות MTB-נישאים, אנו יכולים לראות prepatency שמתעכבת מעט בעכברים שהיה preinfected עם MTB (טבלת 1, איור 3 ב) 1. כפי שכבר דווחו בעבר 1, אנו יכולים לקבוע את ההשפעה של coinfection MTB על המהלך של מלריה על ידי parasitemia ניטור היומיומי בכתמי דם צבעוניים Giemsa כפי שמוצג באיור 3. זיהום של עכברים עם MTB על ידי השימוש בתוצאות מערכת חשיפת משאיפת בתצהיר מוצלח של חיידקים לריאות עם השתנות נמוכה יחסית בין עכברים הבודדים (איור 4 א). אנחנו יכולים לעקוב אחר עומסי mycobacterial ריאות ואיברים אחרים של עניין לאורך זמן על ידי נחישות CFU. דוגמא לעומס mycobacterial ריאות שלMTB נגוע C57BL / 6 עכברים בהעדר או הנוכחות של פ berghei מוצג באיור 4. טבלת 1. Prepatency לאחר שידור sporozoite על ידי עקיצת יתוש. כל העכברים פיתחו זיהומים בדם בשלב לאחר שידור טבעי של פ berghei sporozoites על ידי עקיצת יתוש. מעובד מתוך 1 PLoS ONE, 7 (10), e48110 באישורו. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> קבוצת עכבר ניסיונית (C57BL / 6) </td><td> אתגר על ידי 10 עקיצות יתושים זיהומיות </td><td> מס &#39;של דם בשלב חיות / מס חיובי של חיות לכל קבוצה </td><td> Mean prepatency [ד] </td></tr><tr><td> נאיבי </td><td> פ berghei </td><td> 7/7 </td><td> 4,4 </td></tr><tr><td> MTB נגוע </td><td> פ berghei </td><td> 7/7 </td><td> 5,5 </t<html> ד&gt; </tr></tbody></table><img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig1.jpg" /> איור 1. תכנית כוללת של ההליך ניסיוני. C57BL / 6 עכברים שנחשפו לטיפי תרסיס MTB המכילים בתא תרסיס גלאס-Col. יום אחד לאחר הדבקה בתרסיס, את הספיגה של MTB מאומתת על ידי ניתוח CFU של הריאות. 40 ימים לאחר אתגר MTB (כשמחלת השחפת הפכה לכרונית בעכברים נגועים), בעלי חיים שנחשפו לפ berghei נגוע יתושים. כדי לאשר את העברת sporozoite מוצלחת ולעקוב אחר המהלך של זיהום Plasmodium, parasitemia מנוטר יומי בכתמי דם צבעוניים Giemsa מתחילים 3 ימים לאחר עקיצת יתוש. / Files/ftp_upload/50829/50829fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50829/50829fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2. סקיצה של כלוב יתושים. יתושי זיהומיות כלולים בתוך קרטון כמו קופסת גלידה חצי ליטר. פתח קטן הוא חתך לתוך הצד של הקרטון ומכוסה בשכבה כפולה של לטקס עם פתח בכל חתיכה כדי ליצור כניסה מאובטחת ליתושים. פיסת נייר סינון היא מודבקת בתחתית הפנימית של הקרטון כדי לספוג את הטיפות. כוסות גלידה הם סגורות עם רשת (רשת ניילון) שהוא קבוע לקרטון על ידי קלטת וגומייה. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig3.jpg" /> איור 3. parasitemia דם לדוגמא.) של כתם דם מוכתם רייט `s מראה אריתרוציטים parasitized (סרגל קנה מידה, 20 &amp; #181;. Parasitemia מ &#39;) B) בדם עכבר היה פיקוח על ידי ניתוח כתמי דם צבעוני Giemsa יומיים. יש עכברי נישאים parasitemia מופחת בהשוואה לעכברי Plasmodium אחת נגועים (n = 10); תוצאות מוצגות כאמצעי ± SD; *** p &lt;0001. הודפס מ 1 PLoS ONE, 7 (10), e48110 באישורו. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig4.jpg" /> איור 4. זיהוי של MTB בריאות. עכברי C57BL / 6 היו תיגר עם תרסיס של MTB 100 CFU ו40 ימים לאחר מכן, נישאים עם פ חיידקי B berghei על ידי עקיצת יתוש.) יום אחד לאחר הדבקה בתרסיס את הספיגה של המספר הרצוי של MTB אומתה על ידי ציפוי homogenates ריאה כולה לקביעת CFU).המון l בזמן coinfection נקבעו בlysates ריאות של 3 עכברים באמצעות ניתוח CFU (d40/d0 MTB). 12 ימים לאחר coinfection, lysates ריאות היו מצופה לניתוח CFU כדי לקבוע את ההשפעה של coinfection Plasmodium על שליטת MTB. שים לב, שמספרי MTB בריאות עלו במהלך coinfection עם פ berghei NK65. תיוג ציר ה-X: פעם אחר -infection/time MTB לאחר coinfection. מעובד מתוך 1 PLoS ONE, 7 (10), e48110 באישורו.

Watch this Scientific Journal Video about An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei at JoVE.com

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

שחפת ומלריה הן שניים מהזיהומים הנפוצים ביותר בבני אדם וגורמים עיקריים לתחלואה ותמותה באוכלוסיות עניות באזורים הטרופיים. הקמנו מערכת מודל ניסיונית ללמוד תוצאה של coinfection מלריה שחפת בעכברים לאחר אתגר עם שני פתוגנים דרך התוואי הטבעי שלהם לזיהום.

מודל ניסיוני לחקר המלריה שחפת-coinfection על הילוכים טבעיים של חפת Mycobacterium ו Berghei Plasmodium</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

an-experimental-model-to-study-tuberculosis-malaria-coinfection-upon

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

19.7K Views.  University Hospital Heidelberg.  שחפת ומלריה הן שניים מהזיהומים הנפוצים ביותר בבני אדם וגורמים עיקריים לתחלואה ותמותה באוכלוסיות עניות באזורים הטרופיים. הקמנו מערכת מודל ניסיונית ללמוד תוצאה של coinfection מלריה שחפת בעכברים לאחר אתגר עם שני פתוגנים דרך התוואי הטבעי שלהם לזי...

Video: An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

לדוגמא הכנה של<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; תמציות ללימודי metabolomic תהודה מגנטיים גרעיניים

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

גידול של שחפת Mycobacterium Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

<em&gt; במבחנה</em&gt; שיתוף זיהום דגם ללמוד<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 אינטראקציות אדם מונוציטים הנגזרות תאים ראשוניים החיסון

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

בידוד ואנליזה של Leukocytes המוחי מוחרם מ<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; עכברי אנקה נגוע

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

הוכחת סמים רבים עמידים<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; Microarray ההגברה

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most common microdissection technique used today. In this technique, a laser is used to focally melt a thermoplastic membrane that overlies a dehydrated tissue section1. The tissue section composite is then lifted and separated from the membrane. Although this technique can be used successfully for tissue examination, it is time consuming and expensive. Furthermore, the successful completion of procedures using this technique requires the use of a laser, thus limiting its use. A new more affordable and practical microdissection approach called mesodissection is a possible solution to the pitfalls of LCM. This technique employs the MESO-1/MeSectr system to mill the desired tissue from a slide mounted tissue sample while concurrently dispensing and aspirating fluid to recover the desired tissue sample into a consumable mill bit. Before the dissection process begins, the user aligns the formalin fixed paraffin embedded (FFPE) slide with a hematoxylin and eosin stained (H&#38;E) reference slide. Thereafter, the operator annotates the desired dissection area and proceeds to dissect the appropriate segment. The program generates an archived image of the dissection. The main advantage of mesodissection is the short duration needed to dissect a slide, taking an average of ten minutes from set up to sample generation in this experiment. Additionally, the system is significantly more cost effective and user friendly. A slight disadvantage is that it is not as precise as laser capture microscopy. In this article we demonstrate how mesodissection can be used to extract RNA from slides from FFPE granulomas caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been extensively employed for the examination of DNA, RNA, and protein within tissue. Laser capture microscopy (LCM) is the most commonly used method, but a new milling technique, mesodissection, is recently available. We demonstrate RNA extraction from mesodissected formalin fixed paraffin embedded tissue slides of Mycobacterium tuberculosis granulomas.

גישה החדשנית Microdissection לשחזור<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; תמלילים ספציפיים מפרפין קבוע פורמלין משובץ ריאות גרנולומות

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

דגם רקמות 3D ריאות אדם ללימודים פונקציונליים ב<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; זיהום

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Assay תואם תפוקה גבוהה כדי להעריך יעילות התרופה נגד Macrophage passaged<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

הדמיה שחפת Mycobacterium בעכברים עם הכתב אנזים קרינה פלואורסצנטית

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...