CHO-P hücreleri Dr Barbara Furie (Beth Israel Deaconess Tıp Merkezi, Harvard Tıp Okulu) bir tür hediye edildi. Bu çalışma JMK Bu çalışma aynı zamanda JMK bir Movember-Prostat Kanseri Vakfı Yarışması Ödülü tarafından kısmen desteklenen Sağlık hibe HL095722 Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenen

1.. Hücre Kültürü <ol><li> Insan promiyelositik lösemi (HL-60) hücreleri <ol><li> 75 cm kültür HL-60 hücreleri,% 20 (v / v) cenin sığır serumu (FBS),% 1 (v / v), L-glutamin ve 1 ile takviye edilmiş Iscove Modifiye Dulbecco ortamı (IMDM), 15 ml 2 şişe % (v / v) penisilin-streptomisin. </li><li> Hücre süspansiyonu hacminin yarısı aspirasyon ve tam IMDM ortamı ile değiştirilmesiyle her 3 günde bir ortam kullanın. </li><li> Carboxyfluorescein diasetat için, süksinimidil ester (CFSE) boyama, santrifüj HL-60 hücre süspansiyonu (400 x g, 5 dakika), 1 uM CFSE çözelti içinde tekrar süspansiyon (önceden ısıtılmış PBS içinde hazırlandı) ve 37 ° C&#39;de 15 dakika boyunca inkübe Daha sonra, 30 dakika için önceden ısıtılmış taze ortam içinde hücreler, santrifüj, aspirat supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri. PBS içinde hücreleri yıkayın ve daha sonra (P-sel kaplı yüzey üzerine CFSE boyanmış HL-60 hücreleri için temsili görüntüsü Şekil 1B&#39;ye bakınız) haddeleme deneyler için kullanın. </li></ol></li></ol><p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Not: CFSE boyama isteğe bağlıdır, ve mikroakışkan kanalda haddeleme fenomen göstermek için burada sunulmuştur. Bu yazıda sunulan haddeleme parametrelerinin analizi standart aydınlık görüntüleme kullanarak boyanmamış hücreler üzerinde yapıldı. <ol start="2"><li> Akciğer mikrovasküler endotelyal hücreler (LMVECs) <ol><li> Coat 100 mm Petri% 0.1 jelatin çözeltisi (PBS içerisinde v / v) ile yemekleri ve en az 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Tam endotelyal büyüme ortamı içinde jelatin kaplı 100 mm petri çanakları üzerine kültür LMVECs (endotelyal bazal ortamı-2 (EBM-2)), spesifik bir büyüme takviyesi kiti ile takviye edilmiş) REAJANLAR bkz. Medya% 80-90 ulaşan üzerine her gün ve alt-kültür hücreleri değiştirmek. </li><li> Alt-kültürü için, hücreler, PBS ile yıkayın ve daha sonra ayırma hücreleri 1 x tripsin-EDTA 4 ml ile 3 dakika boyunca 37 ° C&#39;de ve tam EBM-2 ortamının bir eşit hacmi içinde nötralize eder. Bir 15 ml tüp ve centrifug hücre süspansiyonu aktarıne (400 xg, 5 dk). Santrifüj sonrasında, tam endotelyal ortam 1 ml pelet tekrar süspansiyon ve bir hemasitometre ile hücre sayımı. Bu tüm deneyler için geçiş 7 altında yalnızca hücre morfoloji ve fonksiyon kullanımını etkilediği gibi, değil over-geçit hücreleri. </li></ol></li></ol><ol start="3"><li> Çin Hamsteri Yumurtalık-P-selektin (CHO-P) Hücreler <ol><li> Şekilde insan P-sel ifade transfekte CHO hücreleri olan CHO-P hücreleri, işbirlikçiler (Beth Israel Deaconess Tıp Merkezi, Harvard Tıp Okulu) 11,12 tarafından sağlandı. </li><li> F-12 ortamı içinde 25 ml T175 cm kültür CHO-P hücreleri 2 şişe hazırlanmıştır. </li><li> Geçirilmesi için, 4-5 saniye boyunca, 10 ml PBS ile yıkayın ve daha sonra hücreler, tam ortam içinde nötralize ardından 37 ° C&#39;de 3 dakika boyunca 1 x tripsin-EDTA, 10 ml trypsinize. </li><li> Santrifüj hücre süspansiyonu (400 x g, 5 dakika), dikkatli bir şekilde, süpernatan aspire tam ortam içinde 1 ml hücre pelletini ile hücre sayımıBir hemositometre. </li></ol></li></ol> 2. Entegre Multi-iyi Plate mikroakışkan Sisteminin İşletilmesi <ol><li> Tüm ekipman düzgün bağlandığından emin olun ve farklı modülleri açmak: bilgisayar, kontrolör, ters mikroskop ve CCD kamera. </li><li> Görüntüleme yazılımı açın, çoklu-plaka modülü ve görüntüleme modülü düzgün ekranda sunulmaktadır emin olun. </li><li> (Denetleyiciye bağlı) buhar tuzak tüpleri bağlamak ve aynı zamanda onları Basınç Arayüzüne bağlanamıyorum. </li><li> Plaka ısıtıcı / adaptörü, çok oyuklu plaka koyun. Oyuklara (aşağıda tarif edilmiştir) reaktiflerin ilave edin ve plaka üstüne arayüzü ekleyin. Otomatik sahnede görüntüleme için plaka koyun. </li><li> Arayüz plakanın üstüne eklenir ve çok-yuvalı plaka kullanılarak kolaylıkla kontrol tarafından belirlenen akış hızında mikroakışkan kanallardan sıvı, sürücü, kuyu üstüne denetleyicisinden bir pnömatik basınç uygularManuel modu altında modül ekranı. </li><li> Çukurlara arasında yer alan bir gözlem alanı genelinde kanal akışında Reaktifler. Mikroakışkan kanal boyutları 70 mikron boyunda 350 mm genişliğinde x vardır. Doğrusal kanalın uzunluğu 1 mm ve kanalların alt aydınlık faz, floresans ve konfokal mikroskopi ile uyumlu olan bir 180 mikron cam lamel içerir. </li><li> Bir CCD kamera (stream edinimi, 11 kare / sn) kullanarak video Edinme ve uyumlu yazılım aracılığıyla analiz. </li></ol> 3. Bir protein alt-tabakasına ya da bir tekli hücre katmanı ile mikroakışkan Kanallarının Kaplama <ol><li> Fibronektin ya da P-/E-selectin ile mikroakışkan kanal kaplama <ol><li> PBS içinde 20 ug / ml fibronektin çözeltisi 1 ml hazırlayın. Kaplanacak kanal sayısı (kanal başına fibronektinin 25-50 ul kullanım) göre ses değiştirin. </li><li> De her bir girişine fibronektin çözeltisi 25-50 ul ekleyin. 2 dyn / cm 2 kesme kuvveti uygulayın5 dakika kanalı serpmek için. Sıvı iyi çıkışında görünen boncuk unutmayınız. Oda sıcaklığında 30-45 dakika inkübe </li><li> Kuyulardan çözümü (kanalı besleyen orta daire doğrudan aspire etmeyin) 1,13 aspire. Çıkış kuyuya 200-500 ul PBS ilave edin ve 5 dakika boyunca 2 din / cm 2 makaslama akışı uygulayarak PBS ile kanal yıkayın. Kanal artık düzgün fibronektin ve kullanıma hazır ile kaplanmıştır. </li><li> Yüzey kaplama izin vermek için 37 ° C&#39;de 1 saat inkübasyona bırakıldı ile, yukarıda tarif edildiği gibi P-veya E-sel, PBS içinde arzu edilen insan rekombinant protein, 5 mg / ml çözelti hazırlamak ve kat kat kanalları için. </li></ol></li><li> Mikroakışkan kanal içinde CHO-P ya da LMVEC tek tabaka oluşturulması <ol><li> Yavaşça tam ortam ve santrifüj 2 kat bir hacmi (400 x g, 5 dakika) ile söndürülmesi, 3 dakika boyunca kültür kaplarından Hücreleri tripsinize edin. Tam medya ve santrifüj 10 ml (400 x g&#39;de 5 dakika) ile süspanse edin hücreleri Again. </li><li> Süspansiyon içinde hücre konsantrasyonunu saptamak için hücre sayımı. , Kanal içinde bir konfluent tek tabaka LMVEC oluşumunu sağlamak 15-20000000 hücre / ml hücre konsantrasyonunu getirmek için. Konfluent CHO-P hücre tek tabaka için, 50-60000000 hücre / ml kullanmak. Her bir kanal için hücre süspansiyonu 25-50 ul kullanma - göre deney için kullanılan ilk hücre sayısı belirler. </li><li> De girişine uygun bir konsantrasyonda hücre süspansiyonu 25-50 ul ekleyin. Mikroskop sahnede plakayı ve hücreler tüm dolum kanallar ekranda görülür ve daha sonra akışını durdurmak kadar kanalı (2 dyn / cm 2) içine hücreleri tanıtmak. </li><li> Tam LMVEC veya CHO ortamı ya da 200 ul ile çıkış ve giriş hem de doldurun. Hücreler yerleşmek olsun ve kuluçka makinesi içinde 3 saat için bağlı (37 ° C,% 5 CO2). </li><li> 3 saat inkübasyondan sonra, bağlı olmayan kaldırmak için tam ortam (2 dyn / cm 2, 10-15 dakika) ile kanal yıkayınhücreleri. Hücreler artık tamamen birleşen görünmelidir ve kanal artık kullanıma hazırdır. Başlangıç ​​hücre yoğunluğuna bağlı olarak, bir zaman yerleşen ek 2-3 saat hücreler ile yüzeyin tam kapsama sağlamak için gerekli olabilir. </li></ol></li></ol> 4. LMVEC Pro-inflamatuar Aktivasyon ve P-/E-selectin antikor tarafından bloke edilmesi <ol><li> LMVEC bazal ortam maddesi içinde bir TNF-α çözeltisi (10 ng / ml) hazırlayın. </li><li> , Kanallarda LMVEC inflamatuar aktivasyonuna sebep de girişine TNF-α çözeltisi 100 ul ilave edin ve 5 dakika boyunca 2 din / cm 2 makaslama akışı uygulayarak kanalın içine çözelti tanıtmak. Kontrol kanalları için (etkisizleştirilmiş EC), girişine LMVEC bazal ortam, 100 ul de ekleyin ve kanalı (5 dakika boyunca 2 dyn / cm 2) haline getirmektedir. Kanal artık bir yuvarlanma deneyi için hazır. </li><li> P-sel ve LMVECs ve CHO-P hücrelerinde E-sel engellemek için, P-sel (klon AK4, ba 5 ug / ml nötralize tanıtmaksal ortamı) ya da E-sel (klon P2H3, bazal ortam maddesi içinde 5 ug / ml) antikor kanal içine ve 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca inkübe Daha sonra, (5 dakika boyunca 2 dyn / cm 2) bazal ortam ile kanal yıkayın. Kanallar artık yuvarlanan bir tahlil için hazırız. </li></ol> 5. Yüzey / Cep tabakalı-Kaplamalı mikroakışkan Kanallar HL-60 Rolling Deneyi <ol><li> Dikkatle kanal uygun bir şekilde (hücreler ile kaplama durumunda, tam olarak tek katlı bir birleşik hücre dikkate alınmalıdır) kaplanmıştır onaylamak için mikroskop altında kanal inceleyin. </li><li> Haddeleme deneyler, santrifüj HL-60 hücre süspansiyonu (400 x g, 5 dakika) için HL-60 hücre süspansiyonu hazırlamak ve bazal ortamı ile bir kere yıkayın. 5.000.000 hücre / ml bir HL-60 hücre süspansiyonu elde etmek üzere (Ca 2 + ve Mg2 + ihtiva eden bazal ortam,) IMDM&#39;de tekrar süspansiyon hücreleri ve sayılır. Haddeleme tahlili gerçekleştirmek için, her bir kanal için hücre süspansiyonu 25-50 ul kullanın. </li><li> Hücre suspe 25-50 ul eklension mikroskop sahnede sıcaklık kontrollü plaka tutucu (37 ° C) ve yer içinde, iyi bir yerde plaka çıkış için. Daha sonra, (hücre girişine çıkışından akan 10-15 saniye içinde dikkat edilmelidir) 2 din / cm 2 makaslama kuvveti uygulanarak kanala hücreleri tanıtmak. </li><li> Makaslama gerilmesinin bir fonksiyonu olarak yuvarlanma tepkisini incelemek için, (5 dyn kadar 0.25 yavaş yavaş kesme artırmak dyn / cm 2 0.25 kesme azaltmak ve istenen her makaslamada (&quot;stream satın alma&quot; fonksiyonunu kullanarak) 20-30 sn video edinmeniz / 2 cm. It) daha yüksek bir makas kullanımı da mümkündür. </li><li> Bir CCD kamera (stream edinimi, 11 kare / sn) kullanarak video Edinme ve uyumlu yazılımı ile yollarını haddeleme ve haddeleme hızları analiz. </li></ol> 6. Yüzey moleküllerinin ekspresyonunu tespit etmek için akış sitometrisi <ol><li> Tripsinizasyon sonra, arzu edilen hücre tipi (HL-60, CHO-(1-2 x 10 5 hücre / örnek kullanarak) bir hücre süspansiyonunun hazırlanmasıPBS içinde ya da P LMVECs) (- / -),% 2 FBS ile takviye edilmiştir. Iki kez hücreleri yıkayın ve 50 ul (aynı tampon kullanarak) örnek hacmi getirmek. </li><li> 20 dakika boyunca 4 ° C &#39;de arzu edilen fluorofor ile konjüge Ab (daha ayrıntılı bilgi için ekli tabloya bakınız) (alüminyum folyo ile kapak) ile her bir örnek inkübe edin. </li><li> Iki kez (aynı tamponu) hücreleri yıkanır ve 200 ul hücre süspansiyonu, lekeli son hacim getirir. Yüzey moleküllerinin ekspresyonunu tespit etmek için bir akış sitometrisi kullanılarak örnekleri analiz edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Conant, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well+plate+microfluidic+system+for+investigation+of+dynamic+platelet+behavior+under+variable+shear+loads.">Well plate microfluidic system for investigation of dynamic platelet behavior under variable shear loads.</a> Biotechnol. Bioeng. 108, 2978-2987 (2011).</li><li>Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well+plate-coupled+microfluidic+devices+designed+for+facile+image-based+cell+adhesion+and+transmigration+assays.">Well plate-coupled microfluidic devices designed for facile image-based cell adhesion and transmigration assays.</a> J. Biomol. Screen. 15, 102-106 (2010).</li><li>Ankrum, J., Karp, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+therapy:+Two+steps+forward,+one+step+back.">Mesenchymal stem cell therapy: Two steps forward, one step back.</a> Trends Mol. Med. 16, 203-209 (2010).</li><li>Karp, J. M., Leng Teo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+homing:+the+devil+is+in+the+details.">Mesenchymal stem cell homing: the devil is in the details.</a> Cell Stem Cell. 4, 206-216 (2009).</li><li>Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+migration+in+inflammation:+present+and+future+therapeutic+targets.">Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets.</a> Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).</li><li>Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+selectins+in+inflammation+and+disease.">The role of selectins in inflammation and disease.</a> Trends Mol. Med. 9, 263-268 (2003).</li><li>Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+leukocyte+rolling+in+vivo+and+in+vitro.">Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro.</a> Methods Enzymol. 416 (06), 346-371 (2006).</li><li>Brown, D. C., Larson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+to+parallel+plate+flow+chambers+to+reduce+reagent+and+cellular+requirements.">Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements.</a> BMC Immunol. 2, 9 (2001).</li><li>Lawrence, M. B., McIntire, L. V., Eskin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+flow+on+polymorphonuclear+leukocyte/endothelial+cell+adhesion.">Effect of flow on polymorphonuclear leukocyte/endothelial cell adhesion.</a> Blood. 70, 1284-1290 (1987).</li><li>Conant, C. G., Schwartz, M. A., Nevill, T., Ionescu-Zanetti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+adhesion+and+aggregation+under+flow+using+microfluidic+flow+cells.">Platelet adhesion and aggregation under flow using microfluidic flow cells.</a> J. Vis. Exp. (10), e1644 (2009).</li><li>Furie, B., Furie, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+platelet+P-selectin+and+microparticle+PSGL-1+in+thrombus+formation.">Role of platelet P-selectin and microparticle PSGL-1 in thrombus formation.</a> Trends Mol. Med. 10, 171-178 (2004).</li><li>Tchernychev, B., Furie, B., Furie, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritoneal+macrophages+express+both+P-selectin+and+PSGL-1.">Peritoneal macrophages express both P-selectin and PSGL-1.</a> J. Cell Biol. 163, 1145-1155 (2003).</li><li>Conant, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+well-plate+microfluidic+devices+to+conduct+shear-based+thrombosis+assays.">Using well-plate microfluidic devices to conduct shear-based thrombosis assays.</a> J Lab Autom. 16, 148-152 (2011).</li><li>Larsen, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-selectin+and+E-selectin.+Distinct+but+overlapping+leukocyte+ligand+specificities.">P-selectin and E-selectin. Distinct but overlapping leukocyte ligand specificities.</a> J. Biol. Chem. 267, 11104-11110 (1992).</li><li>Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectin+ligands:+will+the+real+ones+please+stand+up.">Selectin ligands: will the real ones please stand up.</a> J. Clin. Invest. 100, S31-S35 (1997).</li><li>Bohnsack, J. F., Chang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+beta+1+integrin+fibronectin+receptors+on+HL60+cells+after+granulocytic+differentiation.">Activation of beta 1 integrin fibronectin receptors on HL60 cells after granulocytic differentiation.</a> Blood. 83, 543-552 (1994).</li><li>Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threshold+levels+of+fluid+shear+promote+leukocyte+adhesion+through+selectins+(CD62L,P,E).">Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E).</a> J. Cell Biol. 136, 717-727 (1997).</li><li>Moore, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-selectin+glycoprotein+ligand-1+mediates+rolling+of+human+neutrophils+on+P-selectin.">P-selectin glycoprotein ligand-1 mediates rolling of human neutrophils on P-selectin.</a> J. Cell Biol. 128, 661-671 (1995).</li><li>Lawrence, M. B., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+roll+on+E-selectin.">Neutrophils roll on E-selectin.</a> J Immunol. 151, 6338-6346 (1993).</li><li>Yao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+inducible+expression+of+P-selectin+and+E-selectin+in+mice+and+primates.">Divergent inducible expression of P-selectin and E-selectin in mice and primates.</a> Blood. 94, 3820-3828 (1999).</li><li>Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoengineering+of+HCELL,+the+human+bone+marrow+homing+receptor:+sweetly+programming+cell+migration.">Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration.</a> Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).</li><li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+physiologic+E-selectin-mediated+leukocyte+rolling+on+microvascular+endothelium.">Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium.</a> J. Vis. Exp. , e1009 (2009).</li><li>Muller, W. A., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+of+transendothelial+migration+in+vitro.">Assays of transendothelial migration in vitro.</a> Methods Enzymol. 443, 155-176 (2008).</li><li>Bakker, D. P., vander Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., vander Mei, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+velocity+profiles+for+different+flow+chamber+designs+used+in+studies+of+microbial+adhesion+to+surfaces.">Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6280-6287 (2003).</li><li>Benoit, M. R., Conant, C. G., Ionescu-Zanetti, C., Schwartz, M., Matin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+device+for+high-throughput+viability+screening+of+flow+biofilms.">New device for high-throughput viability screening of flow biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 4136-4142 (2010).</li><li>Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectin+ligands.">Selectin ligands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7390-7397 (1994).</li><li>Ramos, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+demonstration+of+P-selectin-+and+VCAM-1-dependent+mononuclear+cell+rolling+in+early+atherosclerotic+lesions+of+apolipoprotein+E-deficient+mice.">Direct demonstration of P-selectin- and VCAM-1-dependent mononuclear cell rolling in early atherosclerotic lesions of apolipoprotein E-deficient mice.</a> Circ. Res. 84, 1237-1244 (1999).</li><li>Yago, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core+1-derived+O-glycans+are+essential+E-selectin+ligands+on+neutrophils.">Core 1-derived O-glycans are essential E-selectin ligands on neutrophils.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).</li><li>Yago, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-selectin+engages+PSGL-1+and+CD44+through+a+common+signaling+pathway+to+induce+integrin+alphaLbeta2-mediated+slow+leukocyte+rolling.">E-selectin engages PSGL-1 and CD44 through a common signaling pathway to induce integrin alphaLbeta2-mediated slow leukocyte rolling.</a> Blood. 116, 485-494 (2010).</li><li>Simone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+rolling+and+adhesion+on+surfaces+in+shear+flow.+A+model+for+an+antibody-based+microfluidic+screening+system.">Cell rolling and adhesion on surfaces in shear flow. A model for an antibody-based microfluidic screening system.</a> Microelectronic Eng. 98, 668-671 (2012).</li><li>Perozziello, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+modulate+tumor+cell+line+susceptibility+to+NK+cell+recognition.">Microfluidic devices modulate tumor cell line susceptibility to NK cell recognition.</a> Small. 8, 2886-2894 (2012).</li><li>Perozziello, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+biofunctionalisation+protocols+to+form+multivalent+interactions+for+cell+rolling+and+phenotype+modification+investigations.">Microfluidic biofunctionalisation protocols to form multivalent interactions for cell rolling and phenotype modification investigations.</a> Electrophoresis. , (2013).</li><li>Simone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+facile+in+situ+microfluidic+method+for+creating+multivalent+surfaces:+toward+functional+glycomics.">A facile in situ microfluidic method for creating multivalent surfaces: toward functional glycomics.</a> Lab Chip. 12, 1500-1507 (2012).</li><li>Sarkar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+cell+homing.">Engineered cell homing.</a> Blood. 118, e184-e191 (2011).</li><li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Migration+of+Mesenchymal+Stem+Cells+Modified+With+CXCR4+Gene+to+Infarcted+Myocardium+Improves+Cardiac+Performance.">Targeted Migration of Mesenchymal Stem Cells Modified With CXCR4 Gene to Infarcted Myocardium Improves Cardiac Performance.</a> Mol. Ther. 16, 571-579 (2008).</li><li>Enoki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+mesenchymal+cell+engraftment+by+IGF-1+improves+left+ventricular+function+in+rats+undergoing+myocardial+infarction.">Enhanced mesenchymal cell engraftment by IGF-1 improves left ventricular function in rats undergoing myocardial infarction.</a> Int. J. Cardiol. 138, 9-18 (2010).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan ederim.

Eksojen hücre tabanlı tedavi başarılı çevirisinde önemli zorluklardan biri verimli, yüksek verimlilik engraftmınt 3 ile yaralanma ve inflamasyon sitelere hücreleri sunmak için yetersizliğidir. Hücre haddeleme sonunda dokuya 5 içine endotel yoluyla sağlam yapışması ve göçü yol açan, kan damarlarının duvarlarında hücrelerin yavaşlama kolaylaştıran, hücre homing sürecinde kritik bir adım teşkil etmektedir. Aday hücre tipleri için haddeleme işlemi daha iyi anlaşılm...

Hücre tabanlı tedavinin başarılı klinik çeviride önemli zorluklardan biri verimsiz dağıtım veya arzu sitelere 3,4 sistemik aşılanmış hücrelerin hedef olduğunu. Sonuç olarak, hücre homing geliştirmek için yaklaşımlar için bir arayışlar sürmektedir, ve özellikle de, hücre terapisi geliştirmek için bir strateji olarak, haddeleme hücre. Kan damarları üzerinde yuvarlanan Cep klasik hastalık sitelerine 5 alınsın lökositler için tanımlanan hücre homing kaskad, önemli bir adımdır. Bu adım, endotel selektinler arasındaki spesifik etkileşimlere tarafından yönetilir örneğin, P-selektin ve E-(P-ve E-sel) ve lökositlerin 5,6 yüzeyinde kontra ligandları. Daha iyi anlaşılması ve hücre hedeflemesi geliştirilmiş verimlilik ve özellikle haddeleme adım, hücre tabanlı tedavi geliştirmek için yeni platformlar için arayış içinde büyük önem taşımaktadır. Bugüne kadar bu iki düz plat oluşan, paralel plaka akış odaları (PPFCs) kullanılarak elde edilmiştirBir hücre süspansiyonu bir şırınga 7,8, 9, pompa kullanılarak perfüze, üzerinden, üst plaka üzerinde yer alan bir giriş ve çıkış bağlantı noktası ile aralarında bir conta ile es. Taban levhasının yüzeyi bir ilgili hücre tek tabaka / alt-tabakalar kaplanabilir ve kesme akımı altında perfüze hücreleri ve yüzey arasındaki etkileşimi, daha sonra 7 araştırılmıştır. Ancak, PPFC kabarcık oluşumu, sızıntı ve büyük sakıncalar sergilemesi kötü kontrollü akışı ile düşük verim, reaktif tüketim, ve oldukça sıkıcı bir yöntemdir. Geleneksel PPFC için alternatif bir teknik, düşük reaktif tüketimi 1,10 ile, doğru, bilgisayar kontrollü kesme akımı altında hücresel tahlillerde daha yüksek verim performansı (PPFCs en fazla 10 kat daha yüksek) izin, bir çok-yuvalı plaka mikroakışkan sistemidir. Hücre deneyleri haddeleme USI hücre mono tabakaları veya oluşturulmuş bir alt-tabakalar ile kaplanır ve görüntülü edilebilir, mikroakışkan kanal içinde yapılmaktadırng haddeleme özelliklere sahip bir mikroskop, hali hazırda, uygun bir yazılım kullanılarak analiz edildi. Bu çalışmada, insan promiyelositik lösemi farklı yüzeylerde (HL-60) hücreleri yuvarlanma özelliklerini inceleyerek bu çok-çukurlu plaka mikroakışkan sisteminin yeteneklerini gösterir. HL-60 P-ve E-sel, hem de farklı haddeleme reseptörleri ifade eden hücre tekli katmanları üzerinde, analiz edilmiştir gibi alt-tabakalar üzerinde yuvarlanan. Buna ek olarak, antikor (Ab), bu yüzeyler üzerinde HL-60 yuvarlanma hareketine aracılık özel selektinler doğrudan katılımını göstermek için kullanılmıştır engelleme. Yuvarlanan deneyleri, hız haddeleme, haddeleme hücre sayısı ve haddeleme yolu özellikleri gibi kilit dönme parametrelerini etkin analizi sağlayan, minimal reaktif / hücre tüketimi, kararlı kesme akışı altında, yüksek verim ile yapılmıştır.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Lung Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P)</td>
			<td>Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL-60 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Basal Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 Media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Basal Medium Supplements</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 MV SingleQuots</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM - Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (L/G) 200 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>Sa550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>BD-353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes)</td>
			<td>MedSupply Partners</td>
			<td>TC1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flasks</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin Solution (2%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA Solution (10x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-hE-Selectin/CD62E</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BBA21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Conjugated Mouse IgG1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BBA21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-hP-Selectin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BBA34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Conjugated Mouse IgG1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BBA34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG&#173;1 &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC70545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Conjugated</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC70545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC2859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>556055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1 k Isotype Control</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>550617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-P-Selectin Ab (AK4)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC19996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB2150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Isotype Control</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC3877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Other Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-alpha</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit - For Flow Cytometry</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human P-selectin-FC recombinant protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>137-PS-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human E-selectin-FC recombinant protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>724-ES-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Human, Plasma</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33016-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioflux 1000</td>
			<td>Fluxion Biosciences</td>
			<td>Bioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFlux 48-well plates</td>
			<td>Fluxion Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 Flow Cytometer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>CFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-S</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSnap HQ2 CCD camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

systematic analysis of in vitro cell rolling using a multi-well plate microfluidic system

Hücre bazlı tedavisi için önemli bir sorun, sistemik damar içine veya intra-arteryel infüzyonla, aşağıdaki ilgi dokularına yüksek verim ile yaşayabilir hücrelerin büyük bir miktarda hedef yetersizliğidir. Sonuç olarak, hücre homing artan anda hücre tedavisini geliştirmek için bir strateji olarak incelenmiştir. Vasküler endotel yuvarlanan hücre hücre hedeflemesi sürecinde önemli bir adımdır ve bir paralel plaka akış odası (PPFC) kullanılarak in-vitro olarak tanınacak. Ancak bu zayıf kontrol edilen akış koşulları, son derece can sıkıcı, düşük akış tahlilidir. Bunun yerine, tam olarak kontrol edilen, fizyolojik olarak ilgili kesme akışı altında 1,2 daha yüksek bir verim içinde hücresel yuvarlanma özellikleri çalışma sağlayan bir çok oyuklu bir plaka mikroakışkan sistemi kullanılır. Bu yazıda, P-ve E-selectin kaplı yüzeylerde hem de hücre tek-kaplı yüzeylerde HL-60 (insan promiyelositik lösemi) hücrelerinin yuvarlanma özelliklerini readil olabilir göstermeky incelenmiştir. Daha iltihaplı koşulların simüle edilmesi için, mikroakışkan kanal yüzeyi daha sonra önemli ölçüde dinamik koşullar altında HL-60 hücreleri ile etkileşimleri, artan tümör nekroz faktörü-α (TNF-α) ile aktive edilmiş endotel hücreleri (EC) ile kaplandı. Geliştirilmiş verimlilik ve bu hızları haddeleme ve yolunu haddeleme gibi parametrelerin hızlı analizi izin verir entegre çoklu parametre yazılımı analizi platformu, in-vitro hücre haddeleme özelliklerini değerlendirmek için önemli bir avantaj oluşturmaktadır. Hücre haddeleme ve homing darbe için tasarlanmış mühendislik yaklaşımları, hızlı ve doğru analiz sağlayan, bu platform önceden eksojen hücre tabanlı tedavi yardımcı olabilir.

HL-60 hücreleri, fibronektin üzerinde P-ve E-selektin rulo yüzeyler üzerinde değil, Bu haddeleme ligandlann P-glikoprotein sel ligand-1 (PSGL-1) ve Sialil-Lewis X (Slex) gibi güdümlü ligand, bir dizi 5,14 (Şekil 1A salgılarlar HL-60 hücreleri, altın standart &quot;olarak silindirler&quot; olarak kabul edilir .) Ile spesifik etkileşimi aracılık tetra-sakarit Slex için bir iskele olarak yüzey protein PSGL-1 eylemler, P-ve E-sel, iltihaplanma 5,6,1...

Watch this Scientific Journal Video about Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System at JoVE.com

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Bu çalışma, önemli fizyolojik olarak ilgili kesme akımı altında, hücre haddeleme çalışmalar artırıp, çok oyuklu bir plaka mikroakışkan sistemi kullanılır. Silsilesini ve hastalarda hücre ekzojen popülasyonlarının sistemik olarak uygulanmasını takiben hücre hedeflemesi önemini homing çok adımlı, hücre haddeleme önemi göz önüne alındığında, bu sistem, hücre bazlı tedaviyi geliştirmek için bir tarama platform olarak potansiyel sunmaktadır.

Sistematik Analizi<em&gt; In Vitro</emÇok-çukurlu plaka mikroakışkan Sistemi ile&gt; Hücre Rolling

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

systematic-analysis-vitro-cell-rolling-using-multi-well-plate

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

11.9K Görüntüleme.  Brigham and Women's Hospital.  Bu çalışma, önemli fizyolojik olarak ilgili kesme akımı altında, hücre haddeleme çalışmalar artırıp, çok oyuklu bir plaka mikroakışkan sistemi kullanılır. Silsilesini ve hastalarda hücre ekzojen popülasyonlarının sistemik olarak uygulanmasını takiben hücre hedeflemesi önemini homing çok adımlı, hücre haddeleme önemi göz önüne alındığında, bu sistem, hücre bazlı tedaviyi geliştirmek için bir tarama platform olarak potansiyel sunma...

Video: Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

Bir Tümör Mikroçevre yeniden oluşturmak için mikroakışkan Cihazı<em&gt; In vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Biyomühendislik

Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new devices for label-free separation and analysis of cells1. Such devices may use lateral displacement for continuous-flow separation, or receptor patterns that modulate adhesion to distinguish between different cell phenotypes or levels of receptor expression. Understanding the nature of cell rolling trajectories on receptor-patterned substrates is necessary for engineering of the substrates and design of such devices.
Here, we demonstrate a protocol for studying cell rolling trajectories on asymmetric receptor patterns that support cell rolling adhesion2. Well-defined, &mu;m-scale patterns of P-selectin receptors were fabricated using microcontact printing on gold-coated slides that were incorporated in a flow chamber. HL60 cells expressing the PSGL-1 ligand 3were flowed across a field of patterned lines and visualized on an inverted bright field microscope. The cells rolled and tracked along the inclined edges of the patterns, resulting in lateral deflection1. Each cell typically rolled for a certain distance along the pattern edges (defined as the edge tracking length), detached from the edge, and reattached to a downstream pattern. Although this detachment makes it difficult to track the entire trajectory of a cell from entrance to exit in the flow chamber, particle-tracking software was used to analyze and yield the rolling trajectories of the cells during the time when they were moving on a single receptor-patterned line. The trajectories were then examined to obtain distributions of cell rolling velocities and the edge tracking lengths for each cell for different patterns.
This protocol is useful for quantifying cell rolling trajectories on receptor patterns and relating these to engineering parameters such as pattern angle and shear stress. Such data will be useful for design of microfluidic devices for label-free cell separation and analysis.

We describe a protocol to observe and analyze cell rolling trajectories on asymmetric receptor-patterned substrates. The resulting data are useful for engineering of receptor-patterned substrates for label-free cell separation and analysis.

Asimetrik Reseptör Desenler Hücre Rolling Yörüngeler incelenmesi

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

Yüksek verimli bir kullanımı<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikroakışkan Sistemi Ağız Çok türler biyofilm Geliştirmek İçin

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Yeniden İnşa İnsan Kornea gibi Epitelyal (RHCE) Doku Modeli kullanılarak Göz tahriş Kimyasalların Tehlike Tanımlaması Göz tahrişi Testi (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as well as substance testing. These models are mostly cultivated in membrane-insert systems, their permeability toward different substances being an essential factor. Typically, applied methods for determination of these parameters usually require large sample sizes (e.g., Franz diffusion cell) or laborious equipment (e.g., fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)). This study presents a method for determining permeability coefficients directly in membrane-insert systems with diameter sizes of 4.26 mm and 12.2 mm (cultivation area). The method was validated with agarose and collagen gels as well as a collagen cell model representing skin models. The permeation processes of substances with different molecular sizes and permeation through different cell models (consisting of collagen gel, fibroblast, and HaCaT) were accurately described.
Moreover, to support the above experimental method, a simulation was established. The simulation fits the experimental data well for substances with small molecular size, up to 14 x 10-10 m Stokes radius (4,000 MW), and is therefore a promising tool to describe the system. Furthermore, the simulation can considerably reduce experimental efforts and is robust enough to be extended or adapted to more complex setups.

A method for determination of permeability in a membrane insert system for multi-well plates and in silico parameter optimization for the calculation of diffusion coefficients using simulation are presented.

Bir yöntem belirleme geçirgenliği ve Difüzyon bir zarda bir 3D doku modelindeki simülasyonu için ekleme sistemi çok iyi kaplamalar için

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. Unfortunately, many researchers spend large amounts of time and resources developing and optimizing workflows that are only relevant to their own experiments. In this article, we describe a protocol that can be used by those with access to a widefield high-content analysis system (WHCAS) to image any slide-mounted tissue, with options for customization within pre-built modules found in the associated software. Not originally intended for slide scanning, the steps detailed in this article make it possible to acquire slide scanning images in the WHCAS which can be imported into the associated software. In this example, the automated segmentation of brain tumor slides is demonstrated, but the automated segmentation of any fluorescently-labeled nuclear or cytoplasmic marker is possible. Furthermore, there are a variety of other quantitative software modules including assays for protein localization/translocation, cellular proliferation/viability/apoptosis, and angiogenesis that can be run. This technique will save researchers time and effort and create an automated protocol for slide analysis.

Here we describe a protocol for the automated segmentation of fluorescently labeled tissues on slides using a widefield high-content analysis system (WHCAS). This protocol has wide-ranging applications in any field which involves the quantitation of fluorescent markers in biological tissues including the biological sciences, medical engineering, and health sciences.

Otomatik slayt tarama ve segmentasyon Fluorescently etiketli dokularda Widefield yüksek-içeriği analiz sistemi kullanılarak

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate flow chambers. Endothelial cells form the inner cellular lining of blood vessels and are chronically exposed to the frictional force of blood flow called shear stress. Under physiological conditions, endothelial cells function in the presence of various shear stress conditions. Thus, the application of shear stress conditions in in vitro models can provide greater insight into endothelial responses in vivo. The parallel-plate flow chamber previously published by Lane et al.9 is adapted to study endothelial gene regulation in the presence and absence of steady (non-pulsatile) laminar flow. Key adaptations in the set-up for laminar flow as presented here include a large, dedicated environment to house concurrent flow circuits, the monitoring of flow rates in real-time, and the inclusion of an exogenous reference RNA for the normalization of quantitative real-time PCR data. To assess multiple treatments/conditions with the application of shear stress, multiple flow circuits and pumps are used simultaneously within the same heated and humidified incubator. The flow rate of each flow circuit is measured continuously in real-time to standardize shear stress conditions throughout the experiments. Because these experiments have multiple conditions, we also use an exogenous reference RNA that is spiked-in at the time of RNA extraction for the normalization of RNA extraction and first-strand cDNA synthesis efficiencies. These steps minimize the variability between samples. This strategy is employed in our pipeline for the gene expression analysis with shear stress experiments using the parallel-plate flow chamber, but parts of this strategy, such as the exogenous reference RNA spike-in, can easily and cost-effectively be used for other applications.

Here, a workflow for the culture and gene expression analysis of endothelial cells under fluid shear stress is presented. Included is a physical arrangement for simultaneously housing and monitoring multiple flow chambers in a controlled environment and the use of an exogenous reference RNA for quantitative PCR.

Stres birden çok paralel-plaka akışı Chambers kullanarak yamultmak için maruz endotel hücrelerinin gen ifade Analizi

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, including Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Here, we will describe how the system can be used to study the growth kinetics and the morphological properties such as the surface roughness and textural entropy of P. aeruginosa strain PA01 that expresses an enhanced green fluorescent protein (PA01-EGFP). A detailed protocol will describe how to grow and seed PA01-EGFP cultures, how to set up the microscope and autorun, and conduct the image analysis to determine growth rate and morphological properties using a variety of shear forces that are controlled by the microfluidic device. This article will provide a detailed description of a technique to improve the study of PA01-EGFP biofilms which eventually can be applied towards other strains of bacteria, fungi, or algae biofilms using the microfluidic platform.

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Here, we describe the use of a higher-throughput microfluidic bioreactor coupled with a fluorescent microscope for the analysis of shear stress effects on Pseudomonas aeruginosa biofilms expressing green fluorescent proteins, including instrument set up, the determination of biofilm coverage, growth rate, and morphological properties.

Canlı hücre analizi, yamultma stres bir otomatik yüksek üretilen iş mikrosıvısal sistemi kullanarak Pseudomonas aeruginosa

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

Mikroakışkan Çiple Deterministik Bir Şekilde Tek Hücreli Ortak Kültürlerin Oluşturulması

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...