Los autores desean agradecer a Miriam Ester para la reproducción de mosquitos. Este trabajo fue apoyado por el financiamiento interno del Centro de Investigación Borstel y se unió a la financiación por la infección Leibniz Center.

<ol>
	<li>Mueller, A. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Transmission+of+Plasmodium+berghei+Exacerbates+Chronic+Tuberculosis+in+an+Experimental+Co-Infection+Model.">Natural Transmission of Plasmodium berghei Exacerbates Chronic Tuberculosis in an Experimental Co-Infection Model.</a> PLoS ONE. 7, e48110 (2012).</li><li>Korbel, D. S., Schneider, B. E., Schaible, U. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+in+tuberculosis:+myths+and+truth.">Innate immunity in tuberculosis: myths and truth.</a> Microbes Infect. 10, 995-1004 (2008).</li><li>Aly, A. S., Vaughan, A. M., Kappe, S. 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Los autores no tienen nada que revelar.

Describimos cómo los ratones pueden ser productivamente infectadas por Mtb y P. berghei a través de sus rutas naturales de infección. Aplicamos establecido protocolos de infección experimental para estudiar la tuberculosis o la malaria 13 12 y, recientemente, los adoptó para estudiar la coinfección entre Mtb y Plasmodium en el modelo de ratón 1. Los pasos más importantes para las infecciones de éxito son la transmisión de ambos patógenos en los números deseados. Stocks por micobacterias no deben ser mayores de 2 años, porque van a perder viabilidad en el tiempo, y la decidida originalmente el título de las acciones lo más probable es ya no ser exacta. Como resultado, las dosis de infección sería mucho menor de lo esperado. Por lo tanto, los títulos de UFC de cultivos madre deben determinarse cada pocos meses. Igualmente importante es el cultivo estandarizado y generación de reservas de Mtb en el primer lugar. Las condiciones de cultivo, tales comomedio, suplementos, tiempo, y el volumen deben ser normalizados con el fin de ser capaz de comparar los datos de diferentes experimentos utilizando poblaciones de Mtb. Micobacterias tienden a aglutinarse durante el cultivo, por lo que es importante mantener las condiciones de cultivo estandarizado, las bacterias de la cosecha en la misma fase de crecimiento y volver a suspender con frecuencia durante alícuotas. De lo contrario puede haber una amplia variación en los títulos de UFC y el resultado de la infección. La generación de lotes de mosquitos infectados de forma homogénea es otro paso crítico. Desde diferentes mosquitos se alimentan de cada ratón individual, es importante que todos los mosquitos utilizados para un experimento de infección provienen del mismo lote y que se utilizan únicamente los lotes donde se infectó a más de 90% de los mosquitos. El modelo actual se puede utilizar para diseccionar las respuestas inmunes y modulaciones inmune en un huésped coinfectados por comparación con las respuestas inmunes en hospedadores infectados individuales. Podemos aplicar vametodologías tales como la histología, inmunohistoquímica, citometría de análisis de poblaciones de células inmunes, o PCR y ELISA para la detección de citoquinas y quimioquinas a los tejidos o fluidos corporales de interés GRAVES bien establecidos. Cabe señalar, que tales modelos de ratón tienen ciertas limitaciones. Mientras que la mayoría de la gente infectada con Mtb desarrollar una infección latente, sin signos de los síntomas clínicos, los ratones desarrollan una enfermedad crónica con patología pulmonar progresiva. Sin embargo, ratones C57BL / 6 ratones son relativamente resistentes a la infección de Mtb y no desarrollan granulomas clásicos como se observa en los pacientes con tuberculosis humanos. Como resultado, las reacciones inmunopatológicas en el ratón no reflejan ni la enfermedad de la tuberculosis humana latente ni activa apropiadamente. A pesar de la discrepancia entre la enfermedad latente y crónica en el hombre y el ratón, los ratones se han utilizado ampliamente para identificar y estudiar los factores del huésped que controlan la infección por Mtb y son herramientas valiosas e indispensables para investigarla respuesta inmune en las enfermedades infecciosas. Es importante destacar que, la susceptibilidad a la infección de Mtb varía considerablemente entre las cepas de ratón endogámicas de uso común y las cepas más susceptibles tales como DBA o C3H se pueden incluir en los estudios de co-y-infección única. Por otra parte, además de las especies de patógenos descritos en este documento, se podrían utilizar cualquier otra especie de Mycobacterium de interés (por ejemplo, aislados clínicos). Del mismo modo, mientras que hay un único modelo de la malaria se replica todos los aspectos de la enfermedad humana diferentes modelos de ratones no se parecen mucho a los diferentes aspectos de la infección de la malaria humana adquirida de forma natural. Por ejemplo, P. berghei y P. ANKA Yoelii YM/17XL se estudian ampliamente los modelos de hombre (inducida por P. falciparum) paludismo grave, con P. berghei ANKA está considerado como un excelente modelo para el consumo humano Malari s cerebral 14,15. P. berghei NK65 es un excelente modelo para hiperparasitemia y malaria anemia aguda, y ha sido recientementedescrito como un modelo experimental para el síndrome de la malaria asociada a dificultad respiratoria aguda (SDRA MA-16). Utilizando el modelo de la coinfección descrito, recientemente hemos podido demostrar que P. concurrente infección berghei NK65 exacerba tuberculosis crónica 1. Aparte de utilizar diferentes parásitos de la malaria de roedores, el orden y el calendario de eventos de infección pueden ser adaptados en función de la pregunta de investigación subyacente. En el campo, infecciones por Plasmodium concomitantes pueden estar presentes en el momento de la infección de Mtb o adquirida posteriormente. En ambos casos la respuesta inmune a Mtb y Plasmodium pueden verse afectados de forma diferente. Por lo tanto, los ratones pueden infectarse con esporozoitos de Plasmodium, ya sea antes o después de la infección de Mtb. Además, los ratones pueden ser impugnadas en diferentes momentos después de la infección de Mtb para evaluar el impacto de la respuesta inmune inducida por Plasmodium in aguda frente crónicala tuberculosis. Es importante destacar que, al elegir un parásito de la malaria para el estudio de la coinfección por malaria tuberculosis, uno debe ser consciente de que algunas cepas de Plasmodium roedores causan enfermedad grave en ciertas cepas de ratón y sucumben a la infección dentro de sólo unos días o semanas, mientras Mtb hace crónica y las infecciones de larga duración en inmunocompetentes ratones. Por lo tanto, el momento de la coinfección es crucial con el fin de evitar la muerte prematura de los animales experimentales. La modulación de la inmunidad del huésped por la infección simultánea con múltiples especies de patógenos sigue siendo poco conocida. Nuestro modelo de coinfección experimental proporciona una herramienta poderosa para investigar Mycobacterium - interacción Plasmodium con el sistema inmune de un huésped coinfectados y contribuirá a nuestra comprensión de cómo las coinfecciones pueden afectar patogenia, evolución de la enfermedad, la vacunación, inmunodiagnóstico, y la terapia.

Las poblaciones humanas rara vez se exponen a un solo patógeno. Sobre todo en las regiones con alta incidencia de infecciones como el África subsahariana, las coinfecciones representan un problema de salud pública de primera, pero muy poco apreciada. La tuberculosis y la malaria son las infecciones bacterianas y parasitarias de mayor prevalencia en los seres humanos, respectivamente, y siguen siendo las causas principales de morbilidad y mortalidad en las poblaciones pobres de las zonas tropicales. A pesar de la amplia superposición geográfica entre la tuberculosis y la malaria y el gran número de personas en riesgo de coinfección, se sabe muy poco acerca de las interacciones entre los diversos y con frecuencia contrapuestos reguladores inmunes y efectores simultáneamente provocados contra los parásitos de la malaria y los bacilos de la tuberculosis en las personas coinfectadas. Modelos de roedores de infecciones mixtas permiten caracterizar las reacciones inmunes diferenciales frente a patógenos distintos en un host, lo que enfatiza la influencia mutuariencias modulación de la patología y la evolución clínica de la enfermedad individual, lo que también ayudará a identificar nuevas recomendaciones para el tratamiento y la prevención. Hemos establecido un modelo experimental de ratón, que nos permite investigar las ramificaciones causadas por la infección concurrente con Mycobacterium tuberculosis (Mtb) y especies de Plasmodium de roedores dentro de la misma máquina 1. Es importante destacar que, para emular las infecciones humanas adquiridas naturalmente lo más estrechamente posible, nuestro modelo implementa las rutas naturales de infección utilizados por ambos patógenos. La tuberculosis es una infección por el aire, que por lo tanto se manifiesta principalmente en los pulmones. El agente causal, Mtb es transmitida por las personas con enfermedad activa a través de la ruta de aerosol cuando se expulsan gotitas de aerosol infecciosas durante la tos o el estornudo. Por lo tanto, la infección por aerosol es el método de elección para imitar la infección natural. Generación de partículas en el aire que contienen Mtb se puede lograr mediante el usode un sistema de exposición por inhalación. Esta cámara de exposición de todo el cuerpo permite la exposición de los animales experimentales para Mtb-que contiene gotitas de aerosol infecciosas (Figura 1) que se inhala en los alvéolos de los pulmones, donde se inicia la infección 2. La malaria, por otro lado es una enfermedad transmitida por vectores causada por el protozoo parásito Plasmodium apicomplejo que se transmite de forma natural por la picadura de un mosquito anofeles hembra. Durante la harina de sangre, esporozoitos infecciosos se depositan bajo la piel de acogida y posteriormente alcanzan el hígado a través del torrente sanguíneo. Dentro de los hepatocitos se desarrollan y se multiplican rápidamente en esquizontes hígado etapa. Eventualmente, los esquizontes maduros se rompen y liberan miles de merozoitos de primera generación patógenos en el torrente sanguíneo donde inician un ciclo progresivo de la invasión de células rojas, la replicación, la ruptura de los glóbulos rojos, y la reinvasión 3. La contingencia del ciclo de vida del Plasmodiumues como algunos merozoitos se desarrollan en las etapas de parásitos sexuales, los gametocitos masculinos y femeninos, que pueden ser emprendidas por los mosquitos durante las comidas de sangre. En el mosquito, los esporozoitos de Plasmodium se desarrollan dentro de los ooquistes que residen en el intestino medio del mosquito y eventualmente migran a las glándulas salivales para su posterior transmisión a otro 3,4 anfitrión. Aunque en modelos animales experimentales de la entrega de Mtb través del aerosol y la vía por lo tanto más relevante es muy común, muchos estudios de infección por Plasmodium roedores experimentales, incluyendo estudios sobre la malaria tuberculosis coinfección 5-7 se han llevado a cabo mediante la infección de ratones con eritrocitos parasitados, dando lugar a la infección de la malaria en fase de sangre mientras que excluye la fase hepática en fase clínicamente silenciosa. Sin embargo, la etapa de hígado es un paso obligatorio durante la infección y relevante para la inmunidad anti-plasmodial 8-11. Consideramos que es por lo tanto importante incluir el pH hepáticaase de transmisión de la malaria y el mantenimiento en los estudios tanto de la malaria y la coinfección por malaria tuberculosis, respectivamente. Además, se ha demostrado que los esporozoitos de transmisión de forma natural son más infecciosos que los transmitidos a través de las infecciones de aguja 12, que nos llevó a establecer la infección de la malaria por picadura de mosquito en lugar de inyectar aislado de las glándulas salivales esporozoitos derivados. La única manera de obtener mosquitos infecciosos de transmisión natural de parásitos de la malaria es mantener todo el ciclo de vida del parásito, tanto en el hospedador vertebrado (en este caso el ratón) y el mosquito vector. Por lo tanto, el acceso a un insectario para el mantenimiento parásito es inevitable con el fin de realizar transmisión natural por picadura. Nuestro protocolo descrito en el presente documento ha sido desarrollado para investigar la forma en la coinfección por el Plasmodium esporozoitos impactos sobre la tuberculosis crónica 1. Para ello, los ratones son aerosoles infectados con M. tuberculosis y 40 días más tarde, cuando M. infección por tuberculosis ha alcanzado la fase crónica, los ratones son expuestos a los mosquitos malaria-infeccioso. El resultado de tanto la malaria y la tuberculosis en los animales coinfectados puede ser seguido por el seguimiento de la parasitemia en la sangre y la carga bacteriana en el tejido, respectivamente. En nuestro protocolo, vamos a describir en detalle cómo se infectan ratones con ambos patógenos a través de su ruta de infección natural y la forma de confirmar la transmisión de patógenos con éxito. En nuestras manos, la tasa de infección comúnmente alcanzada por ambas infecciones experimentales es del 100%. Estos protocolos se pueden aplicar para estudiar tanto las infecciones por separado o, como nosotros, para modelar y estudiar la coinfección entre dos de los más desafiantes enfermedades infecciosas humanas. Este modelo es aplicable a otras especies de Mycobacterium y Plasmodium roedor más allá de los descritos en este protocolo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="650">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Buraton</td>
			<td style="width:124px;">Sch&#252;lke</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;">active ingredients: aldehyds (formaldehyde, glutaraldehyde, oxalaldehyde, ethyl hexanal)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Middlebrook 7H9&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M0178</td>
			<td style="width:191px;">For Mtb broth cultures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Middlebrook 7H11&#160;</td>
			<td style="width:124px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">283810</td>
			<td style="width:191px;">Agar medium for Mtb culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Middlebrook OADC enrichment medium</td>
			<td style="width:124px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">212240</td>
			<td style="width:191px;">Add to 7H9 and 7H11 for Mtb culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Staining Dish</td>
			<td style="width:124px;">Science Services</td>
			<td style="width:119px;">E62542-12</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">24-Slide Holder w/Handle</td>
			<td style="width:124px;">Science Services</td>
			<td style="width:119px;">E62543-06</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Giemsas Azur-Eosin-Methylene blue solution</td>
			<td style="width:124px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">109204</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wright&#180;s stain</td>
			<td style="width:124px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">W0625</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inhalation Exposure System</td>
			<td style="width:124px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nebulizer-Venturi</td>
			<td style="width:124px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ice cream cups</td>
			<td style="width:124px;">H&#228;agen-Dazs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;">Used as mosquito cages</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Metal-frame mosquito cages</td>
			<td style="width:124px;">BioQuip Products</td>
			<td style="width:119px;">1450A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an experimental model to study tuberculosis-malaria coinfection upon natural transmission of mycobacterium tuberculosis and plasmodium berghei

Las coinfecciones ocurren de forma natural debido a la coincidencia geográfica de los distintos tipos de organismos patógenos. Infecciones concurrentes muy probablemente modulan la respectiva respuesta inmunitaria a cada solo patógeno y pueden afectar con ello la patogénesis y evolución de la enfermedad. Los pacientes coinfectados también pueden responder diferencialmente a las intervenciones anti-infecciosos. La coinfección entre la tuberculosis como causada por micobacterias y el parásito de la malaria Plasmodium, los cuales son coendemic en muchas partes del África subsahariana, no se ha estudiado en detalle. Con el fin de abordar el reto, pero científicamente y clínicamente pregunta muy relevante cómo modular la coinfección tuberculosis-malaria inmunidad del huésped y el curso de cada enfermedad, establecimos un modelo experimental de ratón que nos permite diseccionar las respuestas inmunitarias producidas a ambos patógenos en el huésped coinfectados . Es de destacar que el fin de la mayoría de las infecciones humanas imitan a la perfección adquiridos naturalmente, realizamos experimentalinfecciones de ratones con ambos patógenos por parte de sus rutas naturales de infección, es decir, aerosol y picadura de un mosquito, respectivamente.

La infección de ratones con Mtb y P. berghei a través de la ruta natural, es decir, aerosol y picadura de un mosquito, respectivamente, los resultados en la infección coherente y reproducible de todos los animales (Tabla 1) 1. Podemos monitorear la infección exitosa y el curso de los dos la malaria y la tuberculosis mediante la determinación de la aparición inicial (prepatencia) y el número de parásitos en la sangre (P. berghei parasitemia) y la carga de Mtb en diferentes órganos, respectivamente. Un ejemplo de éxito de la transmisión del parásito de la malaria por la picadura de un mosquito infectado se muestra en la Tabla 1 y Figura 3. La alimentación de 10 mosquitos esporozoito infectados en cada ratón dio como resultado una tasa de infección del 100% según lo confirmado por la presencia de parásitos en el estadio en sangre 4-5 días después (Tabla 1 y Figura 3A). Es importante destacar que nos encontramos con el número de parásitos similares en la sangre de ratones individuales de la misma gr experimentaloup, lo que indica que la transmisión de esporozoito por los resultados de la mordedura de mosquito en una infección consistente y reproducible. Al comparar la prepatencia en los ratones control no tratados previamente con la de los animales Mtb coinfectados, podemos ver que prepatencia se retrasa ligeramente en ratones que habían sido preinfected con Mtb (Tabla 1, Figura 3B) 1. Como hemos informado anteriormente 1, podemos determinar el impacto de la coinfección Mtb en el curso de la malaria parasitemia seguimiento diario de Giemsa de frotis teñidos de sangre, como se muestra en la Figura 3B. La infección de ratones con Mtb por el uso de un sistema de exposición a la inhalación resultados en la deposición con éxito de las bacterias en los pulmones con relativamente baja variabilidad entre ratones individuales (Figura 4A). Podemos seguir cargas de micobacterias en los pulmones y otros órganos de interés a través del tiempo por la determinación de UFC. Un ejemplo para la carga micobacteriana en los pulmones deMtb infectado ratones C57BL / 6 en la ausencia o presencia de P. berghei se muestra en la Figura 4B. Tabla 1. Prepatencia después de la transmisión de esporozoito por picadura de mosquito. Todos los ratones desarrollaron infecciones del estadio en sangre después de la transmisión natural de P. berghei esporozoitos por picadura de mosquito. Adaptado de 1 PLoS ONE, 7 (10), e48110 con permiso. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Grupo de ratones Experimental (C57BL / 6) </td><td> Desafíe por 10 picaduras de mosquitos infecciosos </td><td> Número de sangre-fase animales positivos / N º de animales por grupo </td><td> Mean prepatencia [d] </td></tr><tr><td> ingenuo </td><td> P. berghei </td><td> 7/7 </td><td> 4,4 </td></tr><tr><td> Mtb infectado </td><td> P. berghei </td><td> 7/7 </td><td> 5,5 </t<html> d&gt; </tr></tbody></table><img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema general del procedimiento experimental. C57BL / 6 ratones se expone a Mtb-que contienen gotitas de aerosol en una cámara de aerosol Glas-Col. Un día después de la infección de aerosol, la absorción de Mtb se verificó por análisis de UFC de pulmón. 40 días después del desafío Mtb (cuando la tuberculosis se ha convertido en crónica en ratones infectados), los animales están expuestos a P. berghei infectado mosquitos. Para confirmar la transmisión de esporozoito éxito y seguir el curso de la infección por Plasmodium, la parasitemia es monitoreada diariamente en Giemsa de frotis teñidos de sangre a partir de 3 días después picadura de mosquito. / Files/ftp_upload/50829/50829fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50829/50829fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Bosquejo de una jaula de mosquitos. Mosquitos infecciosos están contenidas dentro de un cartón, como un cuarto de litro de helado de cartón. Una pequeña abertura se corta en el lado de la caja de cartón y se cubre con una doble capa de látex con una hendidura cortada en cada pieza para crear una entrada segura para los mosquitos. Un trozo de papel de filtro se pega en la parte inferior en el interior de la caja de cartón para absorber los goteos. Copas de helado se cierran con una red (malla de nylon) que está fijado a la caja de cartón por la cinta y la banda elástica. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig3.jpg" /> Figura 3. Parasitemia Sangre. A) Ejemplo de Wright `s frotis de sangre teñida mostrando eritrocitos parasitados (barra de escala, 20 &amp; #181;. M) B) La parasitemia en sangre de ratón se controló mediante el análisis diarios frotis de sangre teñidos con Giemsa. Ratones coinfectados tienen una parasitemia reducido en comparación con los ratones de Plasmodium individuales infectados (n = 10), y los resultados se muestran como medias ± SD; *** p &lt;0,001. Reproducido de 1 PLoS ONE, 7 (10), e48110 con permiso. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig4.jpg" /> Figura 4. La detección de Mtb en el pulmón. C57BL / 6 ratones fueron retados con aerosol 100 UFC de Mtb y 40 días más tarde, coinfectados por el P. B) Las bacterias berghei por picadura de mosquito. A) Un día después de la infección aerosol la captación del número deseado de Mtb se verificó mediante siembra de homogeneizados de pulmón entero para la determinación de UFC.l cargas en el momento de la coinfección se determinaron en lisados ​​de pulmón de 3 ratones a través de análisis de CFU (Mtb d40/d0). 12 días después de la coinfección, lisados ​​de pulmón se sembraron para el análisis de CFU para determinar el impacto de la coinfección por Plasmodium en el control de Mtb. Tenga en cuenta, que los números de Mtb en los pulmones se incrementaron durante la coinfección con P. berghei NK65. Etiquetado del eje X: tiempo después de Mtb -infection/time después de la coinfección. Adaptado de 1 PLoS ONE, 7 (10), e48110 con permiso.

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An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

La tuberculosis y la malaria son dos de las infecciones más prevalentes en los humanos y las principales causas de morbilidad y mortalidad en las poblaciones pobres de las zonas tropicales. Hemos establecido un sistema de modelo experimental para estudiar los resultados de la coinfección tuberculosis-la malaria en ratones tras la exposición a ambos patógenos a través de su vía natural de infección.

Un modelo experimental para estudiar la tuberculosis-Malaria Coinfección sobre Transmisión Natural de Mycobacterium tuberculosis Y Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

19.7K vistas.  University Hospital Heidelberg.  La tuberculosis y la malaria son dos de las infecciones más prevalentes en los humanos y las principales causas de morbilidad y mortalidad en las poblaciones pobres de las zonas tropicales. Hemos establecido un sistema de modelo experimental para estudiar los resultados de la coinfección tuberculosis-la malaria en ratones tras la exposición a ambos patógenos a través de su vía natural de infección. 

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Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

Preparación de la muestra de<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extractos de Estudios de Resonancia Magnética Nuclear metabolómica

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Investigación

Inmunología e Infección

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

Crecimiento de Mycobacterium tuberculosis Las biopelículas

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infección modelo para estudiar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-VIH-1 en las interacciones humano primario de monocitos derivados de las células inmunitarias

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Aislamiento y análisis de Brain-secuestrados Los leucocitos de<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA de ratones infectados

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

Demostración de un resistente a múltiples fármacos<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Microarray Amplificación

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Un modelo de tejido 3D Pulmón humano de Estudios funcionales en<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infección

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Sistema para la eficacia y la citotoxicidad de detección de inhibidores de focalización intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

Proyección de imagen de tuberculosis del Mycobacterium en ratones con reportero enzima fluorescencia

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

Modelado de la Tuberculosis de Mycobacterium marinum infección pez cebra adulto

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected with Mycobacterium tuberculosis. Despite decades of research, many of the mechanisms behind the success of M. tuberculosis as a pathogenic organism remain to be investigated, and the development of safer, more effective antimycobacterial drugs are urgently needed to tackle the rise and spread of drug resistant tuberculosis. However, the progression of tuberculosis research is bottlenecked by traditional mammalian infection models that are expensive, time consuming, and ethically challenging. Previously we established the larvae of the insect Galleria mellonella (greater wax moth) as a novel, reproducible, low cost, high-throughput and ethically acceptable infection model for members of the M. tuberculosis complex. Here we describe the maintenance, preparation, and infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux. Using this infection model, mycobacterial dose dependent virulence can be observed, and a rapid readout of in vivo mycobacterial burden using bioluminescence measurements is easily achievable and reproducible. Although limitations exist, such as the lack of a fully annotated genome for transcriptomic analysis, ontological analysis against genetically similar insects can be carried out. As a low cost, rapid, and ethically acceptable model for tuberculosis, G. mellonella can be used as a pre-screen to determine drug efficacy and toxicity, and to determine comparative mycobacterial virulence prior to the use of conventional mammalian models. The use of the G. mellonella-mycobacteria model will lead to a reduction in the substantial number of animals currently used in tuberculosis research.

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Galleria mellonella was recently established as a reproducible, cheap, and ethically acceptable infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Here we describe and demonstrate the steps taken to establish successful infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux.

Uso de la Invertebrada Galleria mellonella como Modelo de Infección para Estudiar el Complejo Mycobacterium tuberculosis

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...